CN118027205A - 特异性结合crept的抗体及其用途 - Google Patents

特异性结合crept的抗体及其用途 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种特异性结合CREPT的抗体及其用途。本发明提供了一种特异性结合CREPT的抗体或其抗原结合片段,其包含抗体重链可变区和抗体轻链可变区,其中,所述的抗体重链可变区包含至少1个选自以下序列所示的HCDR:SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:4和SEQ ID NO:5;以及所述抗体轻链可变区包含至少1个选自以下序列所示的LCDR:SEQ ID NO:6、SEQ ID NO:7和SEQ ID NO:8。本发明提供的特异性结合CREPT的抗体或其抗原结合片段,与现有CREPT抗体针对CREPT蛋白不同表位,并且可以有效检测肿瘤组织、肿瘤细胞中的CREPT蛋白的抗体。

Description

特异性结合CREPT的抗体及其用途
技术领域
本发明属于抗体技术领域,涉及特异性结合CREPT的抗体及其用途,更具体地,涉及一种用于鉴定肿瘤细胞或肿瘤组织中的CREPT的抗体。
背景技术
癌症是涉及多个基因的状态和表达的改变的一类疾病,这些基因赋予体细胞或生发细胞生存优势和持续的增殖潜力。三大类基因的改变,即(原)癌基因、肿瘤抑制基因和DNA修复基因,共同促进了癌症基因型和表型的发展,这些基因型和表型能够抵抗细胞内嵌的自然和固有死亡机制(凋亡等过程),并伴随着细胞增殖事件的失调。
癌症对人类健康有着深远的影响,它是一种复杂而多样化的疾病,对患者的生命、生活质量和家庭产生重大影响。因此,癌症的检测和诊断在临床中具有重要意义。癌症的早期诊断可以提供更好的治疗机会,因为在疾病较早阶段时,癌细胞尚未扩散到其他部位,提高患者的生存机会。此外,还有助于风险评估以及制定合理的治疗计划。
CREPT,也被称为RPRD1B,是一种新型致癌基因。在临床肿瘤样本的免疫组化染色分析中,CREPT在多种肿瘤中高表达,患者预后差(Lu D,Wu Y,Wang Y,et al.CREPTaccelerates tumorigenesis by regulating the transcription of cell-cycle-related genes.Cancer Cell.2012;21(1):92-104.doi:10.1016/j.ccr.2011.12.016)。此前,已鉴定单克隆抗体3E10(Ren F,Wang R,Zhang Y,et al.Characterization of amonoclonal antibody against CREPT,a novel protein highly expressed intumors.Monoclon Antib Immunodiagn Immunother.2014;33(6):401-408.doi:10.1089/mab.2014.0043)和4H1(CN102559601A)可以特异性识别CREPT蛋白,但是3E10和4H1抗体序列一致,应用场景也相似。因此,需要开发不同表位的抗体去进一步优化CREPT的应用范围。比如,3E10和4H1抗体对于ChIP-seq实验效率低,可能是由于抗体识别表位所致。开发与现有的针对CREPT的抗体识别不同的CREPT蛋白表位的抗体,有利于拓展对于CREPT蛋白的不同检测,例如提高ChIP-seq等实验的效率,在免疫学实验中实现针对不同表位的抗体的组合使用,以及对于研究CREPT信号转导,揭示CREPT与肿瘤的关系具有重要意义。
因此,亟需开发一种与现有CREPT抗体针对CREPT蛋白不同表位,并且可以有效检测肿瘤组织、肿瘤细胞中的CREPT蛋白的抗体。
发明内容
发明要解决的问题
为解决现有技术中存在的上述问题,本发明的目的在于提供一种新的特异性结合CREPT的抗体。
用于解决问题的方案
在本发明的第一方面中,提供了一种特异性结合CREPT的抗体或其抗原结合片段,其包含抗体重链可变区和抗体轻链可变区,其中,所述的抗体重链可变区包含至少1个选自以下序列所示的HCDR:SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:4和SEQ ID NO:5;以及所述抗体轻链可变区包含至少1个选自以下序列所示的LCDR:SEQ ID NO:6、SEQ ID NO:7和SEQ ID NO:8。
在一些实施方案中,所述的重链可变区包含SEQ ID NO:3所示的HCDR1、SEQ IDNO:4所示的HCDR2和SEQ ID NO:5所示的HCDR3;和/或,所述的轻链可变区包含SEQ ID NO:6所示的LCDR1、SEQ ID NO:7所示的LCDR2和SEQ ID NO:8所示的LCDR3。
在一些实施方案中,所述的特异性结合CREPT的抗体或其抗原结合片段,其包含重链可变区和轻链可变区,其中,所述重链可变区包含SEQ ID NO:3所示的HCDR1、SEQ ID NO:4所示的HCDR2和SEQ ID NO:5所示的HCDR3;所述轻链可变区包含SEQ ID NO:6所示的LCDR1、SEQ ID NO:7所示的LCDR2和SEQ ID NO:8所示的LCDR3。
在一些实施方案中,所述的特异性结合CREPT的抗体或其抗原结合片段包含SEQID NO:1所示的重链可变区、或与其具有至少70%,75%,80%,85%,90%,95%或99%同一性的重链可变区;和/或,所述的特异性结合CREPT的抗体或其抗原结合片段包含SEQ IDNO:2所示的轻链可变区、或与其具有至少70%,75%,80%,85%,90%,95%或99%同一性的轻链可变区。
在一些实施方案中,所述的特异性结合CREPT的抗体或其抗原结合片段包含SEQID NO:1所示的重链可变区、或与其具有至少70%,75%,80%,85%,90%,95%或99%同一性的重链可变区,和SEQ ID NO:2所示的轻链可变区、或与其具有至少70%,75%,80%,85%,90%,95%或99%同一性的轻链可变区;优选地,所述的特异性结合CREPT的抗体或其抗原结合片段包含SEQ ID NO:1所示的重链可变区,和SEQ ID NO:2所示的轻链可变区。
在一些实施方案中,所述特异性结合CREPT的抗体或其抗原结合片段还包含源自人或鼠IgG1、IgG2、IgG3或IgG4或其变体的重链恒定区;和/或,所述特异性结合CREPT的抗体或其抗原结合片段还包含源自人或鼠κ链、λ链或其变体的轻链恒定区。
在一些实施方案中,所述特异性结合CREPT的抗体或其抗原结合片段包括鼠源抗体或其片段、嵌合抗体或其片段、人源化抗体或其片段;和/或,所述特异性结合CREPT的抗体或其抗原结合片段选自全长抗体、Fab片段、Fab’片段、F(ab’)2片段、Fv片段、单链抗体、多特异性抗体中的至少一种。
在本发明的第二方面中,提供了一种杂交瘤细胞株,所述杂交瘤细胞株的分类命名为小鼠杂交瘤细胞,其保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(ChinaGeneral Microbiological Culture Collection Center,CGMCC),保藏地址为:北京市朝阳区北辰西路1号院3号,中国科学院微生物研究所,保藏日期为:2023年12月20日,保藏号为:CGMCC No.45759。
在本发明的第三方面中,提供了一种单克隆抗体,其由本发明的第二方面中所述的杂交瘤细胞株分泌产生。
在本发明的第四方面中,提供了一种生物材料,其中,所述生物材料包括如下B1)~B8)中的至少一种:
B1)编码本发明的第一方面中所述的特异性结合CREPT的抗体或其抗原结合片段的多核苷酸;
B2)含有B1)中所述多核苷酸的表达盒;
B3)含有B1)中所述多核苷酸的载体;
B4)含有B2)中所述表达盒的载体;
B5)含有B1)中所述多核苷酸的宿主细胞;
B6)含有B2)中所述表达盒的宿主细胞;
B7)含有B3)中所述重组载体的宿主细胞;
B8)含有B4)中所述重组载体的宿主细胞。
在一些实施方案中,所述的宿主细胞为微生物或哺乳动物细胞。
在本发明的第五方面中,提供了一种检测或诊断试剂盒,其含有本发明的第一方面中所述的特异性结合CREPT的抗体或其抗原结合片段、本发明的第三方面中所述的单克隆抗体、或本发明的第四方面中所述的生物材料。
在本发明的第六方面中,提供了本发明的第一方面中所述的特异性结合CREPT的抗体或其抗原结合片段、本发明的第三方面中所述的单克隆抗体、或本发明的第四方面中所述的生物材料的以下任一项用途:
(i)在制备用于检测样本中CREPT蛋白的试剂或试剂盒中的用途;
(ii)在制备用于诊断或辅助诊断受试者是否患有与CREPT相关的疾病的试剂或试剂盒中的用途。
在本发明的第七方面中,提供了一种检测样本中是否存在CREPT蛋白或其含量的方法,其包括将所述样本与本发明的第一方面中所述的特异性结合CREPT的抗体或其抗原结合片段、本发明的第三方面中所述的单克隆抗体或本发明的第四方面中所述的生物材料接触的步骤。
发明的效果
本发明提供的特异性结合CREPT的抗体或其抗原结合片段、单克隆抗体,与现有CREPT抗体针对CREPT蛋白不同表位,并且可以有效检测肿瘤组织、肿瘤细胞中的CREPT蛋白的抗体。
附图说明
图1为单克隆抗体的效价测定结果示意图。
图2为6H2抗体检测CREPT-Myc和p15RS-Flag结果示意图。
图3为6H2抗体检测CREPT CID-Myc和CREPT CCT-Myc结果示意图。
图4为6H2抗体检测PPC结果示意图。
图5为6H2抗体检测CREPT(△160-168)结果示意图。
图6为6H2抗体、3E10和4H1抗体的重链和轻链可变区序列对比示意图。
图7为6H2抗体的ChIP-seq结果示意图。
图8为6H2抗体检测多种癌细胞中CREPT内源性表达的结果示意图
图9为CREPT基因在肿瘤组织、癌旁组织中表达差异的结果示意图。
具体实施方式
以下将详细说明本发明的各种示例性实施例、特征和方面。在这里专用的词“示例性”意为“用作例子、实施例或说明性”。这里作为“示例性”所说明的任何实施例不必解释为优于或好于其它实施例。
另外,为了更好地说明本发明,在下文的具体实施方式中给出了众多的具体细节。本领域技术人员应当理解,没有某些具体细节,本发明同样可以实施。在另外一些实例中,对于本领域技术人员熟知的方法、手段、器材和步骤未作详细描述,以便于凸显本发明的主旨。
如无特殊声明,本说明书中所使用的单位均为国际标准单位,并且本发明中出现的数值,数值范围,均应当理解为包含了工业生产中所不可避免的系统性误差。
本说明书中,使用“可以”表示的含义包括了进行某种处理以及不进行某种处理两方面的含义。
本说明书中,所提及的“一些具体/优选的实施方案”、“另一些具体/优选的实施方案”、“实施方案”等是指所描述的与该实施方案有关的特定要素(例如,特征、结构、性质和/或特性)包括在此处所述的至少一种实施方案中,并且可存在于其它实施方案中或者可不存在于其它实施方案中。另外,应理解,所述要素可以任何合适的方式组合在各种实施方案中。
本说明书中,使用“数值A~数值B”表示的数值范围是指包含端点数值A、B的范围。
