JP2023552762A - Ｃｄ６ｈｉｇｈ細胞を選択的に標的化してｔｅｆｆ細胞の活性を低下する方法 - Google Patents

Ｃｄ６ｈｉｇｈ細胞を選択的に標的化してｔｅｆｆ細胞の活性を低下する方法 Download PDF

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Abstract

提供されるのは、イトリズマブなどの抗ＣＤ６抗体を含む方法および組成物であって、ＣＤ６ｈｉｇｈＴ細胞を選択的に標的として、例えば、かかる細胞上の細胞表面ＣＤ６のレベルを低下させ、対象またはex vivoにおけるＣＤ６ｈｉｇｈＴ細胞の全体的なレベルおよび病原性活性またはＣＤ６ｈｉｇｈ：ＣＤ６ｌｏｗＴ細胞の比率を低下させ、対象またはex vivoにおけるＴｅｆｆ細胞の全体的なレベルおよび病原性活性またはＴｅｆｆ：Ｔｒｅｇ細胞の比率を低下させ、および／または対象またはex vivoにおけるＴｒｅｇ細胞の生成を増加させ、それによってとりわけ、対象における病原性免疫応答を調節する、前記方法および組成物である。

Description

関連出願の相互参照
本出願は、35 U.S.C. § 119(e)に基づき２０２０年１２月４日に出願された米国仮出願第63/121,567号の利益を主張する；この出願は、参照によりその全体が組み込まれる。
配列表に関する陳述
本出願に関連する配列表は、紙のコピーの代わりにテキスト形式で提供され、参照により本明細書に組み込まれる。配列表を含むテキストファイルの名前はEQIL_010_01WO_ST25.txtである。テキストファイルは約１０．８ＫＢであり、２０２１年１２月２日に作成され、EFS-Webを介して電子的に提出されている。
背景
技術分野
本開示の態様は、一般に、イトリズマブなどの抗ＣＤ６抗体を含む方法および組成物であって、ＣＤ６ｈｉｇｈＴ細胞を選択的に標的として、例えば、かかる細胞上の細胞表面ＣＤ６のレベルを低下させ、対象またはex vivoにおけるＣＤ６ｈｉｇｈＴ細胞の全体的なレベルおよび病原性活性またはＣＤ６ｈｉｇｈ：ＣＤ６ｌｏｗＴ細胞の比率を低下させ、対象またはex vivoにおけるＴｅｆｆ細胞の全体的なレベルおよび病原性活性またはＴｅｆｆ：Ｔｒｅｇ細胞の比率を低下させ、および／または対象またはex vivoにおけるＴｒｅｇ細胞の生成を増加させ、それによって、とりわけ、対象における病原性免疫応答を調節する、前記方法および組成物である。
関連技術の説明
Ｔ細胞またはＴリンパ球は、リンパ球として知られる白血球のグループに属し、適応免疫において中心的な役割を果たす。これらは、Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）と呼ばれる特別な受容体がこれらの細胞表面に存在することにより、Ｂ細胞などの他の種類のリンパ球と区別することができる。２つの主要なグループ：ガンマデルタＴ細胞（γδＴ細胞）およびアルファベータＴ細胞（αβＴ細胞）が存在する：後者は、ＣＤ４およびＣＤ８ Ｔ細胞を含む。ＣＤ４ Ｔ細胞は、ヘルパーＴ（Ｔｈ）サブセット、例えばＴｈ１、Ｔｈ２、Ｔｈ９、Ｔｈ１７、Ｔｈ２２、Ｔｆｈ、およびＴｐｈなどを含み、それぞれが異なるサイトカインプロファイルおよび免疫応答における役割を有する。