CN109254154A - 人cd147的用途 - Google Patents

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Abstract

本发明属于生物医药技术领域，尤其涉及人CD147的用途。本发明中，实验结果表明CD147蛋白的表达与精子活力呈正相关，CD147蛋白缺陷会导致精子活力低下，CD147蛋白在弱精子症组的精子中表达下调，施用重组人CD147蛋白可以显著提高弱精子症患者精子的顶体反应率和精子与卵子的结合能力。CD147蛋白可作为生物标志物在制备诊断男性不育症的试剂盒中进行应用。

Description

人CD147的用途
技术领域
本发明属于生物医药技术领域，尤其涉及人CD147的用途。
背景技术
在世界范围内，自1980至2015年间男性精子的浓度下降了57％，由此而导致的男性不育也显著增加。与其它国家的研究结果类似，中国男性的精子质量也在逐渐衰退，男性不育的比例逐年增多。据研究显示，过去15年当中(2000-2015)，我国年轻男性精子浓度下降了30.8％，前向精子活力下降了38.23％。弱精子症是男性不育的常见原因，约占生育低下或不育症的18％，被认为是影响正常精卵受孕的最重要因素之一。
现有研究表明，许多基因都参与了男性不育的发病机制。然而，大多数的潜在原因仍然不清楚。
发明内容
有鉴于此，本发明提供了人CD147的用途，CD147蛋白可作为生物标志物在制备诊断男性不育症的试剂盒的应用，为现有诊断男性不育症的试剂盒提供了一种新的生物标志物和新的治疗男性不育的靶点。
本发明的具体技术方案如下：
CD147蛋白作为生物标志物在制备诊断男性不育症的试剂盒的应用。
CD147(又名Basigin、EMMPRIN)，含269个氨基酸(aa)，属单次跨膜糖蛋白，包括信号肽(21aa)、胞外结构域(185aa)、跨膜区及C末端肽段(63aa)。CD147位于细胞外的4个半胱氨酸形成2对二硫键，构成免疫球蛋白超家族(IgSF)典型的半球型结构域，它可以激活基质金属蛋白酶(MMPs)家族蛋白的表达，介导广泛的上皮细胞生物学行为。
本发明中，CD147蛋白具体为人CD147蛋白。
本发明中，实验结果表明CD147蛋白的表达与精子活力呈正相关，CD147蛋白缺陷会导致精子活力低下，CD147蛋白在弱精子症组的精子中表达下调，CD147蛋白可作为生物标志物在制备诊断男性不育症的试剂盒中进行应用。
需要说明的是，诊断男性不育症的试剂盒可针对靶向CD147的蛋白或CD147DNA、mRNA、RNA序列或靶向CD147的miRNA进行男性不育症的诊断。
本发明还提供了用于检测CD147蛋白的物质在制备诊断男性不育症的试剂盒的应用。
本发明还提供了一种用于诊断男性不育的试剂盒，所述试剂盒包括用于检测CD147蛋白的物质。
优选的，所述检测CD147蛋白的物质具体为检测CD147蛋白表达量的物质。
优选的，所述试剂盒还包括记载有判断标准的载体。
本发明中，实验结果表明弱精子症和与男性不育相关的顶体反应与CD147蛋白的表达水平具有相关性，检测精子中CD147蛋白水平可诊断由于精子缺乏活力和/或顶体反应导致的男性不育，为男性不育的新病因提供诊断。
随着体外受精技术(in vitro fertilisation，IVF)和卵胞浆内单精子显微注射(intracytoplasmic injection，ISCI)技术的开展，部分男性不育症患者重新获得了生育的机会。根据国家卫生和计划生育委员会的报告，中国大陆患有不孕不育症的人数超过4000万。因此，仅在中国就有1000万到2000万人需要进行不育诊断和治疗。目前，辅助生殖技术(Assisted Reproductive Technology，ART)已成功应用于不育症的治疗中。全世界每年约进行150万次ART循环，约有35万婴儿出生。
本发明还提供了CD147蛋白作为药物靶点在制备预防男性不育症或治疗男性不育症药物中的应用。