本说明书中,使用“基本上”或“实质上”表示与理论模型或理论数据的标准偏差在5%、优选为3%、更优选为1%范围以内。
本说明书中,“任选的”或“任选地”是指接下来描述的事件或情况可发生或可不发生,并且该描述包括该事件发生的情况和该事件不发生的情况。
本说明书中,术语“和/或”当用于连接两个或多个可选项时,应理解为意指可选项中的任一项或可选项中的任意两项或多项。
根据本发明,术语“多肽”、“蛋白质”、“肽”在本文中可互换的使用,指任何长度的氨基酸的聚合形态,可包括编码的和非编码的氨基酸,化学或生物化学修饰的或衍生的氨基酸,和具有相似的肽骨架的多肽。
根据本发明,术语“核酸分子”、“多核苷酸”、“多聚核酸”、“核酸”可互换的使用,指任何长度的核苷酸的聚合形态,不论是脱氧核糖核苷酸或核糖核苷酸,或其类似物。多核苷酸可具有任何三维结构,可实施任何已知或未知的功能。多核苷酸的非限制例子包括基因、基因片段、外显子、内含子、信使RNA(mRNA)、转运RNA、核糖体RNA、核酶、cDNA、重组多核苷酸、分支多核苷酸、质粒、载体、任何序列的分离的DNA、控制区、任何序列的分离的RNA、核酸探针和引物。核酸分子可以是线性或环状的。
根据本发明,所用氨基酸三字母代码和单字母代码如J.biol.chem,243,p3558(1968)中所述。
本发明所述的术语“抗体”指免疫球蛋白,其是由两条相同的重链和两条相同的轻链通过链间二硫键连接而成的四肽链结构。免疫球蛋白重链恒定区的氨基酸组成和排列顺序不同,故其抗原性也不同。据此,可将免疫球蛋白分为五类,或称为免疫球蛋白的同种型,即IgM、IgD、IgG、IgA和IgE,其相应的重链分别为μ链、δ链、γ链、α链和ε链。同一类Ig根据其铰链区氨基酸组成和重链二硫键的数目和位置的差别,又可分为不同的亚类,如IgG可分为IgG1、IgG2、IgG3、IgG4。轻链通过恒定区的不同分为κ链或λ链。五类Ig中第每类Ig都可以有κ链或λ链。
在本发明中,抗体轻链可进一步包含轻链恒定区,所述的轻链恒定区包含人源的κ、λ链或其变体。
在本发明中,抗体重链可进一步包含重链恒定区,所述的重链恒定区包含人源的IgG1、IgG2、IgG3、IgG4或其变体。
抗体重链和轻链靠近N端的约110个氨基酸的序列变化很大,为可变区(V区);靠近C端的其余氨基酸序列相对稳定,为恒定区(C区)。可变区包括3个高变区(HVR)和4个序列相对保守的框架区(FR)。3个高变区决定抗体的特异性,又称为互补决定区(CDR)。每条轻链可变区(VL)和重链可变区(VH)由3个CDR区和4个FR区组成,从氨基端到羧基端依次排列的顺序为:FR1、CDR1、FR2、CDR2、FR3、CDR3、FR4。轻链的3个CDR区指LCDR1、LCDR2,和LCDR3;重链的3个CDR区指HCDR1、HCDR2和HCDR3。抗体或抗原结合片段的VL区和VH区的CDR氨基酸残基在数量和位置符合已知的Kabat编号规则和Kabat或AbM或IMGT定义规则(http://bioinf.org.uk/abs/)。
本公开的抗体包括鼠源抗体、嵌合抗体或人源化抗体。本公开抗体除包括全长抗体外,还包括能结合抗原的抗原结合片段。
术语“鼠源抗体”在本公开中为根据本领域知识和技能制备的来源于小鼠的单克隆抗体。制备时用抗原注射试验对象,然后分离表达具有所需序列或功能特性的抗体的杂交瘤,当所注射的试验对象为小鼠时,所产生的抗体为鼠源抗体。
术语“嵌合抗体(chimeric antibody)”,是将鼠源性抗体的可变区与人抗体的恒定区融合而成的抗体,可以减轻鼠源性抗体诱发的免疫应答反应。建立嵌合抗体,要先建立分泌鼠源性特异性单抗的杂交瘤,然后从鼠杂交瘤细胞中克隆可变区基因,再根据需要克隆人抗体的恒定区基因,将鼠可变区基因与人恒定区基因连接成嵌合基因后插入表达载体中,最后在真核系统或原核系统中表达嵌合抗体分子。所述的嵌合抗体的抗体轻链进一步包含人源κ、λ链或其变体的轻链恒定区。所述的嵌合抗体的抗体重链进一步包含人源IgG1、IgG2、IgG3、IgG4或其变体的重链恒定区,优选包含人源IgG1、IgG2或IgG4重链恒定区,或者使用氨基酸突变(如YTE突变或回复突变,L234A和/或L235A突变,或S228P突变)的IgG1、IgG2或IgG4重链恒定区变体。
术语“人源化抗体(humanized antibody)”,也称为CDR移植抗体(CDR-graftedantibody),是指将鼠的CDR序列移植到人的抗体可变区框架,即不同类型的人种系抗体框架序列中产生的抗体。可以克服嵌合抗体由于携带大量鼠蛋白成分,从而诱导的异源性反应。此类构架序列可以从包括种系抗体基因序列的公共DNA数据库或公开的参考文献获得。如人重链和轻链可变区基因的种系DNA序列可以在“VBase”人种系序列数据库(在因特网www.mrccpe.com.ac.uk/vbase可获得),以及在Kabat,E.A.等人,1991Sequences ofProteins of Immunological Interest,第5版中找到。为避免免疫原性下降的同时,引起的活性下降,可对所述的人抗体可变区框架序列进行最少反向突变或回复突变,以保持活性。本公开的人源化抗体也包括进一步由酵母菌展示对CDR进行亲和力成熟突变后的人源化抗体。
术语“抗原结合片段”是指抗体的抗原结合片段及抗体类似物,其通常包括至少部分母体抗体(parental antibody)的抗原结合区或可变区(例如一个或多个CDR)。抗体片段保留母体抗体的至少某些结合特异性。通常,当基于摩尔来表示活性时,抗体片段保留至少10%的母体结合活性。优选地,抗体片段保留至少20%、50%、70%、80%、90%、95%或100%或更多的母体抗体对靶标的结合亲和力。抗原结合片段实例包括但不限于:Fab片段、Fab’片段、F(ab’)2片段、Fv片段、线性抗体(linear antibody)、单链抗体(single chainantibody fragment,scFv)、结构域抗体、纳米抗体和多特异性抗体(例如双体)。工程改造的抗体变体综述于Holliger和Hudson,2005,Nat.Biotechnol.23:1126-1136中。
术语“Fab片段”包含一条轻链以及一条重链的CH1和可变区。Fab分子的重链不能与另一个重链分子形成二硫键。
术语“Fab’片段”含有一条轻链以及一条重链的部分或片段,所述部分或片段含有VH结构域和CH1结构域以及在CH1和CH2结构域之间的区域。
术语“F(ab’)2片段”含有两条轻链和两条重链,所述重链含有在CH1和CH2结构域之间的恒定区的一部分,使得在两条重链之间形成链间二硫键。F(ab’)2片段因而由两个Fab’片段组成,而两个Fab’片段通过两条重链之间的二硫键连接在一起。
术语“Fv片段”包含来自重链和轻链的可变区,但是缺少恒定区。
术语“单链抗体”、“单链Fv”或“scFv”,是指包含抗体的VH结构域和VL结构域的抗体片段,其中这些结构域以单一多肽链形式存在。通常,Fv多肽还包含VH结构域和VL结构域之间的多肽接头,所述接头使scFv能够形成期望的结构以进行抗原结合。
术语“多特异性抗体”按其最广义使用,涵盖具有多表位特异性的抗体。这些多特异性抗体包括但不限于:包含重链可变区VH和轻链可变区VL的抗体,其中该VH-VL单元具有多表位特异性;具有两个或多个VL和VH区的抗体,每个VH-VL单元与不同的靶点或同一个靶点的不同表位结合;具有两个或更多个单可变区的抗体,每个单可变区与不同的靶点或同一个靶点的不同的表位结合;全长抗体、抗体片段、双抗体(diabodies)、双特异性双抗体和三抗体(triabodies)、己共价或非共价连接在一起的抗体片段等。
术语“双体”或“双抗体”指具有两个抗原结合位点的小抗体片段,所述片段在同一多肽链中包含重链可变结构域(VH)和与之连接的轻链可变结构域(VL)(VH-VL或VL-VH)。通过使用短得不能让同一链上的两个结构域之间发生配对的接头,各结构域被迫与另一条链的互补结构域发生配对,从而产生两个抗原结合位点。
术语“结构域抗体”是仅含有重链可变区或轻链可变区链的具有免疫学功能的免疫球蛋白片段。在某些情况下,两个或多个VH区与肽接头共价连接以形成二价结构域抗体片段。二价结构域抗体片段的两个VH区可靶向相同或不同抗原。
术语“融合抗体”、“抗体融合蛋白”或“Ig融合蛋白”是指在基因水平上将目的基因同免疫球蛋白部分片段基因相连,并在真核或原核表达系统中表达的重组蛋白。抗体融合蛋白具有抗体的特性及融合功能蛋白的活性,可广泛应用于免疫诊断、免疫治疗、抗体纯化及抗体和抗原的定量分析等,特别可用于免疫导向药物的制备。根据结合的Ig片段的不同,可以将抗体融合蛋白分为Fab融合蛋白、Fc融合蛋白与单链抗体(scFv)融合蛋白。
本发明的术语“抗原结合位点”指本发明抗体或抗原结合片段识别的三维空间位点。
术语“表位”是指抗原上与免疫球蛋白或抗体特异性结合的位点。表位可以由相邻的氨基酸、或通过蛋白质的三级折叠而并列的不相邻的氨基酸形成。由相邻的氨基酸形成的表位通常在暴露于变性溶剂后保持,而通过三级折叠形成的表位通常在变性溶剂处理后丧失。表位通常以独特的空间构象包括至少3-15个氨基酸。确定什么表位由给定的抗体结合的方法在本领域中是熟知的,包括免疫印迹和免疫沉淀检测分析等。确定表位的空间构象的方法包括本领域中的技术,例如X射线晶体分析法和二维核磁共振等。
本发明所用的术语“特异性结合”、“选择性结合”是指抗体与预定的抗原上的表位结合。通常,在仪器中通过表面等离子体共振(SPR)技术测定时,抗体以大约低于10-7M或甚至更小的平衡解离常数(K D)与预定的抗原结合,并且其与预定抗原结合的亲和力是其与预定抗原或紧密相关的抗原之外的非特异性抗原(如BSA等)结合的亲和力的至少两倍。术语“识别抗原的抗体”在本文中可以与术语“特异性结合的抗体”互换使用。
根据本发明,氨基酸“添加”指在氨基酸序列的C端或N端添加氨基酸。根据本发明,氨基酸“缺失”指可以从氨基酸序列中删除1、2或3个以上氨基酸。根据本发明,氨基酸“插入”指在氨基酸序列中的适当位置插入氨基酸残基,插入的氨基酸残基也可以全部或部分彼此相邻,或插入的氨基酸之间都不彼此相邻。
根据本发明,氨基酸“取代”指在氨基酸序列中的某个位置的某个氨基酸残基被其他氨基酸残基替代;其中,“取代”可以是保守氨基酸取代。
根据本发明,“保守修饰”、“保守取代”或“保守置换”是指具有类似特征(例如电荷、侧链大小、疏水性/亲水性、主链构象和刚性等)的其它氨基酸置换蛋白中的氨基酸,使得可频繁进行改变而不改变蛋白的生物学活性。本领域技术人员知晓,一般而言,多肽的非必需区域中的单个氨基酸置换基本上不改变生物学活性(参见例如Watson等(1987)Molecular Biology of the Gene,The Benjamin/Cummings Pub.Co.,第224页,(第4版))。另外,结构或功能类似的氨基酸的置换不大可能破坏生物学活性。示例性保守取代于以下“示例性氨基酸保守取代”中陈述。
示例性氨基酸保守取代
原始残基 保守取代
Ala(A) Gly;Ser
Arg(R) Lys;His
Asn(N) Gln;His;Asp
Asp(D) Glu;Asn
Cys(C) Ser;Ala;Val
