JP2018533929A - 二重特異性抗cd19×cd3t細胞活性化抗原結合分子 - Google Patents
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Abstract
Description
(a)第1の抗原に特異的に結合する第1の抗原結合部分;
(b)第2の抗原に特異的に結合する第2の抗原結合部分;
を含み、第1の抗原がT細胞活性化抗原であり、第2の抗原がCD19であるか、又は第1の抗原がCD19であり、第2の抗原がT細胞活性化抗原であり;且つ
CD19に特異的に結合する抗原結合部分が、(i)配列番号14の重鎖相補性決定領域(HCDR)1、配列番号15のHCDR2及び配列番号16のHCDR3を含む重鎖可変領域、特にヒト化重鎖可変領域と、配列番号17の軽鎖相補性決定領域(LCDR)1、配列番号18のLCDR2及び配列番号19のLCDR3を含む軽鎖可変領域、特にヒト化軽鎖可変領域、又は(ii)配列番号50の重鎖相補性決定領域(HCDR)1、配列番号51のHCDR2及び配列番号52のHCDR3を含む重鎖可変領域、特にヒト化重鎖可変領域と、配列番号53の軽鎖相補性決定領域(LCDR)1、配列番号54のLCDR2及び配列番号55のLCDR3を含む軽鎖可変領域、特にヒト化軽鎖可変領域を含む、
T細胞活性化二重特異性抗原結合分子を提供する。
(a)第1の抗原に特異的に結合する第1のFab分子;
(b)第2の抗原に特異的に結合する第2のFab分子であって、Fab軽鎖とFab重鎖の可変ドメインVLとVH又は定常ドメインCLとCH1が互いによって交換されている第2のFab分子;
を含み、
第1の抗原はCD19であり、第2の抗原はT細胞活性化抗原であり;
(a)による第1のFab分子は、(i)配列番号14の重鎖相補性決定領域(HCDR)1、配列番号15のHCDR2及び配列番号16のHCDR3を含む重鎖可変領域、特にヒト化重鎖可変領域と、配列番号17の軽鎖相補性決定領域(LCDR)1、配列番号18のLCDR2及び配列番号19のLCDR3を含む軽鎖可変領域、特にヒト化軽鎖可変領域、又は(ii)配列番号50の重鎖相補性決定領域(HCDR)1、配列番号51のHCDR2及び配列番号52のHCDR3を含む重鎖可変領域、特にヒト化重鎖可変領域と、配列番号53の軽鎖相補性決定領域(LCDR)1、配列番号54のLCDR2及び配列番号55のLCDR3を含む軽鎖可変領域、特にヒト化軽鎖可変領域を含む。
且つ
i)a)による第1のFab分子の定常ドメインCLでは、124位のアミノ酸が、独立して、リジン(K)、アルギニン(R)又はヒスチジン(H)によって置換されており(Kabatによる番号付け)、且つa)による第1のFab分子の定常ドメインCH1では、147位のアミノ酸又は213位のアミノ酸が、独立して、グルタミン酸(E)、又はアスパラギン酸(D)によって置換されている(Kabat EUインデックスによる番号付け);又は
ii)b)による第2のFab分子の定常ドメインCLでは、124位のアミノ酸が、独立して、リジン(K)、アルギニン(R)又はヒスチジン(H)によって置換されており(Kabatによる番号付け)、且つb)による第2のFab分子の定常ドメインCH1では、147位のアミノ酸又は213位のアミノ酸が、独立して、グルタミン酸(E)、又はアスパラギン酸(D)によって置換されている(Kabat EUインデックスによる番号付け)。
(a)第1の抗原に特異的に結合する第1のFab分子;
(b)第2の抗原に特異的に結合する第2のFab分子であって、Fab軽鎖とFab重鎖の可変ドメインVLとVHが互いによって交換されている第2のFab分子
を含み、
第1の抗原はCD19であり、第2の抗原はT細胞活性化抗原であり;
(a)による第1のFab分子は、(i)配列番号14の重鎖相補性決定領域(HCDR)1、配列番号15のHCDR2及び配列番号16のHCDR3を含む重鎖可変領域、特にヒト化重鎖可変領域と、配列番号17の軽鎖相補性決定領域(LCDR)1、配列番号18のLCDR2及び配列番号19のLCDR3を含む軽鎖可変領域、特にヒト化軽鎖可変領域、又は(ii)配列番号50の重鎖相補性決定領域(HCDR)1、配列番号51のHCDR2及び配列番号52のHCDR3を含む重鎖可変領域、特にヒト化重鎖可変領域と、配列番号53の軽鎖相補性決定領域(LCDR)1、配列番号54のLCDR2及び配列番号55のLCDR3を含む軽鎖可変領域、特にヒト化軽鎖可変領域を含み;且つ
a)による第1のFab分子の定常ドメインCLでは、124位のアミノ酸が、独立して、リジン(K)、アルギニン(R)又はヒスチジン(H)により置換されており(Kabatによる番号付け)(好ましい一実施態様では、独立して、リジン(K)又はアルギニン(R)により)、123位のアミノ酸が、独立して、リジン(K)、アルギニン(R)又はヒスチジン(H)により置換されており(Kabatによる番号付け)(好ましい一実施態様では、独立して、リジン(K)又はアルギニン(R)により)、a)による第1のFab分子の定常ドメインCH1において、147位のアミノ酸が、独立して、グルタミン酸(E)、又はアスパラギン酸(D)によって置換されており(Kabat EUインデックスによる番号付け)、213位のアミノ酸が、独立して、グルタミン酸(E)、又はアスパラギン酸(D)によって置換されている(Kabat EUインデックスによる番号付け)。
a)第1の抗原に特異的に結合する第1のFab分子;
b)第2の抗原に特異的に結合する第2のFab分子であって、Fab軽鎖とFab重鎖の可変ドメインVLとVH又はFab軽鎖とFab重鎖の定常ドメインCLとCH1が互いによって交換されている第2のFab分子;
c)第1の抗原に特異的に結合する第3のFab分子;及び
d)安定に会合することができる第1及び第2のサブユニットからなるFcドメイン
を含むT細胞活性化二重特異性抗原結合分子であって、
第1の抗原がCD19であり、第2の抗原がT細胞活性化抗原、特にCD3、さらに詳細にはCD3エプシロンであり;
c)による第3のFab分子がa)による第1のFab分子と同一であり;
(i)a)による第1のFab分子が、Fab重鎖のC末端においてb)による第2のFab分子のFab重鎖のN末端に融合しており、b)による第2のFab分子及びc)による第3のFab分子が、それぞれFab重鎖のC末端においてd)によるFcドメインのサブユニットの一つのN末端に融合しているか、又は
(ii)b)による第2のFab分子が、Fab重鎖のC末端においてa)による第1のFab分子のFab重鎖のN末端に融合しており、a)による第1のFab分子及びc)による第3のFab分子が、それぞれFab重鎖のC末端においてd)によるFcドメインのサブユニットの一つのN末端に融合しており、且つ
a)による第1のFab分子及びc)による第3のFab分子が、(i)配列番号14の重鎖相補性決定領域(HCDR)1、配列番号15のHCDR2及び配列番号16のHCDR3を含む重鎖可変領域、特にヒト化重鎖可変領域と、配列番号17の軽鎖相補性決定領域(LCDR)1、配列番号18のLCDR2及び配列番号19のLCDR3を含む軽鎖可変領域、特にヒト化軽鎖可変領域、又は(ii)配列番号50の重鎖相補性決定領域(HCDR)1、配列番号51のHCDR2及び配列番号52のHCDR3を含む重鎖可変領域、特にヒト化重鎖可変領域と、配列番号53の軽鎖相補性決定領域(LCDR)1、配列番号54のLCDR2及び配列番号55のLCDR3を含む軽鎖可変領域、特にヒト化軽鎖可変領域を含む、
T細胞活性化二重特異性抗原結合分子を提供する。
a)第1の抗原に特異的に結合する第1のFab分子;
b)第2の抗原に特異的に結合する第2のFab分子であって、Fab軽鎖とFab重鎖の可変ドメインVLとVH又は定常ドメインCLとCH1が互いによって交換されている第2のFab分子;
c)安定に会合することができる第1及び第2のサブユニットからなるFcドメイン
を含むT細胞活性化二重特異性抗原結合分子であって、
第1の抗原がCD19であり、第2の抗原がT細胞活性化抗原、特にCD3、さらに詳細にはCD3エプシロンであり;
(i)a)による第1のFab分子が、Fab重鎖のC末端においてb)による第2のFab分子のFab重鎖のN末端に融合しており、b)による第2のFab分子が、Fab重鎖のC末端においてd)によるFcドメインのサブユニットの一つのN末端に融合しているか、又は
(ii)b)による第2のFab分子が、Fab重鎖のC末端においてa)による第1のFab分子のFab重鎖のN末端に融合しており、a)による第1のFab分子が、Fab重鎖のC末端においてd)によるFcドメインのサブユニットの一つのN末端に融合しており、且つ
(a)による第1のFab分子が、(i)配列番号14の重鎖相補性決定領域(HCDR)1、配列番号15のHCDR2及び配列番号16のHCDR3を含む重鎖可変領域、特にヒト化重鎖可変領域と、配列番号17の軽鎖相補性決定領域(LCDR)1、配列番号18のLCDR2及び配列番号19のLCDR3を含む軽鎖可変領域、特にヒト化軽鎖可変領域、又は(ii)配列番号50の重鎖相補性決定領域(HCDR)1、配列番号51のHCDR2及び配列番号52のHCDR3を含む重鎖可変領域、特にヒト化重鎖可変領域と、配列番号53の軽鎖相補性決定領域(LCDR)1、配列番号54のLCDR2及び配列番号55のLCDR3を含む軽鎖可変領域、特にヒト化軽鎖可変領域を含む、
T細胞活性化二重特異性抗原結合分子を提供する。
a)第1の抗原に特異的に結合する第1のFab分子;
b)第2の抗原に特異的に結合する第2のFab分子であって、Fab軽鎖とFab重鎖の可変ドメインVLとVH又は定常ドメインCLとCH1が互いによって交換されている第2のFab分子;及び
c)安定に会合することができる第1及び第2のサブユニットからなるFcドメイン
を含むT細胞活性化二重特異性抗原結合分子であって、
(i)第1の抗原がCD19であり、第2の抗原がT細胞活性化抗原、特にCD3、さらに詳細にはCD3エプシロンであるか;又は
(ii)第2の抗原がCD19であり、第1の抗原がT細胞活性化抗原、特にCD3、さらに詳細にはCD3エプシロンであり;
a)による第1のFab分子及びb)による第2のFab分子が、それぞれFab重鎖のC末端においてc)によるFcドメインのサブユニットの一つのN末端に融合しており;且つ
CD19に特異的に結合するFab分子が、(i)配列番号14の重鎖相補性決定領域(HCDR)1、配列番号15のHCDR2及び配列番号16のHCDR3を含む重鎖可変領域、特にヒト化重鎖可変領域と、配列番号17の軽鎖相補性決定領域(LCDR)1、配列番号18のLCDR2及び配列番号19のLCDR3を含む軽鎖可変領域、特にヒト化軽鎖可変領域、又は(ii)配列番号50の重鎖相補性決定領域(HCDR)1、配列番号51のHCDR2及び配列番号52のHCDR3を含む重鎖可変領域、特にヒト化重鎖可変領域と、配列番号53の軽鎖相補性決定領域(LCDR)1、配列番号54のLCDR2及び配列番号55のLCDR3を含む軽鎖可変領域、特にヒト化軽鎖可変領域を含む、
T細胞活性化二重特異性抗原結合分子を提供する。
a)第1の抗原に特異的に結合する第1のFab分子;
(b)第2の抗原に特異的に結合する第2のFab分子であって、Fab軽鎖とFab重鎖の可変ドメインVLとVHが互いによって交換されている第2のFab分子;
c)第1の抗原に特異的に結合する第3のFab分子;及び
d)安定に会合することができる第1及び第2のサブユニットからなるFcドメイン
を含むT細胞活性化二重特異性抗原結合分子であって、
第1の抗原がCD19であり、第2の抗原がT細胞活性化抗原、特にCD3、さらに詳細にはCD3エプシロンであり;
c)による第3のFab分子がa)による第1のFab分子と同一であり;