本发明还提供了提高CD147蛋白活性和/或表达量的物质在制备预防男性不育症或治疗男性不育症药物中的应用。
本发明中，提高CD147蛋白活性的物质为活化剂，提高CD147蛋白活性包括激活CD147蛋白的活性。
本发明还提供了重组CD147蛋白(rCD147蛋白)在制备男性不育症或治疗男性不育症药物中的应用。
优选的，所述不育症为弱精子症。
本发明中，rCD147蛋白为人rCD147蛋白。
本发明还提供重组CD147蛋白在制备增加人精子活力物质上的应用。
本发明还提供了一种预防男性不育症或治疗男性不育症药物，所述药物包含重组CD147蛋白或提高CD147蛋白活性和/或表达量的物质。
性不育症或治疗男性不育症药物可针对靶向CD147的蛋白或CD147DNA、mRNA、RNA序列或靶向CD147的miRNA进行男性不育症的治疗。
本发明提供一种人CD147在IVF和ICSI中提高精子质量的应用。
鉴于ART对于弱精子症患者的广泛应用，重组CD147可应用于ART中提高精子质量。
使用重组CD147蛋白提高IVF应用中的精子质量，包括HBA结合能力和顶体反应等，使用重组CD147蛋白应用于ICSI中以去除进行ICSI实验前的顶体，重组CD147蛋白应用于ICSI中还可使卵母细胞免受人类精子顶体酶损伤。
现有技术中，联合维生素和矿物质诱导顶体反应，但其与后代中先天性异常风险增加相关。现有技术中还通过ATP处理诱导顶体反应或通过胸腺素a1处理改变渗透性，然而，ATP治疗和胸腺素a1治疗都不能排除对精子的非特异性影响。并且，现有技术诱导顶体反应只能达到有限的顶体反应率(与对照相比<20％)。本发明中，在弱精子症精子中采用重组CD147可显著促进顶体反应，并且精子活力和HBA结合能力表明重组CD147在调节精子质量中具有广泛作用，因此其在提供治疗方面的潜力比ART和/或IVF中描述的其他现有方法更大。
严重男性不育症患者由于缺乏有活性或形态正常的精子，无法辅助常规IVF手术生产后代，但ICSI可以成功应用于严重男性不育症患者的后代生产中。然而，ICSI可能会在卵母细胞的细胞质中引入大量顶体酶，破坏细胞骨架并最终破坏卵母细胞。在进行ICSI之前去除顶体能够改善卵母细胞的存活和胚胎发育情况。尽管有研究表明激素孕酮(P4)能够改善精子活力和促进顶体反应，但P4作为激素治疗对精子的非特异性作用尚不清楚。本发明中可采用重组CD147治疗，诱导人精子中的顶体反应，能有效去除顶体，并可能增加ICSI在人类临床应用中的成功率。
需要说明的是，干扰CD147表达或功能的物质可用于避孕，干扰CD147表达或功能的物质包括反义寡核苷酸和抗体等。
本发明通过免疫印迹法、免疫荧光染色法、计算机辅助精子分析系统检测、精子透明带结合实验和人精子去透明仓鼠穿卵试验分别检测CD147蛋白在人精子上的表达和功能机制，结果表明弱精子症患者的精子中CD147蛋白的表达显著下降。采用抗体干扰正常精子的CD147蛋白功能，将抑制正常精子的活力，而采用rCD147蛋白可显著恢复来自弱精子症患者精子的精子活力、顶体反应和精子结合透明带的能力。
综上所述，本发明提供了CD147蛋白作为生物标志物在制备诊断男性不育症的试剂盒。本发明中，实验结果表明CD147蛋白的表达与精子活力呈正相关，CD147蛋白缺陷会导致精子活力低下，CD147蛋白在弱精子症组的精子中表达下调，CD147蛋白可作为生物标志物在制备诊断男性不育症的试剂盒中进行应用。采用重组人CD147蛋白可以显著提高弱精子患者的精子活力，顶体反应和穿卵能力，CD147蛋白可作为提高精子质量的制剂应用于辅助生殖(ART)。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍。
图1为本发明实施例中采用激光共聚焦显微镜检测CD147蛋白在人精子中的表达定位图；
图2为本发明实施例中正常组和弱精子症组精子中hCD147蛋白的蛋白电泳图；
