TW201741339A - 投與結合至cd33及cd3之雙特異性建構體來用於治療骨髓樣白血病之方 法中 - Google Patents

投與結合至cd33及cd3之雙特異性建構體來用於治療骨髓樣白血病之方 法中 Download PDF

Info

Publication number
TW201741339A
TW201741339A TW106113102A TW106113102A TW201741339A TW 201741339 A TW201741339 A TW 201741339A TW 106113102 A TW106113102 A TW 106113102A TW 106113102 A TW106113102 A TW 106113102A TW 201741339 A TW201741339 A TW 201741339A
Authority
TW
Taiwan
Prior art keywords
construct
leukemia
dose
bispecific
administered
Prior art date
Application number
TW106113102A
Other languages
English (en)
Other versions
TWI752952B (zh
Inventor
吉爾哈德 魯格梅爾
彼德 庫佛
羅曼 金斯琪爾
馬里昂 薩伯克萊溫
克莉絲汀娜 克魯卡
Original Assignee
安美基研究（慕尼黑）公司
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by 安美基研究（慕尼黑）公司 filed Critical 安美基研究（慕尼黑）公司
Publication of TW201741339A publication Critical patent/TW201741339A/zh
Application granted granted Critical
Publication of TWI752952B publication Critical patent/TWI752952B/zh

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/28—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • C07K16/2803—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants against the immunoglobulin superfamily
    • C07K16/2809—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants against the immunoglobulin superfamily against the T-cell receptor (TcR)-CD3 complex
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents
    • A61P35/02—Antineoplastic agents specific for leukemia
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/28—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • C07K16/2803—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants against the immunoglobulin superfamily
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/28—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • C07K16/2896—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants against molecules with a "CD"-designation, not provided for elsewhere
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/28—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • C07K16/30—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants from tumour cells
    • C07K16/3061—Blood cells
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/505—Medicinal preparations containing antigens or antibodies comprising antibodies
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/545—Medicinal preparations containing antigens or antibodies characterised by the dose, timing or administration schedule
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/30—Immunoglobulins specific features characterized by aspects of specificity or valency
    • C07K2317/31—Immunoglobulins specific features characterized by aspects of specificity or valency multispecific
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/30—Immunoglobulins specific features characterized by aspects of specificity or valency
    • C07K2317/32—Immunoglobulins specific features characterized by aspects of specificity or valency specific for a neo-epitope on a complex, e.g. antibody-antigen or ligand-receptor
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/60—Immunoglobulins specific features characterized by non-natural combinations of immunoglobulin fragments
    • C07K2317/62—Immunoglobulins specific features characterized by non-natural combinations of immunoglobulin fragments comprising only variable region components
    • C07K2317/622—Single chain antibody (scFv)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/90—Immunoglobulins specific features characterized by (pharmaco)kinetic aspects or by stability of the immunoglobulin

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Oncology (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)
  • Pharmaceuticals Containing Other Organic And Inorganic Compounds (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)
  • Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
  • Nitrogen And Oxygen Or Sulfur-Condensed Heterocyclic Ring Systems (AREA)
  • Medicinal Preparation (AREA)
  • Acyclic And Carbocyclic Compounds In Medicinal Compositions (AREA)

Abstract

本發明提供包含特異性結合至CD33之第一結合域及特異性結合至CD3之第二結合域之雙特異性建構體，其用於治療骨髓樣白血病之方法中，其中投與該建構體達最長14天之時段，然後至少14天之時段則不投與該建構體。此外，本發明提供用於治療骨髓樣白血病之方法，其包含投與治療有效量之該雙特異性建構體；及該雙特異性建構體之用途，其用於製備用來治療骨髓樣白血病之醫藥組合物。