a)による第1のFab分子及びc)による第3のFab分子の定常ドメインCLでは、124位のアミノ酸が、リジン(K)によって置換されており(Kabatによる番号付け)、123位のアミノ酸が、リジン(K)又はアルギニン(R)によって置換されており(Kabatによる番号付け)、且つa)による第1のFab分子及びc)による第3のFab分子の定常ドメインCH1では、147位のアミノ酸が、グルタミン酸(E)によって置換されており(Kabat EUインデックスによる番号付け)、213位のアミノ酸が、グルタミン酸(E)によって置換されており(Kabat EUインデックスによる番号付け);
(i)a)による第1のFab分子が、Fab重鎖のC末端においてb)による第2のFab分子のFab重鎖のN末端に融合しており、b)による第2のFab分子及びc)による第3のFab分子が、それぞれFab重鎖のC末端においてd)によるFcドメインのサブユニットの一つのN末端に融合しているか、又は
(ii)b)による第2のFab分子が、Fab重鎖のC末端においてa)による第1のFab分子のFab重鎖のN末端に融合しており、a)による第1のFab分子及びc)による第3のFab分子が、それぞれFab重鎖のC末端においてd)によるFcドメインのサブユニットの一つのN末端に融合しており、且つ
a)による第1のFab分子及びc)による第3のFab分子が、(i)配列番号14の重鎖相補性決定領域(HCDR)1、配列番号15のHCDR2及び配列番号16のHCDR3を含む重鎖可変領域、特にヒト化重鎖可変領域と、配列番号17の軽鎖相補性決定領域(LCDR)1、配列番号18のLCDR2及び配列番号19のLCDR3を含む軽鎖可変領域、特にヒト化軽鎖可変領域、又は(ii)配列番号50の重鎖相補性決定領域(HCDR)1、配列番号51のHCDR2及び配列番号52のHCDR3を含む重鎖可変領域、特にヒト化重鎖可変領域と、配列番号53の軽鎖相補性決定領域(LCDR)1、配列番号54のLCDR2及び配列番号55のLCDR3を含む軽鎖可変領域、特にヒト化軽鎖可変領域を含む、
T細胞活性化二重特異性抗原結合分子を提供する。
a)第1の抗原に特異的に結合する第1のFab分子;
b)第2の抗原に特異的に結合する第2のFab分子であって、Fab軽鎖とFab重鎖の可変ドメインVLとVHが互いによって交換されている第2のFab分子;
c)第1の抗原に特異的に結合する第3のFab分子;及び
d)安定に会合することができる第1及び第2のサブユニットからなるFcドメイン
を含むT細胞活性化二重特異性抗原結合分子であって、
第1の抗原がCD19であり、第2の抗原がT細胞活性化抗原、特にCD3、さらに詳細にはCD3エプシロンであり;
c)による第3のFab分子がa)による第1のFab分子と同一であり;
a)による第1のFab分子及びc)による第3のFab分子の定常ドメインCLでは、124位のアミノ酸が、リジン(K)によって置換されており(Kabatによる番号付け)、123位のアミノ酸が、アルギニン(R)によって置換されており(Kabatによる番号付け)、且つa)による第1のFab分子及びc)による第3のFab分子の定常ドメインCH1では、147位のアミノ酸が、グルタミン酸(E)によって置換されており(Kabat EUインデックスによる番号付け)、213位のアミノ酸が、グルタミン酸(E)によって置換されており(Kabat EUインデックスによる番号付け);
a)による第1のFab分子が、Fab重鎖のC末端においてb)による第2のFab分子のFab重鎖のN末端に融合しており、b)による第2のFab分子及びc)による第3のFab分子が、それぞれFab重鎖のC末端においてd)によるFcドメインのサブユニットの一つのN末端に融合しており;且つ
a)による第1のFab分子及びc)による第3のFab分子が、(i)配列番号14の重鎖相補性決定領域(HCDR)1、配列番号15のHCDR2及び配列番号16のHCDR3を含む重鎖可変領域、特にヒト化重鎖可変領域と、配列番号17の軽鎖相補性決定領域(LCDR)1、配列番号18のLCDR2及び配列番号19のLCDR3を含む軽鎖可変領域、特にヒト化軽鎖可変領域、又は(ii)配列番号50の重鎖相補性決定領域(HCDR)1、配列番号51のHCDR2及び配列番号52のHCDR3を含む重鎖可変領域、特にヒト化重鎖可変領域と、配列番号53の軽鎖相補性決定領域(LCDR)1、配列番号54のLCDR2及び配列番号55のLCDR3を含む軽鎖可変領域、特にヒト化軽鎖可変領域を含む、
T細胞活性化二重特異性抗原結合分子を提供する。
a)第1の抗原に特異的に結合する第1のFab分子;
b)第2の抗原に特異的に結合する第2のFab分子であって、Fab軽鎖とFab重鎖の可変ドメインVLとVHが互いによって交換されている第2のFab分子;
c)安定に会合することができる第1及び第2のサブユニットからなるFcドメイン
を含むT細胞活性化二重特異性抗原結合分子であって、
第1の抗原がCD19であり、第2の抗原がT細胞活性化抗原、特にCD3、さらに詳細にはCD3エプシロンであり;
a)による第1のFab分子の定常ドメインCLでは、124位のアミノ酸が、リジン(K)によって置換されており(Kabatによる番号付け)、123位のアミノ酸が、リジン(K)又はアルギニン(R)によって置換されており(Kabatによる番号付け)、且つa)による第1のFab分子の定常ドメインCH1では、147位のアミノ酸が、グルタミン酸(E)によって置換されており(Kabat EUインデックスによる番号付け)、213位のアミノ酸が、グルタミン酸(E)によって置換されており(Kabat EUインデックスによる番号付け);
(i)a)による第1のFab分子が、Fab重鎖のC末端においてb)による第2のFab分子のFab重鎖のN末端に融合しており、b)による第2のFab分子が、Fab重鎖のC末端においてc)によるFcドメインのサブユニットの一つのN末端に融合しているか、又は
(ii)b)による第2のFab分子が、Fab重鎖のC末端においてa)による第1のFab分子のFab重鎖のN末端に融合しており、a)による第1のFab分子が、Fab重鎖のC末端においてc)によるFcドメインのサブユニットの一つのN末端に融合しており、且つ
a)による第1のFab分子が、(i)配列番号14の重鎖相補性決定領域(HCDR)1、配列番号15のHCDR2及び配列番号16のHCDR3を含む重鎖可変領域、特にヒト化重鎖可変領域と、配列番号17の軽鎖相補性決定領域(LCDR)1、配列番号18のLCDR2及び配列番号19のLCDR3を含む軽鎖可変領域、特にヒト化軽鎖可変領域、又は(ii)配列番号50の重鎖相補性決定領域(HCDR)1、配列番号51のHCDR2及び配列番号52のHCDR3を含む重鎖可変領域、特にヒト化重鎖可変領域と、配列番号53の軽鎖相補性決定領域(LCDR)1、配列番号54のLCDR2及び配列番号55のLCDR3を含む軽鎖可変領域、特にヒト化軽鎖可変領域を含む、
T細胞活性化二重特異性抗原結合分子を提供する。
a)第1の抗原に特異的に結合する第1のFab分子;
b)第2の抗原に特異的に結合する第2のFab分子であって、Fab軽鎖とFab重鎖の可変ドメインVLとVHが互いによって交換されている第2のFab分子;及び
c)安定に会合することができる第1及び第2のサブユニットからなるFcドメイン
を含むT細胞活性化二重特異性抗原結合分子であって、
(i)第1の抗原がCD19であり、第2の抗原がT細胞活性化抗原、特にCD3、さらに詳細にはCD3エプシロンであるか;又は
(ii)第2の抗原がCD19であり、第1の抗原がT細胞活性化抗原、特にCD3、さらに詳細にはCD3エプシロンであり;
a)による第1のFab分子の定常ドメインCLでは、124位のアミノ酸が、リジン(K)によって置換されており(Kabatによる番号付け)、123位のアミノ酸が、リジン(K)又はアルギニン(R)によって置換されており(Kabatによる番号付け)、且つa)による第1のFab分子の定常ドメインCH1では、147位のアミノ酸が、グルタミン酸(E)によって置換されており(Kabat EUインデックスによる番号付け)、213位のアミノ酸が、グルタミン酸(E)によって置換されており(Kabat EUインデックスによる番号付け);
a)による第1のFab分子及びb)による第2のFab分子が、それぞれFab重鎖のC末端においてc)によるFcドメインのサブユニットの一つのN末端に融合しており;且つ
CD19に特異的に結合するFab分子が、(i)配列番号14の重鎖相補性決定領域(HCDR)1、配列番号15のHCDR2及び配列番号16のHCDR3を含む重鎖可変領域、特にヒト化重鎖可変領域と、配列番号17の軽鎖相補性決定領域(LCDR)1、配列番号18のLCDR2及び配列番号19のLCDR3を含む軽鎖可変領域、特にヒト化軽鎖可変領域、又は(ii)配列番号50の重鎖相補性決定領域(HCDR)1、配列番号51のHCDR2及び配列番号52のHCDR3を含む重鎖可変領域、特にヒト化重鎖可変領域と、配列番号53の軽鎖相補性決定領域(LCDR)1、配列番号54のLCDR2及び配列番号55のLCDR3を含む軽鎖可変領域、特にヒト化軽鎖可変領域を含む、
T細胞活性化二重特異性抗原結合分子を提供する。
a)第1の抗原に特異的に結合する第1のFab分子;
b)第2の抗原に特異的に結合する第2のFab分子であって、Fab軽鎖とFab重鎖の可変ドメインVLとVH又は定常ドメインCLとCH1が互いによって交換されている第2のFab分子;
c)第1の抗原に特異的に結合する第3のFab分子;及び
d)安定に結合することができる第1及び第2のサブユニットからなるFcドメイン
を含むT細胞活性化二重特異性抗原結合分子であって、
(i)第1の抗原がCD19であり、第2の抗原がCD3、特にCD3エプシロンであり;
(ii)a)による第1のFab分子及びc)による第3のFab分子が、それぞれ配列番号14の重鎖相補性決定領域(CDR)1、配列番号15の重鎖CDR2、配列番号16の重鎖CDR3、配列番号17の軽鎖CDR1、配列番号18の軽鎖CDR2及び配列番号19の軽鎖CDR3を含むか、又はそれぞれ配列番号50の重鎖CDR1、配列番号51の重鎖CDR2、配列番号52の重鎖CDR3、配列番号53の軽鎖CDR1、配列番号54の軽鎖CDR2及び配列番号55の軽鎖CDR3を含み、b)による第2のFab分子が、配列番号4の重鎖CDR1、配列番号5の重鎖CDR2、配列番号6の重鎖CDR3、配列番号8の軽鎖CDR1、配列番号9の軽鎖CDR2及び配列番号10の軽鎖CDR3を含み;且つ
(iii)a)による第1のFab分子が、Fab重鎖のC末端においてb)による第2のFab分子のFab重鎖のN末端に融合しており、b)による第2のFab分子及びc)による第3のFab分子が、それぞれFab重鎖のC末端においてd)によるFcドメインのサブユニットの一つのN末端に融合している、
T細胞活性化二重特異性抗原結合分子を提供する。
本明細書の用語は、以下で特に定義されない限り、当技術分野で一般に使用されるように使用される。
1 表AのすべてのCDRの定義の番号付けは、Kabatら(以下参照)によって規定された番号付けの慣習に従っている。
2 表Aにおいて使用されている小文字の「b」を含む「AbM」は、Oxford Molecularの「AbM」抗体モデル化ソフトウェアによって定義されるCDRを指す。
100 × 分率X/Y
ここで、Xは配列アラインメントプログラムALIGN−2により、AとBのそのプログラムのアラインメントにおいて同マッチとしてスコア化されるアミノ酸残基の数であり、YはBの全アミノ酸残基数である。アミノ酸配列Aの長さがアミノ酸配列Bの長さと異なる場合、AのBに対する%アミノ酸配列同一性は、BのAに対する%アミノ酸配列同一性とは異なることは理解されるであろう。特に断らない限り、本明細書で使用されるすべての%アミノ酸配列同一性値は、ALIGN−2コンピュータープログラムを使用して、前段落で説明したように得られる。