Gln(Q) Asn;Glu
Glu(E) Asp;Gln
Gly(G) Ala
His(H) Asn;Gln
Ile(I) Leu;Val
Leu(L) Ile;Val
Lys(K) Arg;His
Met(M) Leu;Ile;Tyr
Phe(F) Tyr;Met;Leu
Pro(P) Ala
Ser(S) Thr
Thr(T) Ser
Trp(W) Tyr;Phe
Tyr(Y) Trp;Phe
Val(V) Ile;Leu
“同一性”是指两个多核苷酸序列之间或两个多肽之间的序列相似性。当两个比较序列中的位置均被相同碱基或氨基酸单体亚基占据时,例如如果两个DNA分子的每一个位置都被腺嘌呤占据时,那么所述分子在该位置是同源的。两个序列之间的同一性百分率是两个序列共有的匹配或同源位置数除以比较的位置数×100%的函数。例如,在序列最佳比对时,如果两个序列中的10个位置有6个匹配或同源,那么两个序列为60%同源。一般而言,当比对两个序列而得到最大的同一性百分率时进行比较。根据本发明的一些具体实施方案中,“同一性”是指氨基酸序列或核苷酸序列的同一性。可使用国际互联网上的同源性检索站点测定氨基酸序列或核苷酸序列的同一性,如NCBI主页网站的BLAST网页。例如,可在高级BLAST2.1中,通过使用blastp作为程序,将Expect值设置为10,将所有Filter设置为OFF,使用BLOSUM62作为Matrix,将Gap existence cost,Per residue gap cost和Lambdaratio分别设置为11,1和0.85(缺省值)并进行检索一对氨基酸序列的同一性进行计算,然后即可获得同一性的值(%)。
根据本发明,术语“载体”是指,可将多核苷酸插入其中的一种核酸运载工具。当载体能使插入的多核苷酸所编码的蛋白获得表达时,载体称为表达载体。载体可以通过转化,转导或者转染导入宿主细胞,使其携带的遗传物质元件在宿主细胞中获得表达。载体是本领域技术人员公知的,包括但不限于:质粒、噬菌体、柯斯质粒等等。
根据本发明,术语“表达盒”是包含目标基因,与调控目标基因表达的调控元件的重组表达元件。在一些实施方式中,目标基因是目标多肽的编码基因。在一些实施方式中,调控元件是用于起始编码基因转录的启动子元件。在一些实施方式中,调控元件还可以包含增强子、沉默子、绝缘子等元件。
根据本发明,术语“细胞”、“细胞系”和“细胞培养物”可互换使用,并且所有这类名称都包括后代。因此,术语“转化体”和“转化细胞”包括原代受试细胞和由其衍生的培养物,而不考虑转移数目。还应当理解的是,由于故意或非有意的突变,所有后代在DNA含量方面不可能精确相同。包括具有与最初转化细胞中筛选的相同的功能或生物学活性的突变后代。
根据本发明,术语“宿主细胞”是指已向其中引入了表达载体的细胞。宿主细胞可包括细菌、微生物、植物或动物细胞。易于转化的细菌包括肠杆菌科(enterobacteriaceae)的成员,例如大肠杆菌(Escherichia coli)或沙门氏菌(Salmonella)的菌株;芽孢杆菌科(Bacillaceae)例如枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis);肺炎球菌(Pneumococcus);链球菌(Streptococcus)和流感嗜血菌(Haemophilus influenzae)。适当的微生物包括酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)和毕赤酵母(Pichia pastoris)。适当的动物宿主细胞系包括CHO(中国仓鼠卵巢细胞系)和NS0细胞。
在本说明书中,术语“诊断”包括受试者疾病状态或病症的检测或鉴定、确定受试者将患给定疾病或病症的可能性、确定患有疾病或病症的受试者将对治疗有反应的可能性、确定患有疾病或病症的受试者的预后(或其可能的进展或消退)以及确定治疗对患有疾病或病症的受试者的效果。
在本说明书中,术语“受试者”是指人(即,任何年龄段的男性或女性,例如,儿科受试者(例如,婴儿、儿童或青少年)或成人受试者(例如,年轻人、中年人或老年人))或非人动物。在某些实施方案中,非人动物是哺乳动物(例如灵长类动物(例如食蟹猴或恒河猴)、商业相关的哺乳动物(例如牛、猪、马、绵羊、山羊、猫或狗)或鸟。非人动物可以是处于任何发育阶段的雄性或雌性。非人动物可以是转基因动物或基因工程化动物。
在本说明书中,术语“样本”是指可能包含需要进行分析的靶分子的任何物质,包括生物样本。如本文所用,“生物样本”是指从活的或病毒性(或朊病毒的)来源或其他大分子和生物分子来源获得的任何样本,并且包括可以从之获得核酸、蛋白质和/或其他大分子的受试者的任何细胞类型或组织。生物样本可以是直接从生物来源获得的样本或者是被处理的样本。例如,被扩增的分离的核酸构成生物样本。生物样本包括,但不限于,体液(例如血液、血浆、血清、脑脊髓液、滑液、尿液、汗液、精液、粪便、痰、眼泪、粘液、羊水等)、渗出液、骨髓样本、腹水、骨盆冲洗液、胸膜液、脊髓液、淋巴液、眼液、鼻、喉或生殖器拭子的提取物、消化组织的细胞悬浮液、或粪类物质的提取物、以及来自人、动物(例如非人哺乳动物)和植物的组织和器官样本,以及由此衍生出的加工样本。
以下对于本发明的技术方案进行详细说明:
<特异性结合CREPT的抗体或其抗原结合片段>
根据本发明的一些实施方案,提供了一种特异性结合CREPT的抗体或其抗原结合片段,其包含抗体重链可变区和抗体轻链可变区,其中所述的抗体重链可变区包含至少1个选自以下序列所示的HCDR:SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:4和SEQ ID NO:5;以及所述抗体轻链可变区包含至少1个选自以下序列所示的LCDR:SEQ ID NO:6、SEQ ID NO:7和SEQ ID NO:8。
本发明提供的特异性结合CREPT的抗体或其抗原结合片段具有特异性结合CREPT的效果。可以用于检测肿瘤细胞或肿瘤组织中的CREPT,进而用于诊断或辅助诊断癌症。
在本公开的一些实施方案中,CREPT为文献D Lu et al.,CREPT acceleratestumorigenesis by regulating the transcription of cell-cycle relatedgenes.Cancer Cell.21:92-104,2012中公开的CREPT。
在一些实施方案中,CREPT基因的序列记载在NCBI数据库(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/),识别号为:Gene ID:58490。在一些实施方案中,CREPT基因的表达产物(例如,成熟CREPT蛋白)的序列记载在数据库NCBI(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/),识别号为:NP_067038.1。
在一些实施方案中,成熟CREPT蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO:9所示。
在一些实施方案中,根据本发明的特异性结合CREPT的抗体或其抗原结合片段的重链可变区包含:
SEQ ID NO:3所示的HCDR1、
SEQ ID NO:4所示的HCDR2和
SEQ ID NO:5所示的HCDR3。
在一些实施方案中,根据本发明的特异性结合CREPT的抗体或其抗原结合片段的轻链可变区包含:
SEQ ID NO:6所示的LCDR1、
SEQ ID NO:7所示的LCDR2和
SEQ ID NO:8所示的LCDR3。
在一些实施方案中,根据本发明的特异性结合CREPT的抗体或其抗原结合片段包含:
SEQ ID NO:3所示的HCDR1、
SEQ ID NO:4所示的HCDR2和
SEQ ID NO:5所示的HCDR3;以及
SEQ ID NO:6所示的LCDR1、
SEQ ID NO:7所示的LCDR2和
SEQ ID NO:8所示的LCDR3。
在一些实施方案中,根据本发明的特异性结合CREPT的抗体或其抗原结合片段,其包含SEQ ID NO:1所示的重链可变区、或与其具有至少70%,75%,80%,85%,90%,95%或99%同一性的重链可变区。
示例性地,至少90%同一性可为至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%的同一性。
在一些实施方案中,根据本发明的特异性结合CREPT的抗体或其抗原结合片段,其包含SEQ ID NO:2所示的轻链可变区、或与其具有至少70%,75%,80%,85%,90%,95%或99%同一性的轻链可变区。
在一些具体的实施方案中,根据本发明的特异性结合CREPT的抗体或其抗原结合片段,其包含SEQ ID NO:1所示的重链可变区、或与其具有至少70%,75%,80%,85%,90%,95%或99%同一性的重链可变区,和SEQ ID NO:2所示的轻链可变区、或与其具有至少70%,75%,80%,85%,90%,95%或99%同一性的轻链可变区。
在一个具体的实施方案中,根据本发明的特异性结合CREPT的抗体或其抗原结合片段,其包含SEQ ID NO:1所示的重链可变区,和SEQ ID NO:2所示的轻链可变区。
在一些实施方案中,根据本发明的特异性结合CREPT的抗体或其抗原结合片段,可进一步包含人源或鼠源κ、λ链或其变体的轻链恒定区,或进一步包含人源或鼠源IgG1、IgG2、IgG3、IgG4或其变体的重链恒定区。
在一些实施方案中,根据本发明的特异性结合CREPT的抗体或其抗原结合片段包括鼠源抗体或其片段、嵌合抗体或其片段、人源化抗体或其片段。
在一些实施方案中,根据本发明的特异性结合CREPT的抗体或其抗原结合片段选自全长抗体、Fab片段、Fab’片段、F(ab’)2片段、Fv片段、单链抗体、多特异性抗体中的至少一种。
根据本发明的一些实施方案,提供了一种融合抗体,其包含根据本发明的特异性结合CREPT的抗体或其抗原结合片段。
<杂交瘤细胞株及其分泌的抗体>
根据本发明的一些实施方案,提供一种杂交瘤细胞株CREPT-Ab-6H2,所述杂交瘤细胞株CREPT-Ab-6H2的分类命名为小鼠杂交瘤细胞,其保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(China General Microbiological Culture Collection Center,CGMCC),保藏地址为:北京市朝阳区北辰西路1号院3号,中国科学院微生物研究所,保藏日期为:2023年12月20日,保藏号为:CGMCC No.45759。
根据本发明的一些实施方案,提供一种单克隆抗体,其由上述的杂交瘤细胞株分泌产生。
<生物材料>
根据本发明的一些实施方案,提供了一种生物材料,所述生物材料包括如下B1)~B8)中的至少一种:
B1)编码根据本发明的特异性结合CREPT的抗体或其抗原结合片段的多核苷酸;
B2)含有B1)中所述多核苷酸的表达盒;
B3)含有B1)中所述多核苷酸的载体;
B4)含有B2)中所述表达盒的载体;
B5)含有B1)中所述多核苷酸的宿主细胞;
B6)含有B2)中所述表达盒的宿主细胞;
