CN108700494B - 鉴定用于实现哺乳动物受精的途径和授精时期的方法 - Google Patents

鉴定用于实现哺乳动物受精的途径和授精时期的方法 Download PDF

Info

Publication number
CN108700494B
CN108700494B CN201680082394.7A CN201680082394A CN108700494B CN 108700494 B CN108700494 B CN 108700494B CN 201680082394 A CN201680082394 A CN 201680082394A CN 108700494 B CN108700494 B CN 108700494B
Authority
CN
China
Prior art keywords
hours
insemination
sperm
prior
capacitation
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Active
Application number
CN201680082394.7A
Other languages
English (en)
Other versions
CN108700494A (zh
Inventor
A.J.特拉维斯
C.卡多纳
M.A.穆迪
A.J.辛普森
G.C.奥斯特梅尔
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Androvia Life Sciences LLC
Original Assignee
Androvia Life Sciences LLC
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Androvia Life Sciences LLC filed Critical Androvia Life Sciences LLC
Priority to CN202210054191.4A priority Critical patent/CN114527099A/zh
Publication of CN108700494A publication Critical patent/CN108700494A/zh
Application granted granted Critical
Publication of CN108700494B publication Critical patent/CN108700494B/zh
Active legal-status Critical Current
Anticipated expiration legal-status Critical

Links

Images

Classifications

    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/483—Physical analysis of biological material
    • G01N33/487—Physical analysis of biological material of liquid biological material
    • G01N33/48707—Physical analysis of biological material of liquid biological material by electrical means
    • G01N33/48728—Investigating individual cells, e.g. by patch clamp, voltage clamp
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/5005—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving human or animal cells
    • G01N33/5091—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving human or animal cells for testing the pathological state of an organism
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N21/00—Investigating or analysing materials by the use of optical means, i.e. using sub-millimetre waves, infrared, visible or ultraviolet light
    • G01N21/62—Systems in which the material investigated is excited whereby it emits light or causes a change in wavelength of the incident light
    • G01N21/63—Systems in which the material investigated is excited whereby it emits light or causes a change in wavelength of the incident light optically excited
    • G01N21/64—Fluorescence; Phosphorescence
    • G01N21/6428—Measuring fluorescence of fluorescent products of reactions or of fluorochrome labelled reactive substances, e.g. measuring quenching effects, using measuring "optrodes"
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N21/00—Investigating or analysing materials by the use of optical means, i.e. using sub-millimetre waves, infrared, visible or ultraviolet light
    • G01N21/62—Systems in which the material investigated is excited whereby it emits light or causes a change in wavelength of the incident light
    • G01N21/63—Systems in which the material investigated is excited whereby it emits light or causes a change in wavelength of the incident light optically excited
    • G01N21/64—Fluorescence; Phosphorescence
    • G01N21/645—Specially adapted constructive features of fluorimeters
    • G01N21/6456—Spatial resolved fluorescence measurements; Imaging
    • G01N21/6458—Fluorescence microscopy
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/5005—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving human or animal cells
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/58—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving labelled substances
    • G01N33/582—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving labelled substances with fluorescent label
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/68—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving proteins, peptides or amino acids
    • G01N33/689—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving proteins, peptides or amino acids related to pregnancy or the gonads
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N2800/00—Detection or diagnosis of diseases
    • G01N2800/36—Gynecology or obstetrics
    • G01N2800/367—Infertility, e.g. sperm disorder, ovulatory dysfunction

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Urology & Nephrology (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • General Physics & Mathematics (AREA)
  • Pathology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Food Science & Technology (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Tropical Medicine & Parasitology (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Gynecology & Obstetrics (AREA)
  • Pregnancy & Childbirth (AREA)
  • Reproductive Health (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Physiology (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Optics & Photonics (AREA)
  • Investigating Or Analysing Biological Materials (AREA)
  • Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
  • Medicinal Preparation (AREA)
  • Surgery (AREA)
  • Heart & Thoracic Surgery (AREA)
  • Medical Informatics (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Measurement Of The Respiration, Hearing Ability, Form, And Blood Characteristics Of Living Organisms (AREA)

Abstract

雄性不育的诊断主要基于对浓度、总能动性、前进能动性、体积、pH、粘度和/或形态学的标准精液分析结果。当精子进入雌性生殖道时，其必须经历一系列生理学变化，称为获能，以使卵受精。该过程涉及质膜变化，其响应雌性道中的刺激发生。这些变化包括去除甾醇类和神经节苷脂GM1再分布。精液分析仅鉴定一半的雄性不育病例，这是因为标准精液分析提供很少的关于精子功能能力的信息。先前的数据证明神经节苷脂GM1的定位鉴定能够经历称为获能的功能成熟过程的精子亚群并且强力跟踪能育性。