本発明は、特に有効性及び安全性、並びに生産可能性に関し(例えば純度、収率、安定性に関して)、治療的用途に好ましい特性を有するT細胞活性化二重特異性抗原結合分子を提供する。
本発明のT細胞活性化二重特異性抗原結合分子は、その中に含まれるFab分子に、特にそれらの結合アームの一つ(又は三つ以上の抗原結合Fab分子を含む分子の場合、二つ以上)にVH/VL交換を有するFabベースの二重/多重特異性抗原結合分子の生成において生じうる、マッチしない重鎖との軽鎖の誤対合(Bence−Jones型副生成物)を減少させるうえで有効なアミノ酸置換を含むことができる(PCT出願番号PCT/EP2015/057165、特にその実施例も参照されたい。この特許文献を、参照によりその全体を本明細書に包含する)。
(a)第1の抗原に特異的に結合する第1のFab分子
(b)第2の抗原に特異的に結合する第2のFab分子であって、Fab軽鎖とFab重鎖の可変ドメインVLとVHが互いによって置き換えられている第2のFab分子
を含み、第1の抗原がT細胞活性化抗原であり、第2の抗原がCD19であるか、又は第1の抗原がCD19であり、第2の抗原がT細胞活性化抗原であり;且つ
i)a)による第1のFab分子の定常ドメインCLでは、124位のアミノ酸が、正の電荷を有するアミノ酸によって置換されており(Kabatによる番号付け)、且つa)による第1のFab分子の定常ドメインCH1では、147位のアミノ酸又は213位のアミノ酸が、負の電荷を有するアミノ酸によって置換されている(Kabat EUインデックスによる番号付け)か;又は
ii)b)による第2のFab分子の定常ドメインCLでは、124位のアミノ酸が、正の電荷を有するアミノ酸によって置換されており(Kabatによる番号付け)、且つb)による第2のFab分子の定常ドメインCH1では、147位のアミノ酸又は213位のアミノ酸が、負の電荷を有するアミノ酸によって置換されている(Kabat EUインデックスによる番号付け)。
T細胞活性化二重特異性抗原結合分子の成分は、様々な構造で互いに融合することができる。例示的構成を図1に示す。
T細胞活性化二重特異性抗原結合分子のFcドメインは、免疫グロブリン分子の重鎖ドメインを含む一対のポリペプチド鎖からなる。例えば、免疫グロブリン G(IgG)分子のFcドメインはダイマーであり、その各サブユニットはCH2及びCH3 IgG重鎖定常ドメインを含む。Fcドメインの二つのサブユニットは、互いに安定に会合することができる。一実施態様では、本発明のT細胞活性化二重特異性抗原結合分子は、一を超えないFcドメインを含む。
本発明によるT細胞活性化二重特異性抗原結合分子は、Fcドメインの二つのサブユニットの一方又は他方に融合した複数の異なるFab分子を含み、したがってFcドメインの二つのサブユニットは、通常二つの非同一なポリペプチド鎖に含まれている。これらのポリペプチドの組み換え同時発現とそれに続く二量体化は、二つのポリペプチドの複数の可能な組み合わせをもたらす。したがって、組み換え生成におけるT細胞活性化二重特異性抗原結合分子の収率及び純度を改善するために、T細胞活性化二重特異性抗原結合分子のFcドメインに所望のポリペプチドの会合を促す修飾を導入することが有利であろう。
Fcドメインは、T細胞活性化二重特異性抗原結合分子に望ましい薬物動態特性を付与し、そのような薬物動態特性には、標的組織中への良好な蓄積に貢献する長い血清半減期、及び望ましい組織−血液分布比が含まれる。しかしながら、同時に、Fcドメインは、好ましい抗原保有細胞ではなく、Fc受容体を発現する細胞へのT細胞活性化二重特異性抗原結合分子の望ましくないターゲティングの原因となりうる。さらには、Fc受容体シグナル伝達経路の同時活性化はサイトカイン放出の原因となりえ、サイトカイン放出は、T細胞活性化特性及び抗原結合分子の長い半減期と組み合わさって、サイトカイン受容体の過剰な活性化を招き、全身投与されると重い副作用性をを引き起こしうる。T細胞以外の(Fc受容体保有)免疫細胞の活性化は、例えばNK細胞によるT細胞の破壊の可能性により、T細胞活性化二重特異性抗原結合分子の有効性をさらに低下させることすらある。
本発明の抗原結合分子は二重特異性であり、即ち二つの異なる抗原決定基に特異的に結合することができる少なくとも二つの抗原結合部分を含む。本発明の特定の実施態様によれば、抗原結合部分はFab分子(即ち、各々が可変及び定常領域を含む重鎖と軽鎖とからなる抗原結合ドメイン)である。一実施態様では、前記Fab分子はヒトである。別の実施態様では、前記Fab分子はヒト化されている。また別の実施態様では、前記Fab分子はヒト重鎖及び軽鎖定常ドメインを含む。
本発明のT細胞活性化二重特異性抗原結合分子は、T細胞活性化抗原に特異的に結合する少なくとも一の抗原結合部分、特にFab分子(本明細書では「T細胞活性化抗原結合部分又はT細胞活性化抗原結合Fab分子」とも呼ぶ)を含む。特定の一実施態様では、T細胞活性化二重特異性抗原結合分子は、T細胞活性化抗原に対する特異的結合能を有する一を超えない抗原結合部分を含む。一実施態様では、T細胞活性化二重特異性抗原結合分子は、T細胞活性化抗原に対する一価の結合を提供する。
特定の実施態様では、T細胞活性化抗原に特異的に結合する抗原結合部分は、本明細書に記載されるクロスオーバーFab分子、即ちFab重鎖と軽鎖の可変ドメインVHとVL又は定常ドメインCH1とCLが交換されている/互いによって置き換えられているFab分子である。このような実施態様では、標的細胞抗原に特異的に結合する抗原結合部分(複数可)は、好ましくは従来のFab分子である。T細胞活性化二重特異性抗原結合分子に含まれる標的細胞抗原に特異的に結合する一を超える抗原結合部分、特にFab分子が存在する実施態様では、T細胞活性化抗原に特異的に結合する抗原結合部分は好ましくはクロスオーバーFab分子であり、標的細胞抗原に特異的に結合する抗原結合部分は従来のFab分子である。
特定の一実施態様では、T細胞活性化抗原は、CD3、特にヒトCD3(配列番号1)又はカニクイザルCD3(配列番号2)、さらに詳細にはヒトCD3である。特定の実施態様では、T細胞活性化抗原結合部分は、ヒト及びカニクイザルのCD3に交差反応性である(即ち、特異的に結合する)。いくつかの実施態様では、T細胞活性化抗原は、CD3のエプシロンサブユニット(CD3エプシロン)である。
本発明のT細胞活性化二重特異性抗原結合分子は、CD19(標的細胞抗原)に特異的に結合する少なくとも一の抗原結合部分、特にFab分子を含む。特定の実施態様では、T細胞活性化二重特異性抗原結合分子は、CD19に特異的に結合する二の抗原結合部分、特にFab分子を含む。このような特定の一実施態様では、これら抗原結合部分の各々は、同じ抗原決定基に特異的に結合する。さらに詳細な実施態様では、これら抗原結合部分のすべては同一であり、即ちそれらは、本明細書に記載されるようにCH1及びCLドメイン内に同じアミノ酸置換を含む(もしあれば)同じアミノ酸配列を含む。一実施態様では、T細胞活性化二重特異性抗原結合分子は、CD19に特異的に結合する免疫グロブリン分子を含む。一実施態様では、T細胞活性化二重特異性抗原結合分子は、CD19に特異的に結合する二を超えない抗原結合部分、特にFab分子を含む。
(i)配列番号58の重鎖相補性決定領域(CDR)1、配列番号59の重鎖CDR2、及び配列番号60の重鎖CDR3を含む重鎖可変領域と、配列番号61の軽鎖CDR1、配列番号62の軽鎖CDR2及び配列番号63の軽鎖CDR3を含む軽鎖可変領域;
(ii)配列番号66の重鎖相補性決定領域(CDR)1、配列番号67の重鎖CDR2、及び配列番号68の重鎖CDR3を含む重鎖可変領域と、配列番号69の軽鎖CDR1、配列番号70の軽鎖CDR2及び配列番号71の軽鎖CDR3を含む軽鎖可変領域;
(iii)配列番号74の重鎖相補性決定領域(CDR)1、配列番号75の重鎖CDR2、及び配列番号76の重鎖CDR3を含む重鎖可変領域と、配列番号77の軽鎖CDR1、配列番号78の軽鎖CDR2及び配列番号79の軽鎖CDR3を含む軽鎖可変領域;
(iv)配列番号82の重鎖相補性決定領域(CDR)1、配列番号83の重鎖CDR2、及び配列番号84の重鎖CDR3を含む重鎖可変領域と、配列番号85の軽鎖CDR1、配列番号86の軽鎖CDR2及び配列番号87の軽鎖CDR3を含む軽鎖可変領域;
(v)配列番号90の重鎖相補性決定領域(CDR)1、配列番号91の重鎖CDR2、及び配列番号92の重鎖CDR3を含む重鎖可変領域と、配列番号93の軽鎖CDR1、配列番号94の軽鎖CDR2及び配列番号95の軽鎖CDR3を含む軽鎖可変領域;又は
(vi)配列番号98の重鎖相補性決定領域(CDR)1、配列番号99の重鎖CDR2、及び配列番号100の重鎖CDR3を含む重鎖可変領域と、配列番号101の軽鎖CDR1、配列番号102の軽鎖CDR2及び配列番号103の軽鎖CDR3を含む軽鎖可変領域;
を含む。
(i)配列番号64の配列と少なくとも95%、96%、97%、98%、又は99%同一である重鎖可変領域と、配列番号65の配列と少なくとも95%、96%、97%、98%、又は99%同一である軽鎖可変領域;
(ii)配列番号72の配列と少なくとも95%、96%、97%、98%、又は99%同一である重鎖可変領域と、配列番号73の配列と少なくとも95%、96%、97%、98%、又は99%同一である軽鎖可変領域;
(iii)配列番号80の配列と少なくとも95%、96%、97%、98%、又は99%同一である重鎖可変領域と、配列番号81の配列と少なくとも95%、96%、97%、98%、又は99%同一である軽鎖可変領域;
(iv)配列番号88の配列と少なくとも95%、96%、97%、98%、又は99%同一である重鎖可変領域と、配列番号89と少なくとも95%、96%、97%、98%、又は99%同一である軽鎖可変領域;
(v)配列番号96の配列と少なくとも95%、96%、97%、98%、又は99%同一である重鎖可変領域と、配列番号97の配列と少なくとも95%、96%、97%、98%、又は99%同一である軽鎖可変領域;又は
(vi)配列番号104の配列と少なくとも95%、96%、97%、98%、又は99%同一である重鎖可変領域と、配列番号105の配列と少なくとも95%、96%、97%、98%、又は99%同一である軽鎖可変領域
を含む。
(i)配列番号64の重鎖可変領域配列と、配列番号65の軽鎖可変領域配列;
(ii)配列番号72の重鎖可変領域配列と、配列番号73の軽鎖可変領域配列;
(iii)配列番号80の重鎖可変領域配列と、配列番号81の軽鎖可変領域配列;
(iv)配列番号88の重鎖可変領域配列と、配列番号89の軽鎖可変領域配列;
(v)配列番号96の重鎖可変領域配列と、配列番号97の軽鎖可変領域配列;又は
(vi)配列番号104の重鎖可変領域配列と、配列番号105の軽鎖可変領域配列
を含む。
本発明はさらに、本明細書に記載のT細胞活性化二重特異性抗原結合分子をコードする単離されたポリヌクレオチド又はその断片を提供する。いくつかの実施態様において、前記断片は抗原結合断片である。