B7)含有B3)中所述重组载体的宿主细胞;
B8)含有B4)中所述重组载体的宿主细胞。
本发明的多核苷酸可以是DNA形式或RNA形式。DNA形式包括cDNA、基因组DNA或人工合成的DNA。DNA可以是单链的或是双链的。DNA可以是编码链或非编码链。
编码本发明的特异性结合CREPT的抗体或其抗原结合片段的多核苷酸包括:只编码特异性结合CREPT的抗体或其抗原结合片段的编码序列;特异性结合CREPT的抗体或其抗原结合片段的编码序列和各种附加编码序列;特异性结合CREPT的抗体或其抗原结合片段的编码序列(和任选的附加编码序列)以及非编码序列。
术语“编码特异性结合CREPT的抗体或其抗原结合片段的多核苷酸”可以是包括编码此特异性结合CREPT的抗体或其抗原结合片段的多核苷酸,也可以是还包括附加编码和/或非编码序列的多核苷酸。
本发明还涉及与上述的序列杂交且两个序列之间具有至少50%,较佳地至少70%,更佳地至少80%同一性的多核苷酸。本发明特别涉及在严格条件下与本发明所述多核苷酸可杂交的多核苷酸。在本发明中,“严格条件”是指:(1)在较低离子强度和较高温度下的杂交和洗脱,如0.2×SSC,0.1%SDS,60℃;或(2)杂交时加有变性剂,如50%(v/v)甲酰胺,0.1%小牛血清/0.1%Ficoll,42℃等;或(3)仅在两条序列之间的同一性至少在90%以上,更好是95%以上时才发生杂交。并且,可杂交的多核苷酸编码的多肽与特异性结合CREPT的抗体或其抗原结合片段有相同的生物学功能和活性。
在一些实施方案中,所述的宿主细胞可以为微生物。
在一些具体的实施方案中,所述的宿主细胞为细菌;示例性地,所述的宿主细胞为大肠杆菌,但不限于此。
在另一个具体的实施方案中,所述的宿主细胞为酵母菌,示例性地,所述的宿主细胞为毕赤酵母,但不限于此。
在另一些实施方案中,所述的宿主细胞为哺乳动物细胞,示例性地,所述的宿主细胞为哺乳动物细胞系,例如HEK293T细胞、HEK293F细胞、HEK293细胞、CHO细胞,但不限于此。
<检测或诊断试剂盒>
根据本发明的一些实施方案,提供了一种检测或诊断试剂盒,其含有根据本发明的特异性结合CREPT的抗体或其抗原结合片段、或根据本发明的生物材料。
在一些实施方案中,所述检测或诊断试剂盒可以用于检测样本中的CREPT蛋白(是否存在CREPT蛋白或CREPT蛋白的含量),或者可以用于诊断或辅助诊断受试者是否患有与CREPT相关的疾病。
在一些具体的实施方案中,所述样本可以是细胞或组织,优选地,所述样本是肿瘤细胞或肿瘤组织,例如癌细胞或癌组织。
在一些具体的实施方案中,与CREPT相关的疾病包括癌症,例如:肺癌、肝癌、宫颈癌、肠癌、前列腺癌、乳腺癌、胃癌、子宫内膜癌、胰腺癌等(Lu D,Wu Y,Wang Y,et al.CREPTaccelerates tumorigenesis by regulating the transcription of cell-cycle-related genes.Cancer Cell.2012;21(1):92-104.doi:10.1016/j.ccr.2011.12.016;MaD,Zou Y,Chu Y,et al.A cell-permeable peptide-based PROTAC against theoncoprotein CREPT proficiently inhibits pancreatic cancer.Theranostics.2020;10(8):3708-3721.Published 2020Feb 19.doi:10.7150/thno.41677)。
<检测或诊断用途>
根据本发明的一些实施方案,提供了根据本发明的特异性结合CREPT的抗体或其抗原结合片段、或根据本发明的生物材料的以下任一项用途:
(i)在制备用于检测样本中CREPT蛋白(是否存在CREPT蛋白或CREPT蛋白的含量)的试剂或试剂盒中的用途;
(ii)在制备用于诊断或辅助诊断受试者是否患有与CREPT相关的疾病的试剂或试剂盒中的用途。
在一些具体的实施方案中,所述样本可以是细胞或组织,优选地,所述样本是肿瘤细胞或肿瘤组织,例如癌细胞或癌组织。
在一些具体的实施方案中,与CREPT相关的疾病包括癌症,例如:肺癌、肝癌、宫颈癌、肠癌、前列腺癌、乳腺癌、胃癌、子宫内膜癌、胰腺癌等。
<检测或诊断方法>
根据本发明的一些实施方案,提供了根据本发明的特异性结合CREPT的抗体或其抗原结合片段或根据本发明的生物材料,其用于检测样本中CREPT蛋白(是否存在CREPT蛋白或CREPT蛋白的含量),或者其用于诊断或辅助诊断受试者是否患有与CREPT相关的疾病。
根据本发明的一些实施方案,提供了检测样本中CREPT蛋白(是否存在CREPT蛋白或CREPT蛋白的含量),或者诊断或辅助诊断受试者是否患有与CREPT相关的疾病的方法,其包括将待测样本与根据本发明的特异性结合CREPT的抗体或其抗原结合片段或根据本发明的生物材料接触的步骤。
在一些具体的实施方案中,本发明提供了一种检测样本中是否存在CREPT蛋白或其含量的方法,其包括将所述样本与本发明所述的特异性结合CREPT的抗体或其抗原结合片段或本发明所述的生物材料接触的步骤。在一些具体的实施方案中,所述方法还包括检测是否形成了抗原抗体复合物或形成的抗原抗体复合物的量的步骤。在一些实施方案中,所述方法是非疾病治疗和诊断方法。
在一些具体的实施方案中,所述样本可以是细胞或组织,优选地,所述样本是肿瘤细胞或肿瘤组织,例如癌细胞或癌组织。
在一些具体的实施方案中,与CREPT相关的疾病包括癌症,例如:肺癌、肝癌、宫颈癌、肠癌、前列腺癌、乳腺癌、胃癌、子宫内膜癌、胰腺癌等。
实施例
以下的实施例便于更好地理解本发明,但并不限定本发明。下述实施例中的实验方法,如无特殊说明,均为常规方法。下述实施例中所用的试验材料,如无特殊说明,均为自常规生化试剂商店购买得到的。以下实施例中的定量试验,均设置三次重复实验,结果取平均值。同源重组试剂盒来自诺唯赞Version 22.1
实施例1、抗原克隆表达
本发明所用抗原用领域周知的原核表达蛋白方法构建,简要地,将原核表达载体pGEX-5X-2/CREPT转化大肠杆菌(E.coli)BL21(购自clontech),得到重组菌。将重组菌在LB培养基中37℃、200rpm培养12小时,然后以1%(体积比)的接种量接种新的LB培养基,培养至OD600约0.4时加入IPTG(使其初始浓度为0.2mM),自加入IPTG开始计时,16℃培养12小时。将培养体系4℃,6000rpm离心10min,收集菌体沉淀,然后用10倍菌体体积的PBS缓冲液(pH7.5、0.1M)重悬并超声破碎(每超声3s停3s,共进行10min;超声功率是10瓦特),然后4℃、10000rpm离心10min,收集上清。将上清与GST beads(购自GE公司)混匀,在4℃结合旋转3小时,然后用洗脱液进行洗脱(溶剂为pH8.8、50mM的Tris-cl缓冲液,溶质还原性GST,其浓度为10mM)。
人源CREPT抗原的氨基酸序列(SEQ ID NO:9):
MSSFSESALEKKLSELSNSQQSVQTLSLWLIHHRKHAGPIVSVWHRELRKAKSNRKLTF
LYLANDVIQNSKRKGPEFTREFESVLVDAFSHVAREADEGCKKPLERLLNIWQERSVY
GGEFIQQLKLSMEDSKSPPPKATEEKKSLKRTFQQIQEEEDDDYPGSYSPQDPSAGPLLT
EELIKALQDLENAASGDATVRQKIASLPQEVQDVSLLEKITDKEAAERLSKTVDEACLL
LAEYNGRLAAELEDRRQLARMLVEYTQNQKDVLSEKEKKLEEYKQKLARVTQVRKE
LKSHIQSLPDLSLLPNVTGGLAPLPSAGDLFSTD
编码CREPT抗原的核苷酸序列(SEQ ID NO:10):
ATGTCCTCCTTCTCTGAGTCGGCGCTGGAGAAGAAGCTCTCGGAGCTGAGCAACTC
TCAGCAGAGCGTGCAGACCCTGTCCCTTTGGCTCATCCACCACCGCAAGCACGCGG
GACCCATCGTCTCCGTGTGGCACCGCGAGCTCCGCAAAGCCAAATCAAATAGAAAG
CTTACTTTTCTGTATTTAGCGAATGATGTCATCCAAAACAGTAAAAGGAAAGGACCT
GAATTCACTAGAGAATTTGAATCTGTCCTTGTGGATGCTTTTTCTCATGTTGCCAGAG
AGGCAGATGAAGGCTGTAAAAAACCTTTAGAAAGATTGCTGAACATCTGGCAAGA
ACGAAGTGTGTATGGCGGCGAGTTCATACAGCAGCTGAAGCTGTCTATGGAGGACT
CCAAGAGCCCTCCCCCCAAAGCAACAGAAGAGAAGAAATCTCTGAAACGAACTTT
TCAGCAAATTCAGGAGGAGGAGGATGACGACTACCCTGGCAGCTACTCTCCTCAGG
ATCCTTCTGCAGGACCCCTCTTGACTGAGGAACTAATCAAAGCTTTGCAGGATCTGG
AAAATGCCGCATCAGGGGATGCTACTGTCCGACAGAAAATTGCTTCTCTGCCCCAG
GAAGTGCAAGATGTTTCTCTATTGGAAAAAATAACAGACAAAGAGGCAGCTGAAC
GTCTTTCAAAAACAGTAGATGAAGCATGTCTGTTACTAGCAGAATATAACGGGCGCC
TGGCAGCAGAACTGGAGGACCGTCGCCAGCTGGCTCGGATGTTGGTGGAGTATACC
CAGAATCAGAAAGATGTTTTGTCGGAGAAGGAGAAAAAACTAGAGGAATACAAAC
AGAAGCTTGCACGAGTAACCCAGGTCCGCAAGGAACTGAAATCCCATATTCAGAGC
TTGCCAGACCTCTCACTGCTGCCCAACGTCACAGGGGGCTTAGCCCCCCTGCCCTC
TGCTGGGGACCTGTTTTCAACTGACTAG
GST-CREPT融合蛋白的氨基酸序列(SEQ ID NO:11):MSPILGYWKIKGLVQPTRLLLEYLEEKYEEHLYERDEGDKWRNKKFELGLEFPNLPYYIDGDVKLTQSMAIIRYIADKHNMLGGCPKERAEISMLEGAVLDIRYGVSRIAYSKDFETLKVDFLSKLPEMLKMFEDRLCHKTYLNGDHVTHPDFMLYDALDVVLYMDPMCLDAFPKLVCFKKRIEAIPQIDKYLKSSKYIAWPLQGWQATFGGGDHPPKMSSFSESALEKKLSELSNSQQSVQTLSLWLIHHRKHAGPIVSVWHRELRKAKSNRKLTFLYLANDVIQNSKRKGPEFTREFESVLVDAFSHVAREADEGCKKPLERLLNIWQERSVYGGEFIQQLKLSMEDSKSPPPKATEEKKSLKRTFQQIQEEEDDDYPGSYSPQDPSAGPLLTEELIKALQDLENAASGDATVRQKIASLPQEVQDVSLLEKITDKEAAERLSKTVDEACLLLAEYNGRLAAELEDRRQLARMLVEYTQNQKDVLSEKEKKLEEYKQKLARVTQVRKELKSHIQSLPDLSLLPNVTGGLAPLPSAGDLFSTD