图3为本发明实施例中正常组和弱精子症组精子中hCD147蛋白的表达量；
图4为本发明实施例中精子活力与CD147蛋白表达的关系图；
图5为本发明实施例中正常组精子经rCD147、IgG和/或Anti-CD147不同处理后的精子活力图；
图6为本发明实施例中弱精症组精子经rCD147、IgG和/或Anti-CD147不同处理后的精子活力图；
图7为本发明实施例中正常组精子经rCD147、IgG和/或Anti-CD147不同处理后的精子结合百分率图；
图8为本发明实施例中正常组精子人精子-仓鼠卵母细胞穿透实验测定的结果图；
图9为本发明实施例中正常组精子经P4、A23187和/或rCD147不同处理后的顶体反应率图；
图10为本发明实施例中正常组精子经rCD147、IgG和/或Anti-CD147不同处理后的顶体反应率图；
图11为本发明实施例中弱精子症组精子经rCD147、IgG和/或Anti-CD147不同处理后的精子结合百分率图；
图12为本发明实施例中弱精子症组精子经P4、A23187和/或rCD147不同处理后的顶体反应率图；
图13为本发明实施例中弱精子症组精子经rCD147、IgG和/或Anti-CD147不同处理后的顶体反应率图。
具体实施方式
本发明提供了人CD147的用途，CD147蛋白可作为生物标志物在制备诊断男性不育症的试剂盒的应用，为现有诊断男性不育症的试剂盒提供了一种新的生物标志物和治疗靶点。
下面将对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
实施例1
本发明实施例分别采用正常生育和弱精子症患者的精子，分别正常组和弱精子症组来检测CD147缺陷对精子正常功能的影响。采用免疫荧光染色和免疫印迹法对人精子中的CD147蛋白分别进行定位和定量，比较正常组和弱精子症组的精子中CD147蛋白的表达和分布差异，并结合精液参数，对CD147蛋白表达与精子活力进行相关性分析。
1.材料与方法
1)试剂
正常小鼠IgG(Sc-2025)及鼠源抗人CD147(Sc-20797)购自美国Santa CruzBiotechnology(Santa Cruz,CA)公司，不连续密度梯度精子分离液购自Origio公司(SupraSperm#10970060,Origio Inc.)。
2)人精子标本收集和处理
本发明实施例获得深圳大学第一附属医院伦理委员会的批准，并经过每位受试者的知情同意，并排除具有内分泌或解剖学疾病家族史的受试者。按照世界卫生组织标准(WH0,2010)，自2013年10月至2018年2月，从北京大学深圳医院或深圳大学第一附属医院收集生育男性和不育症男性精液标本。精液标本在禁欲3～5天后收集，收集的精液标本在37℃液化30min后，采用计算机辅助精液分析系统(Computer Assisted Semen AnalysisSystem,CASA)检测精液体积、浓度、活力和活率。正常组精液标本符合以下标准：生育男性的精液在小于一年怀孕预期内自然受孕，且距本研究不到一年时间，精子浓度≥20×106个/mL，精子前向运动活率≥32％，正常形态数目≥15％。弱精子症组精液标本符合以下标准：精子浓度>20×106个/mL，精子前向运动活率<32％，精子正常形态数目<14％。
3)Western Blot
人精子经不连续密度梯度分离后，向1×106精子沉淀中加入1×Laemmili样品裂解液，4℃、14000rpm离心30min后取上清，100℃变性5min，离心后取上清液上样至4％～15％SDS-PAGE梯度胶。跑胶程序结束后，转至Nitricelluar(NC)膜上，用5％脱脂奶粉室温孵育1h以封闭非特异性结合蛋白，然后加入一抗[鼠单克隆抗CD147抗体(1:500)或兔多克隆抗GAPDH抗体(1:2000)]，4℃过夜孵育后，用TBST洗3次，每次5min。最后用ECL试剂盒(37071，Pierce,Thermo Fisher Scientific)显影，曝光。