ＣＤ８ Ｔ細胞は、細胞傷害性Ｔ細胞（Ｔｃ細胞またはＣＴＬ）を含む。Ｔ細胞はまた、ナイーブ、エフェクター、および記憶（中枢記憶、エフェクター記憶、および幹記憶）サブセットを含む活性化状態によっても定義される。その他の関連細胞は、ナチュラルキラーＴ細胞（ＮＫＴ細胞）および自然リンパ球（ＩＬＣ）を含む。ＩＬＣはＴＣＲ陰性リンパ球であるが、サブセット：ＩＬＣ１、ＩＬＣ２、およびＩＬＣ３を有し、これらは分泌するサイトカインの点で異なるＴｈサブセットに類似している。活性化された（ナイーブではなくなった）すべてのＴ細胞（またはＩＬＣ）は、集合的にエフェクターＴ細胞（Ｔｅｆｆ）と呼ばれる。
サプレッサーＴ細胞としても知られる制御性Ｔ細胞（Ｔｒｅｇ細胞）は、他のＴ細胞の免疫応答を抑制するように作用する、Ｔ細胞の特殊な亜集団である。例えばＴｒｅｇ細胞は、免疫反応中のＴ細胞媒介性免疫の抑制、および胸腺におけるネガティブ選択のプロセスを逃れた自己反応性Ｔ細胞の抑制において、主要な役割を果たす。このように、Ｔｒｅｇ細胞は重要な「自己チェック」を提供して過剰な免疫原性反応を防ぐため、免疫系の恒常性および自己抗原に対する耐性の維持に不可欠である。Ｔｅｆｆ：Ｔｒｅｇ細胞の比率の増加につながるＴｅｆｆ細胞の数と活性の増加は、自己免疫疾患および炎症性疾患を強調する。
Ｔｒｅｇ細胞の２つの主要なクラスは、天然に存在するＴｒｅｇ細胞および誘導されたＴｒｅｇ細胞である。天然に存在するＴｒｅｇ細胞に最も広く用いられるマーカーは、分化クラスター４（ＣＤ４）、分化クラスター２５（ＣＤ２５）、フォークヘッド／ウィングドヘリックス転写因子ボックスＰ３（ＦｏｘＰ３）、転写因子Ｈｅｌｉｏｓ、細胞傷害性Ｔリンパ球関連抗原４（ＣＴＬＡ－４）、グルココルチコイド誘導性腫瘍壊死因子受容体ファミリー関連遺伝子（ＧＩＴＲ）、リンパ球活性化遺伝子３（ＬＡＧ－３）、および分化クラスター１２７（ＣＤ１２７）である。天然に存在するＴｒｅｇ細胞（ＣＤ４＋ＣＤ２５＋ＦｏｘＰ３＋ Ｔｒｅｇ細胞としても知られている）は、胸腺で発生する。誘導されたＴｒｅｇ細胞（Ｔｒ１細胞、Ｔｈ３細胞、およびＨＬＡ－Ｇ＋ Ｔｒｅｇ細胞を含む）は、抗原提示細胞およびサイトカインとの相互作用に応答して、正常な免疫応答中に末梢で発生する。
誘導されたＴｒｅｇ細胞は、天然に存在するＴｒｅｇ細胞の属性の多くを共有しているが、重要な細胞表面と核のバイオマーカーおよび機能的属性が異なり得る。例えばＴｒ１細胞とＴｈ３細胞は、それぞれＩＬ－１０とΤＧＦ－βを産生することが報告されている。これらの細胞サブセットを単離、豊富化、および増大（expand）する能力により、免疫疾患の処置における新しい治療アプローチがもたらされた。
天然に存在するＴｒｅｇ細胞が自己寛容の重要な要素として同定されたことにより、免疫学および免疫寛容を制御する基本プロセスにおける主要な研究分野が開かれた。制御性Ｔ細胞は、独特で強力な治療プロファイルを有する。これらの細胞は、制御活性の発生のために特異的なＴ細胞受容体（ＴＣＲ）を介した活性化を必要とするが、そのエフェクター機能は非特異的であり、細胞間接触および抑制的サイトカイン産生の組み合わせを通じて、局所的な炎症反応を制御しているようである。