Description

鉴定用于实现哺乳动物受精的途径和授精时期的方法
相关申请的交叉引用
本申请要求于2015年12月23日提交的美国临时申请号62/387,348、于2016年4月28日提交的美国临时申请号62/328,876、于2016年1月15日提交的美国临时申请号62/279,315、于2016年4月28日提交的美国临时申请号62/328,885和于2016年11月15日提交的美国临时申请号62/422,279的益处，其各自以其整体结合。
发明领域
本发明一般涉及雄性能育性领域，更具体地，提供鉴定使用的生殖途径以实现受精和/或改变进行授精的时期以实现受精的方法。
背景
雄性不育诊断主要基于对浓度、总能动性、前进能动性、体积、pH、粘度和/或形态学的标准精液分析结果。然而，精子形态学、能动性和浓度的测量不评估致育潜能，包括驻留在雌性生殖道内期间精子经历的复杂变化。除了与评估致育潜能有关的挑战，低温贮藏常常用来保藏精子细胞并将雄性能育性保藏更长的一段时间。不幸地，冻融可负面影响精子活力和功能。据报道低温贮藏改变获能和移动/限制受精窗。
新开发的能育性检验应测定精子致育，以及开始和维持妊娠的能力(Oehninger等人, “Sperm functional tests (精子功能检验),” Fertil Steril. 102: 1528-33(2014); Wang等人, “Limitations of semen analysis as a test of male fertilityand anticipated needs from newer tests (精液分析作为雄性能育性检验的限制和新检验的预期需求),” Fertil Steril. 102: 1502-07 (2014))。尽管新射出的精子似乎形态学成熟和能动，但其不能受精。其必须首先经历成熟过程，称为“获能”，这致使它们能够受精(Austin, “The capacitation of the mammalian sperm (哺乳动物精子的获能),”Nature, 170: 326 (1952); Chang, “Fertilizing capacity of spermatozoadeposited into the fallopian tubes (留在输卵管中的精子的致育能力),” Nature,168: 697-8 (1951))。在多数物种中，获能取决于从精子质膜去除甾醇类(甾醇外流)和碳酸氢盐以及钙离子内流(Baldi等人, “Intracellular calcium accumulation andresponsiveness to progesterone in capacitating human spermatozoa (获能人精子中的胞内钙积累和对孕酮的响应性),” J Androl. 12: 323-30 (1991); Bedu-Addo等人,“Bicarbonate and bovine serum albumin reversibly ‘switch’ capacitation-induced events in human spermatozoa (碳酸氢盐和牛血清白蛋白可逆地’打开’人精子中获能诱发的事件),” Mol Hum Reprod., 11: 683-91 (2005); Cohen等人, “Lipidmodulation of calcium flux through CaV2.3 regulates acrosome exocytosis andfertilization (通过CaV2.3的钙流动的脂质调节调控顶体胞吐和受精),” Dev Cell.28: 310-21 (2014); Gadella等人, “Bicarbonate and its role in mammalian spermfunction (碳酸氢盐及其在哺乳动物精子功能中的作用),” Anim. Reprod. Sci. 82:307-19 (2004))。精子获能期间发生的甾醇类外流改变膜流动性模式并允许重分配特定的膜组分(Cohen等人 2014; Cross, “Role of cholesterol in sperm capacitation (胆固醇在精子获能中的作用),” Biol Reprod. 59: 7-11 (1998); Selvaraj等人,“Mechanisms underlying the micron-scale segregation of sterols and GM1 in livemammalian sperm (甾醇类的微米级分离的潜在机制和活哺乳动物精子中的GM1),” J Cell Physiol. 218: 522-36 (2007); Selvaraj等人, “GM1 dynamics as a marker formembrane changes associated with the process of capacitation in murine andbovine spermatozoa (GM1动力学作为与鼠和牛精子中获能过程相关的膜变化的标志),” J Androl. 28: 588-99 (2009))。
当前，存在很少的(如果有的话)灵敏且简单的适用于临床应用的获能生物标志。例如，酪氨酸残基的磷酸化已经很好地与获能关联而详细描述(Battistone等人,“Functional human sperm capacitation requires both bicarbonate-dependent PKAactivation and down-regulation of Ser/Thr phosphatases by Src family kinases(有功能的人精子获能需要碳酸氢盐依赖的PKA活化和Ser/Thr磷酸酶被Src家族激酶下调二者),” Mol, Human Reprod. 19: 570-80 (2013); Osheroff等人, “Regulation ofhuman sperm capacitation by a cholesterol efflux-stimulated signaltransduction pathway leading to protein kinase A-mediated up-regulation ofprotein tyrosine phosphorylation (通过胆固醇外流刺激的信号转导途径调节人精子获能导致蛋白激酶A介导的蛋白酪氨酸磷酸化上调),” Mol, Human Reprod. 5: 1017-26(1999); Visconti等人. “Capacitation of mouse spermatozoa. I. Correlationbetween the capacitation state and protein tyrosine phosphorylation (小鼠精子获能. I. 获能状态与蛋白质酪氨酸磷酸化之间的关联),” Development, 121: 1129-37(1995))。然而，评估这些事件可耗费数天，并且仅提供半定量评估，使其不适合于临床评估雄性能育性。
已经知道一段时间精子必须经历甾醇外流以变得能够受精(Osheroff等人 1999;Travis等人, “The role of cholesterol efflux in regulating the fertilizationpotential of mammalian spermatozoa (胆固醇外流在调节哺乳动物精子的授精能力中的作用),” The Journal of Clinical Investigation, 110: 731-36 (2002))。另外，胆固醇和其它脂类，例如神经节苷脂GM1，在精子质膜内组构成微结构域(Asano等人,“Biochemical characterization of membrane fractions in murine sperm:Identification of three distinct sub‐types of membrane rafts (鼠精子中膜部分的生化表征：鉴定三个不同的膜筏亚型),” J Cell Physiol., 218: 537-48 (2009);Asano等人, “Characterization of the proteomes associating with three distinctmembrane raft sub‐types in murine sperm (鼠精子中与三个不同的膜筏亚型相关的蛋白质组的表征),” Proteomics, 10: 3494-505 (2010); Travis等人, “Expression andlocalization of caveolin-1, and the presence of membrane rafts, in mouse andGuinea pig spermatozoa (小鼠和豚鼠精子中窖蛋白1的表达和定位，以及膜筏的存在情况),” Dev Biol., 240: 599-610 (2001); Selvaraj等人 2009)。这些膜筏合并信号传导通路，使其成为合乎情理的介导精子功能的候选。有趣地，GM1定位模式的可预测的变化已经在经刺激获能的小鼠和公牛精子二者中测量到(Selvaraj等人 2007)。另外，GM1调节R型钙通道的活性，触发顶体胞吐因此成功受精所必需的瞬时钙流(Cohen等人 2014)。这些发现证实GM1定位模式评估精子功能以及相应地雄性能育性的用途。
已经鉴定了各种GM1定位模式并与获能或非获能相关。具体地，在牛和人精子中顶端顶体(AA) GM1定位模式和顶体质膜(APM) GM1定位模式与获能相关。精子获能可定量表述为Cap-Score™值，经由Cap-Score™精子功能检验(“Cap-Score™Test”或“Cap-Score”)产生，定义为([顶端顶体(AA) GM1定位模式的数目+顶体质膜(APM) GM1定位模式的数目]/GM1标记的定位模式的总数目)，其中测量每一定位模式的数目，然后最终转化为百分比分数。除了APM GM1定位模式和AA GM1定位模式之外，其它标记的定位模式包括内衬细胞GM1定位模式、中间(INTER) GM1定位模式、顶体后质膜(PAPM) GM1定位模式、顶端顶体/顶体后 (AA/PA) GM1定位模式、赤道段(ES) GM1定位模式和弥散性(DIFF) GM1定位模式(Travis等人,“Impacts of common semen handling methods on sperm function (常见精液处理方法对精子功能的影响),”The Journal of Urology, 195 (4), e909 (2016))。
发明概述
在一个实施方案中，本公开内容提供鉴定用于实现哺乳动物受精的途径的方法。将体外获能的精子细胞的第一样品用荧光标记处理。获得一个或多个t0-荧光图像，其中图像显示与t0-荧光标记的体外获能的精子细胞相关的一种或多种GM1定位模式。t0-荧光图像在选自：0.1小时-5小时、0.1小时-8小时、0.1-12小时或0.1小时-18小时的体外获能后时间(t0)获得。对于t0-荧光图像中显示的t0-荧光标记的体外获能的精子细胞，测量顶端顶体(AA) GM1定位模式的数目、顶体质膜(APM) GM1定位模式的数目和GM1定位模式的总数目，以测定t0-[AA GM1定位模式加APM GM1定位模式]的百分比。确定与测量的t0-[AA GM1定位模式加APM GM1定位模式]的百分比相关的能育性状态，其中[AA GM1定位模式加APM GM1定位模式]的参考百分比对应于：大于35 %指示高能育性状态；比35%低一个标准差指示中等能育性状态；且比35%低两个或更多个标准偏差指示低能育性状态。比较测量的t0-[AA GM1定位模式和APM GM1定位模式]的百分比与[AA GM1定位模式加APM GM1定位模式]的参考百分比。生殖途径基于能育性状态鉴定以实现受精。
在前述实施方案的一个例子中，其中雄性具有至少正常的精子浓度：(i) 用于高能育性状态的生殖途径选自：性交、宫颈内授精(ICI)、宫颈内授精之前预先使精子获能、子宫内授精(IUI)或子宫内授精之前预先使精子获能；(ii) 用于中等能育性状态的生殖途径选自：宫颈内授精(ICI)、宫颈内授精之前预先使精子获能、子宫内授精(IUI)、子宫内授精之前预先使精子获能或体外受精(IVF)或体外受精之前预先使精子获能；或(iii) 用于低能育性状态的生殖途径选自：体外受精(IVF)、体外受精之前预先使精子获能、胞浆内精子注射(ICSI)、胞浆内精子注射之前预先使精子获能、配子输卵管内转移(GIFT)、配子输卵管内转移之前预先使精子获能、透明带下授精(SUZI)或透明带下授精之前预先使精子获能。
在前述实施方案的另一个例子中，其中雄性具有小于正常的精子浓度：(i) 用于高能育性状态的生殖途径选自：宫颈内授精(ICI)、宫颈内授精之前预先使精子获能、子宫内授精(IUI)或子宫内授精之前预先使精子获能；(ii) 用于中等能育性状态的生殖途径选自：宫颈内授精(ICI)、宫颈内授精之前预先使精子获能、子宫内授精(IUI)或子宫内授精之前预先使精子获能、体外受精(IVF)、体外受精之前预先使精子获能；或(iii) 用于低能育性状态的生殖途径选自：体外受精(IVF)、体外受精之前预先使精子获能、胞浆内精子注射(ICSI)、胞浆内精子注射之前预先使精子获能、配子输卵管内转移(GIFT)、配子输卵管内转移之前预先使精子获能、透明带下授精(SUZI)或透明带下授精之前预先使精子获能。
在每一前述实施方案的一个例子中，将体外获能的精子细胞的第二样品用荧光标记处理，其中体外获能的精子细胞的第二样品和体外获能的精子细胞的第一样品与同一雄性相关。获得显示与t1-荧光标记的体外获能的精子细胞相关的一种或多种GM1定位模式的一个或多个t1-荧光图像，其中t1-荧光图像在获能后时间t1获得，其中t1选自大于t0或大于18小时。对于t1-荧光图像中显示的t1-荧光标记的体外获能的精子细胞，测量顶端顶体(AA)GM1定位模式的数目、顶体质膜(APM) GM1定位模式的数目和GM1定位模式的总数目，以测定t1-[AA GM1定位模式加APM GM1定位模式]的百分比。比较t1-[AA GM1定位模式加APM GM1定位模式]的百分比与t0-[AA GM1定位模式加APM GM1定位模式]的百分比，以确定体内获能时间，其选自大于12小时的晚期体内获能时间或小于12小时的标准体内获能时间。t0-[AA GM1定位模式加APM GM1定位模式]的百分比与t1-[AA GM1定位模式加APM GM1定位模式]的百分比的差异对应于：距标准35%大于一个标准差指示大于12小时的晚期体内获能时间；或距标准35%小于一个标准差指示小于12小时的标准体内获能时间。此外当t0-[AA GM1定位模式加APM GM1定位模式]的百分比与t1-[AA GM1定位模式加APM GM1定位模式]的百分比的差异对应于：距标准35%大于一个标准差时，则t1-能育性状态基于测量的t1-[AA GM1定位模式加APM GM1定位模式]百分比与[AA GM1定位模式加APM GM1定位模式]的参考百分比的比较确定；或距标准35%小于一个标准差，则t1-能育性状态基于[AA GM1定位模式加APM GM1定位模式]的参考百分比与测量的t1-[AA GM1定位模式加APM GM1定位模式]百分比或测量的t0-[AAGM1定位模式加APM GM1定位模式]百分比的比较确定。基于雄性的t1-能育性状态和体内获能时间，鉴定授精时期和使用的生殖途径以实现受精。
在前述实施方案的一个例子中，其中雄性具有至少正常的精子浓度和晚期体内获能时间：(i) 用于高t1-能育性状态的生殖途径选自：改变性交时间至晚期体内获能时间；改变宫颈内授精(ICI)时间至晚期体内获能时间、改变子宫内授精(IUI)时间至晚期体内获能时间、宫颈内授精之前预先使精子获能或子宫内授精之前预先使精子获能；(ii) 用于中等t1-能育性状态的生殖途径选自：改变宫颈内授精(ICI)时间至晚期体内获能时间、改变子宫内授精(IUI)时间至晚期体内获能时间、改变体外受精(IVF)时间至晚期体内获能时间、宫颈内授精之前预先使精子获能、子宫内授精(IUI)、子宫内授精之前预先使精子获能或体外受精之前预先使精子获能；或(iii) 用于低t1-能育性状态的生殖途径选自：改变体外受精(IVF)时间至晚期体内获能时间、改变胞浆内精子注射(ICSI)时间至晚期体内获能时间、改变配子输卵管内转移(GIFT)时间至晚期体内获能时间、改变透明带下授精(SUZI)时间至晚期体内获能时间、体外受精之前预先使精子获能、胞浆内精子注射之前预先使精子获能、配子输卵管内转移之前预先使精子获能或透明带下授精之前预先使精子获能。
在前述实施方案的一个例子中，其中雄性具有小于正常的精子浓度和晚期体内获能时间：(i) 用于t1-高能育性状态的生殖途径选自：改变性交时间至晚期体内获能时间、改变宫颈内授精(ICI)时间至晚期体内获能时间、改变子宫内授精(IUI)时间至晚期体内获能时间、宫颈内授精之前预先使精子获能或子宫内授精之前预先使精子获能；(ii) 用于t1-中等能育性状态的生殖途径选自：改变宫颈内授精(ICI)时间至晚期体内获能时间、改变子宫内授精(IUI)时间至晚期体内获能时间、改变体外受精(IVF)时间至晚期体内获能时间、宫颈内授精之前预先使精子获能、子宫内授精之前预先使精子获能或体外受精之前预先使精子获能；或(iii) 用于t1-低能育性状态的生殖途径选自：改变体外受精(IVF)时间至晚期体内获能时间、胞浆内精子注射(ICSI), 改变胞浆内精子注射(ICSI)时间至晚期体内获能时间、改变配子输卵管内转移(GIFT)时间至晚期体内获能时间、改变透明带下授精(SUZI)时间至晚期体内获能时间、体外受精之前预先使精子获能、胞浆内精子注射之前预先使精子获能、配子输卵管内转移之前预先使精子获能或透明带下授精之前预先使精子获能。
在前述实施方案的另一个例子中，其中雄性具有至少正常的精子浓度和标准体内获能时间：(i) 用于高t1-能育性状态的生殖途径选自：性交、宫颈内授精(ICI)、宫颈内授精之前预先使精子获能、子宫内授精(IUI)或子宫内授精之前预先使精子获能；(ii) 用于中等t1-能育性状态的生殖途径选自：宫颈内授精(ICI)、宫颈内授精之前预先使精子获能、子宫内授精(IUI)、子宫内授精之前预先使精子获能或体外受精(IVF)或体外受精之前预先使精子获能；或(iii) 用于低t1-能育性状态的生殖途径选自：体外受精(IVF)、体外受精之前预先使精子获能、胞浆内精子注射(ICSI)、胞浆内精子注射之前预先使精子获能、配子输卵管内转移(GIFT)、配子输卵管内转移之前预先使精子获能、透明带下授精(SUZI)或透明带下授精之前预先使精子获能。
在前述实施方案的另一个例子中，其中雄性具有小于正常的精子浓度和标准体内获能时间：(i) 用于高t1-能育性状态的生殖途径选自：宫颈内授精(ICI)、宫颈内授精之前预先使精子获能、子宫内授精(IUI)或子宫内授精之前预先使精子获能；(ii) 用于中等t1-能育性状态的生殖途径选自：宫颈内授精(ICI)、宫颈内授精之前预先使精子获能、子宫内授精(IUI)或子宫内授精之前预先使精子获能、体外受精(IVF)、体外受精之前预先使精子获能；或(iii) 用于低t1-能育性状态的生殖途径选自：体外受精(IVF)、体外受精之前预先使精子获能、胞浆内精子注射(ICSI)、胞浆内精子注射之前预先使精子获能、配子输卵管内转移(GIFT)、配子输卵管内转移之前预先使精子获能、透明带下授精(SUZI)或透明带下授精之前预先使精子获能。