4)共聚焦显微镜染色(Confocal immunostaining)
人精子标本经不连续密度梯度离心，收集的精子沉淀在4％多聚甲醛中固定15min，PBS洗涤后涂于Superfrost玻片，室温风干。玻片上精子经2％BSA封闭1h后，加入小鼠来源抗CD147(1:100，sc-20797)抗体，孵育过夜。第二日，经PBST洗三次后，加入AlexaFluor-488驴抗小鼠IgG(H+L)荧光二抗(1:500,Molecular Probes,Eugene,0R)，室温孵育1h。玻片上的精子经Hoechst 33258(Invitrogen,Camarillo,CA)复染核后，用Prolong-Gold Antifade Reagent(Invitrogen,Camarillo,CA)封片，再用激光共聚焦显微镜(Zeiss,Germany)拍照，并使用图像分析软件Image J进行定量分析。其中，精子获能通过放入获能液中在5％CO2、37℃下孵育3h诱导。
5)统计学处理
用GraphPad Prism Version 5.0(GraphPad Software,San Diego,CA)进行统计学分析，数值表示为Mean±SEM。两组间比较采用t检验，多组间比较采用One Way ANOVATukey Post Hoc Test法分析，组间比较用Two Way ANOVA Mann-Whitney Test分析，*P<0.05表示具有统计学意义。
2.结果
1)CD147定位于人精子的头部和颈部
请参阅图1，为本发明实施例中采用激光共聚焦显微镜检测CD147蛋白在人精子中的表达定位图。免疫荧光共聚焦表明正常组精子中，CD147蛋白主要位于精子的颈部和头部，获能后CD147蛋白部分转移至人精子的头部，说明CD147蛋白可能参与调节精子的功能。
请参阅图2和图3，分别为本发明实施例中正常组和弱精子症组精子中hCD147蛋白的蛋白电泳图和表达量。图2和图3表明弱精子症组的精子中CD147蛋白的表达显著低于正常组精子(p<0.05)。对精子活力和CD147蛋白进行相关性分析，请参阅图4，为本发明实施例中精子活力与CD147蛋白表达的关系图。图4表明CD147蛋白的表达与精子活力呈正相关(r＝0.5068，p＝0.0003)。结果表明CD147蛋白缺陷会导致精子活力低下，CD147蛋白在弱精子症组的精子中表达下调。
实施例2
本发明实施例采用抗体干扰实验，来模拟体内精子CD147蛋白的表达缺陷，检测CD147蛋白对精子活力的影响。同时，采用重组人CD147蛋白来检测其是否对弱精子症组的精子活力具有补救作用。
精子质量的评估除了精子活力之外，还涉及到其他生理学功能，其中包括精子获能、超活化、顶体反应和精卵结合的能力。本发明实施例同样在弱精子症组精子中使用rCD147蛋白处理精子，检查其对弱精子症组精子功能的促进作用。
1.材料与方法
1)试剂
不连续密度梯度精子分离液(SupraSperm#10970060,Origio Inc.)、Quinn′sAdvantage Fertilization(HTF)Medium(ART-1020)和精子透明质酸酶结合检测试剂盒均购自丹麦Origio公司，SpermFuncTM ARIC kit顶体反应检测试剂盒购自深圳博锐德公司，rCD147蛋白购自于美国Abcam公司，注射用尿促性素粉针和注射绒促性素粉针购自上海丽珠制药公司。
2)人精子标本收集和处理
同实施例2)。
3)顶体反应的检测
使用深圳博锐德公司购买的SpermFuncTM ARIC kit顶体反应检测试剂盒，具体步骤如下：
将密度梯度分离后的精子用HTF培养液调节精子密度至1×106个活动精子/mL，在5％CO2、37℃孵育3h诱导精子获能。向测定管内加入10g/mlrCD147或抗CD47抗体(Anti-CD147)(10g/ml)，以A23187为阳性对照，混匀后在CO2培养箱内孵育30min。生理盐水洗涤后取10μL精子悬液进行涂片、干燥和固定，再用蒸馏水洗涤后加入FITC-PSA 50μL，水平放置于湿盒内，4℃过夜。第二天，将涂片洗涤3次后封片；在激发光488nm荧光显微镜60×物镜下观察结果。每个涂片窗至少观察200个精子，记录发生顶体反应的精子数量。