本発明のT細胞活性化二重特異性抗原結合分子は、例えば、固相ペプチド合成(例えばメリフィールド固体相合成)又は組み換え生成によって得ることができる。組み換え生成のために、例えば上述したように、T細胞活性化二重特異性抗原結合分子(断片)をコードする一又は複数のポリヌクレオチドが単離され、宿主細胞内でのさらなるクローニング及び/又は発現のために一又は複数のベクターに挿入される。このようなポリヌクレオチドは、一般的な手順を使用して容易に単離され配列決定されうる。一実施態様において、本発明のポリヌクレオチドの一又は複数を含むベクター、好ましくは発現ベクターが提供される。当業者によく知られている方法を使用して、適切な転写/翻訳制御シグナルとともに、T細胞活性化二重特異性抗原結合分子(断片)のコード配列を含む発現ベクターを構築することができる。これらの方法は、in vitroでの組み換えDNA技術、合成技術及びin vivoでの組み換え/遺伝子組み換えを含む。例えば、Maniatis et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, N.Y. (1989); 及びAusubel et al., Current Protocols in Molecular Biology, Greene Publishing Associates and Wiley Interscience, N.Y (1989)に記載される技術を参照。発現ベクターはプラスミド、又はウイルスの一部とすることができるか、又は核酸断片でよい。発現ベクターは、T細胞活性化二重特異性抗原結合分子(断片)をコードするポリヌクレオチド(即ち、コード化領域)が、プロモーター及び/又は他の転写若しくは翻訳制御エレメントと作動可能に結合するようにクローニングされる発現カセットを含む。本発明で使用される場合、「コード化領域」は、アミノ酸に翻訳されるコドンからなる核酸の一部である。「終止コドン」(TAG、TGA、又はTAA)はアミノ酸に翻訳されないが、存在する場合にはコード化領域の一部と考えられ、しかし、任意の隣接配列、例えばプロモーター、リボソーム結合部位、転写ターミネーター、イントロン、5’及び3’非翻訳領域などはコード化領域の一部ではない。二以上のコード化領域が、単一のポリヌクレオチドコンストラクト、例えば単一のベクター上に、又は別々のポリヌクレオチドコンストラクトの中、例えば別の(異なる)ベクター上に存在することができる。さらに、任意のベクターは、単一のコード化領域を含んでいてもよいし、二以上のコード化領域を含んでいてもよく、例えば本発明のベクターは、タンパク質分解性切断を介して、翻訳後又は翻訳と同時に最終タンパク質中に分離された一又は複数のポリペプチドをコードしてもよい。加えて、本発明のベクター、ポリヌクレオチド、又は核酸は、本発明のT細胞活性化二重特異性抗原結合分子(断片)、又はその変異体若しくは誘導体をコードするポリヌクレオチドに融合した又は融合していない異種コード化領域をコードしうる。異種コード化領域は、限定しないが、特殊化要素又はモチーフ、例えば分泌シグナルペプチド又は異種機能ドメインを含む。作動可能に結合とは、ポリペプチドなどの遺伝子産物のコード化領域が、調節配列の影響下又は制御下において遺伝子産物の発現を配置するように、一又は複数の調節配列と結合するときである。(ポリペプチドコード化領域及びそれに結合するプロモーターのような)二つのDNA断片は、プロモーター機能の誘導が所望の遺伝子産物をコードするmRNAの転写をもたらす場合、及び二つのDNA断片間の連結の性質が、遺伝子産物の発現を導く発現調節配列の能力を妨げないか又は転写されるべきDNA鋳型の能力を妨げない場合、「作動可能に結合している」。したがって、プロモーター領域は、プロモーターがその核酸の転写をもたらすことができる場合に、ポリペプチドをコードする核酸に作動可能に結合されるといえる。プロモーターは所定の細胞においてのみDNAの実質的な転写を導く細胞特異的プロモーターであってもよい。プロモーターの他に他の転写制御エレメント、例えばエンハンサー、オペレーター、リプレッサー、及び転写終結シグナルが、細胞特異的転写を導くポリヌクレオチドと作動可能に結合することができる。適切なプロモーター及び他の転写制御領域は本明細書に開示されている。種々の転写制御領域が当業者に知られている。これらには、限定されないが、脊椎動物細胞において機能する転写制御領域、例えば、限定されないが、サイトメガロウイルス由来のプロモーター及びエンハンサーセグメント(例えばイントロン−Aと連動した即初期プロモーター)、サルウイルス40(例えば初期プロモーター)、及びレトロウイルス(例えばラウス肉腫ウイルスなど)が含まれる。他の転写制御領域は、脊椎動物の遺伝子由来のもの、例えばアクチン、熱ショックタンパク質、ウシ成長ホルモン及びウサギ−αグロビン、並びに、真核細胞における遺伝子発現を制御することができる他の配列を含む。さらなる適切な転写制御領域は、組織特異的プロモーター及びエンハンサー並びに誘導性プロモーター(例えば、プロモーター誘導性テトラサイクリン)を含む。同様に、種々の翻訳制御エレメントが当業者に知られている。これらには、限定されないが、リボソーム結合部位、翻訳開始及び終結コドン、並びにウイルス系由来の要素(特に、配列内リボソーム進入部位、又はCITE配列とも呼ばれるIRES)が含まれる。発現カセットは、例えば、複製起点、及び/又はレトロウイルスの長い末端反復配列(LTR)又はアデノ随伴ウイルス(AAV)の末端反転型配列(ITR)などの染色体組み込み要素といった他の特徴を含んでいてもよい。
本明細書で提供されるT細胞活性化二重特異性抗原結合分子が、当技術分野で既知の様々なアッセイによって、その物理的/化学的性質及び/又は生物学的活性について同定、スクリーニング、又は特徴付けされる。
Fc受容体又は標的抗原に対するT細胞活性化二重特異性抗原結合分子の親和性を、実施例に規定される方法に従い、BIAcore機器(GE Healthcare)のような標準的器具類と、組み換え発現により得られるような受容体又は標的タンパク質とを用いて、プラズモン共鳴アッセイ(SPR)により決定することができる。代替的に、異なる受容体又は標的抗原に対するT細胞活性化二重特異性抗原結合分子の結合は、特定の受容体又は標的抗原を発現する細胞株を用いて、例えばフローサイトメトリー(FACS)により、評価することができる。結合親和性を測定するための特定の説明的で例示的な実施態様は、後述及び以下の実施例に記載されている。
本発明のT細胞活性化二重特異性抗原結合分子の生物活性は、実施例に記載される様々なアッセイにより測定することができる。生物活性には、例えば、T細胞の増殖の誘導、T細胞中のシグナル伝達の誘導、T細胞中の活性マーカーの発現の誘導、T細胞によるサイトカイン分泌の誘導、腫瘍細胞などの標的細胞の溶解の誘導、及び腫瘍後退の誘導及び/又は生存率の改善が含まれる。
さらなる態様において、本発明は、例えば下記の治療法のいずれかに使用される、本明細書で提供されるT細胞活性化二重特異性抗原結合分子のいずれかを含む薬学的組成物を提供する。一実施態様では、薬学的組成物は、本明細書で提供されるT細胞活性化二重特異性抗原結合分子のいずれかと、薬学的に許容される担体とを含む。別の他の実施態様において、薬学的組成物は、本明細書で提供されるT細胞活性化二重特異性抗原結合分子のいずれかと、少なくとも一の追加的治療剤を、例えば後述するように含む。
本明細書において提供されるいずれのT細胞活性化二重特異性抗原結合分子も、治療法に使用することができる。本発明のT細胞活性化二重特異性抗原結合分子は、例えばがんの治療において、免疫療法薬剤として使用することができる。
本発明のT細胞活性化二重特異性抗原結合分子は、療法において、一又は複数の他の薬剤との組み合わせで投与されうる。例えば、本発明のT細胞活性化二重特異性抗原結合分子は、少なくとも一の追加的治療剤と共投与される。用語「治療剤」は、そのような治療を必要とする個体の症状又は疾患を治療するために投与されるあらゆる薬剤を包含する。このような追加的な治療剤は、治療される特定の兆候に適したあらゆる活性成分、好ましくは、互いに打ち消し合うことのない相補的活性を有する活性成分を含む。特定の実施態様では、追加的治療剤は、免疫調節剤、細胞増殖抑制剤、細胞接着の阻害剤、細胞傷害性剤、細胞アポトーシスの活性剤、又はアポトーシス誘導因子に対する細胞の感受性を増大させる薬剤である。特定の実施態様では、追加的治療剤は、抗がん剤、例えば微小管破壊因子、抗代謝剤、トポイソメラーゼ阻害剤、DNAインターカレーター、アルキル化剤、ホルモン療法、キナーゼ阻害剤、受容体アンタゴニスト、腫瘍細胞アポトーシスの活性化因子、又は抗血管新生剤である。
本発明の別の態様では、上述した障害の治療、予防、及び/又は診断に有用な材料を含む製造品が提供される。製造品は、容器と容器上又は容器に付随するラベル又は添付文書を含む。好適な容器は、例としてボトル、バイアル、シリンジ、IV輸液バッグなどを含む。容器はガラス又はプラスチックなどの様々な材料から形成されうる。容器は、状態の治療、予防、及び/又は診断に有効な、単独の又はその他の組成物と併用される化合物を収容し、無菌のアクセスポートを有することができる(例えば、容器は皮下注射針により穿孔可能なストッパーを有する静脈内溶液のバッグ又はバイアルであってよい)。組成物中の少なくとも一の活性な薬剤は、本発明のT細胞活性化二重特異性抗原結合分子である。ラベル又は添付文書は、組成物が選択された状態の治療のために使用されることを示している。さらに、製造品は、(a)本発明のT細胞活性化二重特異性抗原結合分子を含む組成物を中に含む第一の容器;及び(b)さらなる細胞傷害性又はその他の治療剤を含む組成物を中に含む第2の容器を含みうる。本発明の本実施態様における製造品は、組成物が特定の状態を治療するために使用できることを示す添付文書をさらに含んでいてもよい。代替的に又は追加的に、製造品は、薬学的に許容されるバッファー、例えば注射用静菌水(BWFI)、リン酸緩衝生理食塩水、リンゲル液、及びデキストロース溶液を含む第二(又は第三)の容器をさらに含んでもよい。製造品は、他のバッファー、希釈剤、フィルター、針、及びシリンジを含む、商業的に及びユーザーの立場から望まれる他の材料をさらに含んでもよい。
組み換えDNA技術
標準的な方法を使用して、Sambrook et al., Molecular cloning: A laboratory manual; Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, New York, 1989に記載されているようにDNAを操作した。分子生物学的試薬を、製造者の指示に従って使用した。ヒト免疫グロブリンの軽鎖及び重鎖のヌクレオチド配列に関する一般情報は以下に与えられている:Kabat, E.A. et al., (1991) Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5thed., NIH Publication No. 91-3242。
DNA配列は、二本鎖配列決定により決定された。
所望の遺伝子セグメントは、必要に応じて、適切なテンプレートを用いてPCRによって生成するか、又は自動化された遺伝子合成による合成オリゴヌクレオチド及びPCR生成物からGeneart AG(Regensburg、Germany)により合成した。正確な遺伝子配列が入手可能でない場合、最も近いホモログ由来の配列に基づいてオリゴヌクレオチドプライマーを設計し、適切な組織を起源とするRNAからRT−PCRによって遺伝子を単離した。特異な制限エンドヌクレアーゼ切断部位に隣接する遺伝子セグメントを、標準のクローニング/シーケンシングベクター中にクローニングした。形質転換した細菌からプラスミドDNAを精製し、UV分光法により濃度を決定した。サブクローニングされた遺伝子断片のDNA配列を、DNA配列決定によって確認した。遺伝子セグメントは、それぞれの発現ベクター中へのサブクローニングを可能にする適切な制限部位を用いて設計された。すべてのコンストラクトは、真核細胞内の分泌のためにタンパク質を標的とするリーダーペプチドをコードする5’末端DNA配列を含むように設計された。