编码GST-CREPT融合蛋白的核苷酸序列(SEQ ID NO:12):ATGTCCCCTATACTAGGTTATTGGAAAATTAAGGGCCTTGTGCAACCCACTCGACTTCTTTTGGAATATCTTGAAGAAAAATATGAAGAGCATTTGTATGAGCGCGATGAAGGTGATAAATGGCGAAACAAAAAGTTTGAATTGGGTTTGGAGTTTCCCAATCTTCCTTATTATATTGATGGTGATGTTAAATTAACACAGTCTATGGCCATCATACGTTATATAGCTGACAAGCACAACATGTTGGGTGGTTGTCCAAAAGAGCGTGCAGAGATTTCAATGCTTGAAGGAGCGGTTTTGGATATTAGATACGGTGTTTCGAGAATTGCATATAGTAAAGACTTTGAAACTCTCAAAGTTGATTTTCTTAGCAAGCTACCTGAAATGCTGAAAATGTTCGAAGATCGTTTATGTCATAAAACATATTTAAATGGTGATCATGTAACCCATCCTGACTTCATGTTGTATGACGCTCTTGATGTTGTTTTATACATGGACCCAATGTGCCTGGATGCGTTCCCAAAATTAGTTTGTTTTAAAAAACGTATTGAAGCTATCCCACAAATTGATAAGTACTTGAAATCCAGCAAGTATATAGCATGGCCTTTGCAGGGCTGGCAAGCCACGTTTGGTGGTGGCGACCATCCTCCAAAAATGTCCTCCTTCTCTGAGTCGGCGCTGGAGAAGAAGCTCTCGGAGCTGAGCAACTCTCAGCAGAGCGTGCAGACCCTGTCCCTTTGGCTCATCCACCACCGCAAGCACGCGGGACCCATCGTCTCCGTGTGGCACCGCGAGCTCCGCAAAGCCAAATCAAATAGAAAGCTTACTTTTCTGTATTTAGCGAATGATGTCATCCAAAACAGTAAAAGGAAAGGACCTGAATTCACTAGAGAATTTGAATCTGTCCTTGTGGATGCTTTTTCTCATGTTGCCAGAGAGGCAGATGAAGGCTGTAAAAAACCTTTAGAAAGATTGCTGAACATCTGGCAAGAACGAAGTGTGTATGGCGGCGAGTTCATACAGCAGCTGAAGCTGTCTATGGAGGACTCCAAGAGCCCTCCCCCCAAAGCAACAGAAGAGAAGAAATCTCTGAAACGAACTTTTCAGCAAATTCAGGAGGAGGAGGATGACGACTACCCTGGCAGCTACTCTCCTCAGGATCCTTCTGCAGGACCCCTCTTGACTGAGGAACTAATCAAAGCTTTGCAGGATCTGGAAAATGCCGCATCAGGGGATGCTACTGTCCGACAGAAAATTGCTTCTCTGCCCCAGGAAGTGCAAGATGTTTCTCTATTGGAAAAAATAACAGACAAAGAGGCAGCTGAACGTCTTTCAAAAACAGTAGATGAAGCATGTCTGTTACTAGCAGAATATAACGGGCGCCTGGCAGCAGAACTGGAGGACCGTCGCCAGCTGGCTCGGATGTTGGTGGAGTATACCCAGAATCAGAAAGATGTTTTGTCGGAGAAGGAGAAAAAACTAGAGGAATACAAACAGAAGCTTGCACGAGTAACCCAGGTCCGCAAGGAACTGAAATCCCATATTCAGAGCTTGCCAGACCTCTCACTGCTGCCCAACGTCACAGGGGGCTTAGCCCCCCTGCCCTCTGCTGGGGACCTGTTTTCAACTGACTAG
实施例2、抗人CREPT的小鼠单克隆抗体细胞株及抗体的产生
本发明通过免疫小鼠,脾细胞融合、杂交瘤筛选方法得到小鼠来源抗人CREPT单克隆细胞株。该方法为本领域熟知。例如,可以参考Zhang C.Hybridoma technology for thegeneration of monoclonal antibodies.Methods Mol Biol.2012;901:117-135.doi:10.1007/978-1-61779-931-0_7中记载的制备方法。
具体地,以GST-CREPT融合蛋白为抗原,免疫5周龄雌性BALB/C小鼠(维通利华公司,许可证号:SCXK(京)2002-0003)。每只小鼠免疫5μg抗原,在四肢的淋巴结附近皮下多点注射,注射体积为0.3ml/只。每间隔7天免疫1次,第1次与完全福氏佐剂混合免疫,第2次和第3次与不完全福氏佐剂混合免疫。第三次免疫后,眼眶采血并分离血清,通过间接ELISA测定抗体效价。测定抗体效价(方法同实施例3)。选择血清抗体效价达到1×105的小鼠,于融合前3天加强免疫1次。
取对数生长期的小鼠骨髓瘤Sp2/0细胞和免疫小鼠的脾细胞按常规PEG方法融合,有限稀释法克隆细胞,间接ELISA筛选特异性抗体,克隆化后的细胞株经传代确定为稳定的细胞株后,液氮保存,将其中一株命名为CREPT-Ab-6H2。
Balb/c小鼠(维通利华公司)腹腔注射灭菌石蜡油(0.4mL/只),3天后腹腔注射杂交瘤细胞株(5×105个/只),7天后采集腹水,即为单克隆抗体,-80℃保存备用。也可以采用增量培养法制备单克隆抗体:将杂交瘤细胞株置于细胞培养基中,37℃培养3-4天,得到的培养液即为单克隆抗体溶液(-80℃保存)。
实施例3、抗体效价测定
通过ELISA对CREPT-Ab-6H2杂交瘤细胞的抗体效价进行检测。抗体效价测定的具体步骤如下(均采用pH 9.5、0.1M的PBS缓冲液):
(1)采用GST-CREPT融合蛋白溶液(采用PBS缓冲液调节浓度)进行包被,100μL/孔,包被浓度为1μg/mL,4℃孵育16小时,封闭并洗板。
(2)每孔加入100μL血清或其稀释液(采用PBS缓冲液进行梯度稀释),设置只加入PBS缓冲液的孔作为阴性对照,室温孵育2h,洗板。
(3)每孔加入50μL酶标二抗(辣根过氧化物酶标记的羊抗鼠IgG),室温避光孵育2h,洗板。
(4)每孔加入50μL TMB(Thermofisher,WP20004)显色液,避光显色5min。
(5)每孔加入100μL 2M硫酸中止反应;读OD450值。以检测孔与阴性对照孔OD值的比值大于2.1为阳性结果。
结果表明,CREPT-Ab-6H2杂交瘤细胞的抗体效价可以达到1:25600(图1)。本发明提供的抗CREPT抗体为CREPT-Ab-6H2杂交瘤细胞(简称6H2)分泌的单克隆抗体,其为可以用于鉴定肿瘤细胞或肿瘤组织的CREPT抗体,也即特异性结合CREPT的抗体,简称抗CREPT抗体或6H2抗体。
杂交瘤细胞株CREPT-Ab-6H2的分类命名为小鼠杂交瘤细胞;保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(China General Microbiological CultureCollection Center,CGMCC),保藏地址为:北京市朝阳区北辰西路1号院3号,中国科学院微生物研究所,保藏日期为:2023年12月20日,保藏号为:CGMCC No.45759。
实施例4、抗CREPT抗体序列克隆
将实施例3中得到的活性好的单细胞株CREPT-Ab-6H2杂交瘤细胞进行cDNA序列克隆,然后重组表达出单克隆抗体并进行各项活性检测。
抗CREPT抗体序列的测定包括以下步骤:
(1)取1×106 6H2杂交瘤细胞,加入1mL Trizol直接裂解细胞,室温裂解10分钟。
(2)加入200μL氯仿,上下颠倒混匀,室温静置15分钟。4℃,12000rpm,离心10分钟后可以看到分层。
(3)将上层水相转移至无RNAase的离心管中,加入500μL异丙醇,充分混匀,冰上放置10分钟。
(4)10分钟后,4℃,12000rpm,离心10分钟,RNA沉于管底。弃掉上清,用75%乙醇洗两次,晾干后用无RNAase的水溶解,检测RNA浓度和质量。
(5)通过反转录试剂盒(诺唯赞HiScript IIQ RT SuperMix for Gpcr,货号R222-01)对RNA进行反转录,得到cDNA。
(6)以步骤(5)的cDNA为模板,用如下所示F1和R1,F2和R2组成的引物对分别对6H2的重链可变区和轻链可变区进行PCR扩增,得到PCR扩增产物。
F1:GAGGTGCAGCTGGTGGAGTC(SEQ ID NO:13)
R1:CTGCAGAGACAGTGACCA(SEQ ID NO:14)
F2:GACATTGTGATGTCACAG(SEQ ID NO:15)
R2:GTTTGATTTCCAGCTTGG(SEQ ID NO:16)
PCR反应条件:95℃变性5min;94℃变性30s、58℃退火30s、72℃延伸30s、进行30个循环;72℃延伸10min。
(7)将PCR产物进行纯化后,测序。
经上述测序,本发明小鼠杂交瘤细胞单克隆抗体6H2抗体的序列如下:
重链可变区的氨基酸序列(SEQ ID NO:1):
EVQLVESGGGLVQPGGSRKLSCAASGFTFSSFGMHWVRQAPEKGLEWVAYISSGRSTIYYADTVKGRFTISRDNPKNTLFLQMTSLRSEDTAMYYCARGNYGPPFAYWGQGTLVTVSA
其中,下划线部分代表CDR区。
轻链可变区的氨基酸序列(SEQ ID NO:2):
DIVMSQSPASLAVSLGQRATISYRASKSVSTSGYSYMHWNQQKPGQPPRLLIYLVSNLESGVPARFSGSGSGTDFTLNIHPVEEEDAATYYCQHIRELTRSEGGPSWKSNKIY
其中,下划线部分代表CDR区。
抗人CREPT抗体的VH/VL CDR的氨基酸残基由Kabat编号系统确定并注释。
本发明中抗人CREPT抗体的CDR序列如下:
重链CDR1(HCDR1) SFGMH SEQ ID NO:3
重链CDR1(HCDR2) YISSGRSTIYYADTVKG SEQ ID NO:4
重链CDR1(HCDR3) GNYGPPFAY SEQ ID NO:5
轻链CDR1(LCDR1) RASKSVSTSGYSYMH SEQ ID NO:6
轻链CDR2(LCDR2) LVSNLES SEQ ID NO:7
轻链CDR3(LCDR3) QHIRELTRS SEQ ID NO:8
实施例5、抗CREPT抗体特异性测定
一、真核表达载体的构建
1.真核表达载体pcDNA3.1-CREPT-Myc的构建
(1)合成SEQ ID NO:10所示的双链DNA。
(2)以步骤(1)的双链DNA为模板,用如下所示F1和R1组成的引物对进行PCR扩增,得到PCR扩增产物。