4)HBA结合实验
精子透明带结合试验(Sperm-Hyaluronna Binding Assay,HBA)是一种检测精子成熟和功能的商品化试剂，其原理是透明质酸可与具有完整顶体和形态的精子结合。
按照说明书提供的实验步骤进行精子透明带结合试验(BCT-HBA-10,Origio)。取正常组和弱精子组的精子经密度梯度离心处理后，在HTF培养基(含3％BSA)中在37℃、5％CO2获能30min。调整精子浓度后，每份精子与rCD147(10g/ml)或PBS(含15％甘油)共孵育20min。然后，取10μl精液滴加入切片小室中，37℃下孵育15min。HBA结合的公式表示＝结合精子数目/总活动精子数目。
5)人精子去透明带穿卵试验(Human sperm-hamster’egg penetration assay，SPA)
根据WHO的人精子操作手册，选取8周左右的雌性仓鼠进行超排卵。注射人绒毛膜促性腺激素(Human Chorionic Gonadotropin，hCG)15h～17h后，颈椎脱臼法处死雌鼠，将卵巢和输卵管取出放入含37℃预热HTF液的培养皿中，在体式显微镜镜下(1.5X)找到输卵管的膨大部位，用无菌注射器刺破输卵管壶腹部，使得卵丘卵母细胞复合体(cumulus-oocyte complex，COC)将流出，用巴斯德吸管将COC转移至含有80IU/mL透明质酸酶的液滴中消化20s以去除颗粒细胞及卵细胞透明带。收集正常生育者和弱精子症患者的精子，经密度梯度离心后，放入获能液中5％CO2、37℃孵育3h诱导精子获能；调整精子浓度后，分别加入rCD147(PBS为阴性对照)，Anti-CD147抗体(相应的正常IgG为阴性对照)，37℃孵育30min，然后各取10μL精液加入卵培养液中(100μL，10个卵细胞)，孵育3h后，相差显微镜拍照并计算穿卵率。
6)统计学处理，统计方法同实施例5)。*P<0.05表示具有统计学意义。
2.结果
本发明实施例进一步通过特异性抗体拮抗正常组精子的CD147蛋白，进一步验证CD147蛋白下调引起的精子功能改变。请参阅图5和图6，分别为本发明实施例中正常组精子和弱精症组精子经rCD147、IgG和/或Anti-CD147不同处理后的精子活力图。结果表明Anti-CD147抗体可显著下调正常组精子的活力，而此抑制效应对来自弱精症的精子并不明显。各组采用的鼠来源的正常IgG对照，均未见显著抑制效果，表明采用Anti-CD147抗体的抑制效果是特异的。上述结果表明采用Anti-CD147抗体能够免疫拮抗正常组精子，减弱精子活力，精子功能的改变与弱精子症组精子观察的现象类似，提示CD147缺陷可能参与弱精子症和与男性不育相关的顶体反应这两种男性不育症的发生过程。
请参阅图5、图7至图10，图5为本发明实施例中正常组精子经rCD147、IgG和/或Anti-CD147不同处理后的精子活力图，图5表明Anti-CD147抗体阻断CD147功能后，正常组精子活力被抑制，重组CD147(rCD147)蛋白处理后，精子活力有轻微的上升。图7为本发明实施例中正常组精子经rCD147、IgG和/或Anti-CD147不同处理后的精子结合百分率图，图7表明Anti-CD147抗体处理正常组精子，HBA测定中结合精子的百分比显著降低，而rCD147蛋白处理可以挽救由于Anti-CD147抗体诱导的结合精子的减少。图8为本发明实施例中正常组精子人精子-仓鼠卵母细胞穿透实验测定的结果图，图8表明Anti-CD147抗体显著降低了卵母细胞穿透精子的数量，而rCD147显著增加了卵母细胞穿透精子的数量。