在一个实施方案中，本公开内容提供鉴定用于实现哺乳动物受精的途径的方法。将t0-体外获能的精子细胞样品用荧光标记处理和t1-体外获能的精子细胞样品用荧光标记处理。获得一个或多个t0-荧光图像，t0-荧光图像显示与t0-荧光标记的体外获能的精子细胞相关的一种或多种GM1定位模式。并且获得一个或多个t1-荧光图像，t1-荧光显示与t1-荧光标记的体外获能的精子细胞相关的一种或多种GM1定位模式。t0-荧光图像在选自：0.1小时-5小时、0.1小时-8小时、0.1-12小时或0.1小时-18小时的体外获能后时间(t0)获得；t1-荧光图像在获能后时间t1获得，其中t1大于t0。对于t0-荧光图像中显示的t0-荧光标记的体外获能的精子细胞，测量顶端顶体(AA) GM1定位模式的数目、顶体质膜(APM) GM1定位模式的数目和GM1定位模式的总数目，以测定t0-[AA GM1定位模式加APM GM1定位模式]的百分比。并且对于t1-荧光图像中显示的t1-荧光标记的体外获能的精子细胞，测量顶端顶体(AA)GM1定位模式的数目、顶体质膜(APM) GM1定位模式的数目和GM1定位模式的总数目，以测定t1-[AA GM1定位模式加APM GM1定位模式]的百分比。比较t1-[AA GM1定位模式加APM GM1定位模式]的百分比与t0-[AA GM1定位模式加APM GM1定位模式]的百分比，以确定体内获能时间，其选自大于12小时的晚期体内获能时间或者12小时或更少的标准体内获能时间。t0-[AAGM1定位模式加APM GM1定位模式]的百分比与t1-[AA GM1定位模式加APM GM1定位模式]的百分比之间的差异对应于：距标准35%大于一个标准差指示大于12小时的晚期体内获能时间；或距标准35%小于一个标准差指示小于12小时的标准体内获能时间。[AA GM1定位模式加APMGM1定位模式]的参考百分比对应于：大于35 %指示高能育性状态，比35%低一个标准差指示中等能育性状态；比35%低两个或更多个标准差指示低能育性状态。此外当t0-[AA GM1定位模式加APM GM1定位模式]的百分比与t1-[AA GM1定位模式加APM GM1定位模式]的百分比的差异对应于：距标准35%大于一个标准差时，则t1-能育性状态基于测量的t1-[AA GM1定位模式加APM GM1定位模式]百分比与 [AA GM1定位模式加APM GM1定位模式]的参考百分比的比较确定；或距标准35%小于一个标准差，则t1-能育性状态基于[AA GM1定位模式加APM GM1定位模式]的参考百分比与测量的t1-[AA GM1定位模式加APM GM1定位模式]百分比或测量的t0-[AA GM1定位模式加APM GM1定位模式]百分比的比较确定。基于雄性的t1-能育性状态和体内获能时间，鉴定授精时期和使用的生殖途径以实现受精。
在前述实施方案的一个例子中，其中雄性具有至少正常的精子浓度和晚期体内获能时间：(i) 用于高t1-能育性状态的生殖途径选自：改变性交时间至晚期体内获能时间、改变宫颈内授精(ICI)时间至晚期体内获能时间、改变子宫内授精(IUI)时间至晚期体内获能时间、宫颈内授精之前预先使精子获能或子宫内授精之前预先使精子获能；(ii) 用于中等t1-能育性状态的生殖途径选自：改变宫颈内授精(ICI)时间至晚期体内获能时间、改变子宫内授精(IUI)时间至晚期体内获能时间、改变体外受精(IVF)时间至晚期体内获能时间、宫颈内授精之前预先使精子获能、子宫内授精(IUI)、子宫内授精之前预先使精子获能或体外受精之前预先使精子获能；或(iii) 用于低t1-能育性状态的生殖途径选自：改变体外受精(IVF)时间至晚期体内获能时间、改变胞浆内精子注射(ICSI)时间至晚期体内获能时间、改变配子输卵管内转移(GIFT)时间至晚期体内获能时间、改变透明带下授精(SUZI)时间至晚期体内获能时间、体外受精之前预先使精子获能、胞浆内精子注射之前预先使精子获能、配子输卵管内转移之前预先使精子获能或透明带下授精之前预先使精子获能。
在前述实施方案的另一个例子中，其中雄性具有小于正常的精子浓度和晚期体内获能时间：(i) 用于t1-高能育性状态的生殖途径选自：改变性交时间至晚期体内获能时间、改变宫颈内授精(ICI)时间至晚期体内获能时间、改变子宫内授精(IUI)时间至晚期体内获能时间、宫颈内授精(ICI)之前预先使精子获能或子宫内授精(IUI)之前预先使精子获能；(ii) 用于t1-中等能育性状态的生殖途径选自：改变宫颈内授精(ICI)时间至晚期体内获能时间、改变子宫内授精(IUI)时间至晚期体内获能时间、改变体外受精(IVF)时间至晚期体内获能时间、宫颈内授精之前预先使精子获能、子宫内授精之前预先使精子获能或体外受精之前预先使精子获能；或(iii) 用于t1-低能育性状态的生殖途径选自：改变体外受精(IVF)时间至晚期体内获能时间、胞浆内精子注射(ICSI)、改变胞浆内精子注射(ICSI)时间至晚期体内获能时间、改变配子输卵管内转移(GIFT)时间至晚期体内获能时间、改变透明带下授精(SUZI)时间至晚期体内获能时间、体外受精之前预先使精子获能、胞浆内精子注射之前预先使精子获能、配子输卵管内转移之前预先使精子获能或透明带下授精之前预先使精子获能。
在前述实施方案的另一个例子中，其中雄性具有至少正常的精子浓度和标准体内获能时间：(i) 用于高t1-能育性状态的生殖途径选自：性交、宫颈内授精(ICI)、宫颈内授精之前预先使精子获能、子宫内授精(IUI)或子宫内授精之前预先使精子获能；(ii) 用于中等t1-能育性状态的生殖途径选自：宫颈内授精(ICI)、宫颈内授精之前预先使精子获能、子宫内授精(IUI)、子宫内授精之前预先使精子获能或体外受精(IVF)或体外受精之前预先使精子获能；或(iii) 用于低t1-能育性状态的生殖途径选自：体外受精(IVF)、体外受精之前预先使精子获能、胞浆内精子注射(ICSI)、胞浆内精子注射之前预先使精子获能、配子输卵管内转移(GIFT)、配子输卵管内转移之前预先使精子获能、透明带下授精(SUZI)或透明带下授精之前预先使精子获能。
在前述实施方案的另一个例子中，其中雄性具有小于正常的精子浓度和标准体内获能时间：(i) 用于高t1-能育性状态的生殖途径选自：宫颈内授精(ICI)、宫颈内授精之前预先使精子获能、子宫内授精(IUI)或子宫内授精之前预先使精子获能；(ii) 用于中等t1-能育性状态的生殖途径选自：宫颈内授精(ICI)、宫颈内授精之前预先使精子获能、子宫内授精(IUI)或子宫内授精之前预先使精子获能、体外受精(IVF)、体外受精之前预先使精子获能；或(iii) 用于低t1-能育性状态的生殖途径选自：体外受精(IVF)、体外受精之前预先使精子获能、胞浆内精子注射(ICSI)、胞浆内精子注射之前预先使精子获能、配子输卵管内转移(GIFT)、配子输卵管内转移之前预先使精子获能、透明带下授精(SUZI)或透明带下授精之前预先使精子获能。
在一个实施方案中，本公开内容提供鉴定用于实现哺乳动物受精的途径的方法。将体外获能的精子细胞用荧光标记处理。产生说明荧光标记处理的体外获能的精子细胞的一种或多种GM1定位模式的数据，所述数据在选自：0.1小时-5小时、0.1小时-8小时、0.1-12小时或0.1小时-18小时的体外获能后时间(t0)，和大于t0的时间(t1)获得。雄性的能育性状态数据然后使用在那些时间的一种或多种GM1定位模式的数据表征。基于雄性的能育性状态数据，鉴定授精时期和使用的生殖途径以实现受精。在一个实施方案中，将精子细胞低温贮藏，并在用获能条件体外处理之前储存。在另一个实施方案中，将精子细胞用获能条件体外处理，能育性状态使用在那些时间的一种或多种GM1定位模式的数据评估，然后将精子低温贮藏和储存。
在又一个实施方案中，本公开内容提供鉴定用于实现哺乳动物受精的途径的方法。将体外获能的精子细胞用荧光标记处理。获得荧光标记的体外获能的精子细胞的一个或多个荧光图像。在用获能条件体外处理精子细胞持续不同的时期后，测量荧光标记的体外获能的精子样品的Cap-Score值。比较Cap-Score值和与已知能育性状态的雄性相关的在那些时间的参考Cap-Score值。基于Cap-Score值，鉴定授精时期和使用的生殖途径以实现受精。在一个实施方案中，将精子细胞低温贮藏并在用获能条件体外处理之前储存。在另一个实施方案中，将精子细胞用获能条件体外处理，能育性状态使用在那些时间的一种或多种GM1定位模式的数据评估，然后将精子低温贮藏和储存。
在又一个实施方案中，本公开内容提供鉴定用于实现哺乳动物受精的途径的方法。将体外获能的精子细胞用荧光标记处理。获得荧光标记的体外获能的精子细胞的一个或多个荧光图像。精子细胞用低温贮藏程序处理并用获能条件体外处理不同的时长后，测量荧光标记的体外获能的精子样品的Cap-Score值。比较Cap-Score值与已知能育性状态的雄性相关的在那些时间的参考Cap-Score值。基于在那些时间的Cap-Score值，鉴定授精时期和使用的生殖途径以实现受精。
在又一个实施方案中，本公开内容提供鉴定用于实现哺乳动物受精的途径的方法。将体外获能的精子细胞用荧光标记处理。精子细胞用低温贮藏程序处理并用获能条件体外处理不同的时长后，产生说明体外获能的精子细胞的一种或多种GM1定位模式的数据。雄性的能育性状态数据然后使用在那些时间的一种或多种GM1定位模式的数据表征。基于雄性的能育性状态数据，鉴定授精时期和使用的生殖途径以实现受精。
在另一个实施方案中，本公开内容提供鉴定用于实现成功的哺乳动物妊娠的适当方法的方法。将体外获能的精子细胞用荧光标记处理。获得荧光标记的体外获能的精子细胞的一个或多个荧光图像。测量荧光标记的体外获能的精子样品的Cap-Score值。比较Cap-Score值和与能育雄性相关的参考Cap-Score值。基于Cap-Score值确定实现成功妊娠的适当机制。
附图简述
前面的概述，以及下面的发明详述，将会在结合附图阅读时更好地理解。
图1A说明平均Cap-Score在x轴显示且相应的标准差在y轴显示的绘图。对于所有图像，发现平均SD为三(3)，并通过实体水平线显示。虚线显示SD的线性依从性(y = 0.06x+ 0.02; r= 0.69; p=0.00)。
图1B说明平均Cap-Score在x轴显示且变异系数在y轴显示的绘图。对于所有图像，发现CoV为十三(13)，并通过实体水平线显示。虚线显示CoV与Cap-Score平均值的线性依从性(y = -0.32x + 0.22; r=-0.84; p=0.00)。
图2A说明操作者之间平均Cap-Score的重现性。对于“小于正常”(比正常男性群体的平均Cap-Score结果低超过一(1)个SD)，获得10个拼接图像，各自包含多达5,000个精子。两个不同的读取者通过随机重新取样每一图像20次并且每次计数150个细胞(读取者1空心条，读取者2灰色条)而测定Cap-Score。
图2B说明操作者之间平均Cap-Score的重现性。对于“假定正常的”(如上分类为比正常男性群体的平均Cap-Score结果低一(1)个SD)，获得10个拼接图像，各自包含多达5,000个精子。两个不同的读取者通过随机重新取样每一图像20次并且每次计数150个细胞(读取者1空心条，读取者2灰色条)而测定Cap-Score。
图3A说明操作者之间Cap-Score方差的重复性。对于“小于正常”(比正常男性群体的平均Cap-Score结果低超过一(1)个SD)，获得10个拼接图像，各自包含多达5,000个精子。两个不同的读取者通过随机重新取样每一图像20次并且每次计数150个细胞(读取者1空心条，读取者2灰色条)而测定Cap-Score。
图3B说明操作者之间Cap-Score方差的重复性。对于“假定正常的”(如上分类为比正常男性群体的平均Cap-Score结果低一(1)个SD)，获得10个拼接图像，各自包含多达5,000个精子。两个不同的读取者通过随机重新取样每一图像20次并且每次计数150个细胞(读取者1空心条，读取者2灰色条)而测定Cap-Score。
图4说明正常人精子和来自不育雄性的精子中的各种GM1定位模式，其在体外获能条件下形成。
发明详述
如本文所描述的，精子获能时期在不同的雄性之间和之内不同。已经发现测定雄性的精子获能时期可用于鉴定授精时期和授精时期期间使用的生殖途径以实现受精。
GM1指单唾液酸四己糖基神经节苷脂，为神经节苷脂类的神经节系列的成员。
对于人精子，当精子在体外获能条件下时已经报道8种不同的GM1定位模式，如图4中所说明的。为了可视化定位模式，将获能的精子用GM1的标记分子例如霍乱毒素b (其上具有荧光可检测的标记)处理。
INTER特征为其中绝大多数荧光信号在赤道段周围的带中以及一些信号在覆盖顶体的质膜中的精子细胞。通常存在荧光信号梯度，大部分在赤道段，然后向顶部逐渐减少。横跨赤道段的带中在精子头部的边缘常常存在荧光信号强度的增加。
顶端顶体“AA”特征为其中荧光信号向顶端浓缩、亮度增加且信号区域减少的精子细胞。
顶体质膜“APM”特征为在覆盖顶体的质膜显示分布的荧光信号的精子细胞。APM信号从向顶端移动的明亮的赤道INTER带见到，或其可起始进一步直至顶端，并且存在于更小的区域，如同其与AA为连续区。
顶体后质膜“PAPM”特征为其中荧光信号只在顶体后质膜中的精子细胞。
顶端顶体顶体后“AA/PA”特征为其中荧光信号位于覆盖顶体的质膜和顶体后质膜二者中的精子细胞。赤道段不显示荧光信号。
赤道段“ES”特征为具有单独位于赤道段的亮荧光信号的精子细胞。其可伴随横跨赤道区域的精子头部增厚。
弥散性“DIFF”特征为具有定位在整个精子头部的弥散性荧光信号的精子细胞。
内衬细胞特征为在顶体后区域上面和覆盖顶体的质膜处以及赤道段底部(即，顶体后/赤道带)具有弥散性的荧光信号的精子细胞。荧光信号在赤道段周围缺失。
各种GM1定位模式通过用GM1的标记分子例如霍乱毒素b (其上具有荧光可检测的标记)处理精子细胞鉴定。标记的精子细胞然后使用荧光显微镜可视化，如本领域技术人员所已知的。
Cap-Score定义为[顶端顶体(AA) GM1定位模式的数目+顶体质膜(APM) GM1定位模式的数目]除以[GM1标记的定位模式的总数目]的比率(Travis等人,“Impacts of commonsemen handling methods on sperm function (常见精液处理方法对精子功能的影响),”The Journal of Urology, 195 (4), e909 (2016))。为了得出不同GM1定位模式的数目，定位模式的数目对于至少100个精子细胞计数。
为了本申请的目的，“t0”对应于用体外获能条件处理精子细胞之后的小时数，其选自0.1小时-5小时、0.1小时-8小时、0.1-12小时或0.1小时-18小时。
为了本申请的目的，“t1”对应于用体外获能条件处理精子细胞之后的小时数，其大于18小时或大于t0。
为了本申请的目的，图像理解为意指(i) 数字图像；(ii) 操作者通过目镜直接可见的GM1模式；或(iii) 通过流式细胞术识别的GM1模式。
为了本申请的目的，“授精”理解为具有依赖于生殖途径的含义。例如，对于“性交”，授精理解为意指将精子引入雌性的生殖道内。例如，对于“宫颈内授精(ICI)”，授精理解为意指将精子引入雌性的宫颈内。对于“子宫内授精(IUI)”，授精理解为意指将精子引入雌性的子宫内。对于“体外受精(IVF)”，授精理解为意指将精子引入包含卵细胞(卵母细胞)的介质的微滴内时，允许共孵育精子和卵细胞。对于“体外受精之前预先使精子获能”，授精理解为意指当将精子引入包含卵细胞(卵母细胞)的介质的微滴内时，允许共孵育精子和卵细胞。对于“胞浆内精子注射(ICSI)”，授精理解为意指将精子或预获能的精子注射入卵细胞。对于“配子输卵管内转移(GIFT)”，授精理解为意指将精子或预获能的精子和卵细胞注射入雌性的输卵管内。对于“透明带下授精(SUZI)”，授精理解为意指将单个精子细胞或单个预获能的精子细胞注射入透明带正下方。为了本申请的目的，术语“低温贮藏”指冷冻、储存和为了使用融化细胞的整个过程。
如下文所使用的，雄性为哺乳动物。在一个实施方案中，雄性为人。在另一个实施方案中，雄性为非人哺乳动物。在一个这样的实施方案中，雄性为伴侣动物。在另一个实施方案中，雄性为农业动物。在一个这样的实施方案中，雄性为犬科、猫科、马科、牛科、绵羊、山羊、猪、骆驼科或水牛。
在一个实施方案中，本公开内容提供鉴定用于实现哺乳动物受精的途径的方法。将体外获能的精子细胞的第一样品用荧光标记处理。获得一个或多个t0-荧光图像，其中图像显示与t0-荧光标记的体外获能的精子细胞相关的一种或多种GM1定位模式。t0-荧光图像在选自：0.1小时-5小时、0.1小时-8小时、0.1-12小时或0.1小时-18小时的体外获能后时间(t0)获得。对于t0-荧光图像中显示的t0-荧光标记的体外获能的精子细胞，测量顶端顶体(AA) GM1定位模式的数目、顶体质膜(APM) GM1定位模式的数目和GM1定位模式的总数目，以测定t0-[AA GM1定位模式加APM GM1定位模式]的百分比。确定与测量的t0-[AA GM1定位模式加APM GM1定位模式]的百分比相关的能育性状态，其中[AA GM1定位模式加APM GM1定位模式]的参考百分比对应于：大于35 %指示高能育性状态；低于35%一个标准差指示中等能育性状态；低于35%两个或更多个标准偏差指示低能育性状态。比较测量的t0-[AA GM1定位模式和APM GM1定位模式]的百分比与[AA GM1定位模式加APM GM1定位模式]的参考百分比。生殖途径基于能育性状态鉴定以实现受精。
在前述实施方案的一个例子中，其中雄性具有至少正常的精子浓度：(i) 用于高能育性状态的生殖途径选自：性交、宫颈内授精(ICI)、宫颈内授精之前预先使精子获能、子宫内授精(IUI)或子宫内授精之前预先使精子获能；(ii) 用于中等能育性状态的生殖途径选自：宫颈内授精(ICI)、宫颈内授精之前预先使精子获能、子宫内授精(IUI)、子宫内授精之前预先使精子获能或体外受精(IVF)或体外受精之前预先使精子获能；或(iii) 用于低能育性状态的生殖途径选自：体外受精(IVF)、体外受精之前预先使精子获能、胞浆内精子注射(ICSI)、胞浆内精子注射之前预先使精子获能、配子输卵管内转移(GIFT)、配子输卵管内转移之前预先使精子获能、透明带下授精(SUZI)或透明带下授精之前预先使精子获能。
在前述实施方案的另一个例子中，其中雄性具有小于正常的精子浓度：(i) 用于高能育性状态的生殖途径选自：宫颈内授精(ICI)、宫颈内授精之前预先使精子获能、子宫内授精(IUI)或子宫内授精之前预先使精子获能；(ii) 用于中等能育性状态的生殖途径选自：宫颈内授精(ICI)、宫颈内授精之前预先使精子获能、子宫内授精(IUI)或子宫内授精之前预先使精子获能、体外受精(IVF)、体外受精之前预先使精子获能；或(iii) 用于低能育性状态的生殖途径选自：体外受精(IVF)、体外受精之前预先使精子获能、胞浆内精子注射(ICSI)、胞浆内精子注射之前预先使精子获能、配子输卵管内转移(GIFT)、配子输卵管内转移之前预先使精子获能、透明带下授精(SUZI)或透明带下授精之前预先使精子获能。