Description

投與結合至CD33及CD3之雙特異性建構體來用於治療骨髓樣白血病之方 法中
本發明係關於包含特異性結合至CD33之第一結合域及特異性結合至CD3之第二結合域的雙特異性建構體，其用於治療骨髓樣白血病之方法中，其中投與該建構體達最長14天之時段，其後至少14天之時段則不投與該建構體。此外，本發明係關於用於治療骨髓樣白血病之方法，其包含投與治療有效量之該雙特異性建構體；及該雙特異性建構體之用途，其用於製備用來治療骨髓樣白血病之醫藥組合物。
諸如BiTE®(雙特異性T細胞接合器)抗體建構體等雙特異性分子為自兩個撓性連接抗體源結合域製得之重組蛋白建構體。BiTE®抗體建構體之一個結合域特異性針對靶細胞上之所選腫瘤相關表面抗原；第二結合域特異性針對CD3(T細胞上之T細胞受體複合物之亞單位)。藉由其特定設計，BiTE®抗體建構體獨特地適於短暫連結T細胞與靶細胞，且同時有效地活化T細胞對靶細胞之固有溶細胞潛能。第一代BiTE®抗體建構體(參見WO 99/54440及WO 2005/040220)以AMG 103(蘭妥莫單抗(blinatumomab))及AMG 110(蘇力圖單抗(solitomab))形式形成於臨床中。該等BiTE®抗體建構體經由連續靜脈內輸注來投與。舉例而言，蘭妥莫單抗在B急性淋巴母細胞性白血病中以4週輸注來投與，其中在第1週輸注較低初始劑量且在第1週期之其餘治療中及開始後之所有其他週期中輸注較高劑量。在開始第二週期之前有兩週之不治療時段。已對蘇力圖單抗使用類似投與方案，經至少28天使用遞增劑量以連續靜脈內輸注投與該單抗亦及介於兩個週期之間之兩週不治療時段。
第一代BiTE®抗體建構體之重要的進一步發展為提供結合至人類及白鬢狨(Callithrix jacchus)、棉冠獠狨(Saguinus oedipus)或松鼠猴(Saimiri sciureus)之CD3ε鏈N末端之背景獨立表位的雙特異性抗體建構體(WO 2008/119567)。在此申請案中亦揭示另外結合至CD33之雙特異性抗體。CD33為尤其在大多數患者之AML母細胞上及可能在一些患者之白血病幹細胞上發現之唾液酸依賴性細胞黏著分子，稱為骨髓樣分化抗原。因此，CD33已經鑑別為骨髓樣白血病之有前景之標記物及治療該等疾病之靶分子。
Mylotarg®(吉妥珠單抗奧佐米星(gemtuzumab ozogamcin))係一種連接至針對存在於白血病骨髓母細胞上之CD33抗原之重組單株抗體之細胞毒性抗生素，其在美國已經由加速批准批准用於AML患者。然而，在藥物無法展示證實的試驗中之臨床益處及在售後環境中所觀察到之增加的靜脈阻塞疾病風險後，該藥物由製造商自發退出美國市場。頻繁報導之使用吉妥珠單抗奧佐米星所觀察到之毒性包括嗜中性球減少症及血小板減少症，且較不頻繁報導之毒性包括與急性輸注相關反應(過敏反應)相關之事件、肝毒性及靜脈阻塞疾病。
定義
必須注意，除非上下文另外明確指示，否則如本文所用之單數形式「一(a、an)」及「該」包括複數個指示物。因此，例如，對「試劑」之提及包括該等不同試劑中之一或多者，且對「方法」之提及包括提及熟習此項技術者已知可經修改或取代本文所述方法之等效步驟及方法。
除非另外指示，否則在一系列要素之前之術語「至少」應理解為指該等系列中之每個要素。熟習此項技術者將僅使用常規實驗即意識到或能夠明瞭本文所述之本發明特定實施例之許多等效物。該等等效物意欲涵蓋於本發明中。
本文無論何處使用之術語「及/或」包括「及」、「或」及「由該術語連結之要素之所有或任何其他組合」之含義。
如本文所用術語「約」或「大約」意指在給定值或範圍之 ±20%內，較佳在±15%內，更佳在±10%內，且最佳在±5%內。
在本說明書通篇及隨附申請專利範圍中，除非上下文另外需要，否則詞語「包含(comprise)」及諸如「包含(comprises及comprising)」等變化形式應理解為暗指包括所述整數或步驟或整數或步驟之群，但並不排除任何其他整數或步驟或整數或步驟之群。當用於本文中時，術語「包含」可經術語「含有」或「包括」或有時當用於本文中時經術語「具有」取代。
當用於本文中時，「由......組成」不包括所主張要素中未指定之任何要素、步驟或成分。當用於本文中時，「基本上由......組成」並不排除實質上不影響申請專利範圍之基本及新穎特徵之材料或步驟。
在本文之每一情況下，術語「包含」、「基本上由......組成」及「由......組成」中之任一者可經其他兩個術語中之任一者替代。
本發明之詳細描述
在急性淋巴母細胞性白血病之治療中藉由連續靜脈內輸注達4週(第一週為5μg/m2/天且此後為15μg/m2/天)給予蘭妥莫單抗，其後兩週不治療(一個週期)達至多五個週期。藉此，該治療消除CD19+細胞之隔室，該隔室係限於B細胞譜系之隔室。
在測試CD33特異性BiTE®之動物研究中，與該分子之所提出作用模式一致，觀察到短暫骨髓抑制，包括循環中性球、血小板及紅血球質量之減小。與所提出作用模式一致，白血球之減少以及活化動物研究中之預期增多產生短暫骨髓抑制，包括循環嗜中性球、血小板及紅血球質量之減小。在所有劑量組中觀察到白血球之減少以及活化T淋巴球之預期增多及細胞介素含量之增加。發熱性嗜中性球減少症及嗜中性球減少症為在患有惡性血液疾病之患者及先前組合化學療法中所觀察到之常見事件。
出血為AML治療之常見的潛在嚴重併發症，最常繼發於血小板減少症。在出血併發症中，尤其重要的為散播性血管內凝血(DIC)症候群，其歸因於血液凝固之大量血管內活化及凝血因子及血小板之消耗，從而引起嚴重出血。在成年AML患者中，在住院當天已觀察到1%之致死性出血，其皆存在白血球極度過多症或急性前骨髓細胞性白血病(APL)。AML 患者中之最新數據顯示9.9%之出血性死亡率。另外，在此AML患者群體中，在泛血球減少症患者之未治癒的感染與終端出血之間可存在強關聯。
業內亦公認免疫功能不足患者易患常見社區獲得性及機會性感染二者。感染為癌症患者之發病率及死亡率之主要病因，且儘管某些癌症本質上與免疫功能不足相關，但感染之風險主要與細胞毒性之強度及持續時間以及免疫抑制療法相關。
根據上文所述，本發明之根本問題在於，急性骨髓樣白血病中之情形與急性淋巴母細胞性白血病相比有所不同。骨髓樣隔室包括為存活所需之廣譜細胞譜系。因此，無法簡單地將ALL中之蘭妥莫單抗投與方案轉移至使用AML特異性雙特異性抗體建構體治療AML。對於使用CD33+細胞消除治療方式之有效AML治療，該治療需要足夠長以有效且足夠短以最小化對骨髓樣隔室中為存活所需之彼等細胞類型之毒性。另外，劑量亦需要足夠有效。已顯示，治療之持續時間及較高劑量可改良離體研究之效能。
此問題係例如藉由以下方法來解決：提供包含特異性結合至CD33之第一結合域及特異性結合至CD3之第二結合域之雙特異性建構體(CD33/CD3)來用於治療骨髓樣白血病之方法中，其中投與建構體達最長14天之時段，其後為至少14天不投與建構體之時段。
使用與本發明一致之投與時間表，較佳施加具有遞增劑量值之分步投藥可在長達14天之CD33/CD3雙特異性建構體投與時段期間有效地消除骨髓樣白血病細胞，同時仍允許患者在至少14天不投與建構體之時段中恢復骨髓樣隔室。同時，分步投藥較佳消除諸如細胞介素釋放症候群等嚴重免疫副作用之風險。
如自圖1顯而易見，CD33在骨髓樣細胞(包含共同骨髓樣先驅細胞、骨髓母細胞、單核細胞)表面上之表現已在文獻中藉由流式細胞術展示。此外，巨噬細胞表面上之CD33表現已經由免疫組織化學法展示。骨髓樣隔室中之彼等CD33+細胞群體在用本文所述之雙特異性建構體治療患者時得以消除。由於彼等細胞群體中之一些本身為骨髓樣隔室中其他細胞群體之先驅細胞的事實，故共同骨髓樣先驅細胞下游之所有細胞類型之造 血作用受影響，此引起泛血球減少症。
對於骨髓樣白血病之成功治療，需要將患者顯著暴露(即一定暴露時長)於本文所述之雙特異性建構體以誘導T細胞活化/增殖及彼等T細胞之細胞毒性活性。然而，基於上述觀察結果，雙特異性建構體之投與時段持續越長，預期泛血球減少症越長。因此，本發明根本問題之解決方案為平衡暴露時長與雙特異性建構體之劑量，此使得能夠利用停止治療時段有效地消除白血病細胞，在該時段期間允許患者之骨髓樣隔室恢復。此由上述投與方案反映。
應理解，當活性化合物(例如雙特異性化合物)之血清含量降至所定義臨限值以下時，到達投與時段之結束。該臨限值之實例為低於EC90值、較佳低於EC50值、更佳低於EC10值之血清含量。該等EC值可於細胞毒性分析中使用CD33+靶細胞及人類PBL作為與分析一致之效應細胞來定義。
在雙特異性單鏈抗體建構體(例如AMG 330，參見SEQ ID NO：104，已知其具有短血清半衰期(基於隨附實例2中所顯示之PK參數，小鼠中AMG 330之半衰期為6.5至8.7h，而人類中AMG 330之所預測半衰期為約2小時))之情形下，血清含量在停止連續iv投與後短時間內、即幾乎在投與期結束後立即降至上文所討論臨限值以下。在半衰期延長之雙特異性單鏈抗體建構體情形下，必須按計劃結束投與期以確保下降至與本發明之治療基模一致之臨限值以下。
測定適於本發明之雙特異性建構體之特定ECx值的分析闡述於下文實例中。
術語「雙特異性建構體」指具有適於特異性結合兩個個別靶結構之結構的分子。在本發明上下文中，該等雙特異性建構體特異性結合至靶細胞之細胞表面上之CD33及T細胞之細胞表面上之CD3。在雙特異性建構體之較佳實施例中，雙特異性建構體之至少一個、更佳兩個結合域基於抗體之結構及/或功能。該等建構體可稱為與本發明一致之「雙特異性抗體建構體」。
術語「抗體建構體」指結構及/或功能基於抗體(例如全長抗 體或完整免疫球蛋白分子)之結構及/或功能的分子。因此，抗體建構體能夠結合至其特異性靶或抗原。另外，本發明之抗體建構體包含抗體之允許靶結合之最低結構要求。此最低要求可例如定義為存在至少三個輕鏈CDR(即VL區之CDR1、CDR2及CDR3)及/或三個重鏈CDR(即VH區之CDR1、CDR2及CDR3)。本發明建構體所基於之抗體包括例如單株、重組、嵌合、去免疫化、人類化及人類抗體。
全長或全抗體在本發明「抗體建構體」之定義內，亦包括駱駝抗體及藉由生物技術或蛋白質改造方法或製程產生之其他免疫球蛋白抗體。該等全長抗體可為例如單株、重組、嵌合、去免疫化、人類化及人類抗體。全長抗體之片段(例如VH、VHH、VL、(s)dAb、Fv、Fd、Fab、Fab’、F(ab')2或「r IgG」(「半抗體」))亦在「抗體建構體」之定義內。本發明之抗體建構體亦可為抗體之經修飾片段，亦稱為抗體變體，例如scFv、二-scFv或雙-scFv、scFv-Fc、scFv拉鏈、scFab、Fab2、Fab3、雙價抗體、單鏈雙價抗體、串聯雙價抗體(串聯雙體抗體)、串聯二-scFv、串聯三-scFv；由如下結構例示之「微抗體」：(VH-VL-CH3)2、(scFv-CH3)2、((scFv)2-CH3+CH3)、((scFv)2-CH3)或(scFv-CH3-scFv)2；多價抗體，例如三價抗體或四價抗體；及單域抗體，例如奈米抗體或僅包含一個可變域(其可為VHH、VH或VL)之單可變域抗體，其特異性結合獨立於其他V區或域之抗原或表位。
結合域通常可包含抗體輕鏈可變區(VL)及抗體重鏈可變區(VH)；然而，其不必包含二者。舉例而言，Fd片段具有兩個VH區且通常保留完整抗原結合域之一定抗原結合功能。抗體片段、抗體變體或結合域之格式之其他實例包括(1)Fab片段，其為具有VL、VH、CL及CH1域之單價片段；(2)F(ab')2片段，其為具有兩個在鉸鏈區由二硫橋連接之Fab片段之二價片段；(3)具有兩個VH及CH1域之Fd片段；(4)具有抗體單臂之VL及VH域之Fv片段，(5)dAb片段(Ward等人(1989)Nature 341：544-546)，其具有VH域；(6)經分離互補決定區(CDR)，及(7)單鏈Fv(scFv)，後者較佳(例如，衍生自scFV文庫)。本發明抗體建構體之實施例之實例揭示於例如以下專利中：WO 00/006605、WO 2005/040220、WO 2008/119567、WO 2010/037838、WO 2013/026837、WO 2013/026833、US 2014/0308285、US 2014/0302037、W O2014/144722、WO 2014/151910及WO 2015/048272。
另外，術語「抗體建構體」之定義包括單價、二價及多價(polyvalent)/多價(multivalent)建構體，且因此包括僅特異性結合至一個抗原結構之單特異性建構體以及經由不同結合域特異性結合一個以上抗原結構(例如兩個、三個或更多個)之雙特異性及多特異性(polyspecific)/多特異性(multispecific)建構體。此外，術語「抗體建構體」之定義包括僅由一條多肽鏈組成之分子以及由一條以上之多肽鏈組成之分子，該等鏈可相同(同二聚體、同三聚體或同寡聚體)或不同(異二聚體、異三聚體或異寡聚體)。上文所鑑別抗體及其變體或衍生物之實例尤其闡述於以下文獻中：Harlow及Lane,Antibodies a laboratory manual,CSHL Press(1988)及Using Antibodies：a laboratory manual,CSHL Press(1999)；Kontermann及Dübel,Antibody Engineering,Springer，第2版，2010；及Little,Recombinant Antibodies for Immunotherapy,Cambridge University Press 2009。
本發明之抗體建構體較佳為「活體外產生之抗體建構體」。此術語指依照上述定義之抗體建構體，其中可變區之全部或一部分(例如至少一個CDR)以非免疫細胞選擇(例如活體外噬菌體展示、蛋白質晶片或可測試候選序列結合至抗原之能力之任何其他方法)來產生。因此，此術語較佳排除僅藉由動物之免疫細胞之基因組重排產生之序列。「重組抗體」為經由使用重組DNA技術或遺傳改造製得之抗體。
本發明雙特異性抗體建構體之實施例為「單鏈抗體建構體」。彼等單鏈抗體建構體僅包括抗體建構體之上述實施例，其由單一肽鏈組成。
如本文所用術語「單株抗體」(mAb)或單株抗體建構體指自實質上均一之抗體群體獲得之抗體，即包含該群體之個別抗體相同，只是可存在少量可能的天然突變及/或轉譯後修飾(例如異構化、醯胺化)。單株抗體具有高度特異性，針對抗原上之單一抗原位點或決定簇，此與通常包括針對不同決定簇(或表位)之不同抗體之習用(多株)抗體製劑不同。除其特異性外，單株抗體之優點在於，其由雜交瘤培養物合成，因此未經其他免 疫球蛋白污染。修飾語「單株」指示抗體為自實質上均一之抗體群體獲得之特徵，且不應理解為需要藉由任何特定方法來產生該抗體。
對於單株抗體之製備，可使用任何提供由連續細胞系培養物產生之抗體之技術。舉例而言，欲使用之單株抗體可藉由首次闡述於Koehler等人，Nature,256：495(1975)中之雜交瘤方法製得，或可藉由重組DNA方法製得(例如，參見美國專利第4,816,567號)。產生人類單株抗體之其他技術之實例包括三元雜交瘤技術、人類B細胞雜交瘤技術(Kozbor,Immunology Today 4(1983),72)及EBV-雜交瘤技術(Cole等人，Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy,Alan R.Liss,Inc.(1985),77-96)。
然後可使用諸如酶聯免疫吸附分析(ELISA)及表面電漿共振(BIACORETM)分析等標準方法來篩選雜交瘤，以鑑別出一或多種產生與指定抗原特異性結合之抗體之雜交瘤。可使用相關抗原之任一形式作為免疫原，例如重組抗原、天然形式、其任何變體或片段以及其抗原肽。可使用如用於BIAcore系統中之表面電漿共振來增加噬菌體抗體之結合至靶抗原之表位(例如靶細胞表面抗原CD33或CD3ε)的效率(Schier,Human Antibodies Hybridomas 7(1996),97-105；Malmborg,J.Immunol.Methods 183(1995),7-13)。
製備單株抗體之另一實例性方法包括篩選蛋白質表現文庫，例如噬菌體展示或核糖體展示文庫。噬菌體展示闡述於例如Ladner等人，美國專利第5,223,409號；Smith(1985)Science 228：1315-1317；Clackson等人，Nature,352：624-628(1991)；及Marks等人，J.Mol.Biol.,222：581-597(1991)中。
除使用展示文庫外，可使用相關抗原來免疫非人類動物，例如囓齒類動物(例如小鼠、倉鼠、兔或大鼠)。在一個實施例中，非人類動物包括人類免疫球蛋白基因之至少一部分。舉例而言，可用較大人類Ig(免疫球蛋白)基因座片段來改造缺少小鼠抗體產生之小鼠品系。使用雜交瘤技術可產生及選擇衍生自具有所需特異性之基因之抗原特異性單株抗體。例如，參見XENOMOUSETM,Green等人(1994)Nature Genetics 7：13-21、US 2003-0070185、WO 96/34096及WO96/33735。
單株抗體亦可自非人類動物產生，且然後使用業內已知之重組DNA技術進行修飾，例如人類化、去免疫化、使其嵌合等。經修飾抗體建構體之實例包括非人類抗體之人類化變體、「親和力成熟」抗體(例如，參見Hawkins等人，J.Mol.Biol.254,889-896(1992)及Lowman等人，Biochemistry 30,10832-10837(1991))及具有改變的效應功能之抗體突變體(例如，參見美國專利5,648,260、Kontermann及Dübel(2010)，上述引文及Little(2009)，上述引文)。
在免疫學中，親和力成熟為一種方法，藉助該方法B細胞在免疫反應之進程期間產生具有增加的抗原親和力之抗體。藉由反復暴露於相同抗原，宿主將產生親和力遞增之抗體。與天然原型一樣，活體外親和力成熟基於突變及選擇原理。活體外親和力成熟已成功地用於優化抗體、抗體建構體及抗體片段。使用輻射、化學誘變劑或易錯PCR引入CDR內之隨機突變。另外，可藉由鏈改組增加遺傳多樣性。使用如噬菌體展示等展示方法進行兩輪或三輪突變及選擇通常產生親和力在低奈莫耳濃度範圍內之抗體片段。
抗體建構體之較佳類型之胺基酸取代變化涉及取代親代抗體(例如人類化或人類抗體)之一或多個超變區殘基。通常，經選擇用於進一步研發之所得變體將具有相對於產生其之親代抗體改良之生物性質。產生該等取代變體之便利方法涉及使用噬菌體展示之親和力成熟。簡言之，使若干超變區位點(例如6-7個位點)突變以在每一位點產生所有可能的胺基酸取代。由此產生之抗體變體以單價方式自絲狀噬菌體粒子展示為封裝於每一粒子內之M13基因III產物之融合物。然後如本文所揭示針對生物活性(例如結合親和力)篩選噬菌體展示之變體。為鑑別出用於修飾之候選超變區位點，可實施丙胺酸掃描誘變以鑑別出明顯有助於抗原結合之超變區殘基。或者或另外，可有益地分析抗原-抗體複合物之晶體結構以鑑別出結合域與例如人類靶細胞表面抗原CD33之間之接觸點。該等接觸殘基及鄰近殘基為本文詳述技術之候選取代。產生該等變體後，立即使變體組經受如本文所述之篩選，且可選擇在一或多種相關分析中具有優異性質之抗體以供進一步研發。
本發明之單株抗體及抗體建構體特定包括「嵌合」抗體(免疫球蛋白)，其中重鏈及/或輕鏈之一部分與衍生自特定物種或屬於特定抗體類別或子類之抗體中之相應序列一致或同源，而鏈之其餘部分與衍生自另一物種或屬於另一抗體類別或子類之抗體中之相應序列一致或同源，以及該等抗體之片段，只要其展現所需生物活性即可(美國專利第4,816,567號；Morrison等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA,81：6851-6855(1984))。本文所關注之嵌合抗體包括「靈長類化」抗體，其包含衍生自非人類靈長類動物(例如舊大陸猴(Old World Monkey)、人猿等)之可變域抗原結合序列及人類恆定區序列。已闡述多種製備嵌合抗體之方法。例如，參見Morrison等人，Proc.Natl.Acad.ScL U.S.A.81：6851,1985；Takeda等人，Nature 314：452,1985；Cabilly等人，美國專利第4,816,567號；Boss等人，美國專利第4,816,397號；Tanaguchi等人，EP 0171496；EP 0173494；及GB 2177096。
抗體、抗體建構體或抗體片段亦可藉由WO 98/52976及WO 00/34317中所揭示之方法特定缺失人類T細胞表位(該方法稱為「去免疫化」)來修飾。簡言之，可分析抗體之重鏈及輕鏈可變域之結合至II類MHC之肽；該等肽代表潛在T細胞表位(如WO 98/52976及WO 00/34317中所定義)。對於潛在T細胞表位之檢測，可應用稱為「肽串線分析」之電腦建模方法，且另外可檢索人類Il類MHC結合肽之數據庫之存在於VH及VL序列中之基序，如WO 98/52976及WO 00/34317中所述。該等基序結合至18個主要Il類MHC DR異型中之任一者，且因此構成潛在T細胞表位。所檢測到之潛在T細胞表位可藉由取代可變域中之少量胺基酸殘基或較佳藉由單一胺基酸取代來消除。通常，製備保守取代。通常但不唯一地，可使用為人類種系抗體序列中之位置共用之胺基酸。人類種系序列揭示於例如Tomlinson等人(1992)J.MoI.Biol.227：776-798；Cook,G.P.等人(1995)Immunol.Today第16卷(5)：237-242；及Tomlinson等人(1995)EMBO J.14：14：4628-4638中。V BASE目錄提供人類免疫球蛋白可變區序列之總目錄(由Tomlinson,LA.等人，MRC Centre for Protein Engineering,Cambridge,UK編譯)。該等序列可用作人類序列之來源，例如用於框架區及CDR。亦可使用共有人類框架區，例如如美國專利第6,300,064號中所述。
「人類化」抗體、抗體建構體或其片段(例如Fv、Fab、Fab'、F(ab')2或抗體之其他抗原結合子序列)為主要具有人類序列之抗體或免疫球蛋白，其含有衍生自非人類免疫球蛋白之最小序列。對於大部分，人類化抗體為人類免疫球蛋白(受體抗體)，其中受體超變區(亦稱為CDR)之殘基經具有所需特異性、親和力及容量之諸如小鼠、大鼠、倉鼠或兔等非人類(例如囓齒類動物)種類(供體抗體)之超變區之殘基替代。在一些情況下，人類免疫球蛋白之Fv框架區(FR)殘基經相應非人類殘基替代。另外，如本文所用「人類化抗體」亦可包含既不在受體抗體亦不在供體抗體中發現之殘基。該等修飾經製備以進一步細化及優化抗體性能。人類化抗體亦可包含通常人類免疫球蛋白之免疫球蛋白恆定區(Fc)之至少一部分。關於其他細節參見Jones等人，Nature,321：522-525(1986)；Reichmann等人，Nature,332：323-329(1988)；及Presta,Curr.Op.Struct.Biol.,2：593-596(1992)。
人類化抗體或其片段可藉由用人類Fv可變域之等效序列替代Fv可變域之不直接參與抗原結合之序列來產生。產生人類化抗體或其片段之實例性方法提供於以下文獻中：Morrison(1985)Science 229：1202-1207；Oi等人(1986)BioTechniques 4：214；及US 5,585,089；US 5,693,761；US 5,693,762；US 5,859,205；及US 6,407,213。彼等方法包括分離、操縱及表現編碼重鏈或輕鏈中至少一者之免疫球蛋白Fv可變域之全部或一部分的核酸序列。該等核酸可自如上文所述產生針對預定靶之抗體之雜交瘤以及自其他來源獲得。然後可將編碼人類化抗體分子之重組DNA選殖至適當表現載體中。
人類化抗體亦可使用轉基因動物(例如表現人類重鏈及輕鏈基因、但無法表現內源小鼠免疫球蛋白重鏈及輕鏈基因之小鼠)來產生。Winter闡述實例性CDR移植方法，其可用於製備本文所述之人類化抗體(美國專利第5,225,539號)。可用非人類CDR之至少一部分替代特定人類抗體之所有CDR，或可僅用非人類CDR替代一些CDR。僅需要替代為人類化抗體與預定抗原結合所需之CDR數。
可藉由引入保守取代、共有序列取代、種系取代及/或回復突變來優化人類化抗體。該等改變的免疫球蛋白分子可藉由若干業內已知 技術中之任一者製得(例如，Teng等人，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.,80：7308-7312,1983；Kozbor等人，Immunology Today,4：7279,1983；Olsson等人，Meth.Enzymol.,92：3-16,1982；及EP 239 400)。
術語「人類抗體」、「人類抗體建構體」及「人類結合域」包括具有實質上對應於業內已知之人類種系免疫球蛋白序列(包括例如Kabat等人(1991)(上述引文)所述之彼等)之抗體區域(例如可變區及恆定區)或域之抗體、抗體建構體及結合域。本發明之人類抗體、抗體建構體或結合域可包括例如在CDR中且具體而言在CDR3中並非由人類種系免疫球蛋白序列編碼之胺基酸殘基(例如，藉由活體外隨機或位點特異性誘變或藉由活體內體細胞突變引入之突變)。人類抗體、抗體建構體或結合域可具有至少一個、兩個、三個、四個、五個或更多個經並非由人類種系免疫球蛋白序列編碼之胺基酸殘基替代之位置。如本文所用人類抗體、抗體建構體及結合域之定義亦涵蓋全人類抗體，其僅包括抗體之非人工及/或遺傳改變之人類序列，此乃因彼等可藉由使用諸如Xenomouse等技術或系統衍生而來。
在一些實施例中，本發明之抗體建構體為「經分離」或「實質上純」之抗體建構體。「經分離」或「實質上純」在用於闡述本文所揭示之抗體建構體時意指已自其產生環境之組份鑑別、分離及/或回收之抗體建構體。較佳地，抗體建構體不含或實質上不含與其產生環境之所有其他組份之締合。其產生環境、例如源自重組經轉染細胞之污染物組份為通常將干擾多肽之診斷或治療用途之材料，且可包括酶、激素及其他蛋白質性或非蛋白質性溶質。抗體建構體可例如構成給定樣品中至少約5重量%或至少約50重量%之總蛋白質。應理解，經分離蛋白質可構成5重量%至99.9重量%之總蛋白質含量，此端視各情況而定。多肽可以顯著較高之濃度經由使用誘導型啟動子或高表現啟動子製得，使得其以增加之濃度值製得。該定義包括在眾多種業內已知之生物體及/或宿主細胞中產生抗體建構體。在較佳實施例中，抗體建構體將(1)純化至一定程度以足以藉由使用轉杯式測序儀獲得N末端或內部胺基酸序列之至少15個殘基，或(2)根據在非還原或還原條件下使用考馬斯藍(Coomassie blue)或較佳銀染色之SDS-PAGE，純化至均一性。然而，經分離抗體建構體通常將藉由至少一個純化步驟來製備。
術語「結合域」結合本發明表徵分別(特異性)結合至/與其相互作用/識別靶分子(抗原)上之給定靶表位或給定靶位點及CD3之域。第一結合域(識別靶細胞表面抗原CD33)之結構及功能亦及較佳第二結合域(CD3)之結構及/或功能基於抗體(例如全長或全免疫球蛋白分子)之結構及/或功能。根據本發明，第一結合域之特徵在於存在三個輕鏈CDR(即VL區之CDR1、CDR2及CDR3)及三個重鏈CDR(即VH區之CDR1、CDR2及CDR3)。第二結合域較佳亦包含抗體之允許靶結合之最低結構要求。更佳地，第二結合域包含至少三個輕鏈CDR(即VL區之CDR1、CDR2及CDR3)及/或三個重鏈CDR(即VH區之CDR1、CDR2及CDR3)。設想第一及/或第二結合域係藉由噬菌體展示或文庫篩選方法產生或可藉由該等方法獲得而非藉由將現有(單株)抗體之CDR序列移植至支架中來獲得。
根據本發明，結合域較佳呈多肽形式。該等多肽可包括蛋白質性部分及非蛋白質性部分(例如化學連接體或化學交聯劑，例如戊二醛)。蛋白質(包括其通常具有不到30個胺基酸之片段、較佳生物活性片段及肽)包含兩個或更多個經由共價肽鍵彼此偶合之胺基酸(產生胺基酸鏈)。如本文所用術語「多肽」闡述一組通常由30個以上之胺基酸組成之分子。多肽可進一步形成多聚體，例如二聚體、三聚體及更高寡聚體，即由一個以上之多肽分子組成。形成該等二聚體、三聚體等之多肽分子可相同或不同。因此，該等多聚體之相應較高級結構稱為同或異二聚體、同或異三聚體等。異多聚體之實例為抗體分子，其天然形式由兩條相同之輕多肽鏈及兩條相同之重多肽鏈組成。術語「肽」、「多肽」及「蛋白質」亦指經天然修飾之肽/多肽/蛋白質，其中該修飾藉由例如轉譯後修飾(如醣基化、乙醯化、磷酸化及諸如此類)來實現。「肽」、「多肽」或「蛋白質」在本文中提及時亦可經化學修飾，例如聚乙二醇化。該等修飾為業內所熟知且闡述於下文中。
包含至少一個人類結合域之抗體及抗體建構體避免一些與具有非人類(例如囓齒類動物，例如鼠類、大鼠、倉鼠或兔)可變區及/或恆定區之抗體或抗體建構體相關之問題。該等囓齒類動物源蛋白質之存在可快速清除抗體或抗體建構體或可使患者產生針對抗體或抗體建構體之免疫反應。為避免使用囓齒類動物源抗體或抗體建構體，可經由將人類抗體功 能引入囓齒類動物中以使得囓齒類動物產生全人類抗體來產生人類或全人類抗體/抗體建構體。
在YAC中選殖及重建兆鹼基大小之人類基因座及將其引入小鼠種系中之能力提供闡明具有極大或粗映射基因座之功能組份以及產生有用的人類疾病模型之有力方法。另外，利用該技術用其人類等效物取代小鼠基因座可提供對發育期間人類基因產物之表現及調控、其與其他系統之通信及其參與疾病誘導及進展之理解。
該策略之重要實際應用為小鼠激素免疫系統之「人類化」。將人類免疫球蛋白(Ig)基因座引入內源Ig基因已失活之小鼠中提供研究抗體之程式化表現及組裝所基於之機制以及其在B細胞發育中之作用。另外，該策略可為產生全人類單株抗體(mAb)提供理想來源，其為實現人類疾病中之抗體療法之願望的重要里程碑。預期全人類抗體或抗體建構體使小鼠或小鼠源mAb所固有之免疫原性及過敏性反應最小化，且因此增加所投與抗體/抗體建構體之效能及安全性。可預期使用全人類抗體或抗體建構體會提供治療需要重複化合物投與之慢性及復發性人類疾病(例如發炎、自體免疫性及癌症)方面之顯著優勢。