图9为本发明实施例中正常组精子经P4、A23187和/或rCD147不同处理后的顶体反应率图，图10为本发明实施例中正常组精子经rCD147、IgG和/或Anti-CD147不同处理后的顶体反应率图，图9和图10表明rCD147、诱发顶体反应的激素孕酮(P4)以及阳性对照A23187能够诱导顶体反应，在正常组精子中，Anti-CD147抗体能够抑制由rCD147诱导的顶体反应，表明顶体反应是CD147特异性诱导的。图5、图7至图10表明用Anti-CD147抗体免疫拮抗正常组精子的CD147蛋白，可以显著抑制人精子与HBA结合的能力、降低了卵母细胞穿透精子的数量以及抑制正常人精子的顶体反应。而对上述免疫拮抗的精子施用人rCD147(rCD147，包含CD147蛋白的细胞外活性区域22-205a.a.)，可以显著的逆转Anti-CD147抗体所抑制的HBA结合能力、精子穿透卵母细胞的能力以及顶体反应。并且，图9表明rCD147所诱导的人精子顶体反应的程度与阳性对照A23187和生理条件下诱发顶体反应的激素孕酮(P4)相类似，说明rCD147可用于诱发精子顶体反应的A23187和P4的替代分子。上述结果表明免疫拮抗正常生育精子的CD147可降低人精子功能，重组人CD147蛋白可以逆转上述过程。
请参阅图6、图11至图13，图6为本发明实施例中弱精症组精子经rCD147、IgG和/或Anti-CD147不同处理后的精子活力图，图6表明rCD147蛋白显着改善了弱精子症组精子的精子活力，Anti-CD147抗体不改变弱精子症组精子的精子活力。图11为本发明实施例中弱精子症组精子经rCD147、IgG和/或Anti-CD147不同处理后的精子结合百分率图，图11表明rCD147蛋白显著增加弱精子症组精子的HBA结合精子百分比。图12为本发明实施例中弱精子症组精子经P4、A23187和/或rCD147不同处理后的顶体反应率图，图13为本发明实施例中弱精子症组精子经rCD147、IgG和/或Anti-CD147不同处理后的顶体反应率图，图12和图13表明rCD147蛋白能够诱导弱精子组精子的顶体反应，通过Anti-CD147抗体处理会抑制rCD147诱导的顶体反应，表明顶体反应是由CD147蛋白特异性诱导的。图6、图11至图13表明rCD147蛋白(10μg/ml)可以显著改善弱精子症组精子的精子活力、与HBA结合的能力以及顶体反应的比例。而特异性的Anti-CD147抗体(10μg/ml)则可以阻断rCD147的改善作用，表明上述的精子功能的改善是由rCD147处理所致。
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

Claims (10)

1.CD147蛋白作为生物标志物在制备诊断男性不育症的试剂盒的应用。
2.用于检测CD147蛋白的物质在制备诊断男性不育症的试剂盒的应用。
3.一种用于诊断男性不育的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括用于检测CD147蛋白的物质。
4.根据权利要求3所述的试剂盒，其特征在于，所述检测CD147蛋白的物质具体为检测CD147蛋白表达量的物质。
5.根据权利要求3所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒还包括记载有判断标准的载体。
6.CD147蛋白作为药物靶点在制备预防男性不育症或治疗男性不育症药物中的应用。
7.提高CD147蛋白活性和/或表达量的物质在制备预防男性不育症或治疗男性不育症药物中的应用。
8.重组CD147蛋白在制备男性不育症或治疗男性不育症药物中的应用。
9.根据权利要求8所述的应用，其特征在于，所述不育症为弱精子症。
10.一种预防男性不育症或治疗男性不育症药物，其特征在于，所述药物包含重组CD147蛋白或提高CD147蛋白活性和/或表达量的物质。
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