对于其中精子为预获能的并且生殖途径对应于体外受精之前预先使精子获能的前述实施方案，预获能时期对应于在包含一种或多种获能刺激物的介质中孵育精子，持续授精之前24小时、授精之前18小时、授精之前12小时、授精之前6小时、授精之前4小时、授精之前3小时或授精之前1小时的时期。
对于其中精子为预获能的并且生殖途径对应于胞浆内精子注射(ICSI)的实施方案，授精之前预获能的时期对应于在包含一种或多种获能刺激物的介质中孵育精子，持续授精之前24小时、授精之前18小时、授精之前12小时、授精之前6小时、授精之前4小时、授精之前3小时或授精之前1小时的时期。
对于其中精子为预获能的并且生殖途径对应于配子输卵管内转移(GIFT)的实施方案，授精之前预获能的时期对应于在包含一种或多种获能刺激物的介质中孵育精子，持续授精之前24小时、授精之前18小时、授精之前12小时、授精之前6小时、授精之前4小时、授精之前3小时或授精之前1小时的时期。
对于其中精子为预获能的并且生殖途径对应于透明带下授精(SUZI)的实施方案，授精之前预获能的时期对应于在包含一种或多种获能刺激物的介质中孵育精子，持续授精之前24小时、授精之前18小时、授精之前12小时、授精之前6小时、授精之前4小时、授精之前3小时或授精之前1小时的时期。
在每一前述实施方案的例子中，将体外获能的精子细胞的第二样品用荧光标记处理，其中体外获能的精子细胞的第二样品和体外获能的精子细胞的第一样品与同一雄性相关。获得显示与t1-荧光标记的体外获能的精子细胞相关的一种或多种GM1定位模式的一个或多个t1-荧光图像，其中t1-荧光图像在获能后时间t1获得，其中t1选自大于t0或大于18小时。对于t1-荧光图像中显示的t1-荧光标记的体外获能的精子细胞，测量顶端顶体(AA) GM1定位模式的数目、顶体质膜(APM) GM1定位模式的数目和GM1定位模式的总数目，以测定t1-[AA GM1定位模式加APM GM1定位模式]的百分比。比较t1-[AA GM1定位模式加APM GM1定位模式]的百分比与t0-[AA GM1定位模式加APM GM1定位模式]的百分比，以确定体内获能时间，其选自大于12小时的晚期体内获能时间或小于12小时的标准体内获能时间。t0-[AA GM1定位模式加APM GM1定位模式]的百分比与t1-[AA GM1定位模式加APM GM1定位模式]的百分比的差异对应于：距标准35%大于一个标准差指示大于12小时的晚期体内获能时间；或距标准35%小于一个标准差指示小于12小时的标准体内获能时间。此外当t0-[AA GM1定位模式加APM GM1定位模式]的百分比与t1-[AA GM1定位模式加APM GM1定位模式]的百分比的差异对应于：距标准35%大于一个标准差时，则t1-能育性状态基于测量的t1-[AA GM1定位模式加APM GM1定位模式]百分比与[AA GM1定位模式加APM GM1定位模式]的参考百分比的比较确定；或距标准35%小于一个标准差，则t1-能育性状态基于[AA GM1定位模式加APM GM1定位模式]的参考百分比与测量的t1-[AA GM1定位模式加APM GM1定位模式]百分比或测量的t0-[AAGM1定位模式加APM GM1定位模式]百分比的比较确定。基于雄性的t1-能育性状态和体内获能时间，鉴定授精时期和使用的生殖途径以实现受精。
在前述实施方案的一个例子中，其中雄性具有至少正常的精子浓度和晚期体内获能时间：(i) 用于高t1-能育性状态的生殖途径选自：改变性交时间至晚期体内获能时间、改变宫颈内授精(ICI)时间至晚期体内获能时间、改变子宫内授精(IUI)时间至晚期体内获能时间、宫颈内授精之前预先使精子获能或子宫内授精之前预先使精子获能；(ii) 用于中等t1-能育性状态的生殖途径选自：改变宫颈内授精(ICI)时间至晚期体内获能时间、改变子宫内授精(IUI)时间至晚期体内获能时间、改变体外受精(IVF)时间至晚期体内获能时间、宫颈内授精之前预先使精子获能、子宫内授精(IUI)、子宫内授精之前预先使精子获能或体外受精之前预先使精子获能；或(iii) 用于低t1-能育性状态的生殖途径选自：改变体外受精(IVF)时间至晚期体内获能时间、改变胞浆内精子注射(ICSI)时间至晚期体内获能时间、改变配子输卵管内转移(GIFT)时间至晚期体内获能时间、改变透明带下授精(SUZI)时间至晚期体内获能时间、体外受精之前预先使精子获能、胞浆内精子注射之前预先使精子获能、配子输卵管内转移之前预先使精子获能或透明带下授精之前预先使精子获能。
在前述实施方案的一个例子中，其中雄性具有小于正常的精子浓度和晚期体内获能时间：(i) 用于t1-高能育性状态的生殖途径选自：改变性交时间至晚期体内获能时间、改变宫颈内授精(ICI)时间至晚期体内获能时间、改变子宫内授精(IUI)时间至晚期体内获能时间、宫颈内授精之前预先使精子获能或子宫内授精之前预先使精子获能；(ii) 用于t1-中等能育性状态的生殖途径选自：改变宫颈内授精(ICI)时间至晚期体内获能时间、改变子宫内授精(IUI)时间至晚期体内获能时间、改变体外受精(IVF)时间至晚期体内获能时间、宫颈内授精之前预先使精子获能、子宫内授精之前预先使精子获能或体外受精之前预先使精子获能；或(iii) 用于t1-低能育性状态的生殖途径选自：改变体外受精(IVF)时间至晚期体内获能时间、胞浆内精子注射(ICSI)、改变胞浆内精子注射(ICSI)时间至晚期体内获能时间、改变配子输卵管内转移(GIFT)时间至晚期体内获能时间、改变透明带下授精(SUZI)时间至晚期体内获能时间、体外受精之前预先使精子获能、胞浆内精子注射之前预先使精子获能、配子输卵管内转移之前预先使精子获能或透明带下授精之前预先使精子获能。
在前述实施方案的另一个例子中，其中雄性具有至少正常的精子浓度和标准体内获能时间：(i) 用于高t1-能育性状态的生殖途径选自：性交、宫颈内授精(ICI)、宫颈内授精之前预先使精子获能、子宫内授精(IUI)或子宫内授精之前预先使精子获能；(ii) 用于中等t1-能育性状态的生殖途径选自：宫颈内授精(ICI)、宫颈内授精之前预先使精子获能、子宫内授精(IUI)、子宫内授精之前预先使精子获能或体外受精(IVF)或体外受精之前预先使精子获能；或(iii) 用于低t1-能育性状态的生殖途径选自：体外受精(IVF)、体外受精之前预先使精子获能、胞浆内精子注射(ICSI)、胞浆内精子注射之前预先使精子获能、配子输卵管内转移(GIFT)、配子输卵管内转移之前预先使精子获能、透明带下授精(SUZI)或透明带下授精之前预先使精子获能。
在前述实施方案的另一个例子中，其中雄性具有小于正常的精子浓度和标准体内获能时间：(i) 用于高t1-能育性状态的生殖途径选自：宫颈内授精(ICI)、宫颈内授精之前预先使精子获能、子宫内授精(IUI)或子宫内授精之前预先使精子获能；(ii) 用于中等t1-能育性状态的生殖途径选自：宫颈内授精(ICI)、宫颈内授精之前预先使精子获能、子宫内授精(IUI)或子宫内授精之前预先使精子获能；体外受精(IVF)、体外受精之前预先使精子获能；或(iii) 用于低t1-能育性状态的生殖途径选自：体外受精(IVF)、体外受精之前预先使精子获能、胞浆内精子注射(ICSI)、胞浆内精子注射之前预先使精子获能、配子输卵管内转移(GIFT)、配子输卵管内转移之前预先使精子获能、透明带下授精(SUZI)或透明带下授精之前预先使精子获能。
对于其中精子为预获能的并且生殖途径对应于体外受精之前预先使精子获能的前述实施方案，预获能时期对应于在包含一种或多种获能刺激物的介质中孵育精子，持续授精之前24小时、授精之前18小时、授精之前12小时、授精之前6小时、授精之前4小时、授精之前3小时或授精之前1小时的时期。
对于其中精子为预获能的并且生殖途径对应于胞浆内精子注射(ICSI)的实施方案，授精之前预获能的时期对应于在包含一种或多种获能刺激物的介质中孵育精子，持续授精之前24小时、授精之前18小时、授精之前12小时、授精之前6小时、授精之前4小时、授精之前3小时或授精之前1小时的时期。
对于其中精子为预获能的并且生殖途径对应于配子输卵管内转移(GIFT)的实施方案，授精之前预获能的时期对应于在包含一种或多种获能刺激物的介质中孵育精子，持续授精之前24小时、授精之前18小时、授精之前12小时、授精之前6小时、授精之前4小时、授精之前3小时或授精之前1小时的时期。
对于其中精子为预获能的并且生殖途径对应于透明带下授精(SUZI)的实施方案，授精之前预获能的时期对应于在包含一种或多种获能刺激物的介质中孵育精子，持续授精之前24小时、授精之前18小时、授精之前12小时、授精之前6小时、授精之前4小时、授精之前3小时或授精之前1小时的时期。
在每一前述实施方案的例子中，鉴定步骤还基于下列一个或多个：患者人口统计资料、雌性伴侣的生殖状态、精子浓度、总能动性、前进能动性、精液体积、精液pH、精液粘度和/或精子形态学及其组合。
在每一前述实施方案的例子中，一种以上的GM1定位模式包括AA GM1定位模式、APMGM1定位模式、内衬细胞GM1定位模式、INTER GM1定位模式、PAPM GM1定位模式、AA/PA GM1定位模式、ES GM1定位模式和DIFF GM1定位模式。
在每一前述实施方案的例子中，将精子细胞用获能条件体外处理，持续：至少1小时、至少3小时、至少12小时、至少18小时、至少24小时的获能时期，持续范围为0.5小时-3小时、3小时-12小时、6小时-12小时、3小时-24小时、12小时-24小时或18小时-24小时的获能时期。
在每一前述实施方案的例子中，将体外获能的精子细胞用固定剂处理，持续：至少0.5小时、至少3小时、至少12小时、至少18小时、至少24小时、至少30小时、至少36小时或至少48小时的固定时期，持续范围为0.5小时-3小时、3小时-12小时、6小时-12小时、3小时-18小时、6-18小时、6-24小时、12小时-24小时、18小时-24小时、18-30小时、18-36小时、24-30小时、24-26小时、18-48小时、24-48小时或36-48小时的固定时期。
在每一前述实施方案的例子中，精子细胞经低温贮藏程序处理，并在用获能条件体外处理之前储存。
在一个实施方案中，本公开内容提供鉴定用于实现哺乳动物受精的途径的方法。将t0-体外获能的精子细胞样品用荧光标记处理并将t1-体外获能的精子细胞样品用荧光标记处理。获得一个或多个t0-荧光图像，t0-荧光图像显示与t0-荧光标记的体外获能的精子细胞相关的一种或多种GM1定位模式。并且获得一个或多个t1-荧光图像，t1-荧光显示与t1-荧光标记的体外获能的精子细胞相关的一种或多种GM1定位模式。t0-荧光图像在选自：0.1小时-5小时、0.1小时-8小时、0.1-12小时或0.1小时-18小时的体外获能后时间(t0)获得；t1-荧光图像在获能后时间t1获得，其中t1大于t0。对于t0-荧光图像中显示的t0-荧光标记的体外获能的精子细胞，测量顶端顶体(AA) GM1定位模式的数目、顶体质膜(APM) GM1定位模式的数目和GM1定位模式的总数目，以测定t0-[AA GM1定位模式加APM GM1定位模式]的百分比。并且对于t1-荧光图像中显示的t1-荧光标记的体外获能的精子细胞，测量顶端顶体(AA)GM1定位模式的数目、顶体质膜(APM) GM1定位模式的数目和GM1定位模式的总数目，以测定t1-[AA GM1定位模式加APM GM1定位模式]的百分比。比较t1-[AA GM1定位模式加APM GM1定位模式]的百分比与t0-[AA GM1定位模式加APM GM1定位模式]的百分比，以确定体内获能时间，其选自大于12小时的晚期体内获能时间或12小时或更少的标准体内获能时间。t0-[AA GM1定位模式加APM GM1定位模式]的百分比与t1-[AA GM1定位模式加APM GM1定位模式]的百分比之间的差异对应于：距标准35%大于一个标准差指示大于12小时的晚期体内获能时间；或距标准35%小于一个标准差指示小于12小时的标准体内获能时间。[AA GM1定位模式加APMGM1定位模式]的参考百分比对应于：大于35 %指示高能育性状态，比35%低一个标准差指示中等能育性状态；并且比35%低两个或更多个标准差指示低能育性状态。此外当t0-[AA GM1定位模式加APM GM1定位模式]的百分比与t1-[AA GM1定位模式加APM GM1定位模式]的百分比的差异对应于：距标准35%大于一个标准差时，则t1-能育性状态基于测量的t1-[AA GM1定位模式加APM GM1定位模式]百分比与[AA GM1定位模式加APM GM1定位模式]的参考百分比的比较确定；或距标准35%小于一个标准差，则t1-能育性状态基于[AA GM1定位模式加APM GM1定位模式]的参考百分比与测量的t1-[AA GM1定位模式加APM GM1定位模式]百分比或测量的t0-[AA GM1定位模式加APM GM1定位模式]百分比的比较确定。基于雄性的t1-能育性状态和体内获能时间，鉴定授精时期和使用的生殖途径以实现受精。
在前述实施方案的一个例子中，其中雄性具有至少正常的精子浓度和晚期体内获能时间：(i) 用于高t1-能育性状态的生殖途径选自：改变性交时间至晚期体内获能时间、改变宫颈内授精(ICI)时间至晚期体内获能时间、改变子宫内授精(IUI)时间至晚期体内获能时间、宫颈内授精之前预先使精子获能或子宫内授精之前预先使精子获能；(ii) 用于中等t1-能育性状态的生殖途径选自：改变宫颈内授精(ICI)时间至晚期体内获能时间、改变子宫内授精(IUI)时间至晚期体内获能时间、改变体外受精(IVF)时间至晚期体内获能时间、宫颈内授精之前预先使精子获能、子宫内授精(IUI)、子宫内授精之前预先使精子获能或体外受精之前预先使精子获能；或(iii) 用于低t1-能育性状态的生殖途径选自：改变体外受精(IVF)时间至晚期体内获能时间、改变胞浆内精子注射(ICSI)时间至晚期体内获能时间、改变配子输卵管内转移(GIFT)时间至晚期体内获能时间、改变透明带下授精(SUZI)时间至晚期体内获能时间、体外受精之前预先使精子获能、胞浆内精子注射之前预先使精子获能、配子输卵管内转移之前预先使精子获能或透明带下授精之前预先使精子获能。
在前述实施方案的另一个例子中，其中雄性具有小于正常的精子浓度和晚期体内获能时间：(i) 用于t1-高能育性状态的生殖途径选自：改变性交时间至晚期体内获能时间、改变宫颈内授精(ICI)时间至晚期体内获能时间、改变子宫内授精(IUI)时间至晚期体内获能时间、宫颈内授精(ICI)之前预先使精子获能或子宫内授精(IUI)之前预先使精子获能；(ii) 用于t1-中等能育性状态的生殖途径选自：改变宫颈内授精(ICI)时间至晚期体内获能时间、改变子宫内授精(IUI)时间至晚期体内获能时间、改变体外受精(IVF)时间至晚期体内获能时间、宫颈内授精之前预先使精子获能、子宫内授精之前预先使精子获能或体外受精之前预先使精子获能；或(iii) 用于t1-低能育性状态的生殖途径选自：改变体外受精(IVF)时间至晚期体内获能时间、胞浆内精子注射(ICSI)、改变胞浆内精子注射(ICSI)时间至晚期体内获能时间、改变配子输卵管内转移(GIFT)时间至晚期体内获能时间、改变透明带下授精(SUZI)时间至晚期体内获能时间、体外受精之前预先使精子获能、胞浆内精子注射之前预先使精子获能、配子输卵管内转移之前预先使精子获能或透明带下授精之前预先使精子获能。
在前述实施方案的另一个例子中，其中雄性具有至少正常的精子浓度和标准体内获能时间：(i) 用于高t1-能育性状态的生殖途径选自：性交、宫颈内授精(ICI)、宫颈内授精之前预先使精子获能、子宫内授精(IUI)或子宫内授精之前预先使精子获能；(ii) 用于中等t1-能育性状态的生殖途径选自：宫颈内授精(ICI)、宫颈内授精之前预先使精子获能、子宫内授精(IUI)、子宫内授精之前预先使精子获能或体外受精(IVF)或体外受精之前预先使精子获能；或(iii) 用于低t1-能育性状态的生殖途径选自：体外受精(IVF)、体外受精之前预先使精子获能、胞浆内精子注射(ICSI)、胞浆内精子注射之前预先使精子获能、配子输卵管内转移(GIFT)、配子输卵管内转移之前预先使精子获能、透明带下授精(SUZI)或透明带下授精之前预先使精子获能。
在前述实施方案的另一个例子中，其中雄性具有小于正常的精子浓度和标准体内获能时间：(i) 用于高t1-能育性状态的生殖途径选自：宫颈内授精(ICI)、宫颈内授精之前预先使精子获能、子宫内授精(IUI)或子宫内授精之前预先使精子获能；(ii) 用于中等t1-能育性状态的生殖途径选自：宫颈内授精(ICI)、宫颈内授精之前预先使精子获能、子宫内授精(IUI)或子宫内授精之前预先使精子获能、体外受精(IVF)、体外受精之前预先使精子获能；或(iii) 用于低t1-能育性状态的生殖途径选自：体外受精(IVF)、体外受精之前预先使精子获能、胞浆内精子注射(ICSI)、胞浆内精子注射之前预先使精子获能、配子输卵管内转移(GIFT)、配子输卵管内转移之前预先使精子获能、透明带下授精(SUZI)或透明带下授精之前预先使精子获能。
在每一前述实施方案的例子中，鉴定步骤还基于下列一个或多个：患者人口统计资料、雌性伴侣的生殖状态、精子浓度、总能动性、前进能动性、精液体积、精液pH、精液粘度和/或精子形态学及其组合。
在每一前述实施方案的例子中，一种以上的GM1定位模式包括AA GM1定位模式、APMGM1定位模式、内衬细胞GM1定位模式、INTER GM1定位模式、PAPM GM1定位模式、AA/PA GM1定位模式、ES GM1定位模式和DIFF GM1定位模式。
在每一前述实施方案的例子中，将精子细胞用获能条件体外处理，持续：至少1小时、至少3小时、至少12小时、至少18小时、至少24小时的获能时期，持续范围为0.5小时-3小时、3小时-12小时、6小时-12小时、3小时-24小时、12小时-24小时或18小时-24小时的获能时期。
在每一前述实施方案的例子中，将体外获能的精子细胞用固定剂处理，持续：至少0.5小时、至少3小时、至少12小时、至少18小时、至少24小时、至少30小时、至少36小时或至少48小时的固定时期，持续范围为0.5小时-3小时、3小时-12小时、6小时-12小时、3小时-18小时、6-18小时、6-24小时、12小时-24小时、18小时-24小时、18-30小时、18-36小时、24-30小时、24-26小时、18-48小时、24-48小时或36-48小时的固定时期。
在每一前述实施方案的例子中，精子细胞经低温贮藏程序处理，并在用获能条件体外处理之前储存。
在一个实施方案中，本公开内容提供鉴定用于实现哺乳动物受精的途径的方法。将体外获能的精子细胞用荧光标记处理。产生说明荧光标记处理的体外获能的精子细胞的一种或多种GM1定位模式的数据，所述数据在选自：0.1小时-5小时、0.1小时-8小时、0.1-12小时或0.1小时-18小时的体外获能后时间(t0)，和大于t0的时间(t1)获得。雄性的能育性状态数据然后使用在那些时间的一种或多种GM1定位模式的数据表征。基于雄性的能育性状态数据，鉴定授精时期和使用的生殖途径以实现受精。在一个实施方案中，将精子细胞低温贮藏，并在用获能条件体外处理之前储存。
在一个这样的实施方案中，将精子细胞用获能条件体外处理，持续：至少1小时、至少3小时、至少12小时、至少18小时、至少24小时的获能时期，持续范围为0.5小时-3小时、3小时-12小时、6小时-12小时、3小时-24小时、12小时-24小时或18小时-24小时的获能时期。在一个实施方案中，获能条件包括体外暴露于2-羟丙基-β-环糊精。在另一个实施方案中，非获能条件包括缺乏体外暴露于任何碳酸氢根离子、钙离子和甾醇外流介质例如2-羟丙基-β-环糊精，持续不同的时期。