一種達成此目標之方法為用較大人類Ig基因座片段改造缺少小鼠抗體產生之小鼠品系，預期該等小鼠將在小鼠抗體不存在下產生較大人類抗體譜。較大人類Ig片段將保留較大可變基因多樣性以及抗體產生及表現之適當調控。藉由探究用於抗體多樣化及選擇以及缺少對人類蛋白質之免疫可耐受性的小鼠機構，該等小鼠品系中再生之人類抗體譜應產生針對任何所關注抗原(包括人類抗原)之高親和力抗體。使用雜交瘤技術可容易地產生及選擇具有所需特異性之抗原特異性人類mAb。此一般策略係結合第一XenoMouse小鼠品系之產生來展示(參見Green等人，Nature Genetics 7：13-21(1994))。XenoMouse品系經改造具有分別含有245kb及190kb大小之人類重鏈基因座及κ輕鏈基因座種系構形片段之酵母人工染色體(YAC)，其含有核心可變區及恆定區序列。關於抗體之重排及表現二者，含有YAC之人類Ig證實與小鼠系統相容，且能夠取代失活之小鼠Ig基因。此由其誘導B細胞發育、產生全人類抗體之成人樣人類譜及產生抗原特異 性人類mAb之能力所證實。該等結果亦表明，引入人類Ig基因座之含有較大V基因數、額外調控元件及人類Ig恆定區之較大部分可實質上概括針對感染及免疫之人類激素反應所特有之全譜。Green等人之工作最近擴展至經由分別引入兆鹼基大小之人類重鏈基因座及κ輕鏈基因座種系構形YAC片段來引入大於大約80%之人類抗體譜。參見Mendez等人，Nature Genetics 15：146-156(1997)及美國專利申請案第08/759,620號。
XenoMouse小鼠之產生進一步論述及描繪於以下專利中：美國專利申請案第07/466,008號、第07/610,515號、第07/919,297號、第07/922,649號、第08/031,801號、第08/112,848號、第08/234,145號、第08/376,279號、第08/430,938號、第08/464,584號、第08/464,582號、第08/463,191號、第08/462,837號、第08/486,853號、第08/486,857號、第08/486,859號、第08/462,513號、第08/724,752號及第08/759,620號；及美國專利第6,162,963號、第6,150,584號、第6,114,598號、第6,075,181及第5,939,598號以及日本專利第3 068 180 B2號、第3 068 506 B2號及第3 068 507 B2號。亦參見Mendez等人，Nature Genetics 15：146-156(1997)以及Green及Jakobovits J.Exp.Med.188：483-495(1998)、EP 0 463 151 B1,WO 94/02602、WO 96/34096、WO 98/24893、WO 00/76310及WO 03/47336。
在替代方法中，他人(包括GenPharm International,Inc.)已使用「微小基因座」方法。在微小基因座方法中，經由納入Ig基因座之小段(個別基因)來模擬外源Ig基因座。因此，一或多個VH基因、一或多個DH基因、一或多個JH基因、mu恆定區及另一恆定區(較佳γ恆定區)形成於建構體中以摻入動物中。此方法闡述於以下專利中：頒予Surani等人之美國專利第5,545,807號；及各自頒予Lonberg及Kay之美國專利第5,545,806號、第5,625,825號、第5,625,126號、第5,633,425號、第5,661,016號、第5,770,429號、第5,789,650號、第5,814,318號、第5,877,397號、第5,874,299號及第6,255,458號；頒予Krimpenfort及Berns之美國專利第5,591,669號及第6,023.010號；頒予Berns等人之美國專利第5,612,205號、第5,721,367號及第5,789,215號；及頒予Choi及Dunn之美國專利第5,643,763號；及GenPharm International美國專利申請案第07/574,748號、第07/575,962號、 第07/810,279號、第07/853,408號、第07/904,068號、第07/990,860號、第08/053,131號、第08/096,762號、第08/155,301號、第08/161,739號、第08/165,699號、第08/209,741號。亦參見EP 0 546 073 B1、WO 92/03918、WO 92/22645、WO 92/22647、WO 92/22670、WO 93/12227、WO 94/00569、WO 94/25585、WO 96/14436、WO 97/13852及WO 98/24884以及美國專利第5,981,175號。另外參見Taylor等人(1992)、Chen等人(1993)、Tuaillon等人(1993)、Choi等人(1993)、Lonberg等人(1994)、Taylor等人(1994)及Tuaillon等人(1995)、Fishwild等人(1996)。
Kirin亦已展示自已經由微細胞融合引入大段染色體或整個染色體之小鼠產生人類抗體。參見歐洲專利申請案第773 288號及第843 961號。Xenerex Biosciences正在研發可能產生人類抗體之技術。在此技術中，SCID小鼠經人類淋巴細胞(例如B及/或T細胞)重構。然後用抗原免疫小鼠且可產生針對抗原之免疫反應。參見美國專利第5,476,996號；第5,698,767號；及第5,958,765號。
人類抗小鼠抗體(HAMA)反應已引導企業製備嵌合或其他人類化抗體。然而，預期將觀察到某些人類抗嵌合抗體(HACA)反應，尤其在慢性或多劑量使用該抗體時。因此，期望提供包含針對靶細胞表面抗原之全人類結合域及針對CD3之全人類結合域之抗體建構體，以減弱HAMA或HACA反應之問題及/或效應。
術語「(特異性)結合至」、「(特異性)識別」、「(特異性)針對」及「與......(特異性)反應」根據本發明意指結合域與位於靶蛋白質或抗原(靶細胞表面抗原CD33/CD3)上之表位之一或多個、較佳至少兩個、更佳至少三個且最佳至少四個胺基酸相互作用或特異性相互作用。
術語「表位」指抗原上結合域(例如抗體或免疫球蛋白或抗體或免疫球蛋白之衍生物或片段)所特異性結合之位點。「表位」為抗原表位且因此術語表位有時在本文中亦稱為「抗原結構」或「抗原決定簇」。因此，結合域為「抗原相互作用位點」。該結合/相互作用亦應理解為定義「特異性識別」。術語「表位」結合本申請案應理解為闡述完整抗原結構，而術語「表位之一部分」可用於闡述給定結合域之特異性表位之一或多個亞組。
「表位」可藉由蛋白質之三級摺疊並置之鄰接胺基酸或非鄰接胺基酸來形成。「線性表位」為胺基酸一級序列包含所識別表位之表位。線性表位通常包括獨特序列中之至少3個或至少4個、且更通常至少5個或至少6個或至少7個、例如約8個至約10個胺基酸。
與線性表位不同，「構象表位」為包含該表位之胺基酸之一級序列並非所識別表位之唯一定義組份之表位(例如，胺基酸之一級序列不必由結合域識別之表位)。通常，構象表位包含相對於線性表位增多之胺基酸數。關於構象表位之識別，結合域識別抗原、較佳肽或蛋白質或其片段之三維結構(在本發明上下文中，一個結合域之抗原包含在靶細胞表面抗原CD33內)。舉例而言，當蛋白質分子摺疊形成三維結構時，形成構象表位之某些胺基酸及/或多肽骨架變得並置，以使得抗體能夠識別該表位。確定表位構象之方法包括(但不限於)x射線結晶學、二維核磁共振(2D-NMR)光譜及位點定向自旋標記以及電子順磁共振(EPR)光譜。
結合域與表位或表位簇之間之相互作用暗示，結合域展現對特定蛋白質或抗原(在此處分別為靶細胞表面抗原CD33及CD3)上之表位或表位簇之可觀親和力，且通常不展現與除靶細胞表面抗原CD33或CD3外之蛋白質或抗原之顯著反應性。「可觀親和力」包括以約10-6M(KD)或更強之親和力結合。較佳地，當結合親和力為約10-12至10-8M、10-12至10-9M、10-12至10-10M、10-11至10-8M、較佳約10-11至10-9M時，結合視為特異性。結合域是否與靶特異性反應或結合可容易地尤其藉由比較該結合域與靶蛋白質或抗原的反應與該結合域與除靶細胞表面抗原CD33或CD3外之蛋白質或抗原的反應來測試。較佳地，本發明結合域基本上或實質上不與除靶細胞表面抗原CD33或CD3外之蛋白質或抗原結合(即，第一結合域無法結合至除靶細胞表面抗原CD33外之蛋白質，且第二結合域無法結合至除CD3外之蛋白質)。
術語「基本上/實質上不結合」或「無法結合」意指本發明結合域不結合除靶細胞表面抗原CD33或CD3外之蛋白質或抗原，即不顯示大於30%、較佳不大於20%、更佳不大於10%、尤佳不大於9%、8%、7%、6%或5%之與除靶細胞表面抗原CD33或CD3外之蛋白質或抗原之反 應性，其中與靶細胞表面抗原CD33或CD3之結合分別設定為100%。
業內認為特異性結合可藉由結合域及抗原之胺基酸序列中之特定基序來實現。因此，結合係因其一級、二級及/或三級結構以及該等結構之二級修飾來達成。抗原相互作用位點與其特異性抗原之特異性相互作用可產生該位點與該抗原之簡單結合。此外，抗原相互作用位點與其特異性抗原之特異性相互作用可或者或另外例如因引起抗原之構象變化、抗原寡聚化等而起始信號。
術語「可變」指抗體或免疫球蛋白域之展現其序列可變性且參與確定特定抗體之特異性及結合親和力的部分(即「可變域」)。可變重鏈(VH)及可變輕鏈(VL)之配對一起形成單一抗原結合位點。
可變性並不均勻分佈於抗體之整個可變域中；其集中於重鏈及輕鏈可變區中每一者之子域中。該等子域稱為「超變區」或「互補決定區」(CDR)。可變域之更保守(即非超變)部分稱為「框架」區(FRM)且在三維空間中為六個CDR提供支架以形成抗原結合表面。天然重鏈及輕鏈之可變域各自包含四個FRM區(FR1、FR2、FR3及FR4)，其主要採用由三個超變區連結之β-褶板構形，該等超變區形成連結β-褶板結構且在一些情形下形成β-褶板結構之一部分的環。每一鏈中之超變區藉由FRM與另一鏈之超變區緊密固持在一起，此有助於形成抗原結合位點(參見Kabat等人，上述引文)。
術語「CDR」及其複數形式「CDR」指三個構成輕鏈可變區之結合特徵(CDR-L1、CDR-L2及CDR-L3)及三個構成重鏈可變區之結合特徵(CDR-H1、CDR-H2及CDR-H3)之互補決定區。CDR含有大多數負責抗體與抗原之特異性相互作用之殘基，且因此有助於抗體分子之功能活性：其為主要的抗原特異性決定簇。
確切定義的CDR邊界及長度取決於不同的分類及編號系統。因此，CDR可藉由Kabat、Chothia、contact或任何其他邊界定義來提及，包括本文所述之編號系統。儘管邊界不同，但該等系統中之每一者皆具有一定程度之重疊，其構成可變序列內所謂的「超變區」。因此，依照該等系統之CDR定義之長度及邊界區域相對於毗鄰框架區可不同。參見例如 Kabat(基於交叉物種序列可變性之方法)、Chothia(基於抗原-抗體複合物之結晶學研究之方法)及/或MacCallum(Kabat等人，上述引文；Chothia等人，J.MoI.Biol,1987,196：901-917；及MacCallum等人，J.MoI.Biol,1996,262：732)。表徵抗原結合位點之另一標準為Oxford Molecular's AbM抗體建模軟體所用之AbM定義。例如，參見Protein Sequence and Structure Analysis of Antibody Variable Domains.在Antibody Engineering Lab Manual(編輯：Duebel,S.及Kontermann,R.,Springer-Verlag,Heidelberg)中。就兩種殘基鑑別技術界定重疊區域而非相同區域而言，其可組合界定雜合CDR。然而，依照所謂的Kabat系統之編號較佳。
通常，CDR形成可分類為規範結構之環結構。術語「規範結構」指抗原結合(CDR)環所採用之主鏈構象。根據比較結構研究已發現，六個抗原結合環中之五者僅具有有限的可用構象譜。每一規範結構之特徵可在於多肽骨架之扭轉角。因此，抗體之間之對應環可具有極相似之三維結構，但環之大部分具有高胺基酸序列可變性(Chothia及Lesk,J.MoI.Biol.,1987,196：901；Chothia等人，Nature,1989,342：877；Martin及Thornton,J.MoI.Biol,1996,263：800)。另外，所採用環結構與其周圍之胺基酸序列之間存在一定關係。特定規範類別之構象係由環之長度及駐留於環內以及保守框架內(即環外)之關鍵位置之胺基酸殘基確定。因此，可基於該等關鍵胺基酸殘基之存在分配至特定規範類別。
術語「規範結構」亦可包括對線性抗體序列之考慮，例如如Kabat所編錄(Kabat等人，上述引文)。Kabat編號方案(系統)為廣泛採用之以一致方式對抗體可變域之胺基酸殘基編號之標準且為本發明中所應用之較佳方案，亦如本文別處所提及。亦可使用其他結構考慮來確定抗體之規範結構。舉例而言，彼等由Kabat編號不完全反映之差異可由Chothia等人之編號系統確定及/或藉由其他技術(例如，結晶學及二維或三維計算建模)來揭露。因此，給定抗體序列可置於尤其允許鑑別適當框架序列(例如，基於將多個規範結構納入文庫中之需要)之規範類別中。抗體胺基酸序列之Kabat編號及如Chothia等人，上述引文所述之結構考慮及其解釋抗體結構之規範態樣之含義闡述於文獻中。不同免疫球蛋白類別之亞單位結構及三 維構形為業內所熟知。關於抗體結構之綜述參見Antibodies：A Laboratory Manual,Cold Spring Harbor Laboratory,Harlow等人編輯，1988。
輕鏈之CDR3及尤其重鏈之CDR3可構成輕鏈及重鏈可變區內之抗原結合之最重要決定簇。在一些抗體建構體中，重鏈CDR3似乎構成抗原與抗體之間之主要接觸區域。可使用僅改變CDR3之活體外選擇方案來改變抗體之結合性質或確定哪些殘基有助於抗原結合。因此，CDR3通常為抗體結合位點內之分子多樣性之最大來源。舉例而言，H3可短至兩個胺基酸殘基或大於26個胺基酸。
在經典全長抗體或免疫球蛋白中，每一輕鏈(L)藉由一個共價二硫鍵連接至重鏈(H)，而兩個H鏈藉由一或多個二硫鍵彼此連接，此端視H鏈同型而定。最靠近VH之CH域通常稱為CH1。恆定(「C」)域並不直接參與抗原結合，但展現多種效應功能，例如抗體依賴性細胞介導之細胞毒性及補體活化。抗體之Fc區包含在重鏈恆定域內且例如能夠與位於細胞表面之Fc受體相互作用。
組裝及體細胞突變後抗體基因之序列高度變化，且估計該等變化的基因編碼1010個不同的抗體分子(Immunoglobulin Genes，第2版，Jonio等人編輯，Academic Press,San Diego,CA,1995)。因此，免疫系統提供免疫球蛋白譜。術語「譜」指至少一條全部或部分衍生自至少一條編碼至少一種免疫球蛋白之序列之核苷酸序列。該(等)序列可藉由活體內重排重鏈之V、D及J區段以及輕鏈之V及J區段來產生。或者，該(等)序列可自細胞產生，因應細胞進行重排，例如活體外刺激。或者，該(等)序列之一部分或全部可藉由DNA剪接、核苷酸合成、誘變及其他方法來獲得，例如參見美國專利5,565,332。譜可僅包括一條序列或可包括複數條序列，包括遺傳多樣集合中之序列。
如本文所用術語「雙特異性」指具有「至少雙特異性」之建構體，即其包含至少第一結合域及第二結合域，其中第一結合域結合至一種抗原或靶，且第二結合域結合至另一抗原或靶(在此處為CD3)。因此，本發明之雙特異性建構體包含針對至少兩種不同抗原或靶之特異性。術語本發明之「雙特異性建構體」亦涵蓋多特異性建構體(例如三特異性建構體)， 後者包括三個結合域，或具有大於三種(例如四種、五種......)特異性之建構體。在結合本發明使用之建構體為抗體建構體之情形下，涵蓋相應建構體之該等建構體為多特異性抗體建構體(例如三特異性抗體建構體)，後者包括三個結合域，或具有大於三種(例如四種、五種......)特異性之建構體。
鑒於本發明之抗體建構體為(至少)雙特異性，其並非天然的且其顯著不同於天然產物。因此，「雙特異性」抗體建構體或免疫球蛋白為具有至少兩個具有不同特異性之不同結合位點之人工雜合抗體或免疫球蛋白。雙特異性抗體可藉由多種方法(包括雜交瘤融合或連接Fab'片段)產生。例如，參見Songsivilai及Lachmann,Clin.Exp.Immunol.79：315-321(1990)。
本發明抗體建構體之至少兩個結合域及可變域可或可不包含肽連接體(間隔肽)。術語「肽連接體」根據本發明定義胺基酸序列，藉由該胺基酸序列，本發明抗體建構體之一個(可變及/或結合)域與另一(可變及/或結合)域之胺基酸序列彼此連接。該肽連接體之基本技術特徵在於，該肽連接體不包含任何聚合活性。適宜肽連接體尤其為闡述於美國專利4,751,180及4,935,233或WO 88/09344中之彼等。肽連接體亦可用於將其他域或模組或區域(例如半衰期延長域)附接至本發明抗體建構體。
在使用連接體之情況下，此連接體較佳具有一定長度及序列以足以確保第一及第二域中之每一者可獨立於彼此保留其差異結合特異性。對於連結本發明抗體建構體中之至少兩個結合域(或兩個可變域)之肽連接體，僅包含少數胺基酸殘基(例如12個胺基酸殘基或更少)之彼等肽連接體較佳。因此，具有12個、11個、10個、9個、8個、7個、6個或5個胺基酸殘基之肽連接體較佳。所設想具有少於5個胺基酸之肽連接體包含4個、3個、2個或1個胺基酸，其中富含Gly之連接體較佳。該「肽連接體」背景下之尤佳「單一」胺基酸為Gly。因此，該肽連接體可由單一胺基酸Gly組成。肽連接體之另一較佳實施例之特徵在於胺基酸序列Gly-Gly-Gly-Gly-Ser(即Gly4Ser)或其聚合物(即(Gly4Ser)x)，其中x為1或更大之整數。該肽連接體之特徵(其包含不存在二級結構之促進)為業內已知且闡述於例如Dall’Acqua等人(Biochem.(1998)37,9266-9273)、Cheadle等人(Mol Immunol(1992)29,21-30)以及Raag及Whitlow(FASEB(1995)9(1), 73-80)中。亦不促進任何二級結構之肽連接體較佳。可藉由例如遺傳改造提供該等域彼此之連接，如實例中所述。製備融合及可操作連接之雙特異性單鏈建構體及在哺乳動物細胞或細菌中表現其之方法為業內所熟知(例如WO 99/54440或Sambrook等人，Molecular Cloning：A Laboratory Manual,Cold Spring Harbor Laboratory Press,Cold Spring Harbor,New York,2001)。
雙特異性單鏈分子為業內已知且闡述於以下文獻中：WO 99/54440；Mack,J.Immunol.(1997),158,3965-3970；Mack,PNAS,(1995),92,7021-7025；Kufer,Cancer Immunol.Immunother.,(1997),45,193-197；Löffler,Blood,(2000),95,6,2098-2103；Brühl,Immunol.,(2001),166,2420-2426；Kipriyanov,J.Mol.Biol.,(1999),293,41-56。經闡述用於產生單鏈抗體之技術(尤其參見美國專利4,946,778；Kontermann及Dübel(2010)，上述引文；及Little(2009)，上述引文)可適於產生特異性識別所選靶之單鏈抗體建構體。
可藉由連接兩個scFv分子來改造雙價(亦稱為二價)或雙特異性單鏈可變片段(具有格式(scFv)2之雙scFv或二-scFv)。在該兩個scFv分子具有相同結合特異性之情形下，所得(scFv)2分子較佳將稱為雙價分子(即其具有兩個針對相同靶表位之化合價)。在兩個scFv分子具有不同結合特異性之情形下，所得(scFv)2分子較佳將稱為雙特異性分子。連接可藉由產生具有兩個VH區及兩個VL區之單一肽鏈來進行，從而產生串聯scFv(參見例如Kufer P.等人，(2004)Trends in Biotechnology 22(5)：238-244)。另一可能性為產生具有連接體肽之scFv分子，該等連接體肽對於兩個可變區而言太短以致於其無法摺疊在一起(例如約五個胺基酸)，從而迫使scFv二聚化。此類型稱為雙價抗體(參見例如Hollinger,Philipp等人，(1993年7月)Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America 90(14)：6444-8。)。
單域抗體僅包含一個(單體)抗體可變域，其能夠選擇性結合至獨立於其他V區或域之特異性抗原。第一單域抗體為自在駱駝科中發現之重鏈抗體改造，且該等稱為VHH片段。軟骨魚類亦具有重鏈抗體(IgNAR)，自其可獲得稱為VNAR片段之單域抗體。替代方法為將例如來自 人類或囓齒類動物之常見免疫球蛋白之二聚體可變域拆分成單體，由此獲得VH或VL作為單域Ab。儘管當前對單域抗體之大多數研究基於重鏈可變域，但亦已顯示衍生自輕鏈之奈米抗體特異性結合至靶表位。單域抗體之實例稱為sdAb、奈米抗體或單可變域抗體。
因此，(單域mAb)2為由(至少)兩個單域單株抗體構成之單株抗體建構體，該兩個單域單株抗體個別地選自包含VH、VL、VHH及VNAR之群。連接體較佳呈肽連接體形式。類似地，「scFv-單域mAb」為由至少一個如上文所述之單域抗體及一個如上文所述之scFv分子構成之單株抗體建構體。連接體較佳亦呈肽連接體形式。
亦設想本發明之抗體建構體除其結合至靶抗原CD33及CD3之功能外亦具有另一功能。在此格式中，抗體建構體經由結合至靶抗原靶向靶細胞、經由CD3結合調介細胞毒性T細胞活性並提供另一功能(例如標記(螢光等)、治療劑(例如毒素或放射性核素)等)而為三功能或多功能抗體建構體。
抗體建構體之共價修飾亦包括在本發明範疇內，且通常但並不總是在轉譯後進行。舉例而言，藉由使抗體建構體之特定胺基酸殘基與能夠與所選側鏈或N末端或C末端殘基反應之有機衍生劑反應將抗體建構體之若干類型之共價修飾引入分子中。
最通常使半胱胺醯殘基與α-鹵代乙酸(及相應胺)(例如氯乙酸或氯乙醯胺)反應，以獲得羧甲基或羧甲醯基甲基衍生物。半胱胺醯殘基亦藉由與以下各項反應衍生而來：溴三氟丙酮、α-溴-β-(5-咪唑基)丙酸、磷酸氯乙醯基酯、N-烷基馬來醯亞胺、3-硝基-2-吡啶基二硫化物、甲基2-吡啶基二硫化物、對氯汞苯甲酸、2-氯汞-4-硝基苯酚或氯-7-硝基苯并-2-氧雜-1,3-二唑。
組胺醯殘基藉由在pH 5.5-7.0下與焦碳酸二乙酯反應衍生而來，此乃因此試劑相對特異性針對組胺醯側鏈。對溴苯醯基溴化物亦有用；反應較佳在pH 6.0下在0.1M二甲基胂酸鈉中實施。使離胺醯及胺基末端殘基與琥珀酸或其他羧酸酐反應。用該等試劑衍生具有反轉離胺醯殘基之電荷之效應。用於衍生含α-胺基之殘基之其他適宜試劑包括亞胺酯， 例如甲基吡啶亞胺甲酯；磷酸吡哆醛；吡哆醛；硼氫化氯；三硝基苯磺酸；O-甲基異脲；2,4-戊二酮；及轉胺酶催化之與乙醛酸之反應。
藉由與一或若干種習用試劑、尤其苯基乙二醛、2,3-丁二酮、1,2-環己二酮及茚三酮反應來修飾精胺醯殘基。精胺酸殘基之衍生要求在鹼性條件下實施反應，此乃因胍官能基之pKa較高。另外，該等試劑可與離胺酸之基團以及精胺酸ε-胺基反應。
可對酪胺醯殘基進行特異性修飾，其中尤其關注藉由與芳族重氮化合物或四硝基甲烷反應將特殊標記引入酪胺醯殘基中。最通常而言，分別使用N-乙醯基咪唑及四硝基甲烷形成O-乙醯基酪胺醯物質及3-硝基衍生物。使用125I或131I碘化酪胺醯殘基以製備經標記之蛋白質用於放射性免疫分析中，上文所述之氯胺T方法較為適宜。
藉由與碳化二亞胺(R'-N=C=N--R')反應選擇性修飾羧基側基(天冬胺醯基或麩胺醯基)，其中R及R'視情況為不同烷基，例如1-環己基-3-(2-嗎啉基-4-乙基)碳化二亞胺或1-乙基-3-(4-氮陽離子-4、4-二甲基戊基)碳化二亞胺。另外，天冬胺醯及麩胺醯殘基藉由與銨離子反應轉化成天冬醯胺醯及麩醯胺醯殘基。
用雙功能試劑衍生可用於交聯本發明之抗體建構體與水不溶性載體基質或表面以用於多種方法中。常用交聯劑包括例如1,1-雙(重氮基乙醯基)-2-苯基乙烷、戊二醛、N-羥基琥珀醯亞胺酯，例如與4-疊氮基水楊酸之酯、同雙功能亞胺酯(包括二琥珀醯亞胺基酯，例如3,3'-二硫代雙(丙酸琥珀醯亞胺基酯))及雙功能馬來醯亞胺(例如雙-N-馬來醯亞胺基-1,8-辛烷)。諸如甲基-3-[(對疊氮基苯基)二硫代]丙醯亞胺酸酯等衍生劑產生能夠在光存在下形成交聯之光可活化中間體。或者，將反應性水不溶性基質(例如溴化氰活化之碳水化合物)及美國專利第3,969,287號、第3,691,016號、第4,195,128號、第4,247,642號、第4,229,537號及第4,330,440號中所述之反應性受質用於蛋白質固定。
麩醯胺醯及天冬醯胺醯殘基通常分別去醯胺化至相應麩胺醯及天冬胺醯殘基。或者，該等殘基在弱酸性條件下去醯胺化。該等殘基之任一形式在本發明範疇內。
其他修飾包括脯胺酸及離胺酸之羥基化、絲胺醯或蘇胺醯殘基之羥基之磷酸化、離胺酸、精胺酸及組胺酸側鏈之α-胺基之甲基化(T.E.Creighton,Proteins：Structure and Molecular Properties,W.H.Freeman & Co.,San Francisco,1983，第79-86頁)、N末端胺之乙醯化及任一C末端羧基之醯胺化。
包括在本發明範疇內之抗體建構體之另一類型之共價修飾包含改變蛋白質之醣基化模式。如業內已知，醣基化模式可取決於蛋白質之序列(例如存在或不存在下文所論述之特定醣基化胺基酸殘基)或產生蛋白質之宿主細胞或生物體。特定表現系統論述於下文中。
多肽之醣基化通常為N-連接或O-連接。N-連接指將碳水化合物部分附接至天冬醯胺殘基之側鏈。三肽序列天冬醯胺-X-絲胺酸及天冬醯胺-X-蘇胺酸(其中X為除脯胺酸外之任一胺基酸)為將碳水化合物部分酶附接至天冬醯胺側鏈之識別序列。因此，在多肽中存在該等三肽序列中之任一者會產生潛在醣基化位點。O-連接醣基化指將糖N-乙醯基半乳糖胺、半乳糖或木糖中之一者附接至羥胺基酸、最通常絲胺酸或蘇胺酸，但亦可使用5-羥脯胺酸或5-羥離胺酸。
將醣基化位點添加至抗體建構體方便地藉由改變胺基酸序列、使得其含有上述三肽序列中之一或多者來實現(對於N-連接醣基化位點)。改變亦可藉由將一或多個絲胺酸或蘇胺酸殘基添加至起始序列或用該等殘基取代來進行(對於O-連接醣基化位點)。為簡便起見，抗體建構體之胺基酸序列較佳經由DNA層級上之變化、尤其藉由突變編碼預選鹼基處之多肽之DNA、使得產生將轉譯成所需胺基酸之密碼子來改變。
增加抗體建構體上之碳水化合物部分之數量之另一方法為藉由將醣苷化學或酶偶合至蛋白質。該等程序之優點在於其無需在具有醣基化能力(N-連接及O-連接醣基化)之宿主細胞中產生蛋白質。端視所用之偶合模式，糖可附接至(a)精胺酸及組胺酸，(b)游離羧基，(c)游離巰基，例如半胱胺酸之彼等，(d)游離羥基，例如絲胺酸、蘇胺酸或羥脯胺酸之彼等，(e)芳族殘基，例如苯基丙胺酸、酪胺酸或色胺酸之彼等，或(f)麩胺醯胺之醯胺基。該等方法闡述於WO 87/05330以及Aplin及Wriston,1981,CRC Crit. Rev.Biochem.，第259-306頁中。
可以化學或酶方式去除存在於起始抗體建構體上之碳水化合物部分。化學去醣基化需要蛋白質暴露於化合物三氟甲烷磺酸或等效化合物。此處理可裂解除連接糖(N-乙醯基葡糖胺或N-乙醯基半乳糖胺)外之大部分或所有糖，同時使多肽完整。化學去醣基化闡述於Hakimuddin等人，1987,Arch.Biochem.Biophys.259：52及Edge等人，1981,Anal.Biochem.118：131中。可藉由使用多種內切及外切醣苷酶來達成酶對多肽上之碳水化合物部分之裂解，如Thotakura等人，1987,Meth.Enzymol.138：350所述。可藉由使用化合物衣黴素(tunicamycin)防止潛在醣基化位點之醣基化，如Duskin等人，1982,J.Biol.Chem.257：3105所述。衣黴素阻斷蛋白質-N-醣苷連接之形成。
本文涵蓋抗體建構體之其他修飾。舉例而言，抗體建構體之另一類型之共價修飾包含以美國專利第4,640,835號、第4,496,689號、第4,301,144號、第4,670,417號、第4,791,192號或第4,179,337號中所述之方式將抗體建構體連接至多種非蛋白質性聚合物，包括(但不限於)各種多元醇，例如聚乙二醇、聚丙二醇、聚氧烷或聚乙二醇及聚丙二醇之共聚物。另外，如業內已知，可在抗體建構體內之多個位置進行胺基酸取代，例如以幫助添加諸如PEG等聚合物。
在一些實施例中，本發明抗體建構體之共價修飾包含添加一或多個標記。標記基團可經由不同長度之間隔體臂偶合至抗體建構體以減小潛在位阻。多種標記蛋白質之方法為業內已知且可用於實施本發明。術語「標記」或「標記基團」指任何可檢測標記。一般而言，標記分為多個類別，此端視欲檢測其之分析而定，以下實例包括(但不限於)：
a)同位素標記，其可為放射性或重同位素，例如放射性同位素或放射性核素(例如3H、14C、15N、35S、89Zr、90Y、99Tc、111In、125I、131I)
b)磁性標記(例如磁性粒子)
c)氧化還原活性部分
d)光學染料(包括(但不限於)生色團、磷光體及螢光團)，例如螢光基團(例如FITC、羅丹明(rhodamine)、鑭系磷光體)、化學發光基團及可為「小分子」螢光素或蛋白質性螢光素之螢光團
e)酶基團(例如辣根過氧化物酶、β-半乳糖苷酶、螢光素酶、鹼性磷酸酶)
f)生物素化基團
g)由二級報告子識別之預定多肽表位(例如白胺酸拉鏈對序列、二級抗體之結合位點、金屬結合域、表位標籤等)
「螢光標記」意指可經由其固有螢光性質檢測到之任何分子。適宜螢光標記包括(但不限於)螢光素、羅丹明、四甲基羅丹明、伊紅、原藻紅、香豆素、甲基-香豆素、芘、孔雀石綠、二苯乙烯、螢蝦黃、層疊藍J、德州紅(Texas Red)、IAEDANS、EDANS、BODIPY FL、LC紅640、Cy 5、Cy 5.5、LC紅705、俄勒岡綠(Oregon green)、Alexa-Fluor染料(Alexa Fluor 350、Alexa Fluor 430、Alexa Fluor 488、Alexa Fluor 546、Alexa Fluor 568、Alexa Fluor 594、Alexa Fluor 633、Alexa Fluor 660、Alexa Fluor 680)、層疊藍、層疊黃及R-藻紅素(PE)(Molecular Probes,Eugene,OR)、FITC、羅丹明及德州紅(Pierce,Rockford,IL)、Cy5、Cy5.5、Cy7(Amersham Life Science,Pittsburgh,PA)。適宜光學染料(包括螢光團)闡述於Richard P.Haugland之Molecular Probes Handbook中。