ヒト化CD19バインダー(変種5)を、欧州特許出願EP15187820.4(参照によりその全体を本明細書に包含する)に記載されるようにして調製した。本明細書に示すように、この抗体は、重鎖可変領域の64位におけるN(Asn)からQ(Gln)の点突然変異(Kabatによる番号付け)及び軽鎖可変領域26e位におけるS(Ser)からP(Pro)の点突然変異(Kabatによる番号付け)の導入により、他のヒト化変異体と比較して、改善された安定性、特に脱アミド安定性を有する。この改善されたヒト化抗ヒトCD19抗体では、親マウス抗体(8B8、国際公開第2011/147834号)のヒト/カニクイザル交差反応性が保持される。
この実施例では以下の分子を調製した;これらの模式図を図2に示す:
A.荷電修飾(CD3バインダーにおけるVH/VL交換、CD19バインダーにおける荷電修飾、親マウスのCD19バインダー(8B8))を有する「2+1のIgG CrossFab、反転型」(図2A、配列番号22〜25)
B.荷電修飾(CD3バインダーにおけるCH1/CL交換、親マウスのCD19バインダー(8B8))を有さない「2+1のIgG CrossFab、反転型」(図2B、配列番号26〜29)
C.荷電修飾(CD3バインダーにおけるVH/VL交換、CD19バインダーにおける荷電修飾、ヒト化CD19バインダー(変種5))を有する「2+1のIgG CrossFab、反転型」(図2C、配列番号24、30〜32)
D.荷電修飾(CD3バインダーにおけるCH1/CL交換、マウスのCD19バインダー10C1)を有さない「2+1のIgG CrossFab、反転型」(図2D、配列番号28、41〜43)
E.荷電修飾(CD3バインダーにおけるCH1/CL交換、親マウスのCD19バインダー(8B8))を有さない「1+1のIgG CrossFab、反転型」(図2E、配列番号27〜29、44)
F.荷電修飾(CD3バインダーにおけるVH/VL交換、CD19バインダーにおける荷電修飾、親マウスのCD19バインダー(8B8))を有する「1+1のIgG CrossMab」,(図2F、配列番号22、24、25、45)
G.荷電修飾(CD19バインダーにおけるVH/VL交換、CD3バインダーにおける荷電修飾、親マウスのCD19バインダー(8B8))を有する「2+1のIgG CrossFab、反転型」(図2G、配列番号46〜49)
H.荷電修飾(CD3バインダーにおけるVH/VL交換、CD19バインダーにおける荷電修飾、ヒト化CD19バインダー 2B11)を有する「2+1のIgG CrossFab、反転型」(図2H、配列番号24、114〜116)
CD19 IgG及びCD19 TCBのヒトCD19及びCD3発現標的細胞に対する結合を、CD19発現バーキットリンパ腫細胞(Raji)及びCD3発現不死化Tリンパ細胞株(Jurkat)を用いて試験した。簡潔には、細胞は、回収され、カウントされ、生存率をチェックされて、FACSバッファー(100μlのPBS 0.1% BSA)中に、1mlあたり2×106個の細胞で再懸濁された。100μlの細胞懸濁液(0.2×106個の細胞を含有)を、漸増濃度のCD19 IgG及びCD19 TCB(10pM〜200nM)と共に丸底96ウェルプレートで30分間4℃でインキュベートし、冷たいPBS 0.1% BSAで二度洗浄し、PE−コンジュゲートAffiniPure F(ab’)2断片ヤギ抗ヒトIgG Fcg断片特異的二次抗体(Jackson Immuno Research Lab PE #109−116−170)と共にさらに30分間4℃で再インキュベートし、冷たいPBS 0.1% BSAで二度洗浄し、DAPI陰性の生細胞をゲーティングすることによりFACS CantoII(Software FACS Diva)を用いるFACSにより直ちに分析した。
CD19 TCB抗体によって媒介されるCD19発現腫瘍細胞の溶解及びその後のT細胞活性化を、Nalm−6(B細胞前駆体白血病ALL、70000のCD19結合部位)、Z−138細胞(マントル細胞リンパ腫、10000のCD19結合部位)及びSUDHL−4(B−NHL、40000のCD19結合部位)において評価した。Z−138細胞を用いるアッセイでは、ブリナツモマブを比較のために追加のCD19 TCB抗体として加えた。ヒトPBMCをエフェクターとして使用し、異なる二重特異性抗体とのインキュベーションの18〜21時間経過時点で、腫瘍の溶解を検出した。簡潔には、標的細胞を、回収し、洗浄し、丸底96ウェルプレートを用いて30000細胞/ウェルの密度で播いた。末梢血単核(PBMC)を、健常なヒトドナーから得られた新鮮血のHistopaque密度遠心分離により調製した。新鮮血を滅菌PBSで希釈し、Histopaqueグラジエント上に重ねた(Sigma、H10771)。遠心分離(450×g、30分間、室温、ブレーキなし)後、PBMC含有界面相上の血漿を棄て、PBMCを新しいファルコンチューブに移し、その後50mlのPBSで満たした。混合物を遠心分離(350×g、10分間、室温)し、上清を棄て、PBMCペレットを、滅菌PBSを用いて二度洗浄した(遠心分離工程:300×g、10分間)。その結果得られたPBMC集団を自動カウントし(ViCell)、2%のFCS及び1%のL−粗ニル−L−グルタミン(Biochrom,K0302)を含むRPMI1640培地に6×106細胞/mlで再懸濁した。腫瘍溶解アッセイのために、抗体を示された濃度(0.005pM〜250pMの範囲で3通り)で加えた。PBMCを標的細胞に、最終的なエフェクター対標的(E:T)の比が10:1となるように加えた。腫瘍細胞の溶解を、37℃、5% CO2での20〜24時間のインキュベーションの後に、アポトーシス/壊死細胞による細胞上清中に放出されたLDHの定量化(LDH検出キット、Roche Applied Science、#11 644 793 001)により評価した。標的細胞の最大溶解(=100%)が、1% Triton X−100と共になされた標的細胞のインキュベーションにより達成された。最小溶解(=0%)は、二重特異性コンストラクトなしでエフェクター細胞と共にコインキュベートした標的細胞を指す。腫瘍細胞溶解時に生じるT細胞活性化の評価のために、細胞を、400×gで4分間遠心分離し、0.1%のBSAを含むPBSで二度洗浄した。CD8の表面染色(FITC抗ヒトCD8 Biolegend# 344704又はAPCCy7、抗ヒトCD8 Biolegend# 301016)、CD4(BV421抗ヒトCD4、Biolegend# 300532又はAPC抗ヒトCD4、BD# 555349)、CD25(APC抗ヒトCD25 Biolegend# 356110又はPECy7抗ヒトCD25 Biolegend# 302612)及びCD69(PE抗ヒトCD69、Biolegend# 310906又はBV421抗ヒトCD69、Biolegend# 310930)を、供給者の指示に従って実施した。細胞を、0.1% BSAを含有する150μl/ウェルのPBSを用いて二度洗浄し、100μl/ウェルの固定化バッファー(BD #554655)を用いて4℃で20分間固定した。遠心分離後、試料を100μl/ウェルのPBS 0.1% BSAに再懸濁した。試料をBD FACS CantoIIで分析した。
さらに、二のCD19 TCB抗体(8B8及び10C1クローンに基づく)によって媒介される正常なB細胞の枯渇とその後のT細胞活性化を、正常なボランティア由来のヘパリン添加ヒト新鮮血を用いて評価した。簡潔には、新鮮血は、ヘパリン含有シリンジ中に収集された。血液のアリコート(190μL/ウェル)を、TCB希釈液(10μL/ウェル)を補充した96ディープウェルプレートに配置し、20〜24時間37℃で、加湿した細胞インキュベーター内において5% CO2でインキュベートした。インキュベーション後、血液を、上下にピペット操作することにより混合し、その後35μL/ウェルの血液アリコートを96丸底プレートに移し、合計55μL容積の蛍光性抗CD45(抗ヒトCD45 PerCPCy5.5、Biolegend# 300506)、抗CD4(抗ヒトCD4 FITC、Biolegend# 300506)、抗CD8(抗ヒトCD8 APCCy7、Biolegend# 301016)、抗CD22(抗ヒトCD22 APC、Biolegend# 302510)、抗CD25(抗ヒトCD25 PECy7、Biolegend# 302612)、抗CD14(抗ヒトCD14 PE、Biolegend# 325606)及び抗CD69(抗ヒトCD69 BV421、Biolegend# 310930)と共にフローサイトメトリー用にインキュベートした。室温(暗所)での15分のインキュベーションの後、180μL/ウェルのFACS溶解溶液(BD Biosciences)を加えて赤血球を除去し、フローサイトメトリーに先立って細胞を固定した。図7Aは、8B8クローンに基づくCD19 TCB抗体が、B細胞の枯渇を媒介するうえで10C1クローンに基づくCD19 TCB抗体にやや勝っていたことを示している。同じことが、B細胞の枯渇後のT細胞活性化(CD69マーカー)を示す図7Bによって強調されている。
CD19 TCB抗体(8B8及び10C1クローンに基づく)の交差反応性を、ヒト及びカニクイザルCD19発現B細胞及びCD3発現CD4及びCD8T細胞に対する結合を評価することにより評価した。簡潔には、健常なカニクイザル及び健常なヒトドナー由来のPBMCを新鮮血から単離した。ヒト新鮮血を滅菌PBSで希釈し(2:1)、Histopaqueグラジエント上に重ねた(Sigma、H8889)。遠心分離(450×g、30分間、室温、ブレーキなし)後、PBMC含有界面相上の血漿を棄て、PBMCを新しいFalconチューブに移し、その後50mlのPBSで満たした。混合物を遠心分離した(350×g、10分、室温)。赤血球を、5mlのACK溶解バッファー(ddH2O中、0.155MのNH4Cl+10mMのKHCO3+0.1mMのEDTA(pH7.3)、インキュベーション:5分、室温)を用いて溶解した。10mlの細胞培地を加えた後、遠心分離し、PBMCペレットを滅菌PBSで二度洗浄した(遠心分離工程300×g、10分)。カニクイザル新鮮血を、滅菌PBSで希釈し(1:1)、Histopaqueグラジエント上に重ねた(Sigma、#10771)。遠心分離(520×g、30分、室温、ブレーキなし)後、広帯域PBMCを新しいファルコンチューブに移し、その後50mlのPBSで満たした。混合物を遠心分離(400×g、10分、4℃)し、上清を棄て、PBMCペレットを滅菌PBSを用いて洗浄した(遠心分離:150×g、15分)。赤血球を、1mlのACK溶解バッファー(ddH2O中、0.155MのNH4Cl+10mMのKHCO3+0.1mMのEDTA(pH7.3)、インキュベーション:5分、室温)を用いて溶解した。10mlの細胞培地を加えた後、遠心分離した(300×g、10分、RT)。その結果得られたヒト及びカニクイザルのPBMC集団を自動カウントした(ViCell)。PBMCを、FACSバッファー(PBS+0.1% BSA)中に、4x106細胞/mlで再懸濁した。100μlの細胞懸濁液(0.4x106細胞含有)を、丸底96ウェルプレートに播種し、遠心分離した(420xg、4分)。上清を廃棄し、細胞を、漸増濃度のCD19 TCB(0.05pM〜200nM)と共に30分間4℃でインキュベートし、冷たいPBS 0.1% BSAで二度洗浄し、さらに30分間4℃で、PEコンジュゲートAffiniPure F(ab’)2 断片ヤギ抗ヒトIgG Fcg断片特異的二次抗体(Jackson Immuno Research Lab PE#109−116−170)及び抗hu/cyno CD4 PerCPCy5.5(BD# 552838)、抗hu/cyno CD8 APCCy7(Biolegend# 328824)、抗hu/cyno CD20 PECy7(BD # 560735)と共に再インキュベートし、冷たいPBS 0.1% BSAで洗浄し、BD FACSライジングソリューション(BD # 349202)で固定し、その後細胞を、FACS CantoII(Software FACS Diva)を用いるFACSにより分析した。結合曲線はGraphPadPrism5を使用して得た。