在一个这样的实施方案中，将体外获能的精子细胞用固定剂处理，持续：至少0.5小时、至少3小时、至少12小时、至少18小时、至少24小时的固定时期，持续范围为0.5小时-3小时、3小时-12小时、6小时-12小时、3小时-24小时、12小时-24小时或18小时-24小时的获能时期。在一个实施方案中，固定剂包括多聚甲醛或戊二醛。
在前述实施方案的例子中，雄性的能育性状态数据通过比较说明体外获能的精子细胞的GM1定位模式的数据与说明具有已知能育性状态的雄性的体外获能的精子细胞的GM1定位模式的参考数据表征。在一个这样的实施方案中，对于预定数目的体外获能的精子细胞，测定每一GM1标记的定位模式的数目。然后计算顶端顶体(AA) GM1定位模式的数目和顶体质膜(APM) GM1定位模式的数目的总和与GM1标记的定位模式的总数目的总和的比率。然后比较GM1定位模式的比率与具有已知能育性状态的雄性的GM1定位模式的参考比率。在这样的实施方案中，一种以上的GM1定位模式对应于顶端顶体(AA) GM1定位模式、顶体质膜(APM) GM1定位模式、内衬细胞GM1定位模式、中间(INTER) GM1定位模式、顶体后质膜(PAPM)GM1定位模式、顶端顶体/顶体后 (AA/PA) GM1定位模式、赤道段(ES) GM1定位模式和弥散性(DIFF) GM1定位模式。
在前述实施方案的另一个例子中，比较雄性的能育性状态数据和与已知授精时期相关的以及与已知生殖途径相关的已知男性能育性状态的数据。在这样的实施方案中，已知的能育性状态包括能育且3小时内精子获能、能育且12小时内精子获能、能育且12-24小时获能和不育。
在前述实施方案中，生殖途径可对应于自然授精途径和人工授精途径，如本领域所已知的。在一个实施方案中，生殖途径包括：性交、宫颈内授精(ICI)、子宫内授精(IUI)、体外受精(IVF)、胞浆内精子注射(ICSI)、体外受精之前预先使精子获能、配子输卵管内转移(GIFT)和透明带下授精(SUZI)。
对于其中生殖途径对应于性交的实施方案，性交的时期相对于雌性的排卵时间确定，如用超声检查可视化的，和/或基于月经周期、使用排卵时间试剂盒、体温变化或相对于一次或多次注射一种或多种设计为诱导卵泡生长和排卵的激素的时间所预测的。例如，授精时期可对应于：排卵时间之前96小时、排卵时间之前72小时、排卵时间之前48小时、排卵时间之前24小时、排卵时间之前12小时、排卵时间之前6小时或排卵时。
对于其中生殖途径对应于ICI或IUI的实施方案，授精时期相对于雌性的排卵时期确定，如用超声检查可视化的，和/或基于月经周期、使用排卵时间试剂盒、体温变化或相对于一次或多次注射一种或多种设计为诱导卵泡生长和排卵的激素的时间所预测的。例如，授精时期可对应于：排卵时间之前96小时、排卵时间之前72小时、排卵时间之前48小时、排卵时间之前24小时、排卵时间之前12小时、排卵时间之前6小时或排卵时。
对于其中生殖途径对应于IVF的实施方案，授精时期对应于确定前核形成之前3小时、确定前核形成之前4小时、确定前核形成之前6小时、确定前核形成之前12小时、确定前核形成之前18小时、确定前核形成之前24小时或确定前核形成之前30小时。
对于其中生殖途径对应于体外受精之前预先使精子获能的实施方案，预获能时期对应于在包含一种或多种获能刺激物的介质中孵育精子，持续授精之前24小时、授精之前18小时、授精之前12小时、授精之前6小时、授精之前4小时、授精之前3小时或授精之前1小时的时期。
对于其中生殖途径对应于胞浆内精子注射(ICSI)的实施方案，授精之前预获能的时期对应于在包含一种或多种获能刺激物的介质中孵育精子，持续授精之前24小时、授精之前18小时、授精之前12小时、授精之前6小时、授精之前4小时、授精之前3小时或授精之前1小时的时期。
对于其中生殖途径对应于配子输卵管内转移(GIFT)的实施方案，授精之前预获能的时期对应于在包含一种或多种获能刺激物的介质中孵育精子，持续授精之前24小时、授精之前18小时、授精之前12小时、授精之前6小时、授精之前4小时、授精之前3小时或授精之前1小时的时期。
对于其中生殖途径对应于透明带下授精(SUZI)的实施方案，授精之前预获能的时期对应于在包含一种或多种获能刺激物的介质中孵育精子，持续授精之前24小时、授精之前18小时、授精之前12小时、授精之前6小时、授精之前4小时、授精之前3小时或授精之前1小时的时期。
在前述实施方案的一些例子中，其它参数可用于鉴定授精时期和生殖途径。其它参数可包括下列一个或多个：患者人口统计资料、雌性伴侣的生殖状态、精子浓度、总能动性、前进能动性、精液体积、精液pH、精液粘度和/或精子形态学及其组合。
在另一个实施方案中，本公开内容提供鉴定用于实现哺乳动物受精的途径的方法。将体外获能的精子细胞用荧光标记处理。获得荧光标记的体外获能的精子细胞的一个或多个荧光图像。在用获能条件体外处理精子细胞不同的时期后，测量荧光标记的体外获能的精子样品的Cap-Score值。比较Cap-Score值和与已知能育性状态的雄性相关的在那些时间的参考Cap-Score值。基于Cap-Score值，鉴定使用的授精时期和生殖途径以实现受精。
在一个这样的实施方案中，将精子细胞用获能条件体外处理，持续：至少1小时、至少3小时、至少12小时、至少18小时、至少24小时的获能时期，持续范围为0.5小时-3小时、3小时-12小时、6小时-12小时、3小时-24小时、12小时-24小时或18小时-24小时的获能时期。在另一个实施方案中，非获能条件包括缺乏体外暴露于任何碳酸氢根离子、钙离子和甾醇外流介质例如2-羟丙基-β-环糊精持续不同的时期。
在一个其它的这样的实施方案中，将体外获能的精子细胞用固定剂处理，持续：至少0.5小时、至少3小时、至少12小时、至少18小时、至少24小时、至少30小时、至少36小时或至少48小时的固定时期，持续范围为0.5小时-3小时、3小时-12小时、6小时-12小时、3小时-18小时、6-18小时、6-24小时、12小时-24小时、18小时-24小时、18-30小时、18-36小时、24-30小时、24-26小时、18-48小时、24-48小时或36-48小时的固定时期。在一个实施方案中，固定剂包括多聚甲醛或戊二醛。
在前述实施方案的一个例子中，比较Cap-Score值和与已知授精时期相关的以及与已知生殖途径相关的已知男性能育性状态的参考Cap-Score值。在这样的实施方案中，已知的能育性状态包括：能育且3小时内精子获能、能育且12小时内精子获能、能育且12-24小时获能和不育。
在前述实施方案的例子中，Cap-Score对应于AA GM1定位模式的数目和APM GM1定位模式的数目的总和与GM1标记的定位模式的总数目的总和的比率，其每一对于体外获能的精子样品测定。在这样的实施方案中，一种或多种GM1标记的定位模式包括AA GM1定位模式、APM GM1定位模式、内衬细胞GM1定位模式、INTER GM1定位模式、PAPM GM1定位模式、AA/PA GM1定位模式、ES GM1定位模式和DIFF GM1定位模式。
在前述实施方案中，生殖途径可对应于自然授精途径和人工授精途径，如本领域所已知的。在一个实施方案中，生殖途径包括：性交、宫颈内授精(ICI)、子宫内授精(IUI)、体外受精(IVF)、胞浆内精子注射(ICSI)、体外受精之前预先使精子获能、配子输卵管内转移(GIFT)和透明带下授精(SUZI)。
对于其中生殖途径对应于性交的实施方案，性交的时期相对于雌性的排卵时间确定，如用超声检查可视化的，和/或基于月经周期、使用排卵时间试剂盒、体温变化或相对于一次或多次注射一种或多种设计为诱导卵泡生长和排卵的激素的时间所预测的。例如，授精时期可对应于：排卵时间之前96小时、排卵时间之前72小时、排卵时间之前48小时、排卵时间之前24小时、排卵时间之前12小时、排卵时间之前6小时或排卵时。
对于其中生殖途径对应于ICI或IUI的实施方案，授精时期相对于雌性的排卵时期确定，如用超声检查可视化的，和/或基于月经周期、使用排卵时间试剂盒、体温变化或相对于一次或多次注射一种或多种设计为诱导卵泡生长和排卵的激素的时间所预测的。例如，授精时期可对应于：排卵时间之前96小时、排卵时间之前72小时、排卵时间之前48小时、排卵时间之前24小时、排卵时间之前12小时、排卵时间之前6小时或排卵时。
对于其中生殖途径对应于IVF的实施方案，授精时期对应于确定前核形成之前3小时、确定前核形成之前4小时、确定前核形成之前6小时、确定前核形成之前12小时、确定前核形成之前18小时、确定前核形成之前24小时或确定前核形成之前30小时。
对于其中生殖途径对应于体外受精之前预先使精子获能的实施方案，预获能时期对应于在包含一种或多种获能刺激物的介质中孵育精子，持续授精之前24小时、授精之前18小时、授精之前12小时、授精之前6小时、授精之前4小时、授精之前3小时或授精之前1小时的时期。
对于其中生殖途径对应于胞浆内精子注射(ICSI)的实施方案，授精之前预获能的时期对应于在包含一种或多种获能刺激物的介质中孵育精子，持续授精之前24小时、授精之前18小时、授精之前12小时、授精之前6小时、授精之前4小时、授精之前3小时或授精之前1小时的时期。
对于其中生殖途径对应于配子输卵管内转移(“GIFT”)的实施方案，授精之前预获能的时期对应于在包含一种或多种获能刺激物的介质中孵育精子，持续授精之前24小时、授精之前18小时、授精之前12小时、授精之前6小时、授精之前4小时、授精之前3小时或授精之前1小时的时期。
对于其中生殖途径对应于透明带下授精(SUZI)的实施方案，授精之前预获能的时期对应于在包含一种或多种获能刺激物的介质中孵育精子，持续授精之前24小时、授精之前18小时、授精之前12小时、授精之前6小时、授精之前4小时、授精之前3小时或授精之前1小时的时期。
在又一个实施方案中，本公开内容提供鉴定用于实现成功的哺乳动物妊娠的适当机制的方法。将体外获能的精子细胞用荧光标记处理。获得荧光标记的体外获能的精子细胞的一个或多个荧光图像。将精子细胞用获能条件体外处理不同的时期后，测量荧光标记的体外获能的精子样品的Cap-Score值。比较Cap-Score值和与能育雄性相关的参考Cap-Score值。基于Cap-Score值确定实现成功妊娠的适当机制。在一个实施方案中，确定还基于下列一个或多个：患者人口统计资料、雌性伴侣的生殖状态、精子浓度、总能动性、前进能动性、精液体积、精液pH、精液粘度和/或精子形态学。
在任何前述实施方案的例子中，精液样品使用具有足够直径尺寸的孔口的宽口吸管处理以防止剪切精子膜，并且精液样品不使用可损伤精子膜的试剂处理。在一个这样的实施方案中，将处理的精液样品暴露于获能介质、固定剂和用于测定GM1定位模式的试剂。
在一个实施方案中，可损伤精子膜的试剂选自：(i) 蛋白酶；(ii) 核酸酶；(iii)溶粘蛋白剂；(iv) 脂肪酶；(v) 酯酶和(vi) 糖苷水解酶类。可类似地干扰精子响应获能刺激物的能力的化合物的实例包括：(i) 蛋白酶，包括但不限于，糜蛋白酶、胰蛋白酶、胶原酶、菠萝蛋白酶；(ii) 核酸酶，包括但不限于，链道酶、HindIII、EcoRI；(iii) 溶粘蛋白剂，包括但不限于，厄多司坦(Erdostein)、乙酰半胱氨酸、愈创木酚甘油醚(Guiafenesin)；(iv) 脂肪酶，包括但不限于，磷脂酶A1、磷脂酶C、脂蛋白脂肪酶；(v) 酯酶，包括但不限于，胆碱酯酶、硫酯酶、碱性磷酸酶；和(vi) 糖苷水解酶类，包括但不限于，α淀粉酶、β半乳糖苷酶、透明质酸酶、神经氨酸酶(neuorminodase)和溶菌酶。
在任何前述实施方案的例子中，测定一种或多种GM1标记的定位模式的群体大小，以致于关于Cap-Score的百分比变化在个体内最小化。在一些这样的实施方案中，一种或多种GM1标记的定位模式包括AA GM1定位模式、APM GM1定位模式、内衬细胞GM1定位模式、中间(INTER) GM1定位模式、顶体后质膜(PAPM) GM1定位模式、顶端顶体/顶体后 (AA/PA) GM1定位模式、赤道段(ES) GM1定位模式和弥散性(DIFF) GM1定位模式。
实施例
下列实施例进一步描述和证明本发明范围内的说明性实施方案。实施例仅为了说明给出，不应解释为对本发明的限制，因为不脱离其精神和范围时的许多变更是可能的。
实施例1
精子操作方法
评估了三种减少粘度的常见方法。将射精液：1) 孵育0.25、1.25或2小时，2) 用改良的人输卵管液(Irvine Scientific; Santa Anna, CA) 1:1稀释，然后通过宽口移液管(“WOTP”)或巴斯德吸管(“PP”)，3) 用糜蛋白酶(“chymo”)酶促消化。初步研究显示通过皮下针头负面影响能动性和膜完整性并且未进一步研究。液化后，将样品洗涤并在获能(CAP)和非获能(NC)条件下孵育。Cap-Score值通过荧光显微术按照上述计算获得。
Cap-Score™的可靠性和重现性
将来自同意的男性的精液样品液化之后，将精子洗涤、孵育、固定，然后通过荧光显微术评估GM1定位模式。对一个样品内评分的精确度和读取者之间评分同一样品的变异二者均进行评估。使用Microsoft Excel (2013)进行利用不等方差的Student's t检验。
Cap-Score与传统精液分析参数的相关性
将来自同意的患者的精液样品液化、洗涤并在非获能和获能两种条件下孵育。精液分析根据WHO指南进行。Cap-Score值通过荧光显微术获得。统计分析使用MicrosoftExcel (2013)和XLSTAT (2015)进行。
对于已证明能育性的雄性与待评估能育性的雄性使用Cap-Score™评估获能
测定来自两个组的同意男性的Cap-Score值：1) 已知能育性(怀孕的伴侣或为小于3岁的儿童的父亲)，和2) 寻求其第一次精液分析的患者。液化之后，将精子洗涤并将3百万在非获能(NC)和获能(CAP)条件下孵育3小时。将精子固定过夜并通过荧光显微术评估GM1定位模式。
结果
液化时间、稀释和吸液不改变Cap-Score值。对照(仅孵育)、WOTP和PP处理的样品具有Cap-Score值41±4、40±5和41±6 (n=5; CAP)。对获能刺激物的响应的降低在样品使用chymo液化时观察到(P=0.03)。对照样品具有Cap-Score值40±6 (n=5; CAP)，而酶促液化的样品具有Cap-Score值31±4 (n=5; CAP)。由于chymo为可切割膜蛋白的蛋白酶，因此进行检查以确定减少的Cap-Score值是否由标记的变更引起。比较未暴露于获能刺激物的样品，未观察到差异。对照和酶促液化的样品具有Cap-Score值22±4和21±5 (n=5; NC)。这些数据支持以下观点：用chymo处理精液(尽管在临床实践中广泛使用)可抑制精子响应获能刺激物的能力。
可类似地干扰精子响应获能刺激物的能力的化合物的类别包括：(i) 蛋白酶，包括但不限于，糜蛋白酶、胰蛋白酶、胶原酶、菠萝蛋白酶；(ii) 核酸酶，包括但不限于，链道酶、HindIII、EcoRI；(iii) 溶粘蛋白剂，包括但不限于，厄多司坦(Erdostein)、乙酰半胱氨酸、愈创木酚甘油醚(Guiafenesin)；(iv) 脂肪酶，包括但不限于，磷脂酶A1、磷脂酶C、脂蛋白脂肪酶；(v) 酯酶，包括但不限于，胆碱酯酶、硫酯酶、碱性磷酸酶；和(vi) 糖苷水解酶类，包括但不限于，α淀粉酶、β半乳糖苷酶、透明质酸酶、神经氨酸酶(neuorminodase)和溶菌酶。
多达2小时的液化时间和使用WOTP和/或PP机械液化不影响获能。相反，使用酶例如chymo减少精子获能的能力，如通过Cap-Score™检验所测量的。这些结果证明知道精液处理方法如何影响精子功能的重要性。
精确度通过比较当评估50、100、150和200个精子时Cap-Score值的百分比变化(%Δ=(y2-y1)/y2)评估。对于每一次加入50个精子，观察到11、6和5%的值变化(n≥23)。为保守起见，Cap-Score值通过计数至少150个细胞的GM1定位模式测定。为了评估读取者内和之间的变异，8个包含多达5,000个精子的大图像文件通过组合从多个视野获取的图像产生。训练两个不同的读取者，其通过随机重新取样每一图像20次、每次计数150个细胞测定Cap-Score值。当评分同一样品时，个体读取者报告三(3)个Cap-Score单元的平均SD。当评分同一样品时读取者之间的差异在0.00-1.52范围内，对于任何给定样品读取者之间的平均差异为一(1)。对于多重比较应用Bonferroni校正，对于任何图像文件，读取者之间未观察到差异(p-值范围0.02-0.99)。
Cap-Score不受液化时间或用WOTP或PP机械液化影响(n=5)，尽管洗涤和孵育后，经历两(2)小时液化或通过PP后的样品显示更大的能动性下降(p=0.02, 3E-3)。使用针头损伤精子，并且未进一步调查。用chymo液化减少CAP的Cap-Score (p=0.03)，但NC样品不减少(p=0.74)。用chymo孵育的样品(n=5; 3mg/ml)由于膜损伤不能评分，但在NC条件下显示能动性增加(p=9E-4)。
实施例2
本实施例使用能育(组1，怀孕或新近的父亲)和潜在的低能育性/不育男性(组2，怀疑能育性的男性)之间的组比较进行。还探究Cap-Score与传统精液量度之间的关系。
所有研究由WIRB (20152233)批准。将精液样品液化、洗涤和在非获能以及获能条件下孵育。将精子固定过夜，Cap-Score通过荧光显微术测定。精液质量量度根据WHO评估。T-检验、ANOVA和相关性分析使用Microsoft Excel (2013)和XLSTAT进行。
组1的平均Cap-Score为35.3 (SD= 7.7%; n=76个供体; 187个收集)。Cap-Score对于组2较低(p=1.0E-03)，33.6% (41/122)具有比组1的平均值低一(1)个SD以下的Cap-Score，相对于预期的16%。对于组2，Cao-Score和形态学(p=0.28)、能动性(p=0.14)或浓度(p=0.67)之间未观察到相关性。组2中93.4% (114/122)的男性显示正常能动性，而其中的30.7% (35/114)具有比平均值低一(1)个SD以下的Cap-Score。类似地，122个男性中的101个(82.7%)显示正常浓度，而32.6% (33/101)具有比平均值低一(1)个SD以下的Cap-Score。这些结果显示获能缺陷在受孕困难的男性中常见，Cap-Score提供补充精液分析的功能数据。
精子获能的能力在能育男性和受孕困难的那些之间不同。由于获能是受精所需的，因此Cap-Score可提供标准精液分析的重要功能补充，并且可帮助选择最适合的能育性治疗。
精液质量的常见量度是主观的，可在读取者之内和之中变动，使雄性能育性的评估富有挑战。Cap-Score™检验评估精子获能的能力，其为雄性能育性所必需的。本文呈现的数据显示Cap-Score™检验在读取者之内和之间是高度可重现和可靠的，当企图诊断雄性不育时这是关键考虑。
使用来自41个能育男性的Cap-Score均值(µ=39)和SD (σ=7)估计建立稳健的能育的获能概况所需的已知能育男性的数目。对于功效分析，均值的可接受范围设置为3%，双尾t检验设置为p<0.01水平，且应用检测如此大的差异的概率为90%。结果提示有效标准可用≥85个个体建立。初步的正常可育标准使用来自41个独特供体的125个观察值建立。Cap-Score值按供体平均，然后转换为z-分数((X-μ)/σ; X=观察值, µ=39; σ=7)。这将µ转换为0，σ转换为1，转换值代表距µ (均值)以σ (S.D.)为单位的距离。正常的能育标准针对来自寻求能育性检查的93个男性的Cap-Score值检验。该组评分显著低于能育的群体(p=1.6E-5)，27和38%具有z-分数≤-2和在-1与-2之间。仅35%得分在均值附近或以上。这些数据提示，与能育男性相比，许多寻求能育性检查的男性具有获能缺陷。