適宜蛋白質性螢光標記亦包括(但不限於)綠色螢光蛋白(包括GFP之海腎(Renilla)、海筆(Ptilosarcus)或水母(Aequorea)種類(Chalfie等人，1994,Science 263：802-805))、EGFP(Clontech Laboratories,Inc.,Genbank Accession Number U55762)、藍色螢光蛋白(BFP,Quantum Biotechnologies,Inc.1801 de Maisonneuve Blvd.West,8th Floor,Montreal,Quebec,Canada H3H 1J9；Stauber,1998,Biotechniques 24：462-471；Heim等人，1996,Curr.Biol.6：178-182)、增強之黃色螢光蛋白(EYFP,Clontech Laboratories,Inc.)、螢光素酶(Ichiki等人，1993,J.Immunol.150：5408-5417)、β半乳糖苷酶(Nolan等人，1988,Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.85：2603-2607)及海腎(WO92/15673、WO95/07463、WO98/14605、WO98/26277、WO99/49019、 美國專利第5292658號、第5418155號、第5683888號、第5741668號、第5777079號、第5804387號、第5874304號、第5876995號、第5925558號)。
白胺酸拉鏈域為促進發現其之蛋白質之寡聚化之肽。白胺酸拉鏈最初在若干DNA結合蛋白中鑑別出(Landschulz等人，1988,Science 240：1759)，且之後發現於多種不同蛋白質中。已知白胺酸拉鏈尤其為天然肽及其二聚化或三聚化衍生物。適於產生可溶性寡聚蛋白質之白胺酸拉鏈域之實例闡述於PCT申請案WO 94/10308中，且衍生自肺表面活性劑蛋白D(SPD)之白胺酸拉鏈闡述於Hoppe等人，1994,FEBS Letters 344：191中。允許融合至其之異源蛋白質穩定三聚化之經修飾白胺酸拉鏈之用途闡述於Fanslow等人，1994,Semin.Immunol.6：267-78中。在一方法中，在適宜宿主細胞中表現包含融合至白胺酸拉鏈肽之靶抗原抗體片段或衍生物之重組融合蛋白，且自培養物表面活性劑回收所形成之可溶性寡聚靶抗原抗體片段或衍生物。
本發明之抗體建構體亦可包含其他域，其有助於例如分離分子或與分子之適應的藥物動力學特徵相關。有助於分離抗體建構體之域可選自肽基序或二次引入之部分，其可以分離方法(例如分離管柱)捕獲。該等其他域之非限制性實施例包含肽基序，稱為Myc標籤、HAT標籤、HA標籤、TAP標籤、GST標籤、甲殼素結合域(CBD標籤)、麥芽糖結合蛋白(MBP標籤)、Flag標籤、Strep標籤及其變體(例如StrepII標籤)及His標籤。本文所揭示之特徵在於所鑑別CDR之所有抗體建構體較佳包含His標籤域，其在分子之較佳具有6個His殘基之胺基酸序列中通常稱為組成型His殘基重複。
T細胞或T淋巴球為一種類型之在細胞介導之免疫性中起關鍵作用之淋巴球(本身為一種類型之白血球)。存在若干T細胞亞組，其各自具有不同功能。T細胞與其他淋巴球(例如B細胞及NK細胞)之不同之處可在於在細胞表面上存在T細胞受體(TCR)。TCR負責識別結合至主要組織相容性複合物(MHC)分子之抗原且由兩條不同之蛋白質鏈構成。在95%之T細胞中，TCR由阿爾法(α)及貝他(β)鏈組成。當TCR與抗原肽及MHC 接合(肽/MHC複合物)時，T淋巴球經由一系列由相關酶、共受體、專門承接分子及活化或釋放之轉錄因子調介之生物化學事件活化
CD3受體複合物為蛋白質複合物且由四條鏈構成。在哺乳動物中，複合物含有CD3γ(伽馬)鏈、CD3δ(德爾塔)鏈及兩條CD3ε(伊普西隆)鏈。在T淋巴球中該等鏈與T細胞受體(TCR)及所謂的ζ(澤塔)鏈締合以形成T細胞受體CD3複合物且產生活化信號。CD3γ(伽馬)、CD3δ(德爾塔)及CD3ε(伊普西隆)鏈為含有單一細胞外免疫球蛋白域之免疫球蛋白超家族之高度相關之細胞表面蛋白。CD3分子之細胞內尾含有單一保守基序，稱為基於酪胺酸之免疫受體活化基序或簡稱為ITAM，其為TCR之信號傳導能力所必需。CD3ε分子為多肽，其在人類中由駐留於染色體11上之CD3E基因編碼。較佳人類CD3ε細胞外域之序列顯示於SEQ ID NO：1中，且對應於人類CD3ε細胞外域之胺基酸殘基1-27之最佳CD3結合表位表示於SEQ ID NO：2中。
多特異性、至少雙特異性抗體建構體經由募集T細胞對靶細胞之重定向溶解涉及形成溶細胞突觸及遞送穿孔素及顆粒酶。接合T細胞能夠連續溶解靶細胞，且不受干擾肽抗原處理及呈遞之免疫逃逸機制或選殖T細胞分化之影響；例如，參見WO 2007/042261。
由雙特異性建構體調介之細胞毒性可以多種方式來量測。效應細胞可為例如經刺激經富集之(人類)CD8陽性T細胞或未經刺激之(人類)末梢血單核細胞(PBMC)。若靶細胞為獼猴來源或表現獼猴靶細胞抗原或經其轉染，則效應細胞亦應為獼猴來源，例如獼猴T細胞系，例如4119LnPx。靶細胞應表現靶細胞抗原(例如人類或獼猴靶細胞抗原)(之至少細胞外域)。靶細胞可為經靶細胞抗原(例如人類或獼猴靶細胞抗原)穩定或瞬時轉染之細胞系(例如CHO)。或者，靶細胞可為靶細胞抗原陽性天然表現細胞系，例如人類癌細胞系。通常，預期使用在細胞表面上表現較高靶細胞抗原含量之靶細胞系之EC50值較低。效應細胞對靶細胞(E：T)比率通常為約10：1，但亦可有所變化。可在51鉻釋放分析(培育時間為約18小時)中或在基於FACS之細胞毒性分析(培育時間為約48小時)中量測雙特異性建構體之細胞毒性活性。亦可修改分析培育時間(細胞毒性反應)。量測細胞毒性之 其他方法為熟習此項技術者所熟知且包含MTT或MTS分析、基於ATP之分析(包括生物發光分析)、磺基羅丹明B(SRB)分析、WST分析、成株分析及ECIS技術。
較佳在基於細胞之細胞毒性分析中量測由本發明雙特異性建構體調介之細胞毒性活性。其由EC50值表示，該值對應於半最大有效濃度(引起介於基線與最大值中間的細胞毒性反應之抗體建構體濃度)，較佳地，雙特異性建構體之EC50值為20.000pg/ml，更佳5000pg/ml，甚至更佳1000pg/ml，甚至更佳500pg/ml，甚至更佳350pg/ml，甚至更佳250pg/ml，甚至更佳100pg/ml，甚至更佳50pg/ml，甚至更佳10pg/ml，且最佳5pg/ml。
上文所給定EC50值中之任一者可與例如隨附實例中所述之方法一致之基於細胞之細胞毒性分析中之任一所指示情境組合。舉例而言，當使用(人類)CD8陽性T細胞或獼猴T細胞系作為效應細胞時，本發明雙特異性建構體(例如靶細胞抗原/CD3雙特異性建構體)之EC50值較佳1000pg/ml，更佳500pg/ml，甚至更佳250pg/ml，甚至更佳100pg/ml，甚至更佳50pg/ml，甚至更佳10pg/ml，且最佳5pg/ml。若在此分析中，靶細胞為經靶抗原(例如靶細胞抗原CD33)轉染之(人類或獼猴)細胞，例如CHO細胞，則雙特異性建構體之EC50值較佳150pg/ml，更佳100pg/ml，甚至更佳50pg/ml，甚至更佳30pg/ml，甚至更佳10pg/ml，且最佳5pg/ml。若靶細胞為(例如靶細胞抗原之)陽性天然表現細胞系，則EC50值較佳350pg/ml，更佳250pg/ml，甚至更佳200pg/ml，甚至更佳100pg/ml，甚至更佳150pg/ml，甚至更佳100pg/ml，且最佳50pg/ml或更低。當使用(人類)PBMC作為效應細胞時，雙特異性建構體之EC50值較佳1000pg/ml，更佳750pg/ml，更佳500pg/ml，甚至更佳350pg/ml，甚至更佳250pg/ml，甚至更佳100pg/ml，且最佳50pg/ml或更低。
較佳地，本發明之雙特異性建構體不會誘導/調介靶細胞抗原陰性細胞(例如CHO細胞)之溶解或基本上不會誘導/調介其溶解。術語「不會誘導溶解」、「基本上不會誘導溶解」、「不會調介溶解」或「基本上不會調介溶解」意指本發明之抗體建構體不會誘導或調介大於30%、較佳不大 於20%、更佳不大於10%、尤佳不大於9%、8%、7%、6%或5%之靶細胞抗原陰性細胞之溶解，其中靶細胞抗原陽性細胞系之溶解設定為100%。此通常適用於至多500nM之抗體建構體濃度。熟習此項技術者已知量測細胞溶解之方法，此處不再贅述。此外，本說明書教示如何量測細胞溶解之特定說明。
較佳地，根據包含以下步驟之時間表投與根據本發明使用之雙特異性建構體：(a)投與第一劑量之雙特異性建構體，然後(b)投與第二劑量之雙特異性建構體，其中該第二劑量超過該第一劑量，視情況然後(c)投與第三劑量之雙特異性建構體，其中該視情況選用之第三劑量超過該第二劑量。
與上文一致，進一步較佳地，第一劑量之投與時段長達7天。第一劑量之此投與時段可用於雙特異性建構體之初始期/第一投與週期期間例如以減小患者中之腫瘤負荷(腫瘤減積)，同時避免萬一在第一劑量之投與時段期間使用更高劑量可預期之病況，例如細胞介素風暴及/或細胞介素釋放症候群。
儘管在本發明之一個實施例中，第一劑量之投與時段長達7天，但投與此第一劑量達6天、5天、4天、3天、2天或1天之時段亦在此較佳實施例內。在個體患者之腫瘤負荷或一般狀況確實需要在第一有限投藥步驟中投與有限劑量之雙特異性建構體之情形下，此第一投藥步驟應理解為導入期/適應期，其應避免或限制由患者與雙特異性建構體之第一次接觸引起之副作用。對於規範BiTE®(例如AMG 330，其為54kDa單鏈多肽)，該導入期/適應期之較佳劑量範圍可在1至50μg/d範圍內，較佳在3至30μg/d範圍內，進一步較佳在4至20μg/d範圍內，且甚至更佳在5至15μg/d範圍內。在極佳實施例中，本發明之雙特異性建構體以10μg/d之劑量投與。在半衰期延長之雙特異性抗體建構體情形下，可容易地確定各別等莫耳濃度劑量。然而，倘若個體患者之腫瘤負荷或一般狀況無需在第一有限投藥步驟中投與該有限劑量之雙特異性建構體，則第一劑量可在該 範圍內。
例如對於規範BiTE®(例如AMG 330)，雙特異性建構體之第二劑量之較佳範圍在10μg/d至10mg/d範圍內，更佳在25μg/d至1mg/d範圍內，且甚至更佳在30μg/d至500μg/d範圍內。在極佳實施例中，第二劑量為30μg/d或60μg/d。與上文一致，雙特異性建構體之第三劑量之較佳範圍超過第二劑量之各別劑量。第三劑量通常在60μg/d至500μg/d範圍內，且較佳消滅可已避開等效於本發明第二劑量之治療之殘留靶細胞。
在用於本發明用途之雙特異性建構體之一個實施例中，繼第一劑量之後的投藥步驟之整個投與時段在8至13天範圍內。與上文一致，不同投藥步驟中之整個投與時段不超過14天。因此，第二及視情況選用之第三劑量之雙特異性建構體之投與時段可較佳為13天、12天、11天、10天、9天或8天，最佳10天。
令人驚奇地發現，當施加分步投藥時，例如若給予4天之第一劑量且給予10天之第二劑量，其中第一劑量為5至15μg/d、較佳10μg/d，且其中第二劑量為30/dμg至500μg/d、較佳30μg/d或60μg/d，則可有效地預防免疫副作用，例如不期望細胞介素釋放，例如細胞介素釋放症候群。相比之下，若給予等效於第二劑量之劑量而不給予等效於本發明第一劑量之先前較低劑量，則可出現副作用，例如不期望細胞介素釋放，例如細胞介素釋放症候群。
對於本發明亦較佳地，第二劑量之投與時段為4至7天、較佳4天，且第三劑量之投與時段為4至7天。因此，尤佳地，第二劑量之投與時段為7天、6天、5天或4天，且視情況選用之第三劑量之投與時段為7天、6天、5天或4天。
亦與本發明一致，骨髓樣白血病之治療較佳包含兩個或更多個治療週期，該等治療週期各自包含最長14天之建構體投與時段及其後至少14天不投與建構體之時段。倘若與本發明一致之治療包含兩個或更多個週期，則進一步較佳地在一個實施例中，僅第一治療週期包含依照步驟(a)之投與，而後續週期開始於依照步驟(b)之劑量。
亦與本發明一致，較佳地，對於用於治療骨髓樣白血病之雙 特異性建構體，雙特異性建構體之第一結合域包含選自由以下組成之群的由每組6個CDR構成之多個組：SEQ ID NO：10至12及14至16、22至24及26至28、34至36及38至40、46至48及50至52、58至60及62至64、70至72及74至76、82至84及86至88、94至96及98至100。
此外，與本發明一致，較佳地，對於用於治療骨髓樣白血病之雙特異性建構體，雙特異性建構體之第二結合域包含選自由以下組成之群的由每組6個CDR構成之多個組：WO 2008/119567之SEQ ID NO：9至14、27至32、45至50、63至68、81至86、99至104、117至122、135至140、153至158及171至176。
與第二結合域一樣，本發明抗體建構體之第一(或任何其他)結合域較佳對靈長類動物之哺乳動物目之成員具有交叉物種特異性。交叉物種特異性CD3結合域闡述於例如WO 2008/119567中。根據一個實施例，第一及第二結合域除分別結合至人類CD33靶細胞抗原及人類CD3外，亦將結合至靈長類動物之CD33靶細胞抗原/CD3，該等靈長類動物包括(但不限於)新大陸靈長類動物(例如白鬢狨、棉冠獠狨或松鼠猴)、舊大陸靈長類動物(例如狒狒及獼猴)、長臂猿及非人類人亞科(homininae)。白鬢狨及棉冠獠狨皆為屬於狨科(Callitrichidae)家族之新大陸靈長類動物，而松鼠猴為屬於卷尾猴科(Cebidae)家族之新大陸靈長類動物。
在本發明之較佳實施例中，雙特異性建構體為雙特異性抗體建構體。與上文所提供之定義一致，此實施例係關於雙特異性建構體，其為抗體建構體。在本發明之較佳實施例中，雙特異性抗體建構體為單鏈建構體。與本發明一致，該雙特異性單鏈抗體建構體可包含選自由以下組成之群的胺基酸序列：SEQ ID NO：18、19、20、30、31、32、42、43、44、54、55、56、66、67、68、78、79、80、90、91、92、102、103、104、105、106、107及108。
亦涵蓋本文所述之雙特異性建構體之胺基酸序列修飾。舉例而言，可需要改良雙特異性建構體之結合親和力及/或其他生物性質。藉由將適當核苷酸變化引入雙特異性建構體核酸中或藉由肽合成來製備雙特異性建構體之胺基酸序列變體。所有下述胺基酸序列修飾應產生仍保留未經 修飾之親代分子之所需生物活性(結合至靶細胞抗原及CD3)的雙特異性建構體。
術語「胺基酸」或「胺基酸殘基」通常指具有其公認定義之胺基酸，例如選自由以下組成之群的胺基酸：丙胺酸(Ala或A)；精胺酸(Arg或R)；天冬醯胺(Asn或N)；天冬胺酸(Asp或D)；半胱胺酸(Cys或C)；麩胺醯胺(GIn或Q)；麩胺酸(GIu或E)；甘胺酸(GIy或G)；組胺酸(His或H)；異白胺酸(He或I)；白胺酸(Leu或L)；離胺酸(Lys或K)；甲硫胺酸(Met或M)；苯丙胺酸(Phe或F)；脯胺酸(Pro或P)；絲胺酸(Ser或S)；蘇胺酸(Thr或T)；色胺酸(Trp或W)；酪胺酸(Tyr或Y)；及纈胺酸(VaI或V)，但可視需要使用經修飾、合成或稀有胺基酸。通常，胺基酸可分組為具有非極性側鏈(例如Ala、Cys、He、Leu、Met、Phe、Pro、VaI)；帶負電側鏈(例如Asp、GIu)；帶正電側鏈(例如Arg、His、Lys)；或不帶電極性側鏈(例如Asn、Cys、GIn、GIy、His、Met、Phe、Ser、Thr、Trp及Tyr)。
胺基酸修飾包括例如缺失及/或插入及/或取代雙特異性建構體之胺基酸序列內之殘基。製備缺失、插入及取代之任一組合以獲得最終建構體，條件為最終建構體具有所需特徵。胺基酸變化亦可改變雙特異性建構體之轉譯後過程，例如改變醣基化位點之數量或位置。
舉例而言，在每一CDR中可插入或缺失1個、2個、3個、4個、5個或6個胺基酸(當然端視其長度)，而在每一FR中可插入或缺失1個、2個、3個、4個、5個、6個、7個、8個、9個、10個、11個、12個、13個、14個、15個、16個、17個、18個、19個、20個或25個胺基酸。較佳地，胺基酸序列插入包括與含有100個或更多個殘基之多肽之長度在1個、2個、3個、4個、5個、6個、7個、8個、9個或10個殘基範圍內之胺基及/或羧基末端融合物以及單一或多個胺基酸殘基之序列內插入。本發明雙特異性建構體之插入變體包括雙特異性建構體之N末端或C末端與酶之融合物或與增加雙特異性建構體之血清半衰期之多肽之融合物。
增加的半衰期通常可用於免疫球蛋白、尤其抗體且最尤其大小較小之抗體片段之活體內應用。儘管基於抗體片段(Fv、二硫化物鍵結之Fv、Fab、scFv、dAb)之該等抗體建構體能夠快速到達身體之大多數部分， 但彼等抗體建構體可能遭受自身體快速清除。業內所述用於延長抗體建構體(例如單鏈雙價抗體)之半衰期之策略包括偶聯聚乙二醇鏈(聚乙二醇化)、融合至IgG Fc區或白蛋白或白蛋白結合域。
血清白蛋白為肝臟以生理學方式產生之蛋白質；其在血漿中發生溶解且為哺乳動物中最豐富之血液蛋白。白蛋白為維持血管與身體組織之間之適當體液分佈所需之膠體滲透壓所必需。其亦藉由非特異性結合若干疏水性類固醇激素用作血漿載劑且用作氧化血紅素及脂肪酸之運輸蛋白。術語「血清白蛋白」及其人類變體(「人類白蛋白」)在本發明蛋白質背景下定義親代人類血清白蛋白(如SEQ ID NO：109中所述之序列)或其任何變體(例如如SEQ ID NO：110-138中所繪示之白蛋白)或片段，較佳表現為基因融合蛋白且至少與一種治療蛋白化學交聯等。包含白蛋白之單一或多個突變或片段之變體提供經改良之性質，例如與其親代或參照物相比對FcRn受體之親和力及延長的血漿半衰期。人類白蛋白之變體闡述於例如WO 2014/072481中。與本發明一致，血清白蛋白可經由肽連接體連接至抗體建構體。較佳地，肽連接體具有胺基酸序列(GGGGS)n(SEQ ID NO：13)n，其中「n」為在1至5範圍內之整數。進一步較佳者在於「n」為在1至3範圍內之整數，且最佳地「n」為1或2。
取代誘變之最受關注位點包括重鏈及/或輕鏈之CDR、具體而言超變區，但亦涵蓋重鏈及/或輕鏈中之FR變化。取代較佳為如本文所述之保守取代。較佳地，在CDR中可取代1個、2個、3個、4個、5個、6個、7個、8個、9個或10個胺基酸，而在框架區(FR)中可取代1個、2個、3個、4個、5個、6個、7個、8個、9個、10個、11個、12個、13個、14個、15個、16個、17個、18個、19個、20個或25個胺基酸，此端視CDR或FR之長度而定。舉例而言，若CDR序列涵蓋6個胺基酸，則設想該等胺基酸中之一者、兩者或三者經取代。類似地，若CDR序列涵蓋15個胺基酸，則設想該等胺基酸中之一者、兩者、三者、四者、五者或六者經取代。
可用於鑑別雙特異性建構體之為較佳誘變位置之某些殘基或區域的方法稱為「丙胺酸掃描誘變」，如Cunningham及Wells，Science,244： 1081-1085(1989)所述。在此處，鑑別出雙特異性建構體內之殘基或靶殘基群(例如帶電殘基，例如arg、asp、his、lys及glu)且用中性或帶負電胺基酸(最佳丙胺酸或聚丙胺酸)替代以影響胺基酸與表位之相互作用。
然後藉由在取代位點或針對其引入另外或其他變體來細化展示對取代之功能敏感性之彼等胺基酸位置。因此，儘管用於引入胺基酸序列變化之位點或區域為預定的，但突變之性質本身無需預定。舉例而言，為分析或優化給定位點之突變之性能，可在靶密碼子或區域實施丙胺酸掃描或隨機誘變，且針對所需活性之最佳組合篩選所表現雙特異性建構體變體。DNA之預定位點製備取代突變之技術用於在具有已知序列之為業內所熟知，例如M13引子誘變及PCR誘變。使用靶抗原結合活性之分析來篩選突變體。
通常，若重鏈及/或輕鏈中之一或多個或所有CDR中之胺基酸經取代，則較佳地，隨後獲得之「經取代」序列與「原始」CDR序列至少60%、更佳65%、甚至更佳70%、尤佳75%、更尤佳80%一致。此意味著CDR之長度取決於其與「經取代」序列一致之程度。舉例而言，具有5個胺基酸之CDR較佳與其經取代序列80%一致以使至少一個胺基酸經取代。因此，雙特異性抗體建構體之CDR可與其經取代序列具有不同程度之一致性，例如CDRL1可具有80%，而CDRL3可具有90%。
較佳取代(或替代)為保守取代。然而，設想任何取代(包括非保守取代或下表1中所列示「實例性取代」中之一或多者)，只要雙特異性建構體保留其經由第一結合域結合至靶細胞抗原及經由第二結合域結合至CD3ε之能力及/或其CDR與隨後取代之序列具有一致性(與「原始」CDR序列至少60%、更佳65%、甚至更佳70%、尤佳75%、更尤佳80%一致)即可。
保守取代顯示於表1中之標題「較佳取代」下。若該等取代引起生物活性變化，則可引入在表A中稱為「實例性取代」或如下文參照胺基酸類別進一步闡述之更多實質性變化，且針對所需特徵篩選該等產物。
表A：胺基酸取代
本發明雙特異性建構體之生物性質之實質性修飾係藉由選擇使其對維持以下各項之效應顯著不同之取代來實現：(a)取代區域中多肽骨架之結構，例如呈褶板或螺旋構象，(b)靶位點分子之電荷或疏水性，或(c)側鏈之容積。基於常見側鏈性質將天然殘基分成多組：(1)疏水性：正白胺酸、met、ala、val、leu、ile；(2)中性親水性：cys、ser、thr、asn、gln；(3)酸性：asp、glu；(4)鹼性：his、lys、arg；(5)影響鏈取向之殘基：gly、pro；及(6)芳族：trp、tyr、phe。
非保守取代將使該等類別中一者之成員更換為另一類別。通常可用絲胺酸取代不參與維持雙特異性建構體之正確構象之任何半胱胺酸殘基，以改良分子之氧化穩定性且防止異常交聯。相反，可將半胱胺酸鍵添加至抗體中以改良其穩定性(尤其在抗體為諸如Fv片段等抗體片段時)。
對於胺基酸序列，藉由使用業內已知之標準技術確定序列一致性及/或相似性，該等技術包括(但不限於)Smith及Waterman,1981,Adv.Appl.Math.2：482之局部序列一致性演算法；Needleman及Wunsch,1970,J.Mol.Biol.48：443之序列一致性比對演算法；Pearson及Lipman,1988,Proc.Nat.Acad.Sci.U.S.A.85：2444之檢索相似性方法；該等演算法(Wisconsin Genetics軟體包，Genetics Computer Group,575 Science Drive,Madison,Wis.中之GAP、BESTFIT、FASTA及TFASTA)之電腦化執行；Devereux等人，1984,Nucl.Acid Res.12：387-395所述之最佳擬合序列程式，較佳使用預設設定或藉由檢驗。較佳地，藉由基於以下參數之FastDB來計算一致性%：錯配罰分1；空位罰分1；空位大小罰分0.33；及連接罰分30，「Current Methods in Sequence Comparison and Analysis」,Macromolecule Sequencing and Synthesis,Selected Methods and Applications，第127-149頁(1988),Alan R.Liss,Inc。
有用演算法之實例為PILEUP。PILEUP使用進行性成對比對自相關序列群產生多序列比對。其亦可繪製顯示用於產生比對之聚類關係之樹。PILEUP使用Feng及Doolittle,1987,J.Mol.Evol.35：351-360之進 行性比對方法之簡化版；該方法類似於Higgins及Sharp,1989,CABIOS 5：151-153所述之方法。有用PILEUP參數包括預設空位權重3.00、預設空位長度權重0.10及加權末端空位。
有用演算法之另一實例為BLAST演算法，其闡述於以下文獻中：Altschul等人，1990,J.Mol.Biol.215：403-410；Altschul等人，1997,Nucleic Acids Res.25：3389-3402；及Karin等人，1993,Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.90：5873-5787。尤其有用之BLAST程式為自Altschul等人，1996,Methods in Enzymology 266：460-480獲得之WU-BLAST-2程式。WU-BLAST-2使用若干檢索參數，其中之大多數設定為預設值。可調整參數經設定具有以下值：重疊間隔=1、重疊分數=0.125、字串臨限值(T)=II。HSPS及HSP S2參數為動態值且由該程式自身端視特定序列之組成及檢索所關注序列之特定數據庫之組成來建立；然而，值可經調整以增加靈敏度。
另一有用演算法為空位BLAST，如Altschul等人，1993,Nucl.Acids Res.25：3389-3402所報導。空位BLAST使用BLOSUM-62取代評分；設定為9之臨限值T參數；觸發非空位延伸之雙擊方法、為k之電荷空位長度、為10+k之費用；設定為16之Xu及設定為40(對於數據庫檢索階段)及67(對於演算法之輸出階段)之Xg。空位比對由對應於約22位元之評分來觸發。
通常，個別變體CDR與本文所繪示序列之間之胺基酸同源性、相似性或一致性為至少60%，且更通常較佳增加同源性或一致性為至少65%或70%、更佳至少75%或80%、甚至更佳至少85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%及幾乎100%。以類似方式，相對於本文所鑑別結合蛋白核酸序列之「核酸序列一致性百分數(%)」定義為候選序列中與雙特異性建構體之編碼序列中之核苷酸殘基一致之核苷酸殘基的百分比。特定方法利用設定預設參數之WU-BLAST-2之BLASTN模組，且重疊間隔及重疊分數分別設定為1及0.125。
通常，編碼個別變體CDR之核苷酸序列與本文所繪示核苷酸序列之間之核酸序列同源性、相似性或一致性為至少60%，且更通常較佳增加同源性或一致性為至少65%、70%、75%、80%、81%、82%、83%、 84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%及幾乎100%。因此，「變體CDR」為以下CDR：與本發明親代CDR具有指定同源性、相似性或一致性且共享生物功能、包括(但不限於)至少60%、65%、70%、75%、80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%之親代CDR特異性及/或活性。
在一個實施例中，根據本發明使用之雙特異性建構體係與一或多種選自由以下組成之群的表觀遺傳因子組合投與：組蛋白去乙醯酶(HDAC)抑制劑、DNA甲基轉移酶(DNMT)I抑制劑、羥基脲、顆粒球群落刺激因子(G-CSF)、組蛋白去甲基酶抑制劑及ATRA(所有反式視黃酸)，且其中：(a)一或多種表觀遺傳因子係在投與雙特異性建構體之前投與；(b)一或多種表觀遺傳因子係在投與雙特異性建構體之後投與；或(c)一或多種表觀遺傳因子及雙特異性建構體係同時投與。
術語「表觀遺傳因子」結合本發明定義在投與後能夠改變細胞群體之基因表現或細胞表型之化合物。應理解，該改變指基因組之一或多種功能相關之修飾但不涉及核酸序列之改變。該等修飾之實例為DNA甲基化及組蛋白修飾，其皆對調控基因表現但不改變潛在DNA序列至關重要。
治療骨髓樣白血病之細節包含投與雙特異性建構體與PCT/EP2014/069575中所提供之一或多種上述表觀遺傳因子之組合。
在本發明之一個實施例中，較佳地，一或多種表觀遺傳因子係在投與雙特異性建構體之前至多7天投與。
在本發明之一個實施例中，亦較佳地，表觀遺傳因子為羥基脲。
對於本發明較佳地，骨髓樣白血病選自由以下組成之群：急性骨髓母細胞性白血病、慢性嗜中性白血病、骨髓樣樹突狀細胞白血病、加速期慢性骨髓性白血病、急性骨髓單核球白血病、青少年骨髓單核球白血病、慢性骨髓單核球白血病、急性嗜鹼性白血病、急性嗜伊紅球性白血 病、慢性嗜伊紅球性白血病、急性巨核母細胞性白血病、原發性血小板增多症、急性類紅血球性白血病、真性紅血球增多症、骨髓增生不良症候群、急性泛骨髓樣白血病、骨髓樣肉瘤及急性雙表型白血病。更佳地，骨髓樣白血病為急性骨髓樣白血病(AML)。AML之定義尤其包含急性骨髓母細胞性白血病、急性骨髓樣樹突狀細胞白血病、急性骨髓單核球白血病、急性嗜鹼性白血病、急性嗜伊紅球性白血病、急性巨核母細胞性白血病、急性類紅血球性白血病及急性泛骨髓樣白血病
結合本發明闡述之雙特異性建構體可經調配以醫藥組合物形式適當投與有需要之個體。
本文所述之調配物可用作醫藥組合物來治療、改善及/或預防有需要之患者之如本文所述之病理性醫學病況。術語「治療」指治療性治療及防護性或預防性量測二者。治療包括向患有疾病/病症、疾病/病症之症狀或患疾病/病症傾向之患者之身體、經分離組織或細胞施用或投與調配物，目的為治癒、癒合、緩和、減輕、改變、補救、改善、改良或影響疾病、疾病之症狀或患疾病之傾向。
術語「疾病」指將自本文所述之雙特異性建構體或醫藥組合物之治療受益之任何病況。此包括慢性及急性病症或疾病，包括彼等使哺乳動物易患所討論疾病之病理性病況。
術語「有需要之個體」或「需要治療」之彼等包括已患病症之彼等以及欲預防病症之彼等。有需要之個體或「患者」包括接受防護性或治療性治療之人類及其他哺乳動物個體。
本發明之雙特異性建構體通常將經設計尤其用於特定投與途徑及方法、用於特定投與劑量及頻率、用於特定疾病之特定治療，其具有生物利用度及持久性範圍。較佳為投與位點可接受之濃度調配組合物之材料。
因此，調配物及組合物可根據本發明設計以藉由任一適宜投與途徑遞送。在本發明上下文中，投與途徑包括(但不限於)●局部途徑(例如經皮、吸入、鼻、眼、耳(auricular)/耳(aural)、陰道、黏膜)； ●腸內途徑(例如經口、胃腸、舌下、唇下、頰、直腸)；及●非經腸途徑(例如靜脈內、動脈內、骨內、黏膜內、大腦內、腦室內、硬膜外、鞘內、皮下、腹膜內、羊膜外、關節內、心內、真皮內、病灶內、子宮內、膀胱內、玻璃體內、穿皮、鼻內、經黏膜、滑膜內、管腔內)。
醫藥組合物及結合本發明闡述之雙特異性建構體尤其可用於非經腸投與，例如皮下或靜脈內遞送，例如藉由注射(例如濃注注射)或藉由輸注(例如連續輸注)。醫藥組合物可使用醫學裝置來投與。用於投與醫藥組合物之醫學裝置之實例闡述於美國專利第4,475,196號；第4,439,196號；第4,447,224號；第4,447,233號；第4,486,194號；第4,487,603號；第4,596,556號；第4,790,824號；第4,941,880號；第5,064,413號；第5,312,335號；第5,312,335號；第5,383,851號；及第5,399,163號中。