CD19 TCB抗体(8B8クローン)の機能活性及び交差反応性を、健常なボランティア由来の新しく単離されたヒト及びカニクイザルの全血中における正常B細胞の枯渇とその後のT細胞活性化を検出することによりさらに評価した。加えて、CD19 TCB(8B8クローン)の活性を、同じアッセイにおいてブリナツモマブと比較した。簡潔には、ヒト新鮮血をヘパリン含有シリンジに収集し、カニクイザルの血液をLi−Heparinバキュテナーに収集した。血液のアリコート(180μL/ウェル)を、96ディープウェルプレートに配置し、TCB希釈液(20μL/ウェル)を補充し、20時間37℃で、加湿した細胞インキュベーター内において5% CO2でインキュベートした。インキュベーション後、血液を、ピペットを上下に動かすことにより混合し、その後35μLの血液アリコートを96U字底型プレートに移し、合計55μLの容積の蛍光性抗hu CD45 APC(BD#561290)又は抗cyno CD45 APC(Biolegend#304037)、抗hu/cyno CD4 PerCPCy5.5(BD# 552838)、抗hu/cyno CD8 APCCy7(BD#557760)、抗hu/cyno CD20 PECy7(BD#560735)、抗hu/cyno CD25 PE(BD #557138)及び抗hu/cyno CD69 BV421(BD #562883)と共にフローサイトメトリー用にインキュベートした。室温(暗所)での15分のインキュベーションの後、200μL/ウェルのFACS溶解溶液(BD#349202)を加えて赤血球を除去し、フローサイトメトリーに先立って細胞を固定した。
異なるCD19 TCB抗体フォーマットによって媒介される腫瘍細胞溶解とその後のT細胞活性化の比較を、Nalm−6(B細胞前駆体白血病ALL、70000のCD19結合部位)及びZ−138細胞(マントル細胞リンパ腫、10000のCD19結合部位)において評価した。以下のCD19 TCB抗体フォーマット(すべて8B8クローンに基づく)を試験した:図2Bに示す分子B(この実施例では「CD19 TCB_2+1_no charges_inverted」)、図2Eに示す分子E(この実施例では「CD19 TCB_1+1_head to tail_no charges_inverted」)及び図2Fに示す分子F(この実施例では「CD19 TCB_1+1_charges」)。対応する非標的化TCBフォーマット(即ち既知のタンパク質のいずれをも標的化しないDP47バインダーを含むTCB)をネガティブコントロールとして使用した。ヒト単離pan T細胞をエフェクターとして使用し、異なる二重特異性抗体フォーマットとのインキュベーションの21時間経過時点で腫瘍の溶解を検出した。簡潔には、標的細胞を、回収し、洗浄し、丸底96ウェルプレートを用いて30000細胞/ウェルの密度で播いた。末梢血単核(PBMC)を、健常なヒトドナーから得られたヘパリン添加新鮮血のHistopaque密度遠心分離により調製した。新鮮血を滅菌PBSで希釈し(2:1)、Histopaqueグラジエント上に重ねた(Sigma、H10771)。遠心分離(450×g、30分間、室温、ブレーキなし)後、PBMC含有界面相上の血漿を棄て、PBMCを新しいFalconチューブに移し、その後50mlのPBSで満たした。混合物を遠心分離(350×g、10分間、室温)し、上清を棄て、PBMCペレットを滅菌PBSを用いて二度洗浄した(遠心分離工程:300×g、10分間)。その結果得られたPBMC集団を自動カウントした(ViCell)。T細胞を、キットのマニュアルの指示に従ってMiltenyi Biotec社のpan T細胞単離Kit II(#130−091−156)を用いて単離した。
異なるCD19 TCB抗体フォーマット(8B8クローンに基づく)の結合を、ヒトCD19発現標的細胞(Nalm−6及び正常ヒトB細胞)とヒトCD3発現標的細胞(CD4、CD8T細胞及びJurkat細胞)において評価した。以下のCD19 TCB抗体フォーマットを試験した:図2Bに示す分子B(この実施例では「CD19 TCB_2+1_no charges_inverted」)及び図2Aに示す分子A(この実施例では「CD19 TCB_2+1_charges CD19_inverted」)。標的化されていないTCB(即ち、分子Bと同じフォーマットを有するが、既知のタンパク質のいずれをも標的化しないDP47バインダーを含むTCB)をネガティブコントロールとして使用した。簡潔には、細胞は、回収され、カウントされ、生存率をチェックされて、FACSバッファー(100μlのPBS 0.1% BSA)中、1mlあたり1.5×106個の細胞で再懸濁された。100μlの細胞懸濁液(1.5×506個の細胞を含有)を、漸増濃度のCD19 TCB(10pM〜200nM)と共に丸底96ウェルプレートで30分間4℃でインキュベートし、冷たいPBS 0.1% BSAで二度洗浄し、PE−コンジュゲートAffiniPure F(ab’)2断片ヤギ抗ヒトIgG Fcg断片特異的二次抗体(Jackson Immuno Research Lab PE #109−116−170)と共にさらに30分間4℃で再インキュベートし、冷たいPBS 0.1% BSAで二度洗浄し、FACS CantoII(Software FACS Diva)を用いるFACSにより直ちに分析した。
異なるCD19 TCB抗体フォーマットによって媒介される腫瘍細胞溶解とその後のT細胞活性化の比較を、Nalm−6(B細胞前駆体白血病 ALL、70000のCD19結合部位)及びZ−138細胞(マントル細胞リンパ腫、10000のCD19結合部位)において評価した。以下のCD19 TCB抗体フォーマット(すべて8B8クローンに基づく)を試験した:分子B(この実施例では「CD19 TCB_2+1_no charges_inverted」)、分子A(この実施例では「CD19 TCB_2+1_charges CD19_inverted」)及び分子G(この実施例では「CD19 TCB_2+1_charges CD3_inverted」)。標的化されていないTCB(即ち、分子Bと同じフォーマットを有するが、既知のタンパク質のいずれをも標的化しないDP47バインダーを含むTCB)をネガティブコントロールとして使用した。ヒト単離pan T細胞をエフェクターとして使用し、異なる二重特異性抗体フォーマットとのインキュベーションの21時間経過時点で腫瘍の溶解を検出した。簡潔には、標的細胞を、回収し、洗浄し、丸底96ウェルプレートを用いて50000細胞/ウェルの密度で播いた。末梢血単核(PBMC)を、健常なヒトドナーから得られたヘパリン添加新鮮血のHistopaque密度遠心分離により調製した。新鮮血を滅菌PBSで希釈し、Histopaqueグラジエント上に重ねた(Sigma、H10771)。遠心分離(450×g、30分間、室温、ブレーキなし)後、PBMC含有界面相上の血漿を棄て、PBMCを新しいFalconチューブに移し、その後50mlのPBSで満たした。混合物を遠心分離(350×g、10分間、室温)し、上清を棄て、PBMCペレットを、滅菌PBSを用いて二度洗浄した(遠心分離工程:300×g及び350×g、10分間)。その結果得られたPBMC集団を自動カウントした(ViCell)。T細胞を、キットのマニュアルの指示に従ってMiltenyi Biotec社のpan T細胞単離Kit(#130−091−156)を用いて単離した。腫瘍溶解アッセイのために、抗体を、示された濃度(0.1pM〜1nMの範囲で3通り)で加えた。さらに、抗ヒトCD107a PE(Biolegend#328608)を細胞培養物中に加えた。Pan T細胞を、最終的なE:T比が3:1となるように標的細胞に加えた。腫瘍細胞の溶解を、37℃、5% CO2での21時間のインキュベーションの後に、アポトーシス/壊死細胞により細胞上清中に放出されたLDHの定量化(LDH検出キット、Roche Applied Science、#11 644 793 001)によって評価した。標的細胞の最大溶解(=100%)が、1% Triton X−100と共になされた標的細胞のインキュベーションにより達成された。最小溶解(=0%)は、二重特異性コンストラクトなしでエフェクター細胞と共にコインキュベートした標的細胞を指す。腫瘍細胞溶解時に生じるT細胞活性化の評価のために、PBMCを、400×gで4分間遠心分離し、0.1%のBSAを含むPBSで洗浄した。CD8(APCCy7抗ヒトCD8 Biolegend#301016)、CD4(FITC抗ヒトCD4、Biolegend#300506)、CD69(BV421抗ヒトCD69、Biolegend#310930)及びCD25(PECy7抗ヒトCD25 Biolegend#302612)の表面染色を、供給者の指示に従って実行した。細胞を、0.1% BSAを含む150μl/ウェルのPBSで二度洗浄し、PBS 0.1% BSA中において希釈した2%のPFAを用いて固定した。試料をBD FACS CantoIIで分析した。
CD19 TCB抗体によって媒介されるCD19発現腫瘍細胞の溶解とその後のT細胞活性化を、Z−138細胞(マントル細胞リンパ腫、10000のCD19結合部位)において評価した。このアッセイでは、親マウスCD19バインダー8B8を含む分子A(この実施例では「CD19 TCB_8B8_charges CD19_inverted」)を、ヒト化CD19バインダー変種5を含む分子C(この実施例では「CD19 TCB_hum 8B8_charges CD19_inverted」)及びヒト化CD19バインダー2B11を含む分子H(この実施例では「CD19 TCB_8B8−2B11_charges CD19_inverted」).と比較した。ヒトPBMCをエフェクターとして使用し、異なる二重特異性抗体とのインキュベーションの21時間経過時点で、腫瘍の溶解を検出した。簡潔には、標的細胞を、回収し、洗浄し、丸底96ウェルプレートを用いて50000細胞/ウェルの密度で播いた。末梢血単核(PBMC)を、健常なヒトドナーから得られた新鮮血のHistopaque密度遠心分離により調製した。新鮮血を滅菌PBSで希釈し、Histopaqueグラジエント上に重ねた(Sigma、H10771)。遠心分離(450×g、30分間、室温、ブレーキなし)後、PBMC含有界面相上の血漿を棄て、PBMCを新しいFalconチューブに移し、その後50mlのPBSで満たした。混合物を遠心分離(350×g、10分間、室温)し、上清を棄て、PBMCペレットを、滅菌PBSを用いて二度洗浄した(遠心分離工程:300×g、10分間)。その結果得られたPBMC集団を自動カウントし(ViCell)、10%のFCS及び1%のL−アラニル−L−グルタミン(Biochrom,K0302)を含むRPMI1640培地に5×106細胞/mlで再懸濁した。腫瘍溶解アッセイのために、抗体を、示された濃度(0.1pM〜1000pMの範囲で3通り)で加えた。さらに、抗ヒトCD107a PE(Biolegend#328608)を細胞培養物中に加えた。PBMCを標的細胞に、最終的なE:T比が5:1となるように加えた。腫瘍細胞の溶解を、37℃、5% CO2での20〜24時間のインキュベーションの後に、アポトーシス/壊死細胞により細胞上清中に放出されたLDHの定量化(LDH検出キット、Roche Applied Science、#11 644 793 001)によって評価した。標的細胞の最大溶解(=100%)が、2.67% Triton X−100と共になされた標的細胞のインキュベーションにより達成された。最小溶解(=0%)は、二重特異性コンストラクトなしでエフェクター細胞と共にコインキュベートした標的細胞を指す。腫瘍細胞溶解時に生じるT細胞活性化の評価のために、細胞を、400×gで4分間遠心分離し、2%のFCS、5mMのEDTA及び0.25%のナトリウムアシド(sodium acide)を含むPBSで二度洗浄した。CD8(APCCy7、抗ヒトCD8 Biolegend# 301016)、CD4(PerCPCy5.5抗ヒトCD4、BD# 552838)、CD25(PECy7抗ヒトCD25 BD# 557741)及びCD69(BV421抗ヒトCD69、Biolegend# 310930)の表面染色を、供給者の指示に従って実施した。細胞を、150μl/ウェルのFACSバッファーを用いて二度洗浄し、120μl/ウェルの固定化バッファー(BD#554655)を用いて4℃で20分間固定した。試料をBD FACS CantoIIで分析した。