实施例3
实施例1和2中使用的程序在实施例3中使用。
经典的精液分析提供关于样品使卵受精的能力的很少信息。获能为受精所需，并且可使用GM1定位评估。来自两个男性组的Cap-Score值的比较显示其获能能力的显著差异。稳健的获能概况可定义并用于鉴定异常。显著地，33%的怀疑其能育性的男性具有z-分数≤-1，相对于期望的结果16%。组合Cap-Score™检验与传统分析在诊断男性不育中证明是有价值的。
分析来自求助于不育专家的122个男性的样品，其Cap-Score在13-52%范围内。进行方差分析以比较Cap-Score值与精子形态学。将样品分类为具有0、1、2、3或≥ 4%正常形式(分数≥ 4%认为正常，WHO)，并比较组之间的平均Cap-Score。Cap-Score值和形态学之间未观察到相关性(P=0.67)。接着，使用皮尔逊积矩相关系数比较精子浓度(范围3x106 -210x106/mL)与Cap-Score值，未发现联系(r=0.01, P=0.90)。最后，比较Cap-Score值与总%能动性(范围15-80%)，两个量度确定为独立的(r=0.14 P=0.21)。按照WHO标准分类为正常的多个供体具有Cap-Score值低于正常均值超过两(2)个SD，支持以下观点：即使正常外观的精子仍可具有功能异常。
传统精液分析仅鉴定50%的雄性不育病例。本研究显示Cap-Score值与标准精液分析参数之间几乎无相关性。由于获能是受精所必需的，将Cap-Score检验加入传统精液评估能够鉴定特发性不育病例，并且帮助临床医生为夫妻建议最适当的治疗。
本文呈现的数据证明雄性的Cap-Score值可提供用于实现成功的哺乳动物妊娠的适当机制的指南，包括推荐的辅助生殖技术例如体外受精(IVF)或胞浆内精子注射(ICSI)。雄性可为人或非人哺乳动物。可考虑Cap-Score值组合精液分析的其它组分，包括浓度、总能动性、前进能动性、体积、pH、粘度和/或形态学。例如，对于具有相同Cap-Score的两个雄性，如果其精子计数或精子能动性不同，推荐的辅助生殖技术可能不同。另外，雌性伴侣的能育性状态或生殖健康也会被临床医生考虑。
实施例4
将来自同意的男性的精液样品液化、洗涤，将等分试样在非获能(NC)或获能(CAP)条件下孵育。同意的男性包括基于怀孕伴侣或为新近的生物学父亲的雄性而分类为能育的男性。同意的男性还包括寻求能育性检查的男性。获能条件包括体外暴露于2-羟丙基-β-环糊精。非获能条件包括缺乏体外暴露于任何碳酸氢根离子、钙离子和甾醇外流介质例如2-羟丙基-β-环糊精持续不同的时期。然后将体外获能的精子和体外非获能的精子在固定剂例如多聚甲醛或戊二醛中固定。然后将固定的体外获能的精子和体外非获能的精子用荧光标记的霍乱毒素b亚基标记。
对于一个数据集，将精子样品在获能或非获能条件中孵育三(3)个小时、固定、标记，然后分析(“第0天”)。对于第二个数据集，将精子样品在获能或非获能条件中孵育三(3)个小时、固定过夜、标记，然后分析(“第1天”)。对于第三个数据集，将精子样品在获能或非获能条件中孵育24小时、固定、标记，然后分析(“24hrCap”)。精子获能使用GM1定位(Cap-ScoreTM)评估。
将来自36个能育男性的102个精子样品在第0天和第1天评估。第0天和第1天之间，在81% (83/102)的精子样品中观察到Cap-Score增加，44%的精子样品(45/102)具有超过一(1)个标准差(7%)的Cap-Score增加。
来自寻求能育性治疗的17个男性的精子样品在第0天和第1天评估。第0天和第1天之间，在29% (5/17)中观察到Cap-Score增加，其中Cap-Score增加超过一(1)个标准差(7%)。
为了确定该Cap-Score变化是生理学的还是在固定剂中过夜的假象，将来自九(9)个能育男性的精液样品在第0天、第1天和在获能或非获能介质中体外孵育24小时然后固定后分析。所有体外非获能的样品等同(Cap-Score 19±2、23±2和20±1%)，并且与体外获能的样品(Cap-Score分别为28±1、34±2和31±2%)不同。第1天的Cap-Score显著大于第0天的Cap-Score (p=0.03)。然而，在固定剂中(第1天)或在获能介质中(24hrCap)孵育过夜的体外获能的样品的Cap-Score相同(p=0.33)。
与先前的文献一致，这些数据显示获能中涉及的精子膜变化在某些固定剂中仍随时间发生。这些数据提示精子在不同的射精液中在不同的时间实现获能。为了查看这对于个体是否可重现，将来自25个能育男性的91个样品分类为早期或晚期获能者(第1天-第0天>7)。供体内变化的平均一致性为76%，显示获能时间在男性内高度一致。
实施例5
使用来自8个可育男性(怀孕的伴侣或新近的父亲)的精液样品检查低温贮藏对获能时间的作用。将液化的射精液分开；一半立即处理(新鲜)，其它在含有甘油的精子冷冻保存剂(test yolk buffer)(Irvine Scientific)中低温贮藏。随后将低温贮藏的样品融化和处理(CryoT)。将新鲜和CryoT等分试样洗涤，然后在非获能(NC)和获能(CAP)条件下孵育3小时。获能时间在男性之间不同，并且可通过比较第1天(在促进/允许获能的条件下孵育过夜后)与第0天(3小时孵育后分析)的Cap-Score差异评估。
当与新鲜比较时，Cap-Score在NC CryoT处理中在第0天和第1天都增加。第0天存在155%增加((新鲜 - CryoT)/新鲜; 11±1.6% vs 28±2.4%; n=7; p=0.00)，第1天存在79%增加(19±2.6% vs 34±2.7%; n=8; p=0.00)。相反，CAP处理的Cap-Score在第0天(26±3.1% vs 30±2.5%; n=7; p=0.31)和第1天(34±2.9% vs 34±1.7%; n=8; p=0.86)保持相同。对于CryoT样品平均融化后和洗涤后能动性为27±3.5%和31±8.6%，提示合理的融化后活力。当比较第0天和第1天的样品时，对于NC (10±2.2% vs 8±2.7%)或CAP处理(8±3.8% vs 5±2.3%)，新鲜和CryoT样品之间未观察到获能时间差异(第1天-第0天；n=7)。
实施例6
用于标本收集的所有程序由WIRB批准 (Protocol #20152233)。精液样品从同意的男性通过手淫在性欲节制最少2天且最多5天后收集。具有小于10x106个能动的精子细胞的那些样品从本研究丢弃。
将射精液在37℃液化至少15分钟，并且不超过两(2)小时。液化之后，将精子通过Enhance S-Plus Cell Isolation Media (Vitrolife, 参考: 15232 ESP-100-90%)在300xg离心10分钟从精浆移除。收集细胞，重悬在约4ml改良的人输卵管液介质(mHTF;Irvine Scientific; 参考90126)中，在600xg沉淀10分钟。将精子重悬在具有和不具获能刺激物的mHTF中，孵育三(3)小时。孵育之后，将样品在标记之前如所描述的(Selvaraj V,等人, “Segregation of micron‐scale membrane sub‐domains in live murine sperm(活鼠精子中微米级膜亚结构域的分离),” J Cell Physiol. 206: 636-46 (2006))用多聚甲醛(Electron Microscopy Sciences; Hatfield, PA)固定至少30分钟。
将样品用2 µg/mL缀合Alexa Fluor 488 (CTB; Thermo Fisher: C34775)的霍乱毒素B标记。10分钟之后，将5 µl标记的精子放在显微镜载玻片上，用盖玻片覆盖并移动至成像台。
成像台由Nikon Eclipse NI-E显微镜组成，配备有：CFI60 Plan ApochromatLambda 40x物镜, C-FL AT GFP/FITC长通滤波器组, Hamamatsu ORCA-Flash 4.0照相机,H101F - ProScan III Open Frame Upright Motorized H101F Flat Top显微镜载物台和运行NIS Elements软件(Nikon; Melville, NY)的64位成像工作台。这些系统编程为自动捕获包含多达5,000个精子的15x15拼接图像组。
Cap-Score SFT检测和分析神经节苷脂GM1的定位模式。训练两个独立的读取者以鉴定与人精子获能相关的GM1定位模式。测定样品内经历获能的精子的比例并报告为Cap-Score。
功效分析使用G*power (Faul等人, “G* Power 3: A flexible statisticalpower analysis program for the social, behavioral, and biomedical sciences(G* Power 3：用于社会、行为和生物医学科学的灵活的统计功效分析),” Behav Res Methods. 39: 175-91 (2007))进行。Student's t-检验使用Microsoft Excel (2013)进行。线性回归和同方差性Bartlett's检验在XLSTAT 版本2015.5.01.22912中进行。
结果
测定Cap-Score精确度的第一步是为了定义每样品计数的细胞数目。一般而言，随着计数的细胞数目的增加，精确度增加。然而，在一些点，计数额外的细胞变得冗余，因为Cap-Score将不会随额外的观察增加。为了鉴定计数额外的细胞不必要的点，评估当50、100、150和200个精子时Cap-Score的百分比变化(表1)。
表1：随着计数的精子数目的增加Cap-Score的百分比变化
Figure DEST_PATH_IMAGE001
与当计数100或150个以及150或200个精子时的百分比变化相比，当计数50或100个精子时Cap-Score的百分比变化较大。这些观察结果支持以下观点：Cap-Score精确度通过计数超过100个精子仅适度改善。然而，当计数50或100以及150或200时百分比变化的95%置信区间不重叠，提示当计数至少150个细胞时百分比变化的显著减少。为保守起见，Cap-Score通过计数至少150个细胞的GM1定位模式测定。
为了进一步探究Cap-Score可靠性和评估其作为精液质量的客观量度的潜能，调查其测量值以确定其在个体读取者内的准确度。准确度定义为测量值与真实值的接近程度。未知群体的真实值可通过其集中趋势或均值估计。可基于其分散性或精确度的倒数判断一个数据集是否具有强或弱集中趋势(JCGM/WG2 2008)。即随着分散性增加，精确度降低。标准差(SD)和变异系数(CoV)测量样品内分散性的量。接近零(0)的标准差表明数据点倾向于紧密聚集在均值，而高标准差指示数据点散开。类似地，CoV代表分散性相对于均值的量(CoV=SD/均值)，其可用于比较一个数据系列与另一个的变异程度，即使彼此均值大不相同。
评估读取者内的Cap-Score准确度之前，估计每一读取者取样的图像数目。为此，两个精液供体组基于比具有假定能育性的男性群体(怀孕的妻子或小于3岁的儿童)的平均Cap-Score低(一）个SD的截断定义。具有“较低Cap-Score”的组的平均Cap-Score为27，而“假定能育的”组为40。每组的标准差分别为5.2和4.9。使用双尾检验的功效分析以p<0.05和p<0.01水平进行，如果存在，检测如此大差异的概率为90% (1−beta=0.90)。这些分析的结果表明样品10和14个图像(每组5和7)应分别取样。为保守起见，产生各自在“较低Cap-Score”和“假定能育”组的10个图像。每组取样该数目的图像确保各自被充分审查以鉴定重现性的任何差异，其由于低或高值Cap-Score可能发生。
为了评估Cap-Score SFT的准确度，两个不同的读取者通过从“低Cap-Score”和“假定能育”组随机重新取样10个图像(每一包含多达5,000个精子)测定Cap-Score，并且每一读取者重新取样20次。SD和CoV在每一图像基础上对于每一读取者计算。图像和读取者中的平均SD为3 (图1A)，平均CoV为13% (图1B)。SD和CoV二者均显示与Cap-Score的线性关系。因此，尽管存在与读出较高Cap-Score相关的较大分散性，这显示是由较大的Cap-Score量值引起。这些数据符合高程度的准确度，因为当同一精子群体由同一或不同读取者随机重新取样时，Cap-Score值紧密聚集在真实值。由于这些方差和(或)分散性的量度小并且稳定，其显示读取者内高程度的Cap-Score重现性。
一般而言，分布可使用其均值和方差描述。均值指示分布的位置，而方差描述数据的分散程度。可设想两种分布，其均值相同，而方差不同。例如，一种分布可能类似于标准的钟型，而另一种更扁平，具有更多极值。为了证明读取者之间相似的Cap-Score分布，对于“低Cap-Score”和“假定可育”组的每一个，获得10个拼接图像。两个不同的读取者通过随机重新取样每一图像20次确定Cap-Score。由于每一图像文件包含比所取样的多几个量级的精子，每一次随机重新取样代表来自个体射精液内不同的细胞子样品。
对于20个不同的图像，读取者之间观察到平均Cap-Score的平均差异为一(1) (图3)。当应用Bonferroni校正时，未观察到可辨别的差异。类似地，Cap-Score方差在读取者之间无差异(图3)。这些数据支持以下观点：Cap-Score在读取者之间可重现，因为当重新取样同一精子群体时独立的读取者获得相似的Cap-Score分布。总之，这些数据提供强烈的证据，表明Cap-Score SFT在读取者内和之间高度可重现和可靠，这在试图评估雄性生殖适合度时为关键考虑。
当前研究中呈现的数据证明Cap-Score SFT在读取者内和之间高度可重现和可靠。获得的数据和图像文件应用作实验室内部和之间在评估Cap-Score中的连续质量控制(QC)和质量保证(QA)的基础。例如，20个图像文件中的两个，“低Cap-Score”和“假定可育”组各一个，可随机选择并每天评分以证明读取者每日读取Cap-Score的能力。如果获得距建立的均值超出可接受的范围(Westgard等人, “A multi-rule Shewhart chart forquality control in clinical chemistry (用于临床化学中质量控制的多规则Shewhart图表),” Clin Chem. 27: 493-50 (1981)的值，可请教实验室主任以补救。这些数据也可用于随时间追踪个体读取者和鉴定Cap-Score测定的潜在变化。类似地，随着新人员和(或)实验室受训练和合并入读取轮换，其读取能力可通过评分多个图像文件和比较其Cap-Score与建立的值评估。这种方法将确保实验室内和之间相当的数据。只有通过持续的内部和外部QA和QC，才能维持高标准的精子功能评估。
雄性能育性诊断过去受到不能评估精子功能，即受精的能力困扰(Oehninger等人, “Sperm functional tests, (精子功能检验)” Fertil Steril. 102: 1528-33(2014); Wang等人, “Limitations of semen analysis as a test of male fertilityand anticipated needs from newer tests (精液分析作为雄性能育性检验的限制和对新检验的预期需求),” Fertil Steril. 102: 1502-07 (2014))。这种诊断能力将为传统精液评估的描述性评估提供功能补充。鉴定具有受精能力缺陷的精子可允许更特异性地诊断现在分类为特应性不育的那些。更大的实践重要性是，该信息可使得临床医生能够帮助为夫妻建议最合适的ART形式以实现妊娠。为了实现先前指定的目标，已经建议了许多精子功能测定(例如，仓鼠透明带穿透测定(Barros等人, “Human Sperm Penetration intoZona‐Free Hamster Oocytes as a Test to Evaluate the Sperm Fertilizing Ability(人精子穿透入无透明带的仓鼠卵母细胞作为评估精子受精能力的检验),” Andrologia. 11: 197-210 (1979); Rogers等人, “Analysis of human spermatozoal fertilizingability using zona-free ova (使用无透明带的卵子分析人精子的受精能力),” Fertil Steril. 32: 664-70 )1979)、精子-ZP结合检验(Liu等人, “Clinical application ofsperm-oocyte interaction tests in in vitro fertilization–embryo transfer andintracytoplasmic sperm injection programs (精子-卵母细胞相互作用检验在体外受精中的临床应用—胚胎转移和胞浆内精子注射程序),” Fertil Steril. 82: 1251-63(2004)和宫颈粘液穿透测定(Alexander, “Evaluation of male infertility with anin vitro cervical mucus penetration test (用体外宫颈粘液穿透检验评估雄性的不育性),” Fertil Steril. 36: 201-8 (1981); Menge等人, “Interrelationships amongsemen characteristics, antisperm antibodies, and cervical mucus penetrationassays in infertile human couples (精液特征、抗精子抗体和宫颈粘液穿透测定在不育的人类夫妻中的相互关系).” Fertil Steril. 51: 486-92 (1989); Eggert-Kruse等人, “Prognostic value of in vitro sperm penetration into hormonallystandardized human cervical mucus (体外精子穿透入激素标准化的人宫颈粘液的预后价值),” Fertil Steril. 51: 317-23 (1989)。然而，其使用受到很难以逻辑上实用的方式获得需要的材料限制。为了填充当前的空白，开发了诊断工具以评估精子经历使卵母细胞受精所需的生理学变化的能力。
本公开内容可以以其它具体形式实现而不脱离本发明的精神或基本属性。因此，应参考所附的权利要求而不是前述说明书，作为指示本公开内容的范围。尽管前述说明书指向本公开内容的优选的实施方案，应指出其它变更和修饰将会对本领域技术人员显而易见，并且可不脱离本公开内容的精神或范围进行。