具體而言，本發明提供適宜組合物之不間斷投與。作為非限制性實例，不間斷或實質上不間斷(即連續投與)可藉由患者佩戴之用於計量流入患者體內之治療劑之小幫浦系統來實現。包含結合本發明闡述之雙特異性建構體之醫藥組合物可藉由使用該等幫浦系統來投與。該等幫浦系統通常為業內已知，且通常依賴於含有欲輸注治療劑之柱之週期性交換。當交換該幫浦系統中之柱時，可暫時中斷原本不間斷流入患者體內之治療劑。在該情形下，柱更換前之投與期及柱更換後之投與期仍將視為在本發明醫藥方式及方法之含義內，其共同構成該治療劑之一次「不間斷投與」。
結合本發明闡述之雙特異性建構體之連續或不間斷投與可為藉助流體遞送裝置或小幫浦系統(包括將流體驅動出儲液器之流體驅動機制及使驅動機制致動之致動機制)之靜脈內或皮下投與。用於皮下投與之幫浦系統可包括穿透患者之皮膚並將適宜組合物遞送至患者體內之針或套管。該等幫浦系統可獨立於靜脈、動脈或血管直接固定或附接至患者之皮膚，藉此允許幫浦系統與患者皮膚之間之直接接觸。幫浦系統可附接至患者皮膚達24小時至若干天。幫浦系統可具有較小大小及較小體積之儲液器。作為非限制性實例，用於欲投與之適宜醫藥組合物之儲液器之體積可在0.1ml與50ml之間。
連續投與亦可為藉助佩戴於皮膚上且以間隔更換之貼片之 穿皮投與。熟習此項技術者明瞭用於藥物遞送之貼片系統適用於此目的。應注意，穿皮投與尤其適用於不間斷投與，此乃因更換第一張廢貼片可有利地與例如緊鄰第一張廢貼片且在即將去除第一張廢貼片時在皮膚表面上放置第二張新貼片同時進行。不會出現流量中斷或電源電池失效問題。
若醫藥組合物已凍乾，首先在投與之前將凍乾材料重構於適宜液體中。凍乾材料可重構於例如抑菌性注射用水(BWFI)、生理鹽水、磷酸緩衝鹽水(PBS)或與蛋白質凍乾之前相同之調配物。
本發明組合物可以適宜劑量投與個體，該劑量可例如藉由劑量擴大研究藉由投與遞增劑量之結合本發明闡述之展現本文所述與非黑猩猩靈長類動物(例如獼猴)之交叉物種特異性的雙特異性建構體來確定。如上文所述，結合本發明闡述之展現本文所述交叉物種特異性之雙特異性建構體可有利地以相同形式用於非黑猩猩靈長類動物之臨床前測試中及用作人類中之藥物。投藥方案將由主治醫師及臨床因素確定。如醫學領域中所熟知，用於任一患者之劑量端視許多因素而定，包括患者之大小、身體表面積、年齡、欲投與之具體化合物、性別、投與時間及途徑、一般健康狀況及同時投與之其他藥物。
術語「有效劑量(dose)」或「有效劑量(dosage)」定義為足以達成或至少部分達成所需效應之量。術語「治療有效劑量」定義為足以治癒或至少部分阻止已患該疾病之患者之疾病及其併發症的量。可有效地用於此用途之量或劑量將端視欲治療之病況(適應症)、所遞送之雙特異性建構體、治療背景及目標、疾病之嚴重程度、先前療法、患者之臨床病史及對治療劑之反應、投與途徑、患者之大小(體重、身體表面或器官大小)及/或狀況(年齡及一般健康狀況)以及患者自身免疫系統之一般狀態。可根據主治醫師之判斷來調整適當劑量，使得其可一次性或經一系列投與投與患者，且獲得最佳治療效應。
典型劑量可在約0.1μg/kg至約30mg/kg或更大範圍內，此端視上文所提及之因素而定。在特定實施例中，劑量可在1.0μg/kg至約20mg/kg、視情況10μg/kg至約10mg/kg或100μg/kg至約5mg/kg範圍內。
結合本發明闡述之雙特異性建構體之治療有效量較佳可減 輕疾病症狀之嚴重程度、增加無疾病症狀時段之頻率或持續時間或預防因疾病折磨所致之損害或失能。為治療表現靶細胞抗原之腫瘤，治療有效量之結合本發明闡述之雙特異性建構體(例如抗靶細胞抗原/抗CD3抗體建構體)較佳抑制相對於未經治療之患者至少約20%、至少約40%、至少約50%、至少約60%、至少約70%、至少約80%或至少約90%之細胞生長或腫瘤生長。化合物抑制腫瘤生長之能力可在預測人類腫瘤中之效能之動物模型中評估。
醫藥組合物可以唯一治療劑形式或以與其他療法(例如視需要抗癌療法，例如其他蛋白質性及非蛋白質性藥物)之組合投與。該等藥物可與如本文所定義包含結合本發明闡述之雙特異性建構體之組合物同時投與或在投與該雙特異性建構體之前或之後以時間界定之間隔及劑量單獨投與。
另外，本發明者觀察到，可藉助醣皮質素(前)及/或(輔助)療法來預防或緩和罕見副作用(例如免疫副作用)。
因此，本發明確立，醣皮質素(例如地塞米松(mitigate))減輕或甚至防止可在用本發明之CD33/CD3特異性雙特異性建構體治療期間發生之不利效應。
醣皮質素(GC)仍為治療發炎病症及自體免疫疾病之最廣泛使用之免疫抑制劑。醣皮質素(GC)為一類結合至醣皮質素受體(GR)之類固醇激素，其存在於幾乎每個脊椎動物動物細胞中，包括人類。該等化合物為強效抗發炎劑，而與發炎之原因無關。醣皮質素尤其藉由抑制編碼細胞介素IL-1、IL-2、IL-3、IL-4、IL-5、IL-6、IL-8及IFN-γ之基因來抑制細胞介導之免疫性。
屬於GC群組之可體松(cortisone)為重要的治療藥物，其用於對抗在愛迪生氏病(Addison's disease)至類風濕性關節炎範圍內之許多病痛。自從發現使其成為受歡迎特效藥之抗風濕性質，已產生許多具有增強的較佳對抗特定病痛性質之可體松衍生物。可體松屬於稱為皮質類固醇之類固醇群組。該等類固醇由腎上腺皮質產生，該腎上腺皮質在腎上腺之外部，靠近腎臟。皮質類固醇分成兩大群組：醣皮質素(GC)，其控制脂肪、 蛋白質、鈣及碳水化合物代謝；及鹽皮質素，其控制鈉及鉀含量。可體松屬於前一群組，即屬於GC。可體松及其許多衍生物用於多種疾病。可體松亦幫助實現器官移植，此乃因其可最小化身體對存在於植入器官中之外源蛋白質之防禦反應且因此損害植入器官之功能。然而，儘管在臨床上應用50年以上，但GC對免疫系統不同細胞隔室之特定抗發炎效應尚不清楚。GC影響免疫系統之幾乎每個細胞，且存在愈來愈多之關於細胞類型特異性機制之證據。
在一特定實施例中，本發明係關於醣皮質素(GC)用於改善、治療或防護由CD33/CD3雙特異性建構體引起之不良效應。如上文所概述，該等不期望不良效應可藉由如本文所述之分步投藥來預防。然而，對於僅預防而言，可提供用於改善、治療或防護患者之(免疫)不良效應之醣皮質素，其中該患者正經受CD33/CD3雙特異性抗體建構體之治療。因此，在另一態樣中，本發明係關於醣皮質素(GC)用於改善、治療或防護由本發明之CD33/CD3雙特異性抗體建構體引起之免疫不良效應之方法中。
本發明亦係關於改善、治療或防護由CD33/CD3雙特異性抗體建構體引起之免疫不良效應之方法，該方法包含向有需要之患者投與醣皮質素(GC)。GC較佳以足以改善、治療或預防該由CD33/CD3雙特異性抗體建構體引起之免疫不良效應之量來投與。
術語「醣皮質素」意指結合、較佳特異性結合至醣皮質素受體之化合物。該術語包括選自由以下組成之群的化合物：可體松、皮質醇(氫化可體松)、氯潑尼醇(cloprednol)、潑尼松(prednisone)、潑尼松龍(prednisolone)、甲基潑尼松龍、地夫可特(deflazacort)、氟可龍(fluocortolone)、曲安西龍(triamcinolone)、地塞米松、倍他米松(beatamethasone)、可的伐唑(cortivazol)、帕拉米松(paramethasone)及/或氟替卡松(fluticasone)，包括其醫藥學上可接受之衍生物。在本發明實施例之上下文中，所提及化合物可單獨或以組合使用。地塞米松較佳。然而，本發明並不限於上文所提及之具體GC。設想已或將分類為「醣皮質素」之所有物質亦可用於本發明之上下文中。該等將來醣皮質素包括特異性結合至且活化醣皮質素受體之化合物。術語「特異性結合至GC受體」根據本發明意 指，GC(或假設與GC一樣起作用之化合物)與GC受體(亦稱為NR3C1)締合(例如相互作用)至與通常蛋白質/受體之締合(即非特異性結合)相比統計學上顯著之程度。當GC受體結合至醣皮質素時，其主要作用機制為調控基因轉錄。在GC不存在下，醣皮質素受體(GR)駐留於與多種蛋白質複合之細胞液中，該等蛋白質包括熱休克蛋白90(hsp90)、熱休克蛋白70(hsp70)及蛋白質FKBP52(FK506結合蛋白52)。GC與醣皮質素受體(GR)之結合可釋放熱休克蛋白。因此設想，將來GC或GC之醫藥學上可接受之衍生物或鹽較佳能夠結合至GC受體且釋放上文所提及之熱休克蛋白。經活化GR複合物上調核中抗發炎蛋白質之表現或遏制細胞液中促發炎蛋白之表現(藉由防止其他轉錄因子自細胞液易位至核中)。
在較佳實施例中，該GC選自臨床上最常用且相關之GC，如地塞米松、丙酸氟替卡松、潑尼松龍、甲基潑尼松龍、倍他米松、曲安奈德(triamcinolonacetonide)或其組合。
在甚至更佳實施例中，該GC為地塞米松。
地塞米松具有最常用類固醇之最高醣皮質素功效且亦具有最長半衰期(參見下表)。但熟習此項技術者可選擇一種其他已知醣皮質素，其中之一些揭示於本文中，且選擇適宜有效劑量以改善或預防可因治療有需要之患者引起之免疫不良事件。
地塞米松亦在惡性中樞神經系統(CNS)疾病(例如CNS淋巴瘤或腦轉移)中具有有益效應，此可能歸因於特異性滲透至CNS。其亦優先(優於其他類固醇)用於治療腦水腫。儘管皮質類固醇降低腫瘤自身中之毛細 血管滲透性，但已在動物模型中發現，地塞米松可起不同作用且藉由對自腫瘤大量流走之效應來減少水腫(Molnar、Lapin及Goothuis,1995,Neurooncol.1995；25(1)：19-28)。
對於結合CD33/CD3雙特異性抗體建構體施用之臨床試驗，本發明者必須研發出有效且大多數患者將充分耐受之治療方案。為此，本發明者施加CD33/CD3雙特異性抗體建構體之逐步施用，如本文所概述。藉此，可減少不良效應之數量，改善且甚至防止不良效應。臨床醫師可基於患者中之效能、可耐受性及安全性以及最少不良效應來選擇適當劑量。
並不限制欲根據本發明實施例使用之GC劑量，即其將端視個體患者之情況而定。GC可靜脈內或經口投與。然而，較佳GC劑量包括1至6mg(地塞米松等效物)，在投藥即將結束時達40mg(地塞米松等效物)。該劑量可一次性投與或細分成較小劑量。較佳者為細分劑量，其中給予一個劑量之GC，然後根據如本文所述之分步投藥輸注第一及/或第二劑量，並給予另一劑量之GC，然後根據如本文所述之分步投藥投與第二或第三劑量。因此，每個治療週期較佳投用兩次GC。甚至更佳地，在開始治療週期或開始投與該治療週期內之下一較高劑量之前24h或8h或4h或1h投與一次GC。就此而言，1h為最佳。劑量為各自1至40mg，較佳各自5至20mg，最佳8mg。「d」表示一天。其他投藥方案源自隨附實例。此段落中所給出之所有劑量指地塞米松等效物。
如本文所用術語「有效及無毒劑量」指雙特異性建構體之足夠高至引起病理性細胞清除、腫瘤消除、腫瘤皺縮或疾病穩定且無或基本上無主要毒性效應之可耐受劑量。該等有效及無毒劑量可例如藉由業內所述之劑量擴大研究來確定且應低於引起嚴重不良副事件(劑量限制性毒性，DLT)之劑量。
如本文所用術語「毒性」指不良事件或嚴重不良事件中所表現之藥物毒性效應。該等副事件可指缺乏藥物可耐受性(通常)及/或在投與後缺乏局部耐受性。毒性亦可包括由藥物引起之致畸或致癌效應。
如本文所用術語「安全性」、「活體內安全性」或「可耐受性」定義投與藥物但在投與後(局部耐受性)及在藥物之較長施用時段期間不直 接引起嚴重不良事件。「安全性」、「活體內安全性」或「可耐受性」可在治療及隨訪時段期間以例如規律間隔評估。量度包括臨床評估，例如器官表現及實驗室異常之篩選。可根據NCI-CTC及/或MedDRA標準實施臨床評估且記錄/編碼與正常發現之偏差。器官表現可包括諸如以下等準則：過敏/免疫、血液/骨髓、心律不整、凝血及諸如此類，如例如Common Terminology Criteria for adverse events v3.0(CTCAE)中所述。可測試之實驗室參數包括例如血液學、臨床化學、凝血特徵及尿分析及其他體液(例如血清、血漿、淋巴或脊髓液、酒精及諸如此類)檢查。因此，可例如藉由體檢、成像技術(即超音波、x射線、CT掃描、磁共振成像(MRI)、使用技術裝置(即心電圖)之其他量測、生命體征、藉由量測實驗室參數並記錄不良事件來評價安全性。舉例而言，可藉由組織病理性及/或組織化學方法來檢查在本發明之用途及方法中非黑猩猩靈長類動物中之不良事件。
以上術語亦參見例如Preclinical safety evaluation of biotechnology-derived pharmaceuticals S6；ICH Harmonised Tripartite Guideline；ICH Steering Committee meeting，1997年7月16日。
本發明亦提供治療骨髓樣白血病之方法，其包含向有需要之個體投與治療有效量之雙特異性建構體，該雙特異性建構體包含特異性結合至CD33之第一結合域及特異性結合至CD3之第二結合域，該方法包含向該個體投與建構體達最長14天之時段之步驟及其後在至少14天之時段內不投與建構體之步驟。
對於本發明方法較佳地，根據包含以下步驟之時間表投與雙特異性建構體：(a)投與第一劑量之雙特異性建構體，然後(b)投與第二劑量之雙特異性建構體，其中該第二劑量超過該第一劑量，視情況然後(c)投與第三劑量之雙特異性建構體，其中該視情況選用之第三劑量超過該第二劑量。
在本發明方法之較佳實施例中，第一劑量之投與時段長達7天。
亦在本發明方法之較佳實施例中，繼第一劑量之後的投藥步驟之整個投與時段在8至13天範圍內。
與本發明方法之一個實施例一致，繼第一劑量之後的投藥步驟之整個投與時段在8至13天範圍內。
對於本發明方法之較佳實施例，設想第二劑量之投與時段為4至7天且第三劑量之投與時段為4至7天。
本發明之方法可較佳包含兩個或更多個治療週期，該等治療週期各自包含最長14天之雙特異性建構體投與時段及其後至少14天不投與雙特異性建構體之時段。
在本發明方法之較佳實施例中，僅第一治療週期包含依照步驟(a)之投與，而後續週期開始於依照步驟(b)之劑量。
對於本發明方法較佳地，雙特異性建構體之第一結合域包含選自由以下組成之群的由每組6個CDR構成之多個組：SEQ ID NO：10至12及14至16、22至24及26至28、34至36及38至40、46至48及50至52、58至60及62至64、70至72及74至76、82至84及86至88、94至96及98至100。
亦與本發明方法之較佳實施例一致，雙特異性建構體之第二結合域包含選自由以下組成之群的由每組6個CDR構成之多個組：WO 2008/119567之SEQ ID NO：9至14、27至32、45至50、63至68、81至86、99至104、117至122、135至140、153至158及171至176。
在本發明方法之較佳實施例中，雙特異性建構體為雙特異性抗體建構體。
此外，對於本發明方法較佳地，雙特異性抗體建構體為包含選自由以下組成之群的胺基酸序列之單鏈建構體：SEQ ID NO：18、19、20、30、31、32、42、43、44、54、55、56、66、67、68、78、79、80、90、91、92、102、103、104、105、106、107及108。
在本發明方法之一個實施例中，雙特異性建構體係與一或多種選自由以下組成之群的表觀遺傳因子組合投與：組蛋白去乙醯酶(HDAC)抑制劑、DNA甲基轉移酶(DNMT)I抑制劑、羥基脲、顆粒球群落刺激因子 (G-CSF)、組蛋白去甲基酶抑制劑及ATRA(所有反式視黃酸)，且其中：(a)一或多種表觀遺傳因子係在投與雙特異性建構體之前投與；(b)一或多種表觀遺傳因子係在投與雙特異性建構體之後投與；或(c)一或多種表觀遺傳因子及雙特異性建構體係同時投與。
對於本發明之方法較佳地，一或多種表觀遺傳因子係在投與雙特異性建構體之前至多7天投與。
對於本發明方法之一個實施例，較佳地，表觀遺傳因子為羥基脲
如上文所述，與本發明一致，骨髓樣白血病選自由以下組成之群：急性骨髓母細胞性白血病、慢性嗜中性白血病、骨髓樣樹突狀細胞白血病、加速期慢性骨髓性白血病、急性骨髓單核球白血病、青少年骨髓單核球白血病、慢性骨髓單核球白血病、急性嗜鹼性白血病、急性嗜伊紅球性白血病、慢性嗜伊紅球性白血病、急性巨核母細胞性白血病、原發性血小板增多症、急性類紅血球性白血病、真性紅血球增多症、骨髓增生不良症候群、急性泛骨髓樣白血病、骨髓樣肉瘤及急性雙表型白血病。較佳地，骨髓樣白血病為急性骨髓樣白血病(AML)。
亦在一個實施例中，本發明提供包含特異性結合至CD33之第一結合域及特異性結合至CD3之第二結合域之雙特異性建構體之用途，其用於製備用來治療骨髓樣白血病之醫藥組合物，其中欲投與達建構體最長14天之時段，其後為至少14天不投與建構體之時段。
對於本發明之用途較佳地，欲根據包含以下步驟之時間表投與雙特異性建構體：(a)投與第一劑量之雙特異性建構體，然後(b)投與第二劑量之雙特異性建構體，其中該第二劑量超過該第一劑量，視情況然後(c)投與第三劑量之雙特異性建構體，其中該視情況選用之第三劑量超過該第二劑量。
在本發明用途之較佳實施例中，第一劑量之投與時段長達7天。
亦在本發明用途之較佳實施例中，繼第一劑量之後的投藥步驟之整個投與時段在8至13天範圍內。
與本發明用途之一個實施例一致，繼第一劑量之後的投藥步驟之整個投與時段在8至13天範圍內。
對於本發明方法之較佳實施例，設想第二劑量之投與時段為4至7天且第三劑量之投與時段為4至7天。
在本發明之一個較佳實施例中，骨髓樣白血病之治療包含兩個或更多個治療週期，該等治療週期各自包含最長14天之雙特異性建構體投與時段及其後至少14天不投與雙特異性建構體之時段。
在本發明用途之較佳實施例中，僅第一治療週期包含依照步驟(a)之投與，而後續週期開始於依照步驟(b)之劑量。
對於本發明之用途較佳地，雙特異性建構體之第一結合域包含選自由以下組成之群的由每組6個CDR構成之多個組：SEQ ID NO：10至12及14至16、22至24及26至28、34至36及38至40、46至48及50至52、58至60及62至64、70至72及74至76、82至84及86至88、94至96及98至100。
亦與本發明用途之較佳實施例一致，雙特異性建構體之第二結合域包含選自由以下組成之群的由每組6個CDR構成之多個組：WO 2008/119567之SEQ ID NO：9至14、27至32、45至50、63至68、81至86、99至104、117至122、135至140、153至158及171至176。
在本發明用途之較佳實施例中，雙特異性建構體為雙特異性抗體建構體。
此外，對於本發明之用途較佳地，雙特異性抗體建構體為包含選自由以下組成之群的胺基酸序列之單鏈建構體：SEQ ID NO：18、19、20、30、31、32、42、43、44、54、55、56、66、67、68、78、79、80、90、91、92、102、103、104、105、106、107及108。
在本發明用途之一個實施例中，雙特異性建構體係與一或多種選自由以下組成之群的表觀遺傳因子組合投與：組蛋白去乙醯酶(HDAC)抑制劑、DNA甲基轉移酶(DNMT)I抑制劑、羥基脲、顆粒球群落刺激因子 (G-CSF)、組蛋白去甲基酶抑制劑及ATRA(所有反式視黃酸)，且其中：(a)一或多種表觀遺傳因子係在投與雙特異性建構體之前投與；(b)一或多種表觀遺傳因子係在投與雙特異性建構體之後投與；或(c)一或多種表觀遺傳因子及雙特異性建構體係同時投與。
對於本發明之用途較佳地，一或多種表觀遺傳因子係在投與雙特異性建構體之前至多7天投與。
對於本發明用途之一個實施例較佳地，表觀遺傳因子為羥基脲
如上文所述，與本發明一致，骨髓樣白血病選自由以下組成之群：急性骨髓母細胞性白血病、慢性嗜中性白血病、骨髓樣樹突狀細胞白血病、加速期慢性骨髓性白血病、急性骨髓單核球白血病、青少年骨髓單核球白血病、慢性骨髓單核球白血病、急性嗜鹼性白血病、急性嗜伊紅球性白血病、慢性嗜伊紅球性白血病、急性巨核母細胞性白血病、原發性血小板增多症、急性類紅血球性白血病、真性紅血球增多症、骨髓增生不良症候群、急性泛骨髓樣白血病、骨髓樣肉瘤及急性雙表型白血病。較佳地，骨髓樣白血病為急性骨髓樣白血病(AML)。
圖1：
該圖顯示造血細胞類型及其起源(先驅細胞類型)。
來源：百科(Wikipedia)
圖2：
將人類CD33+ EOL-1細胞或CD33-陰性Kato III細胞與人類末梢血單核細胞(PBMC)(效應物對靶(E：T)細胞比率為5：1)及AMG 330共培養48h。藉由流式細胞術確定PI攝取來監測細胞溶解(A)。藉由確定CD69表面表現來分析T細胞活化(B)。每一數據點表示一式三份量測之平均值。誤差杠表示平均值之標準誤差。
圖3：
將HEK293-huCD33、HEK293-cyCD33或HEK293細胞與食蟹猴PBMC(E：T細胞比率為5：1)及遞增濃度之AMG 330共培養48h。藉由流式細胞術 確定PI攝取來監測靶細胞溶解(A)。藉由流式細胞術使用抗原特異性螢光染料偶聯之單株抗體來檢測T細胞上CD69之表面表現(B)。每一數據點表示一式兩份(A)或一式三份孔(B)之平均值。誤差杠表示平均值之標準誤差。
應理解，本文之本發明並不限於特定方法、方案或試劑，因此可有所變化。本文所提供之論述及實例僅出於闡述具體實施例來呈現且不欲限制本發明之範疇，本發明之範疇僅由申請專利範圍來界定。
整個本說明書正文中所引用之所有出版物及專利(包括所有專利、專利申請案、科學出版物、製造商之說明書、說明等)，無論在上文抑或下文，其全文皆以引用方式併入本文中。本文中之內容皆不應視為承認本發明沒有資格早於根據先前發明之該揭示內容。就以引用方式併入之材料與含於本說明書相矛盾或不一致而言，本說明書將代替任何該材料。
實例：
提供以下實例用於說明本發明之特定實施例或特徵之目的。該等實例不應理解為限制本發明之範疇。出於說明之目的納入實例，且本發明僅受申請專利範圍之限制。
實例1：
AMG 330介導之重定向溶解及T細胞活化
AMG 330之活性需要同時結合至靶細胞及T細胞二者。AMG 330之藥理學效應由先前所引發細胞毒性CD8+或CD4+ T淋巴球之特異性重定向來調介以殺死CD33+細胞(Laszlo等人，2014 Blood,123(4)：554-561；Krupka等人，2014 Blood,123(3)：356-365；Friedrich等人，2014 Mol Cancer Ther,13(6)：1549-1557；Aigner等人，2013 Leukemia,27(5)：1107-1115)。AMG 330為強效分子，其顯示在24至200pg/mL(0.4至3.7 pM)範圍內之活體外人類效應細胞對AML細胞系之半最大溶解(Friedrich等人，2014)。
活體外及離體實驗展示，AMG 330亦可募集並活化食蟹猴T細胞；CD33+腫瘤細胞系之重定向溶解之EC50值稍高於人類(79至254pg/mL[1.5至4.7 pM])。對人類觀察到與食蟹猴效應細胞相比最大3倍較高 功效。結合及生物活性數據驗證食蟹猴為毒性評價之相關物種。
AMG 330誘導人類以及食蟹猴T細胞之活化且以劑量依賴性方式調介CD33+細胞之重定向溶解。
使用CD33+人類EOL-1細胞或CD33-陰性人類Kato III細胞來驗證AMG 330活性之特異性。AMG 330選擇性調介人類T細胞對EOL-1細胞之重定向溶解，同時Kato III之活力保持不變，甚至在暴露於高AMG 330濃度時(圖2A)。另外，AMG 330僅在CD33+細胞存在下增加T細胞上活化標記物CD69之表面表現，同時在CD33-陰性Kato III細胞之共培養物中觀察到CD69+ T細胞未顯著增加(圖2B)。
AMG 330選擇性調介食蟹猴效應細胞對穩定表現人類(huCD33)或食蟹猴CD33(cyCD33)之HEK293細胞之重定向溶解，同時不影響靶陰性細胞之活力(圖3A)。AMG 330對食蟹猴T細胞之活化(CD69)具有高度特異性且在表現CD33之細胞中未觀察到(圖3B)。
使用一組表現人類CD33之CD33+人類AML腫瘤細胞系來研究AMG 330活性。在遞增AMG 330濃度存在下將健康人類供體之PBMC或經分離CD3+ T細胞與表現CD33之靶細胞共培育且藉由流式細胞術分析來測定特異性細胞溶解。AMG 330介導之活體外人類效應細胞對AML細胞系之半最大溶解(EC50)在24至200pg/mL(0.4至3.7 pM)範圍內(表1)。
細胞系之間之差異最可能歸因於CD33細胞表面表現量之變化。對AMG 330細胞毒性觀察到靶表現與EC50值之間之定量關聯，且增加CD33表現之量產生較低EC50值(Laszlo等人，2014，上述引文)。
實例2：
AMG 330之藥物動力學
在向BALB/c小鼠單一IV濃注注射300μg/kg或900μg/kg、單一SC濃注注射900μg/kg及單一IP濃注注射900μg/kg後表徵AMG 330之PK。在IV、SC及IP投與單一劑量後AMG 330之非隔室PK參數顯示於表2中。AMG 330血清濃度可定量直至IV投與後24小時。兩個劑量組之半衰期、清除率及分佈體積相似，此指示AMG 330之線性藥物動力學。自時間0至無窮大(AUCinf)之濃度-時間曲線下面積且Cmax以劑量線性方式自300μg/kg增加至900μg/kg。SC投與後，在劑量後2小時達到210.3ng/mL之Cmax且AMG 330在血清中可定量直至36小時。與900μg/kg IV濃注PK之AUCinf相比，絕對SC生物利用度為22%。在IP投與後2小時達成2201ng/mL之Cmax且AMG 330可定量直至36小時。基於與900μg/kg IV濃注後之AUCinf之比較，絕對IP生物利用度為99%。所有投與途徑之表觀消除半衰期相似且在6.5-8.7小時之間(表2)。
tmax=最大濃度之時間；Cmax=最大濃度；t1/2=末端半衰期；AUCinf=自時間0至無窮大之濃度-時間曲線下面積；Vd=分佈體積；Cl=清除率；F=生物利用度；na=不適用
實例3：
人類中之經預測AMG 330濃度
基於使用其他BiTE®分子研發之先前經驗預測AMG 330之人類PK。基於臨床濃度-時間數據之非隔室分析，蘭妥莫單抗、AMG 211及AMG 110之臨床PK相似(表3)，且半衰期在2.1-4.4小時範圍內。預期AMG 330之PK與彼等數據一致，此乃因該等化合物之結構及分子量相似且其具有相似的作用機制；所有該等BiTE®分子具有一個靶向CD3+ T細胞之臂，且對於蘭妥莫單抗、AMG 211及AMG 110，另一臂分別靶向CD19、CEA或EpCAM。由於意欲經由cIV輸注投與AMG 330來治療患有急性骨髓樣白血病(AML)(液體腫瘤適應症之患者)，且經由cIV輸注投與蘭妥莫單抗來治療ALL(亦為液體腫瘤適應症)，故AMG 330之人類PK參數衍生自蘭妥莫單抗。假設AMG 330之CL及Vd分別為2920mL/hr及4500mL，且PK參數估計值獲自接受蘭妥莫單抗之cIV輸注的患有非霍奇金氏淋巴瘤(non-Hodgkin's lymphoma，NHL)、MRD+ ALL及復發性/難治性(R/R)ALL之患者的4項研究之PK數據之非隔室分析。儘管蘭妥莫單抗及AMG 330靶向不同的細胞受體(B細胞上之CD19對造血細胞上之CD33)，但使用其他BiTE®分子之先前臨床經驗並未表明在所測試投藥範圍內之任何靶介導之藥物處置(TMDD)。因此，AMG 330之假設線性PK與其他臨床上測試之BiTE®分子之所觀察到之線性PK一致。
基於該等PK參數，預測AMG 330之半衰期為1小時；在cIV投與後食蟹猴中之半衰期同樣較短且在1.6-2.7小時範圍內，但SC投與後之半衰期較長且在4-7小時範圍內。另外，蘭妥莫單抗PK參數亦用於預測AMG 110之PK，其正處於治療轉移性實體腫瘤之臨床研究中。預測AMG 110之半衰期在所觀察到半衰期之大約2倍內。AMG 110之清除率比基於 蘭妥莫單抗PK所預期低約4倍，但仍在跨越4項衍生出PK參數之臨床研究對蘭妥莫單抗所觀察到之清除率範圍內；平均清除率值在1.81-3.36L/hr範圍內，且可在32%-103%範圍內變化(如藉由變化係數所量測)。
在以所提出FIH劑量進行AMG 330之cIV輸注後經預測人類暴露(如藉由Css所量測)及暴露界限呈現於表4中。暴露界限基於在10μg/kg/天cIV之HNSTD下雄性及雌性食蟹猴中8.36ng/mL之平均Css且調整人類與猴效應細胞之間之功效差異；AMG 330在人類效應細胞中比猴效應細胞中強效3倍。
a在HNSTD下雄性及雌性猴中之平均Css除以經預測人類Css
b在10μg/kg/天下平均Css為8.36ng/mL。
c針對人類對猴效應細胞中之3倍較大功效進行校正
<110> 德商安美基研究(慕尼黑)公司
<120> 投與結合至CD33及CD3之雙特異性建構體來用於治療骨髓樣白血病之方法中
<130> AMG15250PCT
<160> 207
<170> PatentIn 3.5版
<210> 1
<211> 105
<212> PRT
<213> 智人
<400> 1
<210> 2
<211> 27
<212> PRT
<213> 智人
<400> 2
<210> 3
<211> 96
<212> PRT
<213> 白鬢狨
<400> 3
<210> 4
<211> 27
<212> PRT
<213> 白鬢狨
<400> 4
<210> 5
<211> 96
<212> PRT
<213> 棉冠獠絨
<400> 5
<210> 6
<211> 27
<212> PRT
<213> 棉冠獠絨
<400> 6
<210> 7
<211> 96
<212> PRT
<213> 松鼠猴
<400> 7
<210> 8
<211> 27
<212> PRT
<213> 松鼠猴
<400> 8
<210> 9
<211> 122
<212> PRT
<213> 人工
<220>
<223> 合成肽
<400> 9
<210> 10
<211> 5
<212> PRT
<213> 人工
<220>
<223> 合成肽
<400> 10
<210> 11
<211> 17
<212> PRT
<213> 人工
<220>
<223> 合成肽
<400> 11
<210> 12
<211> 13
<212> PRT
<213> 人工
<220>
<223> 合成肽
<400> 12
<210> 13
<211> 113
<212> PRT
<213> 人工
<220>
<223> 合成肽
<400> 13
<210> 14
<211> 17
<212> PRT
<213> 人工
<220>
<223> 合成肽
<400> 14
<210> 15
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工
<220>
<223> 合成肽