F1:CTAGAGCTTGGTACCATGTCCTCCTTCTCT(SEQ ID NO:17)
R1:GTGCTGGATGATATCCGTCAGTTGAAAACAGG(SEQ ID NO:18)
PCR反应条件:95℃变性5min;94℃变性30s、60℃退火30s、72℃延伸60s、进行30个循环;72℃延伸10min
(3)用天根胶回收试剂盒回收PCR产物。
(4)用限制性内切酶KpnI和EcoRV酶切质粒pcDNA3.1-Myc,回收载体骨架(约5.5kb)。
(5)将步骤(3)的回收产物和步骤(4)的载体骨架通过同源重组连接,得到真核表达载体pcDNA3.1-CREPT-Myc。根据测序结果,对真核表达载体pcDNA3.1-CREPT-Myc进行结构描述如下:在质粒pcDNA3.1-Myc的KpnI和EcoRV酶切位点之间插入了SEQ ID NO:10的DNA片段,SEQ ID NO:10和载体骨架上的Myc标签编码序列形成融合基因,表达CREPT-Myc融合蛋白。
CREPT-Myc融合蛋白的氨基酸序列(SEQ ID NO:27):
MSSFSESALEKKLSELSNSQQSVQTLSLWLIHHRKHAGPIVSVWHRELRKAKSNRKLTF
LYLANDVIQNSKRKGPEFTREFESVLVDAFSHVAREADEGCKKPLERLLNIWQERSVY
GGEFIQQLKLSMEDSKSPPPKATEEKKSLKRTFQQIQEEEDDDYPGSYSPQDPSAGPLLT
EELIKALQDLENAASGDATVRQKIASLPQEVQDVSLLEKITDKEAAERLSKTVDEACLL
LAEYNGRLAAELEDRRQLARMLVEYTQNQKDVLSEKEKKLEEYKQKLARVTQVRKE
LKSHIQSLPDLSLLPNVTGGLAPLPSAGDLFSTDEQKLISEEDL
2.真核表达载体pcDNA3.1-p15RS-Flag的构建
(1)合成SEQ ID NO:28所示的双链DNA。
(2)以步骤(1)的双链DNA为模板,用如下所示F1和R1组成的引物对进行PCR扩增,得到PCR扩增产物。
F1:TATAGATATATGTCAGCCTTCTCTG(SEQ ID NO:19)
R1:TATACTCGAGTCAATCTTCACTGTAG(SEQ ID NO:20)
PCR反应条件:95℃变性5min;94℃变性30s、58℃退火30s、72℃延伸60s、进行30个循环;72℃延伸10min。
(3)用限制性内切酶EcoRV和Xho I酶切步骤(2)的PCR扩增产物,回收酶切产物。
(4)用限制性内切酶EcoRV和Xho I酶切质粒pcDNA3.1-Flag,回收载体骨架(约5.5kb)。
(5)将步骤(3)的回收产物和步骤(4)的载体骨架连接,得到真核表达载体pcDNA3.1-p15RS-Flag。根据测序结果,对真核表达载体pcDNA3.1-p15RS-Flag进行结构描述如下:在质粒pcDNA3.1-Flag的EcoRV和Xho I酶切位点之间插入了SEQ ID NO:28所示的DNA片段,SEQ ID NO:28所示DNA和载体骨架上的Flag标签编码序列形成融合基因,表达p15RS-Flag融合蛋白。
编码p15RS抗原的核苷酸序列(SEQ ID NO:28):
ATGTCAGCCTTCTCTGAGGCGGCGCTGGAGAAGAAGCTGTCGGAGTTGAGCAACT
CGCAGCAGAGCGTGCAGACCTTGTCCCTGTGGCTCATTCACCACCGTAAACACTCG
CGTCCCATCGTCACCGTGTGGGAGCGGGAGCTGCGGAAAGCCAAACCAAACAGGA
AGCTTACTTTTCTCTACCTAGCCAATGATGTCATACAGAACAGCAAGAGGAAGGGG
CCAGAGTTTACAAAAGATTTTGCACCAGTTATAGTGGAGGCTTTTAAGCATGTTTCA
AGTGAAACTGATGAAAGTTGTAAGAAGCACCTTGGAAGAGTGTTATCTATTTGGGA
AGAAAGGTCTGTTTATGAAAATGATGTATTAGAACAACTTAAACAAGCTCTGTATGG
TGATAAGAAGCCTAGGAAGCGAACTTATGAACAGATAAAGGTGGATGAAAATGAAA
ACTGTTCCTCTCTGGGATCTCCAAGTGAACCACCACAGACTCTAGATCTCGTTAGAG
CATTACAAGATCTGGAAAATGCAGCCTCAGGTGATGCAGCAGTTCATCAGAGGATA
GCTTCTTTACCTGTTGAAGTCCAAGAAGTATCTCTATTAGATAAAATAACAGATAAA
GAATCTGGAGAAAGGCTTTCCAAAATGGTAGAGGATGCGTGTATGTTGCTGGCAGA
TTACAATGGCAGATTGGCGGCAGAAATAGATGATAGAAAGCAACTCACTCGAATGTT
AGCAGATTTTCTTCGTTGTCAAAAGGAAGCCCTTGCAGAGAAAGAGCATAAATTGG
AAGAGTACAAGCGCAAGCTAGCCAGAGTTTCCCTGGTGCGCAAAGAACTCAGGTC
CCGGATCCAGAGCCTGCCAGACTTATCTCGATTGCCCAATGTCACTGGCAGCCACAT
GCACCTGCCCTTTGCGGGAGACATCTACAGTGAAGATTGA
p15RS-Flag融合蛋白的氨基酸序列(SEQ ID NO:29):
MSAFSEAALEKKLSELSNSQQSVQTLSLWLIHHRKHSRPIVTVWERELRKAKPNRKLTF
LYLANDVIQNSKRKGPEFTKDFAPVIVEAFKHVSSETDESCKKHLGRVLSIWEERSVYE
NDVLEQLKQALYGDKKPRKRTYEQIKVDENENCSSLGSPSEPPQTLDLVRALQDLENA
ASGDAAVHQRIASLPVEVQEVSLLDKITDKESGERLSKMVEDACMLLADYNGRLAAEI
DDRKQLTRMLADFLRCQKEALAEKEHKLEEYKRKLARVSLVRKELRSRIQSLPDLSRL
PNVTGSHMHLPFAGDIYSEDDYKDHDGDYKDHDIDYKDDDDK
3.真核表达载体pcDNA3.1-CREPT CID-Myc的构建
(1)以SEQ ID NO:10合成的双链DNA为模板,用如下所示F1和R1组成的引物对进行PCR扩增,得到PCR扩增产物。
F1:CTAGAGCTTGGTACCATGTCCTCCTTCTCT(SEQ ID NO:17)
R1:GTGCTGGATGATATCAGGGCTCTTGGAGTCC(SEQ ID NO:21)
PCR反应条件:95℃变性5min;94℃变性30s、60℃退火30s、72℃延伸60s、进行30个循环;72℃延伸10min。
(2)用天根胶回收试剂盒回收PCR产物。
(3)用限制性内切酶KpnI和EcoRV酶切质粒pcDNA3.1-Myc,回收载体骨架(约5.5kb)。
(4)将步骤(2)的回收产物和步骤(3)的载体骨架通过同源重组连接,得到真核表达载体pcDNA3.1-CREPT CID-Myc。根据测序结果,对真核表达载体pcDNA3.1-CREPT CID-Myc进行结构描述如下:在质粒pcDNA3.1-Myc的KpnI和EcoRV酶切位点之间插入了CREPTCID的DNA片段,CREPT CID的DNA片段和载体骨架上的Myc标签编码序列形成融合基因,表达CREPT CID-Myc融合蛋白。
CREPT CID-Myc融合蛋白的氨基酸序列(SEQ ID NO:30):
MSSFSESALEKKLSELSNSQQSVQTLSLWLIHHRKHAGPIVSVWHRELRKAKSNRKLTF
LYLANDVIQNSKRKGPEFTREFESVLVDAFSHVAREADEGCKKPLERLLNIWQERSVY
GGEFIQQLKLSMEDSKSPEQKLISEEDL
4.真核表达载体pcDNA3.1-CREPT CCT-Myc的构建
(1)以SEQ ID NO:10合成的双链DNA为模板,用如下所示F1和R1组成的引物对进行PCR扩增,得到PCR扩增产物。
F1:CTAGAGCTTGGTACCCCCCCCAAAGCAACA(SEQ ID NO:22)
R1:GTGCTGGATGATATCCGTCAGTTGAAAACAGG(SEQ ID NO:18)
PCR反应条件:95℃变性5min;94℃变性30s、60℃退火30s、72℃延伸60s、进行30个循环;72℃延伸10min。
(2)用天根胶回收试剂盒回收PCR产物。
(3)用限制性内切酶KpnI和EcoRV酶切质粒pcDNA3.1-Myc,回收载体骨架(约5.5kb)。
(4)将步骤(2)的回收产物和步骤(3)的载体骨架通过同源重组连接,得到真核表达载体pcDNA3.1-CREPT CCT-Myc。根据测序结果,对真核表达载体pcDNA3.1-CREPT CCT-Myc进行结构描述如下:在质粒pcDNA3.1-Myc的KpnI和EcoRV酶切位点之间插入了CREPTCCT的DNA片段,CREPT CCT的DNA片段和载体骨架上的Myc标签编码序列形成融合基因,表达CREPT CCT-Myc融合蛋白。
CREPT CCT-Myc融合蛋白的氨基酸序列(SEQ ID NO:31):
PPKATEEKKSLKRTFQQIQEEEDDDYPGSYSPQDPSAGPLLTEELIKALQDLENAASGDA
TVRQKIASLPQEVQDVSLLEKITDKEAAERLSKTVDEACLLLAEYNGRLAAELEDRRQ
LARMLVEYTQNQKDVLSEKEKKLEEYKQKLARVTQVRKELKSHIQSLPDLSLLPNVTG
GLAPLPSAGDLFSTDEQKLISEEDL
5.真核表达载体pcDNA3.1-PPC-HA的构建
(1)合成SEQ ID NO:32所示的双链DNA。
(2)以步骤(1)的双链DNA为模板,用如下所示F1和R1组成的引物对进行PCR扩增,得到PCR扩增产物。
F1:CTAGAGCTTGGTACCATGTCAGCCTTCTCTG(SEQ ID NO:23)
R1:GTGCTGGATGATATCCGTCAGTTGAAAACAGG(SEQ ID NO:18)
PCR反应条件:95℃变性5min;94℃变性30s、60℃退火30s、72℃延伸60s、进行30个循环;72℃延伸10min。
(3)用天根胶回收试剂盒回收PCR产物。
(4)用限制性内切酶KpnI和EcoRV酶切质粒pcDNA3.1-HA,回收载体骨架(约5.5kb)。
(5)将步骤(3)的回收产物和步骤(4)的载体骨架通过同源重组连接,得到真核表达载体pcDNA3.1-PPC-HA。根据测序结果,对真核表达载体pcDNA3.1-PPC-HA进行结构描述如下:在质粒pcDNA3.1-HA的KpnI和EcoRV酶切位点之间插入了p15RS CID和linker区域以及CREPT CCT区域的DNA片段,PPC的DNA片段和载体骨架上的Myc标签编码序列形成融合基因,表达PPC-HA融合蛋白。