Claims (52)

1.获能介质在诊断工具的制造中的用途，所述诊断工具用于鉴定用于实现哺乳动物受精的途径，包括以下步骤：
用获能条件处理体外精子细胞；
用荧光标记处理体外获能的精子细胞的第一样品；
获得一个或多个t0-荧光图像，其显示与t0-荧光标记的体外获能的精子细胞有关的一种或多种GM1定位模式，所述t0-荧光图像在选自0.1小时-5小时、0.1小时-8小时、0.1小时-12小时或0.1小时-18小时的体外获能后时间(t0)获得；
对于t0-荧光图像中显示的t0-荧光标记的体外获能的精子细胞，测量顶端顶体(AA) GM1定位模式的数目、顶体质膜(APM) GM1定位模式的数目和GM1定位模式的总数目以测定t0-[AAGM1定位模式加APM GM1定位模式]的百分比；
确定与测量的t0-[AA GM1定位模式加APM GM1定位模式]的百分比相关的能育性状态；
其中[AA GM1定位模式加APM GM1定位模式]的参考百分比对应于：大于35%指示高能育性状态；比35%低一个标准差指示中等能育性状态；比35%低两个或更多个标准偏差指示低能育性状态；
比较测量的t0-[AA GM1定位模式和APM GM1定位模式]的百分比与[AA GM1定位模式加APMGM1定位模式]的参考百分比；和
基于能育性状态鉴定生殖途径以实现受精。
2.权利要求1的用途，其中雄性具有至少正常的精子浓度并且
用于高能育性状态的生殖途径选自：性交、宫颈内授精(ICI)、宫颈内授精之前预先使精子获能、子宫内授精(IUI)或子宫内授精之前预先使精子获能；
用于中等能育性状态的生殖途径选自：宫颈内授精(ICI)、宫颈内授精之前预先使精子获能、子宫内授精(IUI)、子宫内授精之前预先使精子获能或者体外受精(IVF)或体外受精之前预先使精子获能；或
用于低能育性状态的生殖途径选自：体外受精(IVF)、体外受精之前预先使精子获能、胞浆内精子注射(ICSI)、胞浆内精子注射之前预先使精子获能、配子输卵管内转移(GIFT)、配子输卵管内转移之前预先使精子获能、透明带下授精(SUZI)或透明带下授精之前预先使精子获能。
3.权利要求1的用途，其中雄性具有小于正常的精子浓度，并且
用于高能育性状态的生殖途径选自：宫颈内授精(ICI)、宫颈内授精之前预先使精子获能、子宫内授精(IUI)或子宫内授精之前预先使精子获能；
用于中等能育性状态的生殖途径选自：宫颈内授精(ICI)、宫颈内授精之前预先使精子获能、子宫内授精(IUI)或子宫内授精之前预先使精子获能、体外受精(IVF)或体外受精之前预先使精子获能；或
用于低能育性状态的生殖途径选自：体外受精(IVF)、体外受精之前预先使精子获能、胞浆内精子注射(ICSI)、胞浆内精子注射之前预先使精子获能、配子输卵管内转移(GIFT)、配子输卵管内转移之前预先使精子获能、透明带下授精(SUZI)或透明带下授精之前预先使精子获能。
4.权利要求2或3中任一项的用途，其中(i) 生殖途径对应于体外受精之前预先使精子获能，预获能的时期对应于在包含一种或两种获能刺激物的介质中孵育精子，持续授精之前24小时、授精之前18小时、授精之前12小时、授精之前6小时、授精之前4小时、授精之前3小时或授精之前1小时的时期；(ii) 生殖途径对应于胞浆内精子注射(ICSI)，授精之前预获能的时期对应于在包含一种或多种获能刺激物的介质中孵育精子，持续授精之前24小时、授精之前18小时、授精之前12小时、授精之前6小时、授精之前4小时、授精之前3小时或授精之前1小时的时期；(iii) 生殖途径对应于配子输卵管内转移(GIFT)，授精前预获能的时期对应于在包含一种或多种获能刺激物的介质中孵育精子，持续授精之前24小时、授精之前18小时、授精之前12小时、授精之前6小时、授精之前4小时、授精之前3小时或授精之前1小时的时期；或(iv) 生殖途径对应于透明带下授精(SUZI)，授精之前预获能的时期对应于在包含一种或多种获能刺激物的介质中孵育精子，持续授精之前24小时、授精之前18小时、授精之前12小时、授精之前6小时、授精之前4小时、授精之前3小时或授精之前1小时的时期。
5.权利要求4的用途，进一步包括以下步骤：
用荧光标记处理体外获能的精子细胞的第二样品，其中体外获能的精子细胞的第二样品和体外获能的精子细胞的第一样品与同一雄性相关；
获得一个或多个t1-荧光图像，其显示与t1-荧光标记的体外获能的精子细胞相关的一种或多种GM1定位模式，所述t1-荧光图像在获能后时间t1获得，其中t1选自大于t0或大于18小时；
对于t1-荧光图像中显示的t1-荧光标记的体外获能的精子细胞，测量顶端顶体(AA) GM1定位模式的数目、顶体质膜(APM) GM1定位模式的数目和GM1定位模式的总数目，以测定t1-[AA GM1定位模式加APM GM1定位模式]的百分比；
比较t1-[AA GM1定位模式加APM GM1定位模式]的百分比与t0-[AA GM1定位模式加APM GM1定位模式]的百分比，以确定体内获能时间，其选自大于12小时的晚期体内获能时间或小于12小时的标准体内获能时间；
其中t0-[AA GM1定位模式加APM GM1定位模式]的百分比与t1-[AA GM1定位模式加APM GM1定位模式]的百分比的差异对应于：距标准35%大于一个标准差指示大于12小时的晚期体内获能时间；或距标准35%小于一个标准差指示小于12小时的标准体内获能时间；
此外当t0-[AA GM1定位模式加APM GM1定位模式]的百分比与t1-[AA GM1定位模式加APMGM1定位模式]的百分比的差异对应于：距标准35%大于一个标准差时，则t1-能育性状态基于测量的t1-[AA GM1定位模式加APM GM1定位模式]百分比与[AA GM1定位模式加APM GM1定位模式]的参考百分比的比较确定；或距标准35%小于一个标准差，则t1-能育性状态基于[AA GM1定位模式加APM GM1定位模式]的参考百分比与测量的t1-[AA GM1定位模式加APM GM1定位模式]百分比或测量的t0-[AA GM1定位模式加APM GM1定位模式]百分比的比较确定；
基于雄性的t1-能育性状态和体内获能时间，鉴定授精时期和使用的生殖途径以实现受精。
6.权利要求5的用途，其中雄性具有至少正常的精子浓度和晚期体内获能时间；
用于高t1-能育性状态的生殖途径选自：改变性交时间至晚期体内获能时间；改变宫颈内授精(ICI)时间至晚期体内获能时间、改变子宫内授精(IUI)时间至晚期体内获能时间、宫颈内授精之前预先使精子获能或子宫内授精之前预先使精子获能；
用于中等t1-能育性状态的生殖途径选自：改变宫颈内授精(ICI)时间至晚期体内获能时间、改变子宫内授精(IUI)时间至晚期体内获能时间、改变体外受精(IVF)时间至晚期体内获能时间、宫颈内授精之前预先使精子获能、子宫内授精(IUI)、子宫内授精之前预先使精子获能或体外受精之前预先使精子获能；
用于低t1-能育性状态的生殖途径选自：改变体外受精(IVF)时间至晚期体内获能时间、改变胞浆内精子注射(ICSI)时间至晚期体内获能时间、改变配子输卵管内转移(GIFT)时间至晚期体内获能时间、改变透明带下授精(SUZI)时间至晚期体内获能时间、体外受精之前预先使精子获能、胞浆内精子注射之前预先使精子获能、配子输卵管内转移之前预先使精子获能或透明带下授精之前预先使精子获能。
7.权利要求5的用途，其中雄性具有小于正常的精子浓度和晚期体内获能时间；
用于t1-高能育性状态的生殖途径选自：改变性交时间至晚期体内获能时间、改变宫颈内授精(ICI)时间至晚期体内获能时间、改变子宫内授精(IUI)时间至晚期体内获能时间、宫颈内授精之前预先使精子获能或子宫内授精之前预先使精子获能；
用于t1-中等能育性状态的生殖途径选自：改变宫颈内授精(ICI)时间至晚期体内获能时间、改变子宫内授精(IUI)时间至晚期体内获能时间、改变体外受精(IVF)时间至晚期体内获能时间、宫颈内授精之前预先使精子获能、子宫内授精之前预先使精子获能或体外受精之前预先使精子获能；
用于t1-低能育性状态的生殖途径选自：改变体外受精(IVF)时间至晚期体内获能时间、胞浆内精子注射(ICSI)、改变胞浆内精子注射(ICSI)时间至晚期体内获能时间、改变配子输卵管内转移(GIFT)时间至晚期体内获能时间、改变透明带下授精(SUZI)时间至晚期体内获能时间、体外受精之前预先使精子获能、胞浆内精子注射之前预先使精子获能、配子输卵管内转移之前预先使精子获能或透明带下授精之前预先使精子获能。
8.权利要求5的用途，其中雄性具有至少正常的精子浓度和标准体内获能时间；
用于高t1-能育性状态的生殖途径选自：性交、宫颈内授精(ICI)、宫颈内授精之前预先使精子获能、子宫内授精(IUI)或子宫内授精之前预先使精子获能；
用于中等t1-能育性状态的生殖途径选自：宫颈内授精(ICI)、宫颈内授精之前预先使精子获能、子宫内授精(IUI)、子宫内授精之前预先使精子获能或体外受精(IVF)或体外受精之前预先使精子获能；或
用于低t1-能育性状态的生殖途径选自：体外受精(IVF)、体外受精之前预先使精子获能、胞浆内精子注射(ICSI)、胞浆内精子注射之前预先使精子获能、配子输卵管内转移(GIFT)、配子输卵管内转移之前预先使精子获能、透明带下授精(SUZI)或透明带下授精之前预先使精子获能。
9.权利要求5的用途，其中雄性具有小于正常的精子浓度和标准体内获能时间；
用于高t1-能育性状态的生殖途径选自：宫颈内授精(ICI)、宫颈内授精之前预先使精子获能、子宫内授精(IUI)或子宫内授精之前预先使精子获能；
用于中等t1-能育性状态的生殖途径选自：宫颈内授精(ICI)、宫颈内授精之前预先使精子获能、子宫内授精(IUI)或子宫内授精之前预先使精子获能、体外受精(IVF)、体外受精之前预先使精子获能；或
用于低t1-能育性状态的生殖途径选自：体外受精(IVF)、体外受精之前预先使精子获能、胞浆内精子注射(ICSI)、胞浆内精子注射之前预先使精子获能、配子输卵管内转移(GIFT)、配子输卵管内转移之前预先使精子获能、透明带下授精(SUZI)或透明带下授精之前预先使精子获能。
10.权利要求8或9中任一项的用途，其中(i) 生殖途径对应于体外受精之前预先使精子获能，预获能时期对应于在包含一种或多种获能刺激物的介质中孵育精子，持续授精之前24小时、授精之前18小时、授精之前12小时、授精之前6小时、授精之前4小时、授精之前3小时或授精之前1小时的时期，(ii) 生殖途径对应于胞浆内精子注射(ICSI)，授精之前预获能的时期对应于在包含一种或多种获能刺激物的介质中孵育精子，持续授精之前24小时、授精之前18小时、授精之前12小时、授精之前6小时、授精之前4小时、授精之前3小时或授精之前1小时的时期，(iii) 生殖途径对应于配子输卵管内转移(GIFT)，授精之前预获能的时期对应于在包含一种或多种获能刺激物的介质中孵育精子，持续授精之前24小时、授精之前18小时、授精之前12小时、授精之前6小时、授精之前4小时、授精之前3小时或授精之前1小时的时期；或(iv) 生殖途径对应于透明带下授精(SUZI)，授精之前预获能的时期对应于在包含一种或多种获能刺激物的介质中孵育精子，持续授精之前24小时、授精之前18小时、授精之前12小时、授精之前6小时、授精之前4小时、授精之前3小时或授精之前1小时的时期。
11.权利要求10的用途，其中鉴定步骤还基于下列一个或多个：患者人口统计资料、雌性伴侣的生殖状态、精子浓度、总能动性、前进能动性、精液体积、精液pH、精液粘度和/或精子形态学及其组合。
12.权利要求11的用途，其中一种以上的GM1定位模式包括AA GM1定位模式、APM GM1定位模式、内衬细胞GM1定位模式、INTER GM1定位模式、PAPM GM1定位模式、AA/PA GM1定位模式、ESGM1定位模式和DIFF GM1定位模式。
13.权利要求12的用途，其中将精子细胞用获能条件体外处理，持续：至少1小时、至少3小时、至少12小时、至少18小时、至少24小时的获能时期，持续范围为0.5小时-3小时、3小时-12小时、6小时-12小时、3小时-24小时、12小时-24小时或18小时-24小时的获能时期。
14.权利要求13的用途，其中将体外获能的精子细胞用固定剂处理，持续：至少0.5小时、至少3小时、至少12小时、至少18小时、至少24小时、至少30小时、至少36小时或至少48小时的固定时期，持续范围为0.5小时-3小时、3小时-12小时、6小时-12小时、3小时-18小时、6-18小时、6-24小时、12小时-24小时、18小时-24小时、18-30小时、18-36小时、24-30小时、24-26小时、18-48小时、24-48小时或36-48小时的固定时期。
15.权利要求14的用途，其中精子细胞经低温贮藏程序处理，并在用获能条件体外处理之前储存。
16.获能介质在诊断工具的制造中的用途，所述诊断工具用于鉴定用于实现哺乳动物受精的途径，包括以下步骤：
用获能条件处理体外精子细胞；
用荧光标记处理t0-体外获能的精子细胞样品；
用荧光标记处理t1-体外获能的精子细胞样品；
获得一个或多个t0-荧光图像，其显示与t0-荧光标记的体外获能的精子细胞相关的一种或多种GM1定位模式；
获得一个或多个t1-荧光图像，其显示与t1-荧光标记的体外获能的精子细胞相关的一种或多种GM1定位模式；
所述t0-荧光图像在选自0.1小时-5小时、0.1小时-8小时、0.1-12小时或0.1小时-18小时的体外获能后时间(t0)获得；和所述t1-荧光图像在获能后时间t1时获得，其中t1大于t0；
对于t0-荧光图像中显示的t0-荧光标记的体外获能的精子细胞，测量顶端顶体(AA) GM1定位模式的数目、顶体质膜(APM) GM1定位模式的数目和GM1定位模式的总数目，以测定t0-[AA GM1定位模式加APM GM1定位模式]的百分比；
对于t1-荧光图像中显示的t1-荧光标记的体外获能的精子细胞，测量顶端顶体(AA) GM1定位模式的数目、顶体质膜(APM) GM1定位模式的数目和GM1定位模式的总数目，以测定t1-[AA GM1定位模式加APM GM1定位模式]的百分比；
比较t1-[AA GM1定位模式加APM GM1定位模式]的百分比与t0-[AA GM1定位模式加APM GM1定位模式]的百分比以确定体内获能时间，其选自大于12小时的晚期体内获能时间或者12小时或更少的标准体内获能时间；
其中t0-[AA GM1定位模式加APM GM1定位模式]的百分比与t1-[AA GM1定位模式加APM GM1定位模式]的百分比之间的差异对应于：距标准35%大于一个标准差指示大于12小时的晚期体内获能时间；或距标准35%小于一个标准差指示小于12小时的标准体内获能时间；
其中[AA GM1定位模式加APM GM1定位模式]的参考百分比对应于：大于35%指示高能育性状态，比35%低一个标准差指示中等能育性状态；比35%低两个或更多个标准差指示低能育性状态；
此外当t0-[AA GM1定位模式加APM GM1定位模式]的百分比与t1-[AA GM1定位模式加APMGM1定位模式]的百分比的差异对应于：距标准35%大于一个标准差时，则t1-能育性状态基于测量的t1-[AA GM1定位模式加APM GM1定位模式]百分比与[AA GM1定位模式加APM GM1定位模式]的参考百分比的比较确定；或距标准35%小于一个标准差，则t1-能育性状态基于[AA GM1定位模式加APM GM1定位模式]的参考百分比与测量的t1-[AA GM1定位模式加APM GM1定位模式]百分比或测量的t0-[AA GM1定位模式加APM GM1定位模式]百分比的比较确定；
基于雄性的t1-能育性状态和体内获能时间，鉴定授精时期和使用的生殖途径以实现受精。
17.权利要求16的用途，其中雄性具有至少正常的精子浓度和晚期体内获能时间；
用于高t1-能育性状态的生殖途径选自：改变性交时间至晚期体内获能时间、改变宫颈内授精(ICI)时间至晚期体内获能时间、改变子宫内授精(IUI)时间至晚期体内获能时间、宫颈内授精之前预先使精子获能或子宫内授精之前预先使精子获能；
用于中等t1-能育性状态的生殖途径选自：改变宫颈内授精(ICI)时间至晚期体内获能时间、改变子宫内授精(IUI)时间至晚期体内获能时间、改变体外受精(IVF)时间至晚期体内获能时间、宫颈内授精之前预先使精子获能、子宫内授精(IUI)、子宫内授精之前预先使精子获能或体外受精之前预先使精子获能；
用于低t1-能育性状态的生殖途径选自：改变体外受精(IVF)时间至晚期体内获能时间、改变胞浆内精子注射(ICSI)时间至晚期体内获能时间、改变配子输卵管内转移(GIFT)时间至晚期体内获能时间、改变透明带下授精(SUZI)时间至晚期体内获能时间、体外受精之前预先使精子获能、胞浆内精子注射之前预先使精子获能、配子输卵管内转移之前预先使精子获能或透明带下授精之前预先使精子获能。
18.权利要求16的用途，其中雄性具有小于正常的精子浓度和晚期体内获能时间；
用于t1-高能育性状态的生殖途径选自：改变性交时间至晚期体内获能时间、改变宫颈内授精(ICI)时间至晚期体内获能时间、改变子宫内授精(IUI)时间至晚期体内获能时间、宫颈内授精(ICI)之前预先使精子获能或子宫内授精(IUI)之前预先使精子获能；
用于t1-中等能育性状态的生殖途径选自：改变宫颈内授精(ICI)时间至晚期体内获能时间、改变子宫内授精(IUI)时间至晚期体内获能时间、改变体外受精(IVF)时间至晚期体内获能时间、宫颈内授精之前预先使精子获能、子宫内授精之前预先使精子获能或体外受精之前预先使精子获能；
用于t1-低能育性状态的生殖途径选自：改变体外受精(IVF)时间至晚期体内获能时间、胞浆内精子注射(ICSI)、改变胞浆内精子注射(ICSI)时间至晚期体内获能时间、改变配子输卵管内转移(GIFT)时间至晚期体内获能时间、改变透明带下授精(SUZI)时间至晚期体内获能时间、体外受精之前预先使精子获能、胞浆内精子注射之前预先使精子获能、配子输卵管内转移之前预先使精子获能或透明带下授精之前预先使精子获能。
19.权利要求16的用途，其中雄性具有至少正常的精子浓度和标准体内获能时间；
用于高t1-能育性状态的生殖途径选自：性交、宫颈内授精(ICI)、宫颈内授精之前预先使精子获能、子宫内授精(IUI)或子宫内授精之前预先使精子获能；
用于中等t1-能育性状态的生殖途径选自：宫颈内授精(ICI)、宫颈内授精之前预先使精子获能、子宫内授精(IUI)、子宫内授精之前预先使精子获能或体外受精(IVF)或体外受精之前预先使精子获能；或
用于低t1-能育性状态的生殖途径选自：体外受精(IVF)、体外受精之前预先使精子获能、胞浆内精子注射(ICSI)、胞浆内精子注射之前预先使精子获能、配子输卵管内转移(GIFT)、配子输卵管内转移之前预先使精子获能、透明带下授精(SUZI)或透明带下授精之前预先使精子获能。
20.权利要求16的用途，其中雄性具有小于正常的精子浓度和标准的体内获能时间；
用于高t1-能育性状态的生殖途径选自：宫颈内授精(ICI)、宫颈内授精之前预先使精子获能、子宫内授精(IUI)或子宫内授精之前预先使精子获能；
用于中等t1-能育性状态的生殖途径选自：宫颈内授精(ICI)、宫颈内授精之前预先使精子获能、子宫内授精(IUI)或子宫内授精之前预先使精子获能、体外受精(IVF)、体外受精之前预先使精子获能；或
用于低t1-能育性状态的生殖途径选自：体外受精(IVF)、体外受精之前预先使精子获能、胞浆内精子注射(ICSI)、胞浆内精子注射之前预先使精子获能、配子输卵管内转移(GIFT)、配子输卵管内转移之前预先使精子获能、透明带下授精(SUZI)或透明带下授精之前预先使精子获能。
21.权利要求17-20中任一项的用途，其中(i) 生殖途径对应于体外受精之前预先使精子获能，预获能时期对应于在包含一种或多种获能刺激物的介质中孵育精子，持续授精之前24小时、授精之前18小时、授精之前12小时、授精之前6小时、授精之前4小时、授精之前3小时或授精之前1小时的时期；(ii) 生殖途径对应于胞浆内精子注射(ICSI)，授精之前预获能的时期对应于在包含一种或多种获能刺激物的介质中孵育精子，持续授精之前24小时、授精之前18小时、授精之前12小时、授精之前6小时、授精之前4小时、授精之前3小时或授精之前1小时的时期；(iii) 生殖途径对应于配子输卵管内转移(GIFT)，授精之前预获能的时期对应于在包含一种或多种获能刺激物的介质中孵育精子，持续授精之前24小时、授精之前18小时、授精之前12小时、授精之前6小时、授精之前4小时、授精之前3小时或授精之前1小时的时期；或(iv) 生殖途径对应于透明带下授精(SUZI)，授精之前预获能的时期对应于在包含一种或多种获能刺激物的介质中孵育精子，持续授精之前24小时、授精之前18小时、授精之前12小时、授精之前6小时、授精之前4小时、授精之前3小时或授精之前1小时的时期。
22.权利要求21的用途，其中鉴定步骤还基于下列一个或多个：患者人口统计资料、雌性伴侣的生殖状态、精子浓度、总能动性、前进能动性、精液体积、精液pH、精液粘度和/或精子形态学及其组合。
23.权利要求22的用途，其中一种以上的GM1定位模式包括AA GM1定位模式、APM GM1定位模式、内衬细胞GM1定位模式、INTER GM1定位模式、PAPM GM1定位模式、AA/PA GM1定位模式、ESGM1定位模式和DIFF GM1定位模式。
24.权利要求23的用途，其中将精子细胞用获能条件体外处理，持续：至少1小时、至少3小时、至少12小时、至少18小时、至少24小时的获能时期，持续范围为0.5小时-3小时、3小时-12小时、6小时-12小时、3小时-24小时、12小时-24小时或18小时-24小时的获能时期。
25.权利要求24的用途，其中将体外获能的精子细胞用固定剂处理，持续：至少0.5小时、至少3小时、至少12小时、至少18小时、至少24小时、至少30小时、至少36小时或至少48小时的固定时期，持续范围为0.5小时-3小时、3小时-12小时、6小时-12小时、3小时-18小时、6-18小时、6-24小时、12小时-24小时、18小时-24小时、18-30小时、18-36小时、24-30小时、24-26小时、18-48小时、24-48小时或36-48小时的固定时期。
26.权利要求25的用途，其中精子细胞经低温贮藏程序处理，并在用获能条件体外处理之前储存。
27.获能介质在诊断工具的制造中的用途，所述诊断工具用于鉴定用于实现哺乳动物受精的途径，包括以下步骤：
用获能条件处理体外精子细胞；
用荧光标记处理体外获能的精子细胞；
产生说明荧光标记处理的体外获能的精子细胞的一种或多种GM1定位模式的数据，所述数据在选自0.1小时-18小时(t0)或大于18小时(t1)的体外获能后时间获得；
基于体外获能后时间的一种或多种GM1定位模式的数据表征雄性的能育性状态数据；和
基于体外获能后时间的雄性能育性状态数据，鉴定授精时期和使用的生殖途径以实现受精。
28.权利要求27的用途，其中将精子细胞用获能条件体外处理，持续：至少1小时、至少3小时、至少12小时、至少18小时、至少24小时的获能时期，持续范围为0.5小时-3小时、3小时-12小时、6小时-12小时、3小时-24小时、12小时-24小时或18小时-24小时的获能时期。
29.权利要求27或28的用途，其中将体外获能的精子细胞用固定剂处理，持续：至少0.5小时、至少3小时、至少12小时、至少18小时、至少24小时、至少30小时、至少36小时或至少48小时的固定时期，持续范围为0.5小时-3小时、3小时-12小时、6小时-12小时、3小时-18小时、6-18小时、6-24小时、12小时-24小时、18小时-24小时、18-30小时、18-36小时、24-30小时、24-26小时、18-48小时、24-48小时或36-48小时的固定时期。
30.权利要求29的用途，其中精子细胞经低温贮藏程序处理，并在用获能条件体外处理之前储存。
31.权利要求30的用途，其中表征步骤包括：
比较说明体外获能的精子细胞的GM1定位模式的数据与说明具有已知能育性状态的雄性的体外获能的精子细胞的GM1定位模式的参考数据。
32.权利要求31的用途，其中表征步骤进一步包括：
对于预定数目的体外获能的精子细胞，测定每一GM1标记的定位模式的数目；
计算AA GM1定位模式的数目和APM GM1定位模式的数目的总和与GM1标记的定位模式的总数目的总和的比率；和
比较GM1定位模式的比率与具有已知能育性状态的雄性的GM1定位模式的参考比率。
33.权利要求32的用途，进一步包括以下步骤：
比较雄性的能育性状态数据与已知的雄性能育性状态和相关的已知的授精时期和相关的已知的生殖途径的数据。
34.权利要求33的用途，其中已知的能育性状态包括：能育且3小时内精子获能、能育且12小时内精子获能、能育且12-24小时获能和不育。
35.权利要求34的用途，所述生殖途径选自：性交、宫颈内授精(ICI)、子宫内授精(IUI)、体外受精(IVF)、体外受精之前预先使精子获能、胞浆内精子注射(ICSI)、配子输卵管内转移(GIFT)和透明带下授精(SUZI)。
36.权利要求35的用途，其中鉴定步骤还基于下列一个或多个：患者人口统计资料、雌性伴侣的生殖状态、精子浓度、总能动性、前进能动性、精液体积、精液pH、精液粘度和/或精子形态学及其组合。
37.权利要求36的用途，其中一种以上的GM1定位模式为AA GM1定位模式、APM GM1定位模式、内衬细胞GM1定位模式、INTER GM1定位模式、PAPM GM1定位模式、AA/PA GM1定位模式、ESGM1定位模式和DIFF GM1定位模式。
38.获能介质在诊断工具的制造中的用途，所述诊断工具用于鉴定用于实现哺乳动物受精的途径，包括以下步骤：
用获能条件处理体外精子细胞；
用荧光标记处理体外获能的精子细胞；
获得荧光标记的体外获能的精子细胞的一个或多个荧光图像；
测量荧光标记的体外获能的精子样品的Cap-Score值，所述Cap-Score值在选自小于8小时(t0)、8小时-12小时范围内(t1)或大于12小时(t2)的体外获能后时间获得；
比较Cap-Score值和与已知能育性状态的雄性相关的在体外获能后时间的参考Cap-Score值；和
基于体外获能时间后的Cap-Score值，鉴定授精时期和使用的生殖途径以实现受精。
39.权利要求38的用途，其中将精子细胞用获能条件体外处理，持续：至少1小时、至少3小时、至少12小时、至少18小时、至少24小时的获能时期，持续范围为0.5小时-3小时、3小时-12小时、6小时-12小时、3小时-24小时、12小时-24小时或18小时-24小时的获能时期。
40.权利要求38或39的用途，其中将体外获能的精子细胞用固定剂处理，持续：至少0.5小时、至少3小时、至少12小时、至少18小时、至少24小时、至少30小时、至少36小时或至少48小时的固定时期，持续范围为0.5小时-3小时、3小时-12小时、6小时-12小时、3小时-18小时、6-18小时、6-24小时、12小时-24小时、18小时-24小时、18-30小时、18-36小时、24-30小时、24-26小时、18-48小时、24-48小时或36-48小时的固定时期。
41.权利要求40的用途，其中精子细胞经低温贮藏程序处理，并在用获能条件体外处理之前储存。
42.权利要求41的用途，进一步包括以下步骤：
比较Cap-Score值与已知的雄性能育性状态和相关的已知的授精时期和相关的已知的生殖途径的参考Cap-Score值。
43.权利要求42的用途，其中已知的能育性状态包括：能育且3小时内精子获能、能育且12小时内精子获能、能育且12-24小时获能和不育。
44.权利要求43的用途，所述生殖途径选自：性交、宫颈内授精(ICI)、子宫内授精(IUI)、体外受精(IVF)、胞浆内精子注射(ICSI)、体外受精之前预先使精子获能、配子输卵管内转移(GIFT)和透明带下授精(SUZI)。
45.权利要求44的用途，其中鉴定步骤进一步基于下列一个或多个：患者人口统计资料、雌性伴侣的生殖状态、精子浓度、总能动性、前进能动性、精液体积、精液pH、精液粘度和/或精子形态学及其组合。
46.权利要求45的用途，其中Cap-Score对应于AA GM1定位模式的数目和APM GM1定位模式的数目的总和与GM1标记的定位模式的总数目的总和的比率，其各自对于体外获能的精子样品测定。
47.权利要求46的用途，其中一种或多种GM1标记的定位模式包括AA GM1定位模式、APMGM1定位模式、内衬细胞GM1定位模式、INTER GM1定位模式、PAPM GM1定位模式、AA/PA GM1定位模式、ES GM1定位模式和DIFF GM1定位模式。
48.获能介质、固定剂和用于测定GM1定位模式的试剂在诊断工具的制造中的用途，所述诊断工具用于鉴定用于实现成功的哺乳动物妊娠的适当机制，包括以下步骤：
用荧光标记处理体外获能的精子细胞；
获得荧光标记的体外获能的精子细胞的一个或多个荧光图像；
测量荧光标记的体外获能的精子样品的Cap-Score值；
比较Cap-Score 值和与已知能育性状态的雄性相关的参考Cap-Score值；和
基于Cap-Score值，鉴定授精时期和使用的生殖途径以实现受精，
还包括以下步骤：
使用具有足够直径尺寸的孔口的宽口吸管处理精液样品以防止剪切精子膜；和
不使用可损伤精子膜的试剂处理精液样品，
其中不使用可损伤精子膜的试剂处理精液样品的步骤包括：
将处理的精液样品暴露于获能介质、固定剂和用于测定GM1定位模式的试剂。
49.权利要求48的用途，其中测定步骤还基于下列一个或多个：患者人口统计资料、雌性伴侣的生殖状态、精子浓度、总能动性、前进能动性、精液体积、精液pH、精液粘度和/或精子形态学。
50.权利要求48的用途，其中可损伤精子膜的试剂选自：(i) 蛋白酶；(ii) 核酸酶；(iii) 溶粘蛋白剂；(iv) 脂肪酶；(v) 酯酶和(vi) 糖苷水解酶类。
51.权利要求48的用途，进一步包括以下步骤：
对于一种或多种GM1标记的定位模式，测定群体大小，以致于关于Cap-Score的百分比变化在个体中最小。
52.权利要求51的用途，其中一种或多种GM1标记的定位模式包括AA GM1定位模式、APMGM1定位模式、内衬细胞GM1定位模式、中间(INTER) GM1定位模式、顶体后质膜(PAPM) GM1定位模式、顶端顶体/顶体后(AA/PA) GM1定位模式、赤道段(ES) GM1定位模式和弥散性(DIFF)GM1定位模式。
CN201680082394.7A 2015-12-23 2016-12-22 鉴定用于实现哺乳动物受精的途径和授精时期的方法 Active CN108700494B (zh)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN202210054191.4A CN114527099A (zh) 2015-12-23 2016-12-22 鉴定用于实现哺乳动物受精的途径和授精时期的方法