<400> 15
<210> 16
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工
<220>
<223> 合成肽
<400> 16
<210> 17
<211> 250
<212> PRT
<213> 人工
<220>
<223> 合成肽
<400> 17
<210> 18
<211> 505
<212> PRT
<213> 人工
<220>
<223> 合成肽
<400> 18
<210> 19
<211> 505
<212> PRT
<213> 人工
<220>
<223> 合成肽
<400> 19
<210> 20
<211> 505
<212> PRT
<213> 人工
<220>
<223> 合成肽
<400> 20
<210> 21
<211> 122
<212> PRT
<213> 人工
<220>
<223> 合成肽
<400> 21
<210> 22
<211> 5
<212> PRT
<213> 人工
<220>
<223> 合成肽
<400> 22
<210> 23
<211> 17
<212> PRT
<213> 人工
<220>
<223> 合成肽
<400> 23
<210> 24
<211> 13
<212> PRT
<213> 人工
<220>
<223> 合成肽
<400> 24
<210> 25
<211> 113
<212> PRT
<213> 人工
<220>
<223> 合成肽
<400> 25
<210> 26
<211> 17
<212> PRT
<213> 人工
<220>
<223> 合成肽
<400> 26
<210> 27
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工
<220>
<223> 合成肽
<400> 27
<210> 28
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工
<220>
<223> 合成肽
<400> 28
<210> 29
<211> 250
<212> PRT
<213> 人工
<220>
<223> 合成肽
<400> 29
<210> 30
<211> 505
<212> PRT
<213> 人工
<220>
<223> 合成肽
<400> 30
<210> 31
<211> 505
<212> PRT
<213> 人工
<220>
<223> 合成肽
<400> 31
<210> 32
<211> 505
<212> PRT
<213> 人工
<220>
<223> 合成肽
<400> 32
<210> 33
<211> 122
<212> PRT
<213> 人工
<220>
<223> 合成肽
<400> 33
<210> 34
<211> 5
<212> PRT
<213> 人工
<220>
<223> 合成肽
<400> 34
<210> 35
<211> 17
<212> PRT
<213> 人工
<220>
<223> 合成肽
<400> 35
<210> 36
<211> 13
<212> PRT
<213> 人工
<220>
<223> 合成肽
<400> 36
<210> 37
<211> 113
<212> PRT
<213> 人工
<220>
<223> 合成肽
<400> 37
<210> 38
<211> 17
<212> PRT
<213> 人工
<220>
<223> 合成肽
<400> 38
<210> 39
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工
<220>
<223> 合成肽
<400> 39
<210> 40
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工
<220>
<223> 合成肽
<400> 40
<210> 41
<211> 250
<212> PRT
<213> 人工
<220>
<223> 合成肽
<400> 41
<210> 42
<211> 505
<212> PRT
<213> 人工
<220>
<223> 合成肽
<400> 42
<210> 43
<211> 505
<212> PRT
<213> 人工
<220>
<223> 合成肽
<400> 43
<210> 44
<211> 505
<212> PRT
<213> 人工
<220>
<223> 合成肽
<400> 44
<210> 45
<211> 122
<212> PRT
<213> 人工
<220>
<223> 合成肽
<400> 45
<210> 46
<211> 5
<212> PRT
<213> 人工
<220>
<223> 合成肽
<400> 46
<210> 47
<211> 17
<212> PRT
<213> 人工
<220>
<223> 合成肽
<400> 47
<210> 48
<211> 13
<212> PRT
<213> 人工
<220>
<223> 合成肽
<400> 48
<210> 49
<211> 113
<212> PRT
<213> 人工
<220>
<223> 合成肽
<400> 49
<210> 50
<211> 17
<212> PRT
<213> 人工
<220>
<223> 合成肽
<400> 50
<210> 51
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工
<220>
<223> 合成肽
<400> 51
<210> 52
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工
<220>
<223> 合成肽
<400> 52
<210> 53
<211> 250
<212> PRT
<213> 人工
<220>
<223> 合成肽
<400> 53
<210> 54
<211> 505
<212> PRT
<213> 人工
<220>
<223> 合成肽
<400> 54
<210> 55
<211> 505
<212> PRT
<213> 人工
<220>
<223> 合成肽
<400> 55
<210> 56
<211> 505
<212> PRT
<213> 人工
<220>
<223> 合成肽
<400> 56
<210> 57
<211> 122
<212> PRT
<213> 人工
<220>
<223> 合成肽
<400> 57
<210> 58
<211> 5
<212> PRT
<213> 人工
<220>
<223> 合成肽
<400> 58
<210> 59
<211> 17
<212> PRT
<213> 人工
<220>
<223> 合成肽
<400> 59
<210> 60
<211> 13
<212> PRT
<213> 人工
<220>
<223> 合成肽
<400> 60
<210> 61
<211> 113
<212> PRT
<213> 人工
<220>
<223> 合成肽
<400> 61
<210> 62
<211> 17
<212> PRT
<213> 人工
<220>
<223> 合成肽
<400> 62
<210> 63
<211> 6
<212> PRT
<213> 人工
<220>
<223> 合成肽
<400> 63
<210> 64
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工
<220>
<223> 合成肽
<400> 64
<210> 65
<211> 250
<212> PRT
<213> 人工
<220>
<223> 合成肽
<400> 65
<210> 66
<211> 505
<212> PRT
<213> 人工
<220>
<223> 合成肽
<400> 66
<210> 67
<211> 505
<212> PRT
<213> 人工
<220>
<223> 合成肽
<400> 67
<210> 68
<211> 505
<212> PRT
<213> 人工
<220>
<223> 合成肽
<400> 68
<210> 69
<211> 122
<212> PRT
<213> 人工
<220>
<223> 合成肽
<400> 69
<210> 70
<211> 5
<212> PRT
<213> 人工
<220>
<223> 合成肽
<400> 70
<210> 71
<211> 17
<212> PRT
<213> 人工
<220>
<223> 合成肽
<400> 71
<210> 72
<211> 13
<212> PRT
<213> 人工
<220>
<223> 合成肽
<400> 72
<210> 73
<211> 113
<212> PRT
<213> 人工
<220>
<223> 合成肽
<400> 73
<210> 74
<211> 17
<212> PRT
<213> 人工
<220>
<223> 合成肽
<400> 74
<210> 75
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工
<220>
<223> 合成肽
<400> 75
<210> 76
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工
<220>
<223> 合成肽
<400> 76
<210> 77
<211> 250
<212> PRT
<213> 人工
<220>
<223> 合成肽
<400> 77
<210> 78
<211> 505
<212> PRT
<213> 人工
<220>
<223> 合成肽
<400> 78
<210> 79
<211> 505
<212> PRT
<213> 人工
<220>
<223> 合成肽
<400> 79
<210> 80
<211> 505
<212> PRT
<213> 人工
<220>
<223> 合成肽
<400> 80
<210> 81
<211> 122
<212> PRT
<213> 人工
<220>
<223> 合成肽
<400> 81
<210> 82
<211> 5
<212> PRT
<213> 人工
<220>
<223> 合成肽
<400> 82
<210> 83
<211> 17
<212> PRT
<213> 人工
<220>
<223> 合成肽
<400> 83
<210> 84
<211> 13
<212> PRT
<213> 人工
<220>
<223> 合成肽
<400> 84
<210> 85
<211> 113
<212> PRT
<213> 人工
<220>
<223> 合成肽
<400> 85
<210> 86
<211> 17
<212> PRT
<213> 人工
<220>
<223> 合成肽
<400> 86
<210> 87
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工
<220>
<223> 合成肽
<400> 87
<210> 88
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工
<220>
<223> 合成肽
<400> 88
<210> 89
<211> 250
<212> PRT
<213> 人工
<220>
<223> 合成肽
<400> 89
<210> 90
<211> 505
<212> PRT
<213> 人工
<220>
<223> 合成肽
<400> 90
<210> 91
<211> 505
<212> PRT
<213> 人工
<220>
<223> 合成肽
<400> 91
<210> 92
<211> 505
<212> PRT
<213> 人工
<220>
<223> 合成肽
<400> 92
<210> 93
<211> 122
<212> PRT
<213> 人工
<220>
<223> 合成肽
<400> 93
<210> 94
<211> 5
<212> PRT
<213> 人工
<220>
<223> 合成肽
<400> 94
<210> 95
<211> 17
<212> PRT
<213> 人工
<220>
<223> 合成肽
<400> 95
<210> 96
<211> 13
<212> PRT
<213> 人工
<220>
<223> 合成肽
<400> 96
<210> 97
<211> 113
<212> PRT
<213> 人工
<220>
<223> 合成肽
<400> 97
<210> 98
<211> 17
<212> PRT
<213> 人工
<220>
<223> 合成肽
<400> 98
<210> 99
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工
<220>
<223> 合成肽
<400> 99
<210> 100
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工
<220>
<223> 合成肽
<400> 100
<210> 101
<211> 250
<212> PRT
<213> 人工
<220>
<223> 合成肽
<400> 101
<210> 102
<211> 505
<212> PRT
<213> 人工
<220>
<223> 合成肽
<400> 102
<210> 103
<211> 505
<212> PRT
<213> 人工
<220>
<223> 合成肽
<400> 103
<210> 104
<211> 505
<212> PRT
<213> 人工
<220>
<223> 合成肽
<400> 104
<210> 105
<211> 505
<212> PRT
<213> 人工
<220>
<223> 合成肽
<400> 105
<210> 106
<211> 505
<212> PRT
<213> 人工
<220>
<223> 合成肽
<400> 106
<210> 107
<211> 505
<212> PRT
<213> 人工
<220>
<223> 合成肽
<400> 107
<210> 108
<211> 511
<212> PRT
<213> 人工
<220>
<223> 合成肽
<400> 108
<210> 109
<211> 585
<212> PRT
<213> 智人
<400> 109
<210> 110
<211> 585
<212> PRT
<213> 人工
<220>
<223> 合成肽
<400> 110
<210> 111
<211> 585
<212> PRT
<213> 人工
<220>
<223> 合成肽
<400> 111
<210> 112
<211> 585
<212> PRT
<213> 人工
<220>
<223> 合成肽
<400> 112
<210> 113
<211> 585
<212> PRT
<213> 人工
<220>
<223> 合成肽
<400> 113
<210> 114
<211> 585
<212> PRT
<213> 人工
<220>
<223> 合成肽
<400> 114
<210> 115
<211> 585
<212> PRT
<213> 人工
<220>
<223> 合成肽
<400> 115
<210> 116
<211> 585
<212> PRT
<213> 人工
<220>
<223> 合成肽
<400> 116
<210> 117
<211> 585
<212> PRT
<213> 人工
<220>
<223> 合成肽
<400> 117
<210> 118
<211> 585
<212> PRT
<213> 人工
<220>
<223> 合成肽
<400> 118
<210> 119
<211> 585
<212> PRT
<213> 人工
<220>
<223> 合成肽
<400> 119
<210> 120
<211> 585
<212> PRT
<213> 人工
<220>
<223> 合成肽
<400> 120
<210> 121
<211> 585
<212> PRT
<213> 人工
<220>
<223> 合成肽
<400> 121
<210> 122
<211> 585
<212> PRT
<213> 人工
<220>
<223> 合成肽
<400> 122
<210> 123
<211> 585
<212> PRT
<213> 人工
<220>
<223> 合成肽
<400> 123
<210> 124
<211> 585
<212> PRT
<213> 人工
<220>
<223> 合成肽
<400> 124
<210> 125
<211> 585
<212> PRT
<213> 人工
<220>
<223> 合成肽
<400> 125
<210> 126
<211> 585
<212> PRT
<213> 人工
<220>
<223> 合成肽
<400> 126
<210> 127
<211> 585
<212> PRT
<213> 人工
<220>
<223> 合成肽
<400> 127
<210> 128
<211> 585
<212> PRT
<213> 人工
<220>
<223> 合成肽
<400> 128
<210> 129
<211> 585
<212> PRT
<213> 人工
<220>
<223> 合成肽
<400> 129
<210> 130
<211> 585
<212> PRT
<213> 人工
<220>
<223> 合成肽
<400> 130
<210> 131
<211> 585
<212> PRT
<213> 人工
<220>
<223> 合成肽
<400> 131
<210> 132
<211> 585
<212> PRT
<213> 人工
<220>
<223> 合成肽
<400> 132
<210> 133
<211> 585
<212> PRT
<213> 人工
<220>
<223> 合成肽
<400> 133
<210> 134
<211> 585
<212> PRT
<213> 人工
<220>
<223> 合成肽
<400> 134
<210> 135
<211> 585
<212> PRT
<213> 人工
<220>
<223> 合成肽
<400> 135
<210> 136
<211> 585
<212> PRT
<213> 人工
<220>
<223> 合成肽
<400> 136
<210> 137
<211> 585
<212> PRT
<213> 人工
<220>
<223> 合成肽
<400> 137
<210> 138
<211> 585
<212> PRT
<213> 人工
<220>
<223> 合成肽
<400> 138
<210> 139
<211> 4
<212> PRT
<213> 人工
<220>
<223> 肽連接體
<400> 139
<210> 140
<211> 5
<212> PRT
<213> 人工
<220>
<223> 肽連接體
<400> 140
<210> 141
<211> 5
<212> PRT
<213> 人工
<220>
<223> 肽連接體
<400> 141
<210> 142
<211> 6
<212> PRT
<213> 人工
<220>
<223> 肽連接體
<400> 142
<210> 143
<211> 6
<212> PRT
<213> 人工
<220>
<223> 肽連接體
<400> 143
<210> 144
<211> 6
<212> PRT
<213> 人工
<220>
<223> 肽連接體
<400> 144
<210> 145
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工
<220>
<223> 肽連接體
<400> 145
<210> 146
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工
<220>
<223> 肽連接體
<400> 146
<210> 147
<211> 15
<212> PRT
<213> 人工
<220>
<223> 肽連接體
<400> 147
<210> 148
<211> 14
<212> PRT
<213> 人工
<220>
<223> 合成肽
<400> 148
<210> 149
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工
<220>
<223> 合成肽
<400> 149
<210> 150
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工
<220>
<223> 合成肽
<400> 150
<210> 151
<211> 5
<212> PRT
<213> 人工
<220>
<223> 合成肽
<400> 151
<210> 152
<211> 19
<212> PRT
<213> 人工
<220>
<223> 合成肽
<400> 152
<210> 153
<211> 14
<212> PRT
<213> 人工
<220>
<223> 合成肽
<400> 153
<210> 154
<211> 14
<212> PRT
<213> 人工
<220>
<223> 合成肽
<400> 154
<210> 155
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工
<220>
<223> 合成肽
<400> 155
<210> 156
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工
<220>
<223> 合成肽
<400> 156
<210> 157
<211> 5
<212> PRT
<213> 人工
<220>
<223> 合成肽
<400> 157
<210> 158
<211> 19
<212> PRT
<213> 人工
<220>
<223> 合成肽
<400> 158
<210> 159
<211> 14
<212> PRT
<213> 人工
<220>
<223> 合成肽
<400> 159
<210> 160
<211> 14
<212> PRT
<213> 人工
<220>
<223> 合成肽
<400> 160
<210> 161
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工
<220>
<223> 合成肽
<400> 161
<210> 162
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工
<220>
<223> 合成肽
<400> 162
<210> 163
<211> 5
<212> PRT
<213> 人工
<220>
<223> 合成肽
<400> 163
<210> 164
<211> 19
<212> PRT
<213> 人工
<220>
<223> 合成肽
<400> 164
<210> 165
<211> 14
<212> PRT
<213> 人工
<220>
<223> 合成肽
<400> 165
<210> 166
<211> 14
<212> PRT
<213> 人工
<220>
<223> 合成肽
<400> 166
<210> 167
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工
<220>
<223> 合成肽
<400> 167
<210> 168
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工
<220>
<223> 合成肽
<400> 168
<210> 169
<211> 5
<212> PRT
<213> 人工
<220>
<223> 合成肽
<400> 169
<210> 170
<211> 19
<212> PRT
<213> 人工
<220>
<223> 合成肽
<400> 170
<210> 171
<211> 14
<212> PRT
<213> 人工
<220>
<223> 合成肽
<400> 171
<210> 172
<211> 14
<212> PRT
<213> 人工
<220>
<223> 合成肽
<400> 172
<210> 173
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工
<220>
<223> 合成肽
<400> 173
<210> 174
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工
<220>
<223> 合成肽
<400> 174
<210> 175
<211> 5
<212> PRT
<213> 人工
<220>
<223> 合成肽
<400> 175
<210> 176
<211> 19
<212> PRT
<213> 人工
<220>
<223> 合成肽
<400> 176
<210> 177
<211> 14
<212> PRT
<213> 人工
<220>
<223> 合成肽
<400> 177
<210> 178
<211> 14
<212> PRT
<213> 人工
<220>
<223> 合成肽
<400> 178
<210> 179
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工
<220>
<223> 合成肽
<400> 179
<210> 180
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工
<220>
<223> 合成肽
<400> 180
<210> 181
<211> 5
<212> PRT
<213> 人工
<220>
<223> 合成肽
<400> 181
<210> 182
<211> 19
<212> PRT
<213> 人工
<220>
<223> 合成肽
<400> 182
<210> 183
<211> 14
<212> PRT
<213> 人工
<220>
<223> 合成肽
<400> 183
<210> 184
<211> 14
<212> PRT
<213> 人工
<220>
<223> 合成肽
<400> 184
<210> 185
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工
<220>
<223> 合成肽
<400> 185
<210> 186
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工
<220>
<223> 合成肽
<400> 186
<210> 187
<211> 5
<212> PRT
<213> 人工
<220>
<223> 合成肽
<400> 187
<210> 188
<211> 19
<212> PRT
<213> 人工
<220>
<223> 合成肽
<400> 188
<210> 189
<211> 14
<212> PRT
<213> 人工
<220>
<223> 合成肽
<400> 189
<210> 190
<211> 14
<212> PRT
<213> 人工
<220>
<223> 合成肽
<400> 190
<210> 191
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工
<220>
<223> 合成肽
<400> 191
<210> 192
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工
<220>
<223> 合成肽
<400> 192
<210> 193
<211> 5
<212> PRT
<213> 人工
<220>
<223> 合成肽
<400> 193
<210> 194
<211> 19
<212> PRT
<213> 人工
<220>
<223> 合成肽
<400> 194
<210> 195
<211> 14
<212> PRT
<213> 人工
<220>
<223> 合成肽
<400> 195
<210> 196
<211> 14
<212> PRT
<213> 人工
<220>
<223> 合成肽
<400> 196
<210> 197
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工
<220>
<223> 合成肽
<400> 197
<210> 198
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工
<220>
<223> 合成肽
<400> 198
<210> 199
<211> 5
<212> PRT
<213> 人工
<220>
<223> 合成肽
<400> 199
<210> 200
<211> 19
<212> PRT
<213> 人工
<220>
<223> 合成肽
<400> 200
<210> 201
<211> 14
<212> PRT
<213> 人工
<220>
<223> 合成肽
<400> 201
<210> 202
<211> 14
<212> PRT
<213> 人工
<220>
<223> 合成肽
<400> 202
<210> 203
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工
<220>
<223> 合成肽
<400> 203
<210> 204
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工
<220>
<223> 合成肽
<400> 204
<210> 205
<211> 5
<212> PRT
<213> 人工
<220>
<223> 合成肽
<400> 205
<210> 206
<211> 19
<212> PRT
<213> 人工
<220>
<223> 合成肽
<400> 206
<210> 207
<211> 14
<212> PRT
<213> 人工
<220>
<223> 合成肽
<400> 207