Claims (63)
- T細胞活性化二重特異性抗原結合分子であって、
(a)第1の抗原に特異的に結合する第1の抗原結合部分;
(b)第2の抗原に特異的に結合する第2の抗原結合部分;
を含み、第1の抗原がT細胞活性化抗原であり、第2の抗原がCD19であるか、又は第1の抗原がCD19であり、第2の抗原がT細胞活性化抗原であり;且つ
CD19に特異的に結合する抗原結合部分が、(i)配列番号14の重鎖相補性決定領域(HCDR)1、配列番号15のHCDR2及び配列番号16のHCDR3を含む重鎖可変領域、特にヒト化重鎖可変領域と、配列番号17の軽鎖相補性決定領域(LCDR)1、配列番号18のLCDR2及び配列番号19のLCDR3を含む軽鎖可変領域、特にヒト化軽鎖可変領域、又は(ii)配列番号50の重鎖相補性決定領域(HCDR)1、配列番号51のHCDR2及び配列番号52のHCDR3を含む重鎖可変領域、特にヒト化重鎖可変領域と、配列番号53の軽鎖相補性決定領域(LCDR)1、配列番号54のLCDR2及び配列番号55のLCDR3を含む軽鎖可変領域、特にヒト化軽鎖可変領域を含む、
T細胞活性化二重特異性抗原結合分子。 - CD19に特異的に結合する抗原結合部分が、(i)配列番号20のアミノ酸配列と少なくとも約95%、96%、97%、98%、99%又は100%同一であるアミノ酸配列を含む重鎖可変領域と、配列番号21のアミノ酸配列と少なくとも約95%、96%、97%、98%、99%又は100%同一であるアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域、又は(ii)配列番号56のアミノ酸配列と少なくとも約95%、96%、97%、98%、99%又は100%同一であるアミノ酸配列を含む重鎖可変領域と、配列番号57のアミノ酸配列と少なくとも約95%、96%、97%、98%、99%又は100%同一であるアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域を含む、請求項1に記載のT細胞活性化二重特異性抗原結合分子。
- 第1及び/又は第2の抗原結合部分がFab分子である、請求項1又は2に記載のT細胞活性化二重特異性抗原結合分子。
- 第2の抗原結合部分が、第2の抗原に特異的に結合するFab分子であり、Fab軽鎖とFab重鎖の可変ドメインVLとVH又は定常ドメインCLとCH1が互いによって置き換えられている、請求項1から3のいずれか一項に記載のT細胞活性化二重特異性抗原結合分子。
- 第1の抗原がCD19であり、第2の抗原がT細胞活性化抗原である、請求項1から4のいずれか一項に記載のT細胞活性化二重特異性抗原結合分子。
- T細胞活性化抗原がCD3、特にCD3エプシロンである、請求項1から5のいずれか一項に記載のT細胞活性化二重特異性抗原結合分子。
- T細胞活性化抗原に特異的に結合する抗原結合部分が、配列番号4の重鎖相補性決定領域(CDR)1、配列番号5の重鎖CDR2、配列番号6の重鎖CDR3、配列番号8の軽鎖CDR1、配列番号9の軽鎖CDR2及び配列番号10の軽鎖CDR3を含む、請求項1から6のいずれか一項に記載のT細胞活性化二重特異性抗原結合分子。
- T細胞活性化抗原に特異的に結合する抗原結合部分が、配列番号3のアミノ酸配列と少なくとも約95%、96%、97%、98%、99%又は100%同一であるアミノ酸配列を含む重鎖可変領域と、配列番号7のアミノ酸配列と少なくとも約95%、96%、97%、98%、99%又は100%同一であるアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域を含む、請求項1から7のいずれか一項に記載のT細胞活性化二重特異性抗原結合分子。
- (a)による第1の抗原結合部分が、第1の抗原に特異的に結合する第1のFab分子であり、(b)による第2の抗原結合部分が、Fab軽鎖とFab重鎖の可変ドメインVLとVHが互いによって置き換えられている第2の抗原に特異的に結合する第2のFab分子であり;
且つ
i)a)による第1のFab分子の定常ドメインCLにおいて、124位のアミノ酸が、独立して、リジン(K)、アルギニン(R)又はヒスチジン(H)によって置換されており(Kabatによる番号付け)、且つa)による第1のFab分子の定常ドメインCH1において、147位のアミノ酸又は213位のアミノ酸が、独立して、グルタミン酸(E)、又はアスパラギン酸(D)によって置換されている(Kabat EUインデックスによる番号付け);又は
ii)b)による第2のFab分子の定常ドメインCLにおいて、124位のアミノ酸が、独立して、リジン(K)、アルギニン(R)又はヒスチジン(H)によって置換されており(Kabatによる番号付け)、且つb)による第2のFab分子の定常ドメインCH1において、147位のアミノ酸又は213位のアミノ酸が、独立して、グルタミン酸(E)、又はアスパラギン酸(D)によって置換されている(Kabat EUインデックスによる番号付け)、
請求項1から8のいずれか一項に記載のT細胞活性化二重特異性抗原結合分子。 - a)による第1のFab分子の定常ドメインCLにおいて、124位のアミノ酸が、独立して、リジン(K)、アルギニン(R)又はヒスチジン(H)により置換されており(Kabatによる番号付け)、且つa)による第1のFab分子の定常ドメインCH1において、147位のアミノ酸又は213位のアミノ酸が、独立して、グルタミン酸(E)、又はアスパラギン酸(D)によって置換されている(Kabat EUインデックスによる番号付け)、請求項9に記載のT細胞活性化二重特異性抗原結合分子。
- a)による第1のFab分子の定常ドメインCLにおいて、124位のアミノ酸が、独立して、リジン(K)、アルギニン(R)又はヒスチジン(H)により置換されており(Kabatによる番号付け)、且つa)による第1のFab分子の定常ドメインCH1において、147位のアミノ酸が、独立して、グルタミン酸(E)、又はアスパラギン酸(D)によって置換されている(Kabat EUインデックスによる番号付け)、請求項9又は10に記載のT細胞活性化二重特異性抗原結合分子。
- a)による第1のFab分子の定常ドメインCLにおいて、124位のアミノ酸が、独立して、リジン(K)、アルギニン(R)又はヒスチジン(H)によって置換されており(Kabatによる番号付け)、123位のアミノ酸が、独立して、リジン(K)、アルギニン(R)又はヒスチジン(H)によって置換されており(Kabatによる番号付け)、且つa)による第1のFab分子の定常ドメインCH1において、147位のアミノ酸が、独立して、グルタミン酸(E)、又はアスパラギン酸(D)によって置換されており(Kabat EUインデックスによる番号付け)、213位のアミノ酸が、独立して、グルタミン酸(E)、又はアスパラギン酸(D)によって置換されている(Kabat EUインデックスによる番号付け)、請求項9から11のいずれか一項に記載のT細胞活性化二重特異性抗原結合分子。
- a)による第1のFab分子の定常ドメインCLにおいて、124位のアミノ酸がリジン(K)によって置換されており(Kabatによる番号付け)、123位のアミノ酸がアルギニン(R)によって置換されており(Kabatによる番号付け)、且つa)による第1のFab分子の定常ドメインCH1において、147位のアミノ酸がグルタミン酸(E)によって置換されており(Kabat EUインデックスによる番号付け)、213位のアミノ酸がグルタミン酸(E)によって置換されている(Kabat EUインデックスによる番号付け)、請求項9から12のいずれか一項に記載のT細胞活性化二重特異性抗原結合分子。
- a)による第1のFab分子の定常ドメインCLにおいて、124位のアミノ酸がリジン(K)によって置換されており(Kabatによる番号付け)、123位のアミノ酸がリジン(K)によって置換されており(Kabatによる番号付け)、且つa)による第1のFab分子の定常ドメインCH1において、147位のアミノ酸がグルタミン酸(E)によって置換されており(Kabat EUインデックスによる番号付け)、213位のアミノ酸がグルタミン酸(E)によって置換されている(Kabat EUインデックスによる番号付け)、請求項9から12のいずれか一項に記載のT細胞活性化二重特異性抗原結合分子。
- b)による第2のFab分子の定常ドメインCLにおいて、124位のアミノ酸が、独立して、リジン(K)、アルギニン(R)又はヒスチジン(H)によって置換されており(Kabatによる番号付け)、且つb)による第2のFab分子の定常ドメインCH1において、147位のアミノ酸又は213位のアミノ酸が、独立して、グルタミン酸(E)、又はアスパラギン酸(D)によって置換されている(Kabat EUインデックスによる番号付け)、請求項9に記載のT細胞活性化二重特異性抗原結合分子。
- b)による第2のFab分子の定常ドメインCLにおいて、124位のアミノ酸が、独立して、リジン(K)、アルギニン(R)又はヒスチジン(H)によって置換されており(Kabatによる番号付け)、且つb)による第2のFab分子の定常ドメインCH1において、147位のアミノ酸が、独立して、グルタミン酸(E)、又はアスパラギン酸(D)によって置換されている(Kabat EUインデックスによる番号付け)、請求項9又は15に記載のT細胞活性化二重特異性抗原結合分子。
- b)による第2のFab分子の定常ドメインCLにおいて、124位のアミノ酸が、独立して、リジン(K)、アルギニン(R)又はヒスチジン(H)によって置換されており(Kabatによる番号付け)、123位のアミノ酸が、独立して、リジン(K)、アルギニン(R)又はヒスチジン(H)によって置換されており(Kabatによる番号付け)、且つb)による第2のFab分子の定常ドメインCH1において、147位のアミノ酸が、独立して、グルタミン酸(E)、又はアスパラギン酸(D)によって置換されており(Kabat EUインデックスによる番号付け)、213位のアミノ酸が、独立して、グルタミン酸(E)、又はアスパラギン酸(D)によって置換されている(Kabat EUインデックスによる番号付け)、請求項9、15及び16のいずれか一項に記載のT細胞活性化二重特異性抗原結合分子。