编码PPC的核苷酸序列(SEQ ID NO:32):
ATGTCAGCCTTCTCTGAGGCGGCGCTGGAGAAGAAGCTGTCGGAGTTGAGCAACT
CGCAGCAGAGCGTGCAGACCTTGTCCCTGTGGCTCATTCACCACCGTAAACACTCG
CGTCCCATCGTCACCGTGTGGGAGCGGGAGCTGCGGAAAGCCAAACCAAACAGGA
AGCTTACTTTTCTCTACCTAGCCAATGATGTCATACAGAACAGCAAGAGGAAGGGG
CCAGAGTTTACAAAAGATTTTGCACCAGTTATAGTGGAGGCTTTTAAGCATGTTTCA
AGTGAAACTGATGAAAGTTGTAAGAAGCACCTTGGAAGAGTGTTATCTATTTGGGA
AGAAAGGTCTGTTTATGAAAATGATGTATTAGAACAACTTAAACAAGCTCTGTATGG
TGATAAGAAGCCTAGGAAGCGAACTTATGAACAGATAAAGGTGGATGAAAATGAAA
ACTGTTCCTCTCTGGGATCTCCAAGTGAACCACCACAGACTGAGGAACTAATCAAA
GCTTTGCAGGATCTGGAAAATGCCGCATCAGGGGATGCTACTGTCCGACAGAAAAT
TGCTTCTCTGCCCCAGGAAGTGCAAGATGTTTCTCTATTGGAAAAAATAACAGACA
AAGAGGCAGCTGAACGTCTTTCAAAAACAGTAGATGAAGCATGTCTGTTACTAGCA
GAATATAACGGGCGCCTGGCAGCAGAACTGGAGGACCGTCGCCAGCTGGCTCGGAT
GTTGGTGGAGTATACCCAGAATCAGAAAGATGTTTTGTCGGAGAAGGAGAAAAAA
CTAGAGGAATACAAACAGAAGCTTGCACGAGTAACCCAGGTCCGCAAGGAACTGA
AATCCCATATTCAGAGCTTGCCAGACCTCTCACTGCTGCCCAACGTCACAGGGGGC
TTAGCCCCCCTGCCCTCTGCTGGGGACCTGTTTTCAACTGACTAG
PPC-HA融合蛋白的氨基酸序列(SEQ ID NO:33):
MSAFSEAALEKKLSELSNSQQSVQTLSLWLIHHRKHSRPIVTVWERELRKAKPNRKLTF
LYLANDVIQNSKRKGPEFTKDFAPVIVEAFKHVSSETDESCKKHLGRVLSIWEERSVYE
NDVLEQLKQALYGDKKPRKRTYEQIKVDENENCSSLGSPSEPPQTEELIKALQDLENA
ASGDATVRQKIASLPQEVQDVSLLEKITDKEAAERLSKTVDEACLLLAEYNGRLAAEL
EDRRQLARMLVEYTQNQKDVLSEKEKKLEEYKQKLARVTQVRKELKSHIQSLPDLSL
LPNVTGGLAPLPSAGDLFSTDYPYDVPDYA
6.真核表达载体pcDNA3.1-CREPT(△160-168)-Myc的构建
(1)以SEQ ID NO:10合成的双链DNA为模板,分别先用如下所示F1和R1,F2和R2组成的引物对进行PCR扩增,在以得到的PCR扩增产物为模版,用如下所示F1和R2组成的引物对进行PCR扩增。
F1:CTAGAGCTTGGTACCATGTCCTCCTTCTCTG(SEQ ID NO:24)
R1:GTCCTGCAGAAGGATCGTCATCCTCCTCCTC(SEQ ID NO:25)
F2:GAGGAGGAGGATGACGATCCTTCTGCAGGAC(SEQ ID NO:26)
R2:GTGCTGGATGATATCCGTCAGTTGAAAACAGG(SEQ ID NO:18)
PCR反应条件:95℃变性5min;94℃变性30s、60℃退火30s、72℃延伸60s、进行30个循环;72℃延伸10min。
(2)用天根胶回收试剂盒回收PCR产物。
(3)用限制性内切酶KpnI和EcoRV酶切质粒pcDNA3.1-Myc,回收载体骨架(约5.5kb)。
(4)将步骤(2)的回收产物和步骤(3)的载体骨架通过同源重组连接,得到真核表达载体pcDNA3.1-CREPT(△160-168)-Myc。根据测序结果,对真核表达载体pcDNA3.1-CREPT(△160-168)-Myc进行结构描述如下:在质粒pcDNA3.1-Myc的KpnI和EcoRV酶切位点之间插入了CREPT(△160-168)的DNA片段,CREPT(△160-168)的DNA片段和载体骨架上的Myc标签编码序列形成融合基因,表达CREPT(△160-168)-Myc融合蛋白。
CREPT(△160-168)-Myc融合蛋白的氨基酸序列(SEQ ID NO:34):MSSFSESALEKKLSELSNSQQSVQTLSLWLIHHRKHAGPIVSVWHRELRKAKSNRKLTFLYLANDVIQNSKRKGPEFTREFESVLVDAFSHVAREADEGCKKPLERLLNIWQERSVYGGEFIQQLKLSMEDSKSPPPKATEEKKSLKRTFQQIQEEEDDDPSAGPLLTEELIKALQDLENAASGDATVRQKIASLPQEVQDVSLLEKITDKEAAERLSKTVDEACLLLAEYNGRLAAELEDRRQLARMLVEYTQNQKDVLSEKEKKLEEYKQKLARVTQVRKELKSHIQSLPDLSLLPNVTGGLAPLPSAGDLFSTDEQKLISEEDL
二、抗体特异性的测定
第一组:将真核表达载体pcDNA3.1-CREPT-Myc转染293T细胞,简称CREPT-Myc;
第二组:将真核表达载体pcDNA3.1-p15RS-Flag转染293T细胞,简称p15RS-Flag;
第三组:将真核表达载体pcDNA3.1-CREPT CID-Myc转染293T细胞,简称CREPTCID-Myc;
第四组:将真核表达载体pcDNA3.1-CREPT CCT-Myc转染293T细胞,简称CREPTCCT-Myc;
第五组:将真核表达载体pcDNA3.1-PPC-HA转染293T细胞,简称PPC-HA;
第六组:将真核表达载体pcDNA3.1-CREPT(△160-168)-Myc转染293T细胞,简称CREPT(△160-168)-Myc。
转染24小时后,用细胞裂解液裂解细胞后进行Western blot检测,分别采用Myc抗体(Sigma公司,产品编号SAB2702192),Flag抗体(Sigma公司,产品目录号F4042)、HA抗体(Thermo,货号26183),3E10(来自Ren F,Wang R,Zhang Y,et al.Characterization of amonoclonal antibody against CREPT,a novel protein highly expressed intumors.Monoclon Antib Immunodiagn Immunother.2014;33(6):401-408.doi:10.1089/mab.2014.0043),4H1(来自(CN102559601A),6H2单克隆抗体来自于杂交瘤细胞上清和腹水纯化,具体方法同实施例2。
采用Myc抗体的结果见图2~图5。第一组、第三组、第四组和第六组分别可以检测到CREPT-Myc融合蛋白以及CREPT CID-Myc,CREPT CCT-Myc,CREPT(△160-168)-Myc,对照组没有相应条带。
采用Flag抗体的结果见图2,第二组可以检测到p15RS-Flag。
采用HA抗体的结果见图4,第五组可以检测到PPC-HA
采用6H2抗体的结果见图2,图3,图4,图5,6H2抗体可以识别全长CREPT蛋白,CREPTCCT区域以及CREPT(△160-168)蛋白。
采用3E10抗体的结果见图2~图5,3E10抗体可以识别全长CREPT蛋白以及CREPTCCT区域。
采用4H1抗体的结果见图2~图5,4H1抗体可以识别全长CREPT蛋白以及CREPT CCT区域。
结果与分析
由于CREPT蛋白与p15RS的氨基酸序列具有高度的同源性,为了检测单克隆抗体6H2的特异性,本实施例在HEK293T细胞中瞬时转染了携带CREPT-Myc以及携带与其同源性很高的p15RS-Flag质粒。Western blot结果表明,6H2抗体既能识别过表达的CREPT蛋白也可以识别内源性CREPT蛋白(如在实施例7中将证实的),但不识别p15RS蛋白,说明单克隆抗体6H2抗体具有较好的特异性(图2)。进一步,在293T细胞中过表达CREPT蛋白氨基端CREPTCID以及羧基端CREPT CCT缺失体,通过Western blot检测发现,Myc抗体能够同时检测两个缺失体,而单克隆抗体6H2仅识别CREPT羧基端,不识别其氨基端(图3)。接下来,构建了p15RS CID-p15RS linker-CREPT CCT克隆(即pcDNA3.1-PPC-HA,简称PPC-HA/PPC)。在293T细胞中过表达CREPT全长蛋白和PPC,通过Western blot检测发现,6H2抗体仅识别CREPT全长蛋白,不识别PPC(图4),说明6H2的识别表位位于CREPT的linker区域。现有技术中的3E10抗体,是杂交瘤细胞CREPT-Ab-3E10分泌的单克隆抗体,可特异性识别CREPT蛋白(Ren F,Wang R,Zhang Y,et al.Characterization of a monoclonal antibody against CREPT,a novel protein highly expressed in tumors.Monoclon Antib ImmunodiagnImmunother.2014;33(6):401-408.doi:10.1089/mab.2014.0043)。现有技术中的4H1,是杂交瘤细胞CREPT-Ab-4H1分泌的单克隆抗体,也可特异性识别CREPT蛋白((CN102559601A))。此前研究表明,3E10,4H1抗体的识别表位为CREPT蛋白的160-168位氨基酸(Ren F,Wang R,Zhang Y,et al.Characterization of a monoclonal antibody against CREPT,a novelprotein highly expressed in tumors.Monoclon Antib ImmunodiagnImmunother.2014;33(6):401-408.doi:10.1089/mab.2014.0043)。因此,将CREPT蛋白的160-168位氨基酸删除后,过表达至293T细胞中,发现3E10和4H1不识别缺失160-168位氨基酸的CREPT蛋白,而6H2仍然可以识别缺失160-168位氨基酸的CREPT蛋白和全长的CREPT蛋白(图5),这说明6H2识别的CREPT蛋白表位与3E10和4H1是不同的。进一步,如实施例4,对杂交瘤细胞的6H2抗体进行测序,分别对3E10抗体、4H1抗体和6H2抗体的重链和轻链可变区进行序列比对,结果表明,3E10,4H1和6H2的抗体序列是不一致的(图6)。