Applications Claiming Priority (11)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US201562387348P 2015-12-23 2015-12-23
US62/387348 2015-12-23
US201662279315P 2016-01-15 2016-01-15
US62/279315 2016-01-15
US201662328876P 2016-04-28 2016-04-28
US201662328885P 2016-04-28 2016-04-28
US62/328876 2016-04-28
US62/328885 2016-04-28
US201662422279P 2016-11-15 2016-11-15
US62/422279 2016-11-15
PCT/US2016/068204 WO2017112844A1 (en) 2015-12-23 2016-12-22 A method to identify an approach for achieving mammalian fertilization and time period for insemination

Related Child Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN202210054191.4A Division CN114527099A (zh) 2015-12-23 2016-12-22 鉴定用于实现哺乳动物受精的途径和授精时期的方法

Publications (2)

Publication Number Publication Date
CN108700494A CN108700494A (zh) 2018-10-23
CN108700494B true CN108700494B (zh) 2022-02-11

Family

ID=59088271

Family Applications (2)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN202210054191.4A Pending CN114527099A (zh) 2015-12-23 2016-12-22 鉴定用于实现哺乳动物受精的途径和授精时期的方法
CN201680082394.7A Active CN108700494B (zh) 2015-12-23 2016-12-22 鉴定用于实现哺乳动物受精的途径和授精时期的方法

Family Applications Before (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN202210054191.4A Pending CN114527099A (zh) 2015-12-23 2016-12-22 鉴定用于实现哺乳动物受精的途径和授精时期的方法

Country Status (16)

Country Link
US (1) US20170184605A1 (zh)
EP (2) EP3394589B9 (zh)
JP (2) JP7168453B2 (zh)
KR (1) KR20180116241A (zh)
CN (2) CN114527099A (zh)
AU (1) AU2016379379B2 (zh)
CA (1) CA3009491A1 (zh)
DK (1) DK3394589T3 (zh)
ES (1) ES2897777T3 (zh)
HR (1) HRP20211618T1 (zh)
HU (1) HUE056953T2 (zh)
MA (1) MA44168A (zh)
MX (3) MX2018007793A (zh)
PT (1) PT3394589T (zh)
TW (1) TW201735869A (zh)
WO (1) WO2017112844A1 (zh)

Families Citing this family (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2020223515A1 (en) * 2019-04-30 2020-11-05 Androvia Lifesciences, Llc Use of cap-score tm in identification of a reproductive approach in men suffering from varicocele
KR20220022687A (ko) 2020-08-19 2022-02-28 주식회사 실드윈 보조생식술 성공률을 향상시키기 위한 인공정액 제제 및 그 제조 방법
CN113624951B (zh) * 2021-07-19 2023-11-21 国家卫生健康委科学技术研究所 检测精液质量的方法和系统

Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US6258525B1 (en) * 1994-03-30 2001-07-10 North Shore University Hospital Method and kit for detecting infertility
CN1745292A (zh) * 2002-12-09 2006-03-08 先进流体实验室股份有限公司 男性生育能力分析方法和装置

Family Cites Families (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US6051603A (en) * 1998-01-20 2000-04-18 Wayne Hughes Institute Vanadium (IV) metallocene complexes having sperm motility inhibiting activity
US6913932B2 (en) * 2002-08-23 2005-07-05 Beckman Coulter, Inc. Formaldehyde-ammonium salt complexes for the stabilization of blood cells
US8367313B2 (en) 2003-07-23 2013-02-05 Cornell University Method of determining sperm capacitation
CA2533542C (en) 2003-07-23 2013-06-11 Cornell Research Foundation, Inc. Method of determining sperm capacitation
AU2015317864B2 (en) 2014-09-17 2021-07-01 Cornell University Identifying status of male fertility by determining sperm capacitation

Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US6258525B1 (en) * 1994-03-30 2001-07-10 North Shore University Hospital Method and kit for detecting infertility
CN1745292A (zh) * 2002-12-09 2006-03-08 先进流体实验室股份有限公司 男性生育能力分析方法和装置

Non-Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
GM1 Dynamics as a Marker for Membrane Changes Associated;VIMAL SELVARAJ，etc.;《Journal of Andrology》;20070831;第588-598页 *

Also Published As

Publication number Publication date
JP7168453B2 (ja) 2022-11-09
EP3936850B1 (en) 2023-08-09
ES2897777T3 (es) 2022-03-02
MX2022006780A (es) 2022-07-11
EP3394589A4 (en) 2019-10-16
KR20180116241A (ko) 2018-10-24
EP3394589B1 (en) 2021-09-08
MX2018007793A (es) 2019-07-04
EP3394589B9 (en) 2022-02-23
DK3394589T3 (da) 2021-11-01
AU2016379379B2 (en) 2022-12-15
WO2017112844A1 (en) 2017-06-29
EP3936850A1 (en) 2022-01-12
HUE056953T2 (hu) 2022-03-28
EP3394589A1 (en) 2018-10-31
MX2022006781A (es) 2022-07-11
CA3009491A1 (en) 2017-06-29
HRP20211618T1 (hr) 2022-02-04
MA44168A (fr) 2018-10-31
US20170184605A1 (en) 2017-06-29
JP2019506893A (ja) 2019-03-14
PT3394589T (pt) 2021-11-09
CN108700494A (zh) 2018-10-23
JP2021168700A (ja) 2021-10-28
AU2016379379A1 (en) 2018-07-26
TW201735869A (zh) 2017-10-16
EP3936850C0 (en) 2023-08-09
CN114527099A (zh) 2022-05-24

Similar Documents

Publication Publication Date Title
Garrett et al. Clinical application of sperm-oocyte interaction tests in in vitro fertilization–embryo transfer and intracytoplasmic sperm injection programs
JP7182573B2 (ja) 男性の受精能状態を決定するための方法および試験キット
JP7090950B2 (ja) 精子受精能獲得を判定することによるオスの受精能状態の特定
Silverberg et al. Evaluation of sperm
JP2021168700A (ja) 哺乳類受精を達成するためのアプローチおよび授精のための期間を識別するための方法
CA2533542C (en) Method of determining sperm capacitation
Leisinger et al. Evaluation of Sperm
Li et al. The correlation between sperm percentage with a small acrosome and unexplained in vitro fertilization failure
CN114072082A (zh) Cap-scoretm在患有精索静脉曲张的男性的生殖途径鉴定中的用途
Gardner et al. Evaluation of sperm

Legal Events

Date Code Title Description
PB01 Publication
PB01 Publication
SE01 Entry into force of request for substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
REG Reference to a national code

Ref country code: HK

Ref legal event code: DE

Ref document number: 1261729

Country of ref document: HK

GR01 Patent grant
GR01 Patent grant