Claims (45)

  1. 一種雙特異性建構體，其包含特異性結合至CD33之第一結合域及特異性結合至CD3之第二結合域，其用於治療骨髓樣白血病之方法中，其中投與該建構體達最長14天之時段，然後至少14天之時段則不投與該建構體。
  2. 如申請專利範圍第1項之用於該用途之雙特異性建構體，其中該建構體係根據包含以下步驟之時間表來投與：(a)投與第一劑量之該雙特異性建構體，然後(b)投與第二劑量之該雙特異性建構體，其中該第二劑量超過該第一劑量，視情況然後(c)投與第三劑量之該雙特異性建構體，其中該視情況選用之第三劑量超過該第二劑量。
  3. 如申請專利範圍第2項之用於該用途之雙特異性建構體，其中該第一劑量之投與時段長達7天。
  4. 如申請專利範圍第2項或第3項之用於該用途之雙特異性建構體，其中繼該第一劑量之後的該等投藥步驟之整個投與時段在8至13天範圍內。
  5. 如申請專利範圍第2項至第4項中任一項之用於該用途之雙特異性建構體，其中該第二劑量之投與時段為4至7天且該第三劑量之投與時段為4至7天。
  6. 如申請專利範圍第2項至第5項中任一項之用於該用途之雙特異性建構體，其中該骨髓樣白血病之該治療包含兩個或更多個治療週期，該等治療週期各自包含最長14天之建構體投與時段及其後至少14天不投與該建構體之時段。
  7. 如申請專利範圍第6項之用於該用途之雙特異性建構體，其中僅第一治療週期包含依照步驟(a)之投與，而後續週期開始於依照步驟(b)之劑量。
  8. 如申請專利範圍第1項至第7項中任一項之用於該用途之雙特異性建構體，其中該雙特異性建構體之該第一結合域包含選自由以下組成之群的由每組6個CDR構成之多個組：SEQ ID NO：10至12及14至16、22至24及26至28、34至36及38至40、46至48及50至52、58至60及62至64、70至72及74至76、82至84及86至88、94至96及98 至100。
  9. 如申請專利範圍第1項至第8項中任一項之用於該用途之雙特異性建構體，其中該雙特異性建構體之該第二結合域包含選自由以下組成之群的由每組6個CDR構成之多個組：SEQ ID NO：148-153、154-159、160-165、166-171、172-177、178-183、184-189、190-195、196-201及202-207。
  10. 如申請專利範圍第1項至第9項中任一項之用於該用途之雙特異性建構體，其中該雙特異性建構體為雙特異性抗體建構體。
  11. 如申請專利範圍第10項之用於該用途之雙特異性建構體，其中該雙特異性抗體建構體為包含選自由以下組成之群之胺基酸序列的單鏈建構體：SEQ ID NO：18、19、20、30、31、32、42、43、44、54、55、56、66、67、68、78、79、80、90、91、92、102、103、104、105、106、107及108。
  12. 如前述申請專利範圍中任一項之用於該用途之雙特異性建構體，其中該雙特異性建構體係與一或多種選自由以下組成之群之表觀遺傳因子組合投與：組蛋白去乙醯酶(HDAC)抑制劑、DNA甲基轉移酶(DNMT)I抑制劑、羥基脲、顆粒球群落刺激因子(G-CSF)、組蛋白去甲基酶抑制劑及ATRA(所有反式視黃酸)，且其中：(a)該一或多種表觀遺傳因子係在投與該雙特異性建構體之前投與；(b)該一或多種表觀遺傳因子係在投與該雙特異性建構體之後投與；或(c)該一或多種表觀遺傳因子及該雙特異性建構體係同時投與。
  13. 如申請專利範圍第12項之用於該用途之雙特異性建構體，其中該一或多種表觀遺傳因子係在投與該雙特異性建構體之前至多7天投與。
  14. 如申請專利範圍第13項之用於該用途之雙特異性建構體，其中該表觀遺傳因子為羥基脲。
  15. 如前述申請專利範圍中任一項之用於該用途之雙特異性建構體，其中該骨髓樣白血病選自由以下組成之群：急性骨髓母細胞性白血病、慢性嗜中性白血病、骨髓樣樹突狀細胞白血病、加速期慢性骨髓性白血病、急性骨髓單核球白血病、青少年骨髓單核球白血病、慢性骨髓單核球白血病、急性嗜鹼性白血病、急性嗜伊紅球性白血病、慢性嗜伊紅球性白血 病、急性巨核母細胞性白血病、原發性血小板增多症、急性類紅血球性白血病、真性紅血球增多症、骨髓增生不良症候群、急性泛骨髓樣白血病、骨髓樣肉瘤及急性雙表型白血病。
  16. 一種治療骨髓樣白血病之方法，其包含向有需要之個體投與治療有效量之雙特異性建構體，該雙特異性建構體包含特異性結合至CD33之第一結合域及特異性結合至CD3之第二結合域，該方法包含向該個體投與該建構體達最長14天之時段之步驟及其後在至少14天之時段內不投與該建構體之步驟。
  17. 如申請專利範圍第16項之方法，其中該雙特異性建構體係根據包含以下步驟之時間表來投與：(a)投與第一劑量之該雙特異性建構體，然後(b)投與第二劑量之該雙特異性建構體，其中該第二劑量超過該第一劑量，視情況然後(c)投與第三劑量之該雙特異性建構體，其中該視情況選用之第三劑量超過該第二劑量。
  18. 如申請專利範圍第17項之方法，其中該第一劑量之投與時段長達7天。
  19. 如申請專利範圍第17項或第18項之方法，其中繼該第一劑量之後的該等投藥步驟之整個投與時段在8至13天範圍內。
  20. 如申請專利範圍第17項至第19項中任一項之方法，其中該第二劑量之投與時段為4至7天且該第三劑量之投與時段為4至7天。
  21. 如申請專利範圍第17項至第20項中任一項之方法，其包含兩個或更多個治療週期，該等治療週期各自包含最長14天之雙特異性建構體投與時段及其後至少14天不投與該雙特異性建構體之時段。
  22. 如申請專利範圍第21項之方法，其中僅第一治療週期包含依照步驟(a)之投與，而後續週期開始於依照步驟(b)之劑量。
  23. 如申請專利範圍第16項至第22項中任一項之方法，其中該雙特異性建構體之該第一結合域包含選自由以下組成之群的由每組6個CDR構成之多個組：SEQ ID NO：10至12及14至16、22至24及26至28、34至36及38至40、46至48及50至52、58至60及62至64、70至72及74至76、82至84及86至88、94至96及98至100。
  24. 如申請專利範圍第16項至第23項中任一項之方法，其中該雙特異性建構體之該第二結合域包含選自由以下組成之群的由每組6個CDR構成之多個組：SEQ ID NO：148-153、154-159、160-165、166-171、172-177、178-183、184-189、190-195、196-201及202-207。
  25. 如申請專利範圍第16項至第24項中任一項之方法，其中該雙特異性建構體為雙特異性抗體建構體。
  26. 如申請專利範圍第25項之方法，其中該雙特異性抗體建構體為包含選自由以下組成之群之胺基酸序列的單鏈建構體：SEQ ID NO：18、19、20、30、31、32、42、43、44、54、55、56、66、67、68、78、79、80、90、91、92、102、103、104、105、106、107及108。
  27. 如申請專利範圍第16項至第26項中任一項之方法，其中該雙特異性建構體係與一或多種選自由以下組成之群之表觀遺傳因子組合投與：組蛋白去乙醯酶(HDAC)抑制劑、DNA甲基轉移酶(DNMT)I抑制劑、羥基脲、顆粒球群落刺激因子(G-CSF)、組蛋白去甲基酶抑制劑及ATRA(所有反式視黃酸)，且其中：(a)該一或多種表觀遺傳因子係在投與該雙特異性建構體之前投與；(b)該一或多種表觀遺傳因子係在投與該雙特異性建構體之後投與；或(c)該一或多種表觀遺傳因子及該雙特異性建構體係同時投與。
  28. 如申請專利範圍第27項之方法，其中該一或多種表觀遺傳因子係在投與該雙特異性建構體之前至多7天投與。
  29. 如申請專利範圍第28項之方法，其中該表觀遺傳因子為羥基脲。
  30. 如申請專利範圍第16項至第29項中任一項之方法，其中該骨髓樣白血病選自由以下組成之群：急性骨髓母細胞性白血病、慢性嗜中性白血病、骨髓樣樹突狀細胞白血病、加速期慢性骨髓性白血病、急性骨髓單核球白血病、青少年骨髓單核球白血病、慢性骨髓單核球白血病、急性嗜鹼性白血病、急性嗜伊紅球性白血病、慢性嗜伊紅球性白血病、急性巨核母細胞性白血病、原發性血小板增多症、急性類紅血球性白血病、真性紅血球增多症、骨髓增生不良症候群、急性泛骨髓樣白血病、骨髓樣肉瘤及急性雙表型白血病。
  31. 一種雙特異性建構體之用途，該雙特異性建構體包含特異性結合至 CD33之第一結合域及特異性結合至CD3之第二結合域，其用於製備用來治療骨髓樣白血病之醫藥組合物，其中欲投與該建構體達最長14天之時段，其後為至少14天不投與該建構體之時段。
  32. 如申請專利範圍第31項之用途，其中該雙特異性建構體欲根據包含以下步驟之時間表來投與：(a)投與第一劑量之該雙特異性建構體，然後(b)投與第二劑量之該雙特異性建構體，其中該第二劑量超過該第一劑量，視情況然後(c)投與第三劑量之該雙特異性建構體，其中該視情況選用之第三劑量超過該第二劑量。
  33. 如申請專利範圍第32項之用途，其中該第一劑量之投與時段長達7天。
  34. 如申請專利範圍第32項或第33項之用途，其中繼該第一劑量之後的該等投藥步驟之整個投與時段在8至13天範圍內。
  35. 如申請專利範圍第32項至第34項中任一項之用途，其中該第二劑量之投與時段為4至7天且該第三劑量之投與時段為4至7天。
  36. 如申請專利範圍第32項至第35項中任一項之用途，其中該骨髓樣白血病之該治療包含兩個或更多個治療週期，該等治療週期各自包含最長14天之雙特異性建構體投與時段及其後至少14天不投與該雙特異性建構體之時段。
  37. 如申請專利範圍第36項之用途，其中僅第一治療週期包含依照步驟(a)之投與，而後續週期開始於依照步驟(b)之劑量。
  38. 如申請專利範圍第31項至第37項中任一項之用途，其中該雙特異性建構體之該第一結合域包含選自由以下組成之群的由每組6個CDR構成之多個組：SEQ ID NO：10至12及14至16、22至24及26至28、34至36及38至40、46至48及50至52、58至60及62至64、70至72及74至76、82至84及86至88、94至96及98至100。
  39. 如申請專利範圍第31項至第38項中任一項之用途，其中該雙特異性建構體之該第二結合域包含選自由以下組成之群的由每組6個CDR構成之多個組：SEQ ID NO：148-153、154-159、160-165、166-171、172-177、178-183、184-189、190-195、196-201及202-207。
  40. 如申請專利範圍第31項至第39項中任一項之用途，其中該雙特異性建構體為雙特異性抗體建構體。
  41. 如申請專利範圍第40項之用途，其中該雙特異性抗體建構體為包含選自由以下組成之群之胺基酸序列的單鏈建構體：SEQ ID NO：18、19、20、30、31、32、42、43、44、54、55、56、66、67、68、78、79、80、90、91、92、102、103、104、105、106、107及108。
  42. 如申請專利範圍第31項至第41項中任一項之用途，其中該雙特異性建構體係與一或多種選自由以下組成之群之表觀遺傳因子組合投與：組蛋白去乙醯酶(HDAC)抑制劑、DNA甲基轉移酶(DNMT)I抑制劑、羥基脲、顆粒球群落刺激因子(G-CSF)、組蛋白去甲基酶抑制劑及ATRA(所有反式視黃酸)，且其中：(a)該一或多種表觀遺傳因子係在投與該雙特異性建構體之前投與；(b)該一或多種表觀遺傳因子係在投與該雙特異性建構體之後投與；或(c)該一或多種表觀遺傳因子及該雙特異性建構體係同時投與。
  43. 如申請專利範圍第42項之用途，其中該一或多種表觀遺傳因子係在投與該雙特異性建構體之前至多7天投與。
  44. 如申請專利範圍第43項之用途，其中該表觀遺傳因子為羥基脲。
  45. 如申請專利範圍第31項至第44項中任一項之用途，其中該骨髓樣白血病選自由以下組成之群：急性骨髓母細胞性白血病、慢性嗜中性白血病、骨髓樣樹突狀細胞白血病、加速期慢性骨髓性白血病、急性骨髓單核球白血病、青少年骨髓單核球白血病、慢性骨髓單核球白血病、急性嗜鹼性白血病、急性嗜伊紅球性白血病、慢性嗜伊紅球性白血病、急性巨核母細胞性白血病、原發性血小板增多症、急性類紅血球性白血病、真性紅血球增多症、骨髓增生不良症候群、急性泛骨髓樣白血病、骨髓樣肉瘤及急性雙表型白血病。
TW106113102A 2016-04-19 2017-04-19 投與結合至cd33及cd3之雙特異性建構體來用於治療骨髓樣白血病之方法中 TWI752952B (zh)