实施例6、抗体在ChIP-seq实验中的应用
(1)向10cm的培养皿(约107LN229细胞,ATCC,CRL-2611)加入5mL的1%的甲醛(直接在培养上清中配置即可),37℃摇床交联10min。
(2)提前配置好2.5M甘氨酸,直接向培养皿中加入250μL 2.5M甘氨酸,37℃摇床终止交联10min。
(3)用细胞刷将细胞刮下来转移至EP管中,PBS清洗两次后,加入500μL的细胞裂解液(50mM Tris-HCl,10mM EDTA,0.5%SDS1 mM PMSF,1mM DTT)重悬细胞,冰上放置30minl裂解。
(4)超声破碎:40%功率,8s脉冲10s间隔,共40次超声。超声结束后离心(15min,13000rpm,4℃),取上清转移至新的EP管中。
(5)取100μL的上清加入9倍体积的稀释液(16.7mM Tris-HCl,167mM NaCl,1.1mMEDTA,1mM PMSF,1.1% Triton X-100,1mM DTT)和20μL经过细胞裂解液冲洗过的ProteinG Beads(Thermofisher,10003D),以及2μg的CREPT抗体(3E10、6H2或4H1),随后置于4℃冰箱杂交过夜。
(6)依次使用低盐、高盐,LiCl洗涤缓冲液清洗beads一次,TE缓冲液(Invitrogen,12090015)清洗两次,清洗结束后,再用500μL洗脱液重悬beads,孵育30min。
(7)离心3min,取上清转移至新的EP管中。
(8)加入20μL 5M NaCl,65℃解交联过夜。
(9)向试管中加入20μL Tris-HCl(PH=6.8),10μL 0.5M EDTA和1μL蛋白酶K(浓度为20μg/mL),45℃孵育1h。
(10)酚氯仿抽提DNA加入等体积的酚氯仿,漩涡振荡可见白色絮状沉淀,13000rpm,4℃离心15min。
(11)取最上层水相至新的EP管,加入1/10体积的3M NaAc(PH=5.2),振荡混匀,再加入双倍体积的无水乙醇,充分混匀,置于-20℃过夜。
(12)离心15min,13000rpm,4℃,之后弃上清。
(13)加入70%乙醇混匀后13000rpm,离心15min。
(14)弃上清,室温晾干,加入20μL超纯水溶解。
(15)取2μL通过Qubit Fluorometer检测样品的浓度。
(16)取5μL的样品进行2%琼脂糖凝胶电泳检测样品的完整性和纯度。其中电压设置80v,电泳时间为40min,随后在显色仪曝光拍照。
ChIP-seq实验,可实现蛋白与基因组区域的特异性匹配。分离染色质后,使用靶向目标抗原的抗体确定靶点是否与特定的DNA序列结合。合适的抗体是ChIP实验的一个关键因素。该实验对抗体的特异性和灵敏度要求较高,并且抗体的不同识别表位也会影响蛋白与DNA的结合。本实验中,分别在同等数量裂解好的细胞中添加同样量的3E10、4H1、6H2三种单克隆抗体,获得目的蛋白-DNA复合物。之后,纯化DNA即得到染色质免疫沉淀的DNA样本。进一步对三种抗体沉淀下的DNA进行量化。结果如图7所示,显示3E10、4H1、6H2每微克抗体结合的DNA总量,其中6H2结合的DNA量是最多的,比3E10,4H1更适合做ChIP-seq实验。
实施例7、CREPT基因在细胞以及组织中的表达
一、CREPT基因在细胞中的表达
分别对MCF7(人乳腺癌细胞系,ATCC,HTB-22),LN229(人脑胶质母细胞瘤细胞系,ATCC,CRL-2611),PANC-1(人胰腺癌细胞系,ATCC,CRL-1469),HCT116(人结肠癌细胞系,ATCC,CCL-247),H441(人肺腺癌细胞系,ATCC,HTB-174),Hela(人宫颈癌细胞系,ATCC,CCL-2)进行实验,将各个细胞裂解液裂解细胞后进行Western blot检测,采用6H2抗体,结果见图8。结果表明,6H2抗体在多种肿瘤细胞系中均可以检测到内源性CREPT表达。
二、CREPT基因在组织中的表达差异
在患者知情同意的基础上,分别从多家医院获得的肿瘤组织(包括肿瘤组织、癌旁或正常组织),切片后进行免疫组化(均采用6H2单克隆抗体作为一抗,HPR-羊抗鼠(goat-anti-mouse)抗体作为二抗,DAB显色,苏木素进行复染,二抗和显色试剂均购自中杉公司)。结果见图8,在不同类型的肿瘤组织中,CREPT蛋白在肺癌组织、乳腺癌组织、胃癌组织、肾癌组织、前列腺癌组织和结肠癌组织中的表达均明显高于相应的癌旁或正常组织。
以上结果说明,6H2单克隆抗体能够识别内源性CREPT蛋白的表达,利用Westernblot方法检测了MCF7(人乳腺癌细胞系),LN229(人脑胶质母细胞瘤细胞系),PANC-1(人胰腺癌细胞系),HCT116(人结肠癌细胞系),H441(人肺腺癌细胞系),Hela(人宫颈癌细胞系)几个常用细胞系中CREPT的表达。结果表明CREPT蛋白在大多数细胞系内存在(图7)。
为检测制备的CREPT单克隆抗体对组织蛋白是否识别,利用单克隆抗体对临床获取的肺癌、肝癌、宫颈癌、肠癌、前列腺癌、乳腺癌、胃癌、子宫内膜癌及癌旁组织进行了免疫组化实验。实验结果表明,CREPT蛋白定位在细胞核中,在肿瘤组织中呈高表达,而在正常组织中表达很低甚至检测不到(图9)。
以上结果说明,本发明提供的特异性结合CREPT的抗体或其抗原结合片段可以特异性结合CREPT蛋白,包括肿瘤组织或肿瘤细胞中内源性表达的CREPT蛋白。
需要说明的是,尽管以具体实例介绍了本发明的技术方案,但本领域技术人员能够理解,本发明应不限于此。
以上已经描述了本发明的各实施例,上述说明是示例性的,并非穷尽性的,并且也不限于所披露的各实施例。在不偏离所说明的各实施例的范围和精神的情况下,对于本技术领域的普通技术人员来说许多修改和变更都是显而易见的。本文中所用术语的选择,旨在最好地解释各实施例的原理、实际应用或对市场中的技术改进,或者使本技术领域的其它普通技术人员能理解本文披露的各实施例。

Claims (14)

1.一种特异性结合CREPT的抗体或其抗原结合片段,其包含抗体重链可变区和抗体轻链可变区,其中,所述的抗体重链可变区包含至少1个选自以下序列所示的HCDR:SEQ IDNO:3、SEQ ID NO:4和SEQ ID NO:5;以及所述抗体轻链可变区包含至少1个选自以下序列所示的LCDR:SEQ ID NO:6、SEQ ID NO:7和SEQ ID NO:8。
2.根据权利要求1所述的特异性结合CREPT的抗体或其抗原结合片段,其中,所述的重链可变区包含SEQ ID NO:3所示的HCDR1、SEQ ID NO:4所示的HCDR2和SEQ ID NO:5所示的HCDR3;和/或,
所述的轻链可变区包含SEQ ID NO:6所示的LCDR1、SEQ ID NO:7所示的LCDR2和SEQ IDNO:8所示的LCDR3。
3.根据权利要求1或2所述的特异性结合CREPT的抗体或其抗原结合片段,其包含重链可变区和轻链可变区,其中,所述重链可变区包含SEQ ID NO:3所示的HCDR1、SEQ ID NO:4所示的HCDR2和SEQ ID NO:5所示的HCDR3;所述轻链可变区包含SEQ ID NO:6所示的LCDR1、SEQ ID NO:7所示的LCDR2和SEQ ID NO:8所示的LCDR3。
4.根据权利要求1~3中任一项所述的特异性结合CREPT的抗体或其抗原结合片段,其中,所述的特异性结合CREPT的抗体或其抗原结合片段包含SEQ ID NO:1所示的重链可变区、或与其具有至少70%,75%,80%,85%,90%,95%或99%同一性的重链可变区;和/或,
所述的特异性结合CREPT的抗体或其抗原结合片段包含SEQ ID NO:2所示的轻链可变区、或与其具有至少70%,75%,80%,85%,90%,95%或99%同一性的轻链可变区。
5.根据权利要求1~4中任一项所述的特异性结合CREPT的抗体或其抗原结合片段,其中,所述的特异性结合CREPT的抗体或其抗原结合片段包含SEQ ID NO:1所示的重链可变区、或与其具有至少70%,75%,80%,85%,90%,95%或99%同一性的重链可变区,和SEQID NO:2所示的轻链可变区、或与其具有至少70%,75%,80%,85%,90%,95%或99%同一性的轻链可变区;
优选地,所述的特异性结合CREPT的抗体或其抗原结合片段包含SEQ ID NO:1所示的重链可变区,和SEQ ID NO:2所示的轻链可变区。
6.根据权利要求1~5中任一项所述的特异性结合CREPT的抗体或其抗原结合片段,其中,所述特异性结合CREPT的抗体或其抗原结合片段还包含源自人或鼠IgG1、IgG2、IgG3或IgG4或其变体的重链恒定区;和/或,
所述特异性结合CREPT的抗体或其抗原结合片段还包含源自人或鼠κ链、λ链或其变体的轻链恒定区。
7.根据权利要求1~6中任一项所述的特异性结合CREPT的抗体或其抗原结合片段,其中,
所述特异性结合CREPT的抗体或其抗原结合片段包括鼠源抗体或其片段、嵌合抗体或其片段、人源化抗体或其片段;和/或,
所述特异性结合CREPT的抗体或其抗原结合片段选自全长抗体、Fab片段、Fab’片段、F(ab’)2片段、Fv片段、单链抗体、多特异性抗体中的至少一种。
8.一种杂交瘤细胞株,所述杂交瘤细胞株保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心,保藏号为CGMCC No.45759。
9.一种单克隆抗体,其由权利要求8所述的杂交瘤细胞株分泌产生。
10.一种生物材料,其中,所述生物材料包括如下B1)~B8)中的至少一种:
B1)编码如权利要求1~7中任一项所述的特异性结合CREPT的抗体或其抗原结合片段的多核苷酸;
B2)含有B1)中所述多核苷酸的表达盒;
B3)含有B1)中所述多核苷酸的载体;
B4)含有B2)中所述表达盒的载体;
B5)含有B1)中所述多核苷酸的宿主细胞;
B6)含有B2)中所述表达盒的宿主细胞;
B7)含有B3)中所述重组载体的宿主细胞;
B8)含有B4)中所述重组载体的宿主细胞。
11.根据权利要求10所述的生物材料,其中,所述的宿主细胞为微生物或哺乳动物细胞。
12.一种检测或诊断试剂盒,其含有如权利要求1~7中任一项所述的特异性结合CREPT的抗体或其抗原结合片段、如权利要求9所述的单克隆抗体、或如权利要求10或11所述的生物材料。
13.如权利要求1~7中任一项所述的特异性结合CREPT的抗体或其抗原结合片段、如权利要求9所述的单克隆抗体、或如权利要求10或11所述的生物材料的以下任一项用途:
(i)在制备用于检测样本中CREPT蛋白的试剂或试剂盒中的用途;
(ii)在制备用于诊断或辅助诊断受试者是否患有与CREPT相关的疾病的试剂或试剂盒中的用途。
14.一种检测样本中是否存在CREPT蛋白或其含量的方法,其包括将所述样本与权利要求1-7中任一项所述的特异性结合CREPT的抗体或其抗原结合片段、如权利要求9所述的单克隆抗体或如权利要求10或11所述的生物材料接触的步骤。
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