- b)による第2のFab分子の定常ドメインCLにおいて、124位のアミノ酸がリジン(K)によって置換されており(Kabatによる番号付け)、123位のアミノ酸がアルギニン(R)によって置換されており(Kabatによる番号付け)、且つb)による第2のFab分子の定常ドメインCH1において、147位のアミノ酸がグルタミン酸(E)によって置換されており(Kabat EUインデックスによる番号付け)、213位のアミノ酸がグルタミン酸(E)によって置換されている(Kabat EUインデックスによる番号付け)、請求項9及び15から17のいずれか一項に記載のT細胞活性化二重特異性抗原結合分子。
- b)による第2のFab分子の定常ドメインCLにおいて、124位のアミノ酸がリジン(K)によって置換されており(Kabatによる番号付け)、123位のアミノ酸がリジン(K)によって置換されており(Kabatによる番号付け)、且つb)による第2のFab分子の定常ドメインCH1において、147位のアミノ酸がグルタミン酸(E)によって置換されており(Kabat EUインデックスによる番号付け)、213位のアミノ酸がグルタミン酸(E)によって置換されている(Kabat EUインデックスによる番号付け)、請求項9及び15から17のいずれか一項に記載のT細胞活性化二重特異性抗原結合分子。
- c)第1の抗原に特異的に結合する第3の抗原結合部分
をさらに含む、請求項1から19のいずれか一項に記載のT細胞活性化二重特異性抗原結合分子。 - 第3の抗原結合部分がFab分子である、請求項20に記載のT細胞活性化二重特異性抗原結合分子。
- 第3の抗原結合部分が第1の抗原結合部分と同一である、請求項20又は21に記載のT細胞活性化二重特異性抗原結合分子。
- 第1及び第3の抗原結合部分が標的細胞抗原に特異的に結合し、第2の抗原結合部分がT細胞活性化抗原、特にCD3、さらに詳細にはCD3エプシロンに特異的に結合する、請求項20から22のいずれか一項に記載のT細胞活性化二重特異性抗原結合分子。
- d)安定に会合することができる第1及び第2のサブユニットからなるFcドメイン
を追加的に含む、請求項1から23のいずれか一項に記載のT細胞活性化二重特性抗原結合分子。 - 第1の抗原結合部分と第2の抗原結合部分が、任意選択的にペプチドリンカーを介して、互いに融合している、請求項1から24のいずれか一項に記載のT細胞活性化二重特異性抗原結合分子。
- 第1及び第2の抗原結合部分がFab分子であり、第2の抗原結合部分がFab重鎖のC末端において第1の抗原結合部分のFab重鎖のN末端に融合している、請求項1から25のいずれか一項に記載のT細胞活性化二重特異性抗原結合分子。
- 第1及び第2の抗原結合部分がFab分子であり、第1の抗原結合部分がFab重鎖のC末端において第2の抗原結合部分のFab重鎖のN末端に融合している、請求項1から25のいずれか一項に記載のT細胞活性化二重特異性抗原結合分子。
- 第1及び第2の抗原結合部分がFab分子であり、第1の抗原結合部分のFab軽鎖と第2の抗原結合部分のFab軽鎖が、任意選択的にペプチドリンカーを介して、互いに融合している、請求項26又は27に記載のT細胞活性化二重特異性抗原結合分子。
- 第1及び第2の抗原結合部分がFab分子であり、第2の抗原結合部分がFab重鎖のC末端においてFcドメインの第1又は第2のサブユニットのN末端に融合している、請求項24に記載のT細胞活性化二重特異性抗原結合分子。
- 第1及び第2の抗原結合部分がFab分子であり、第1の抗原結合部分がFab重鎖のC末端においてFcドメインの第1又は第2のサブユニットのN末端に融合している、請求項24に記載のT細胞活性化二重特異性抗原結合分子。
- 第1及び第2の抗原結合部分がFab分子であり、第1及び第2の抗原結合部分の各々がFab重鎖のC末端においてFcドメインのサブユニットの一つのN末端に融合している、請求項24に記載のT細胞活性化二重特異性抗原結合分子。
- 第3の抗原結合部分がFab分子であり、Fab重鎖のC末端においてFcドメインの第1又は第2のサブユニットのN末端に融合している、請求項24、29、又は30に記載のT細胞活性化二重特異性抗原結合分子。
- 第1、第2及び第3の抗原結合部分がFab分子であり、第2及び第3の抗原結合部分の各々がFab重鎖のC末端においてFcドメインのサブユニットのうちの一つのN末端に融合しており、第1の抗原結合部分がFab重鎖のC末端において第2の抗原結合部分のFab重鎖のN末端に融合している、請求項24に記載のT細胞活性化二重特異性抗原結合分子。
- 第1、第2及び第3の抗原結合部分がFab分子であり、第1及び第3の抗原結合部分の各々がFab重鎖のC末端においてFcドメインのサブユニットの一つのN末端に融合しており、第2の抗原結合部分がFab重鎖のC末端において第1の抗原結合部分のFab重鎖のN末端に融合している、請求項24に記載のT細胞活性化二重特異性抗原結合分子。
- 第1及び第3の抗原結合部分とFcドメインとが、免疫グロブリン分子、特にIgGクラスの免疫グロブリンの一部である、請求項34に記載のT細胞活性化二重特異性抗原結合分子。
- FcドメインがIgG、具体的にはIgG1又はIgG4のFcドメインである、請求項24から35のいずれか一項に記載のT細胞活性化二重特異性抗原結合分子。
- FcドメインがヒトFcドメインである、請求項24から36のいずれか一項に記載のT細胞活性化二重特異性抗原結合分子。
- FcドメインがFcドメインの第1及び第2のサブユニットの会合を促す修飾を含む、請求項24から37のいずれか一項に記載のT細胞活性化二重特異性抗原結合分子。
- Fcドメインの第1のサブユニットのCH3ドメインにおいて、アミノ酸残基がそれよりも大きな側鎖体積を有するアミノ酸残基で置き換えられ、それにより、第1のサブユニットのCH3ドメイン内部に、第2のサブユニットのCH3ドメイン内部の空洞内に配置可能な隆起が形成され、Fcドメインの第2のサブユニットのCH3ドメインにおいて、アミノ酸残基がそれよりも小さな側鎖体積を有するアミノ酸残基で置き換えられ、それにより、第2のサブユニットのCH3ドメイン内部に、第1のサブユニットのCH3ドメイン内部の隆起を配置可能な空洞が形成される、請求項38に記載のT細胞活性化二重特異性抗原結合分子。
- 前記大きな側鎖体積を有するアミノ酸残基が、アルギニン(R)、フェニルアラニン(F)、チロシン(Y)、及びトリプトファン(W)からなる群より選択され、前記小さな側鎖体積を有するアミノ酸残基が、アラニン(A)、セリン(S)、スレオニン(T)、及びバリン(V)からなる群より選択される、請求項39に記載のT細胞活性化二重特異性抗原結合分子。
- Fcドメインの第1のサブユニットのCH3ドメインにおいて、366位のスレオニン残基がトリプトファン残基によって置き換えられており(T366W)、Fcドメインの第2のサブユニットのCH3ドメインにおいて、407位のチロシン残基がバリン残基によって置き換えられており(Y407V)、任意選択的に、Fcドメインの第2のサブユニットにおいて、追加的に366位のスレオニン残基がセリン残基によって(T366S)、及び368位のロイシン残基がアラニン残基によって(L368A)、それぞれ置き換えられている(Kabat EUインデックスによる番号付け)、請求項39又は40に記載のT細胞活性化二重特異性抗原結合分子。
- Fcドメインの第1のサブユニットにおいて、追加的に354位のセリン残基がシステイン残基で置き換えられている(S354C)か、又は356位のグルタミン酸残基がシステイン残基で置き換えられており(E356C)、Fcドメインの第2のサブユニットにおいて、追加的に349位のチロシン残基がシステイン残基により置き換えられている(Y349C)(Kabat EUインデックスによる番号付け)、請求項39から41のいずれか一項に記載のT細胞活性化二重特異性抗原結合分子。
- Fcドメインの第1のサブユニットがアミノ酸置換S354C及びT366Wを含み、Fcドメインの第2のサブユニットがアミノ酸置換Y349C、T366S、L368A及びY407Vを含む(Kabat EUインデックスによる番号付け)、請求項39から42のいずれか一項に記載のT細胞活性化二重特異性抗原結合分子。
- Fcドメインが、天然IgG1のFcドメインと比較して、Fc受容体に対する結合親和性の低下及び/又はエフェクター機能の低下を呈する、請求項24から43のいずれか一項に記載のT細胞活性化二重特異性抗原結合分子。
- Fcドメインが、Fc受容体への結合を低減する及び/又はエフェクター機能を低下させる一又は複数のアミノ酸置換を含む、請求項24から44のいずれか一項に記載のT細胞活性化二重特異性抗原結合分子。
- 前記一又は複数のアミノ酸置換が、L234、L235、及びP329(Kabat EUインデックスによる番号付け)からなる群より選択される一又は複数の位置におけるものである、請求項45に記載のT細胞活性化二重特異性抗原結合分子。
- Fcドメインの各サブユニットが、活性化Fc受容体への結合を低減する及び/又はエフェクター機能を低下させる三つのアミノ酸置換を含んでおり、前記アミノ酸置換はL234A、L235A及びP329Gである(Kabat EUインデックスによる番号付け)、請求項24から46のいずれか一項に記載のT細胞活性化二重特異性抗原結合分子。
- Fc受容体がFcγ受容体である、請求項44から47のいずれか一項に記載のT細胞活性化二重特異性抗原結合分子。
- エフェクター機能が抗体依存性細胞媒介性細胞傷害(ADCC)である、請求項44から48のいずれか一項に記載のT細胞活性化二重特異性抗原結合分子。
- 請求項1から49のいずれか一項に記載のT細胞活性化二重特異性抗原結合分子をコードする一又は複数の単離されたポリヌクレオチド。
- 請求項50に記載のポリヌクレオチドを含む一又は複数のベクター、特に発現ベクター。
- 請求項50に記載のポリヌクレオチド又は請求項51に記載のベクターを含む、宿主細胞。
- CD19及びT細胞活性化抗原に特異的に結合することができるT細胞活性化二重特異性抗原結合分子の生成方法であって、a)請求項52に記載の宿主細胞を、T細胞活性化二重特異性抗原結合分子の発現に適した条件下で培養する工程と、b)任意選択的にT細胞活性化二重特異性抗原結合分子を回収する工程とを含む方法。
- 請求項53に記載の方法により生成される、T細胞活性化二重特異性抗原結合分子。
- 請求項1から49のいずれか一項又は請求項54に記載のT細胞活性化二重特異性抗原結合分子と薬学的に許容される担体とを含む、薬学的組成物。
- 医薬としての使用のための、請求項1から49のいずれか一項又は請求項54に記載のT細胞活性化二重特異性抗原結合分子、又は請求項55に記載の薬学的組成物。
- それを必要とする個体の疾患の治療における使用のための、請求項1から49のいずれか一項又は請求項54に記載のT細胞活性化二重特異性抗原結合分子、又は請求項55に記載の薬学的組成物。
- 疾患ががんである、請求項57に記載のT細胞活性化二重特異性抗原結合分子又は薬学的組成物。
- それを必要とする個体の疾患の治療のための医薬の製造のための、請求項1から49のいずれか一項又は請求項54に記載のT細胞活性化二重特異性抗原結合分子の使用。
- 個体に対し、請求項1から49のいずれか一項又は請求項54に記載のT細胞活性化二重特異性抗原結合分子を薬学的に許容される形態で含む組成物の治療的有効量を投与することを含む、前記個体の疾患の治療方法。
- 前記疾患ががんである、請求項59に記載の使用又は請求項60に記載の方法。
- 標的細胞を、T細胞の存在下において、請求項1から49のいずれか一項又は請求項54に記載のT細胞活性化二重特異性抗原結合分子と接触させることを含む、標的細胞の溶解を誘導するための方法。
- 上述の本発明。
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