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US201662324451P 2016-04-19 2016-04-19
US62/324,451 2016-04-19

Publications (2)

Publication Number Publication Date
TW201741339A true TW201741339A (zh) 2017-12-01
TWI752952B TWI752952B (zh) 2022-01-21

Family

ID=58671575

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
TW106113102A TWI752952B (zh) 2016-04-19 2017-04-19 投與結合至cd33及cd3之雙特異性建構體來用於治療骨髓樣白血病之方法中

Country Status (18)

Country Link
US (1) US11053318B2 (zh)
EP (1) EP3445784B1 (zh)
JP (1) JP2019514871A (zh)
AU (1) AU2017253621A1 (zh)
BR (1) BR112018070946A2 (zh)
CA (1) CA3019740A1 (zh)
EA (1) EA038736B1 (zh)
IL (1) IL262423A (zh)
JO (1) JOP20170091B1 (zh)
MA (1) MA44726A (zh)
MX (1) MX2018012717A (zh)
MY (1) MY194062A (zh)
PH (1) PH12018502230A1 (zh)
SG (1) SG11201808656SA (zh)
TW (1) TWI752952B (zh)
UA (1) UA124732C2 (zh)
WO (1) WO2017182427A1 (zh)
ZA (1) ZA201806514B (zh)

Families Citing this family (8)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP2018516248A (ja) 2015-05-29 2018-06-21 アンフィヴェナ セラピューティクス，インク． 二重特異性のｃｄ３３およびｃｄ３結合タンパク質を使用する方法
EP3165536A1 (en) * 2015-11-09 2017-05-10 Ludwig-Maximilians-Universität München Trispecific molecule combining specific tumor targeting and local immune checkpoint inhibition
CN112771075A (zh) * 2018-07-30 2021-05-07 安进研发（慕尼黑）股份有限公司 结合至cd33和cd3的双特异性抗体构建体的延长施用
EP3863644A4 (en) * 2018-10-12 2022-10-05 Jeanmarie Guenot CD33×CD3-BINDING PROTEINS FOR THE TREATMENT OF INFLAMMATORY CONDITIONS AND DISEASES
JP2022521036A (ja) * 2018-12-20 2022-04-05 メルス ナムローゼ フェンノートシャップ ＣＬＥＣ１２ＡｘＣＤ３二重特異性抗体及び疾患の治療方法
JP2022538117A (ja) * 2019-06-26 2022-08-31 メモリアル スローン ケタリング キャンサー センター がんを処置するための抗ｃｄ３３抗体
EP4054590A1 (en) * 2019-11-04 2022-09-14 Amgen Inc. Methods for treating leukemia
EP4084821A4 (en) * 2020-01-03 2024-04-24 Marengo Therapeutics, Inc. CD33-BINDING MULTIFUNCTIONAL MOLECULES AND THEIR USES

Family Cites Families (121)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US3180193A (en) 1963-02-25 1965-04-27 Benedict David Machines for cutting lengths of strip material
US3691016A (en) 1970-04-17 1972-09-12 Monsanto Co Process for the preparation of insoluble enzymes
CA1023287A (en) 1972-12-08 1977-12-27 Boehringer Mannheim G.M.B.H. Process for the preparation of carrier-bound proteins
US4179337A (en) 1973-07-20 1979-12-18 Davis Frank F Non-immunogenic polypeptides
US4195128A (en) 1976-05-03 1980-03-25 Bayer Aktiengesellschaft Polymeric carrier bound ligands
US4330440A (en) 1977-02-08 1982-05-18 Development Finance Corporation Of New Zealand Activated matrix and method of activation
CA1093991A (en) 1977-02-17 1981-01-20 Hideo Hirohara Enzyme immobilization with pullulan gel
US4229537A (en) 1978-02-09 1980-10-21 New York University Preparation of trichloro-s-triazine activated supports for coupling ligands
JPS6023084B2 (ja) 1979-07-11 1985-06-05 味の素株式会社 代用血液
US4475196A (en) 1981-03-06 1984-10-02 Zor Clair G Instrument for locating faults in aircraft passenger reading light and attendant call control system
US4447233A (en) 1981-04-10 1984-05-08 Parker-Hannifin Corporation Medication infusion pump
US4640835A (en) 1981-10-30 1987-02-03 Nippon Chemiphar Company, Ltd. Plasminogen activator derivatives
US4439196A (en) 1982-03-18 1984-03-27 Merck & Co., Inc. Osmotic drug delivery system
US4447224A (en) 1982-09-20 1984-05-08 Infusaid Corporation Variable flow implantable infusion apparatus
US4487603A (en) 1982-11-26 1984-12-11 Cordis Corporation Implantable microinfusion pump system
GB8308235D0 (en) 1983-03-25 1983-05-05 Celltech Ltd Polypeptides
US4816567A (en) 1983-04-08 1989-03-28 Genentech, Inc. Recombinant immunoglobin preparations
US4486194A (en) 1983-06-08 1984-12-04 James Ferrara Therapeutic device for administering medicaments through the skin
US4496689A (en) 1983-12-27 1985-01-29 Miles Laboratories, Inc. Covalently attached complex of alpha-1-proteinase inhibitor with a water soluble polymer
JPS6147500A (ja) 1984-08-15 1986-03-07 Res Dev Corp Of Japan キメラモノクロ−ナル抗体及びその製造法
EP0173494A3 (en) 1984-08-27 1987-11-25 The Board Of Trustees Of The Leland Stanford Junior University Chimeric receptors by dna splicing and expression
GB8422238D0 (en) 1984-09-03 1984-10-10 Neuberger M S Chimeric proteins
US4596556A (en) 1985-03-25 1986-06-24 Bioject, Inc. Hypodermic injection apparatus
US4751180A (en) 1985-03-28 1988-06-14 Chiron Corporation Expression using fused genes providing for protein product
DE3675588D1 (de) 1985-06-19 1990-12-20 Ajinomoto Kk Haemoglobin, das an ein poly(alkenylenoxid) gebunden ist.
US4935233A (en) 1985-12-02 1990-06-19 G. D. Searle And Company Covalently linked polypeptide cell modulators
US5159017A (en) 1986-01-17 1992-10-27 Nippon Paint Co., Ltd. Crosslinked polymer microparticles and coating composition containing the same
JPS63502716A (ja) 1986-03-07 1988-10-13 マサチューセッツ・インステチュート・オブ・テクノロジー 糖タンパク安定性の強化方法
GB8607679D0 (en) 1986-03-27 1986-04-30 Winter G P Recombinant dna product
US5225539A (en) 1986-03-27 1993-07-06 Medical Research Council Recombinant altered antibodies and methods of making altered antibodies
US4791192A (en) 1986-06-26 1988-12-13 Takeda Chemical Industries, Ltd. Chemically modified protein with polyethyleneglycol
US4946778A (en) 1987-09-21 1990-08-07 Genex Corporation Single polypeptide chain binding molecules
EP0307434B2 (en) 1987-03-18 1998-07-29 Scotgen Biopharmaceuticals, Inc. Altered antibodies
DE3856559T2 (de) 1987-05-21 2004-04-29 Micromet Ag Multifunktionelle Proteine mit vorbestimmter Zielsetzung
US4790824A (en) 1987-06-19 1988-12-13 Bioject, Inc. Non-invasive hypodermic injection device
US4941880A (en) 1987-06-19 1990-07-17 Bioject, Inc. Pre-filled ampule and non-invasive hypodermic injection device assembly
US5476996A (en) 1988-06-14 1995-12-19 Lidak Pharmaceuticals Human immune system in non-human animal
US5223409A (en) 1988-09-02 1993-06-29 Protein Engineering Corp. Directed evolution of novel binding proteins
GB8823869D0 (en) 1988-10-12 1988-11-16 Medical Res Council Production of antibodies
US5175384A (en) 1988-12-05 1992-12-29 Genpharm International Transgenic mice depleted in mature t-cells and methods for making transgenic mice
US5530101A (en) 1988-12-28 1996-06-25 Protein Design Labs, Inc. Humanized immunoglobulins
US5683888A (en) 1989-07-22 1997-11-04 University Of Wales College Of Medicine Modified bioluminescent proteins and their use
US5064413A (en) 1989-11-09 1991-11-12 Bioject, Inc. Needleless hypodermic injection device
US5312335A (en) 1989-11-09 1994-05-17 Bioject Inc. Needleless hypodermic injection device
US5859205A (en) 1989-12-21 1999-01-12 Celltech Limited Humanised antibodies
US5292658A (en) 1989-12-29 1994-03-08 University Of Georgia Research Foundation, Inc. Boyd Graduate Studies Research Center Cloning and expressions of Renilla luciferase
US6075181A (en) 1990-01-12 2000-06-13 Abgenix, Inc. Human antibodies derived from immunized xenomice
US6150584A (en) 1990-01-12 2000-11-21 Abgenix, Inc. Human antibodies derived from immunized xenomice
US6673986B1 (en) 1990-01-12 2004-01-06 Abgenix, Inc. Generation of xenogeneic antibodies
AU633698B2 (en) 1990-01-12 1993-02-04 Amgen Fremont Inc. Generation of xenogeneic antibodies
FR2664073A1 (fr) 1990-06-29 1992-01-03 Thomson Csf Moyens de marquage d'objets, procede de realisation et dispositif de lecture.
US5789650A (en) 1990-08-29 1998-08-04 Genpharm International, Inc. Transgenic non-human animals for producing heterologous antibodies
US5545806A (en) 1990-08-29 1996-08-13 Genpharm International, Inc. Ransgenic non-human animals for producing heterologous antibodies
US6255458B1 (en) 1990-08-29 2001-07-03 Genpharm International High affinity human antibodies and human antibodies against digoxin
US5625126A (en) 1990-08-29 1997-04-29 Genpharm International, Inc. Transgenic non-human animals for producing heterologous antibodies
WO1992003918A1 (en) 1990-08-29 1992-03-19 Genpharm International, Inc. Transgenic non-human animals capable of producing heterologous antibodies
US6300129B1 (en) 1990-08-29 2001-10-09 Genpharm International Transgenic non-human animals for producing heterologous antibodies
US5770429A (en) 1990-08-29 1998-06-23 Genpharm International, Inc. Transgenic non-human animals capable of producing heterologous antibodies
US5877397A (en) 1990-08-29 1999-03-02 Genpharm International Inc. Transgenic non-human animals capable of producing heterologous antibodies of various isotypes
US5814318A (en) 1990-08-29 1998-09-29 Genpharm International Inc. Transgenic non-human animals for producing heterologous antibodies
US5661016A (en) 1990-08-29 1997-08-26 Genpharm International Inc. Transgenic non-human animals capable of producing heterologous antibodies of various isotypes
US5633425A (en) 1990-08-29 1997-05-27 Genpharm International, Inc. Transgenic non-human animals capable of producing heterologous antibodies
EP0546091B1 (en) 1990-08-29 2007-01-24 Pharming Intellectual Property BV Homologous recombination in mammalian cells
US5874299A (en) 1990-08-29 1999-02-23 Genpharm International, Inc. Transgenic non-human animals capable of producing heterologous antibodies
CA2105984C (en) 1991-03-11 2002-11-26 Milton J. Cormier Cloning and expression of renilla luciferase
WO1992022670A1 (en) 1991-06-12 1992-12-23 Genpharm International, Inc. Early detection of transgenic embryos
WO1992022645A1 (en) 1991-06-14 1992-12-23 Genpharm International, Inc. Transgenic immunodeficient non-human animals
EP1400536A1 (en) 1991-06-14 2004-03-24 Genentech Inc. Method for making humanized antibodies
WO1993004169A1 (en) 1991-08-20 1993-03-04 Genpharm International, Inc. Gene targeting in animal cells using isogenic dna constructs
US5565332A (en) 1991-09-23 1996-10-15 Medical Research Council Production of chimeric antibodies - a combinatorial approach
EP0746609A4 (en) 1991-12-17 1997-12-17 Genpharm Int NON-HUMAN TRANSGENIC ANIMALS CAPABLE OF PRODUCING HETEROLOGOUS ANTIBODIES
CA2135313A1 (en) 1992-06-18 1994-01-06 Theodore Choi Methods for producing transgenic non-human animals harboring a yeast artificial chromosome
US5383851A (en) 1992-07-24 1995-01-24 Bioject Inc. Needleless hypodermic injection device
NZ255101A (en) 1992-07-24 1997-08-22 Cell Genesys Inc A yeast artificial chromosome (yac) vector containing an hprt minigene expressible in murine stem cells and genetically modified rodent therefor
DK0672141T3 (da) 1992-10-23 2003-06-10 Immunex Corp Fremgangsmåder til fremstilling af opløselige, oligomere proteiner
US5981175A (en) 1993-01-07 1999-11-09 Genpharm Internation, Inc. Methods for producing recombinant mammalian cells harboring a yeast artificial chromosome
EP0754225A4 (en) 1993-04-26 2001-01-31 Genpharm Int HETEROLOGIC ANTIBODY-PRODUCING TRANSGENIC NON-HUMAN ANIMALS
WO1995007463A1 (en) 1993-09-10 1995-03-16 The Trustees Of Columbia University In The City Of New York Uses of green fluorescent protein
US5625825A (en) 1993-10-21 1997-04-29 Lsi Logic Corporation Random number generating apparatus for an interface unit of a carrier sense with multiple access and collision detect (CSMA/CD) ethernet data network
WO1995021191A1 (en) 1994-02-04 1995-08-10 William Ward Bioluminescent indicator based upon the expression of a gene for a modified green-fluorescent protein
JP3727063B2 (ja) 1994-05-24 2005-12-14 コーニンクレッカ フィリップス エレクトロニクス エヌ ヴィ レーザおよびフォトダイオードを具える光電子半導体装置
US5643763A (en) 1994-11-04 1997-07-01 Genpharm International, Inc. Method for making recombinant yeast artificial chromosomes by minimizing diploid doubling during mating
US5777079A (en) 1994-11-10 1998-07-07 The Regents Of The University Of California Modified green fluorescent proteins
EP1978033A3 (en) 1995-04-27 2008-12-24 Amgen Fremont Inc. Human antibodies derived from immunized xenomice
CA2219486A1 (en) 1995-04-28 1996-10-31 Abgenix, Inc. Human antibodies derived from immunized xenomice
US5811524A (en) 1995-06-07 1998-09-22 Idec Pharmaceuticals Corporation Neutralizing high affinity human monoclonal antibodies specific to RSV F-protein and methods for their manufacture and therapeutic use thereof
CA2229043C (en) 1995-08-18 2016-06-07 Morphosys Gesellschaft Fur Proteinoptimierung Mbh Protein/(poly)peptide libraries
CN101333516A (zh) 1995-08-29 2008-12-31 麒麟医药株式会社 嵌合体动物及其制备方法
US5874304A (en) 1996-01-18 1999-02-23 University Of Florida Research Foundation, Inc. Humanized green fluorescent protein genes and methods
US5804387A (en) 1996-02-01 1998-09-08 The Board Of Trustees Of The Leland Stanford Junior University FACS-optimized mutants of the green fluorescent protein (GFP)
US5876995A (en) 1996-02-06 1999-03-02 Bryan; Bruce Bioluminescent novelty items
US5925558A (en) 1996-07-16 1999-07-20 The Regents Of The University Of California Assays for protein kinases using fluorescent protein substrates
US5976796A (en) 1996-10-04 1999-11-02 Loma Linda University Construction and expression of renilla luciferase and green fluorescent protein fusion genes
CA2616914C (en) 1996-12-03 2012-05-29 Abgenix, Inc. Egfr-binding antibody
AU741076B2 (en) 1996-12-12 2001-11-22 Prolume, Ltd. Apparatus and method for detecting and identifying infectious agents
ES2258817T3 (es) 1997-05-21 2006-09-01 Biovation Limited Metodo para la produccion de proteinas no inmunogenas.
EP1064360B1 (en) 1998-03-27 2008-03-05 Prolume, Ltd. Luciferases, gfp fluorescent proteins, their nucleic acids and the use thereof in diagnostics
NZ507381A (en) 1998-04-21 2003-12-19 Micromet Ag CD19xCD3 specific polypeptides and uses thereof
DK1100830T3 (da) 1998-07-28 2004-01-19 Micromet Ag Heterominiantistoffer
EP1051432B1 (en) 1998-12-08 2007-01-24 Biovation Limited Method for reducing immunogenicity of proteins
US6833268B1 (en) 1999-06-10 2004-12-21 Abgenix, Inc. Transgenic animals for producing specific isotypes of human antibodies via non-cognate switch regions
US7435871B2 (en) 2001-11-30 2008-10-14 Amgen Fremont Inc. Transgenic animals bearing human Igλ light chain genes
US20050025823A1 (en) * 2003-07-29 2005-02-03 Fong Andy A.T. Methods of use of herbal compositions
BRPI0415457A (pt) 2003-10-16 2006-12-05 Micromet Ag constructo de ligação especìfico de cd3 citotoxicamente ativo, seu processo de produção, composição compreendendo o mesmo, seqüência de ácido nucléico, vetor, hospedeiro, seus usos na preparação de uma composição farmacêutica e kit compreendendo os mesmo
US8236308B2 (en) 2005-10-11 2012-08-07 Micromet Ag Composition comprising cross-species-specific antibodies and uses thereof
EP2084527A4 (en) * 2006-11-02 2011-07-27 Seattle Genetics Inc METHOD FOR TREATING NEOPLASIA, AUTOIMMUNE AND INFLAMMATORY DISEASES
CN101687915B8 (zh) 2007-04-03 2018-08-03 安进研发（慕尼黑）股份有限公司 跨物种特异性CD3-ε结合结构域
EP2352765B1 (en) 2008-10-01 2018-01-03 Amgen Research (Munich) GmbH Cross-species-specific single domain bispecific single chain antibody
RS54655B2 (sr) * 2009-10-27 2021-04-29 Amgen Res Munich Gmbh Dozni režim za primenu cd19xcd3 bispecifičnog antitela
WO2013026837A1 (en) 2011-08-23 2013-02-28 Roche Glycart Ag Bispecific t cell activating antigen binding molecules
JP6339015B2 (ja) 2011-08-23 2018-06-06 ロシュ グリクアート アーゲー 二重特異性ｔ細胞活性化抗原結合分子
BR112015010318A2 (pt) 2012-11-08 2017-08-22 Albumedix As Variantes de albumina
EP2970484B2 (en) 2013-03-15 2022-09-21 Amgen Inc. Heterodimeric bispecific antibodies
US20140302037A1 (en) 2013-03-15 2014-10-09 Amgen Inc. BISPECIFIC-Fc MOLECULES
US20140308285A1 (en) 2013-03-15 2014-10-16 Amgen Inc. Heterodimeric bispecific antibodies
JP6071725B2 (ja) 2013-04-23 2017-02-01 カルソニックカンセイ株式会社 電気自動車の駆動力制御装置
AR097648A1 (es) 2013-09-13 2016-04-06 Amgen Inc Combinación de factores epigenéticos y compuestos biespecíficos que tienen como diana cd33 y cd3 en el tratamiento de leucemia mieloide
WO2015048272A1 (en) 2013-09-25 2015-04-02 Amgen Inc. V-c-fc-v-c antibody
US9212225B1 (en) * 2014-07-01 2015-12-15 Amphivena Therapeutics, Inc. Bispecific CD33 and CD3 binding proteins
JP2018516248A (ja) * 2015-05-29 2018-06-21 アンフィヴェナ セラピューティクス，インク． 二重特異性のｃｄ３３およびｃｄ３結合タンパク質を使用する方法
US11284893B2 (en) 2019-04-02 2022-03-29 Covidien Lp Stapling device with articulating tool assembly

Also Published As

Publication number Publication date
AU2017253621A1 (en) 2018-10-18
JP2019514871A (ja) 2019-06-06
US20190127465A1 (en) 2019-05-02
SG11201808656SA (en) 2018-10-30
CA3019740A1 (en) 2017-10-26
EP3445784B1 (en) 2022-06-01
EA201892367A1 (ru) 2019-04-30
UA124732C2 (uk) 2021-11-10
WO2017182427A1 (en) 2017-10-26
PH12018502230A1 (en) 2019-07-08
US11053318B2 (en) 2021-07-06
MY194062A (en) 2022-11-10
BR112018070946A2 (pt) 2019-02-26
EA038736B1 (ru) 2021-10-12
IL262423A (en) 2018-12-31
MX2018012717A (es) 2019-05-15
ZA201806514B (en) 2019-06-26
MA44726A (fr) 2019-02-27
JOP20170091B1 (ar) 2021-08-17
TWI752952B (zh) 2022-01-21
EP3445784A1 (en) 2019-02-27

Similar Documents

Publication Publication Date Title
JP6974409B2 (ja) アンタゴニストの、抗イヌｐｄ−１抗体
JP7295916B2 (ja) Ｐｓｍａおよびｃｄ３に対する二重特異性を有するｔ細胞エンゲージ抗体コンストラクト
TWI744242B (zh) Egfrviii及cd3抗體構築體
TWI717375B (zh) Ｃｄ７０及ｃｄ３抗體構築體
EP3174901B1 (en) Optimized cross-species specific bispecific single chain antibody constructs
TWI752952B (zh) 投與結合至cd33及cd3之雙特異性建構體來用於治療骨髓樣白血病之方法中
US11472882B2 (en) Anti-B7-H4 antibody, antigen-binding fragment thereof and pharmaceutical use thereof
TW201708257A (zh) Ｆｌｔ３及ｃｄ３抗體構築體
US20200332000A1 (en) Low ph pharmaceutical composition comprising t cell engaging antibody constructs
TW201704264A (zh) Ｃｄｈ３與ｃｄ３之雙特異性抗體構築體
JP2021513848A (ja) Ｌａｇ３に結合する治療用分子
JP2022523710A (ja) Ｃｄ４４に特異的な抗体
JP2022514693A (ja) Ｍｕｃ１８に特異的な抗体
CN115812081A (zh) 抗ctla-4抗体及其用途
US20210301017A1 (en) Prolonged administration of a bispecific antibody construct binding to cd33 and cd3
JP2020532279A (ja) 抗ｇｉｔｒ抗体、その抗原結合性断片、およびその医薬用途
US20240209085A1 (en) Adverse effects-mitigating administration of a bispecific construct binding to cd33 and cd3
WO2023143535A1 (zh) 一种靶向il-18bp的抗体及其应用

Legal Events

Date Code Title Description
MM4A Annulment or lapse of patent due to non-payment of fees