多くの研究が、自己免疫疾患、移植、および移植片対宿主病における病理学的免疫応答の抑制における、天然に存在するＴｒｅｇ細胞の強力な影響を実証している。しかし、ヒトの設定での天然に存在するＴｒｅｇ細胞の研究と応用に対する大きな障害は、Ｔｒｅｇ細胞を定義し、Ｔｒｅｇ細胞を例えばＴｈ細胞、Ｔｃ細胞などの他のＴ細胞サブセットから分離する、ならびにＴｒｅｇ細胞の異なる部分集団を区別するための、単一の特異的な細胞表面バイオマーカーの欠如であった。
Ｔｒｅｇ細胞を同定、単離、豊富化、またはその他で利用する研究では、多くの様々な方法が使用されている。マーカー：ＣＤ４、ＣＤ２５、ＦｏｘＰ３、転写因子Ｈｅｌｉｏｓ、ＣＴＬＡ－４、ＧＩＴＲ、ＬＡＧ－３、およびＣＤ１２７は、Ｔｒｅｇ細胞を識別するために連携して使用されるが、しかし上記のマーカーはいずれも厳密にはＴｒｅｇ細胞に特異的ではないため、単独でＴｒｅｇ細胞を識別することはできない。例えば、ＣＤ２５およびＣＤ４表面マーカー（ＣＤ４＋ＣＤ２５＋細胞）の高発現は、もともと天然に存在するＴｒｅｇ細胞を識別するために使用されていた。しかしＣＤ４は、Ｔｈ細胞、およびＴＭ細胞の亜集団でも発現する。ＣＤ２５も、病原体に対する免疫応答中などの免疫活性化の状況において、非制御性Ｔ細胞にも発現する。したがって、ＣＤ４およびＣＤ２５の発現によって定義されるように、Ｔｒｅｇ細胞は、約５～１０％の成熟Ｔｈ細胞を含む。Ｆｏｘｐ３の細胞発現をさらに測定することにより、天然に存在するＴｒｅｇ細胞（ＣＤ４＋ＣＤ２５＋ＦｏｘＰ３＋細胞）のより特異的な分析が可能となった。しかし、Ｆｏｘｐ３は活性化されたＴＥＭ細胞でも一時的に発現し、ＣＤ４＋ＣＤ２５ｌｏｗ／～Ｔ細胞、Ｔｈ細胞、Ｔｃ細胞、およびメモリーＴ細胞を含むほとんどのヒトＣＤ４＋およびＣＤ８＋ Ｔ細胞が、活性化時に一時的にＦｏｘｐ３を発現することが、現在十分に記録されている。さらにＦｏｘＰ３は、染色前に細胞膜の透過処理を必要とする核マーカーである。したがってこのバイオマーカーを使用すると、生細胞の分離、単離、豊富化、または増大などの後続の処理ステップが妨げられる。
Ｔ細胞のサブセットを選択的に標的とする改善された方法、およびＴｅｆｆ細胞集団を選択的に阻害する方法、ならびに個体における免疫反応を調節する方法の必要性が存在する。さらに、個体における免疫反応を調節するための、免疫抑制性制御性Ｔ細胞の集団を含む組成物を開発する必要がある。
簡単な概要
本開示の態様は、自己免疫疾患、免疫炎症性疾患、または炎症性疾患、移植片対宿主病（ＧＶＨＤ）、または臓器移植拒絶反応を有するヒト対象における、イトリズマブの最適投薬量を決定するための、以下を含む方法を含む：
（ａ）対象からの組織試料中の細胞表面ＣＤ６レベルのベースラインを決定すること、ここで組織試料はＴリンパ球を含み、および任意に、対象における細胞表面ＣＤ６の目標レベルを定義すること；
（ｂ）対象に、一連の２または３投薬量以上のイトリズマブを投与すること、任意に、投薬量を増加すること；
（ｃ）対象からの組織試料中の細胞表面ＣＤ６レベルを、一連の投薬の間でモニタリングすること、ここで組織試料はＴリンパ球を含み；
（ｄ）ステップ（ｃ）の細胞表面ＣＤ６レベルが、（ａ）からのベースラインの約５、１０、１５、２０、２５、３０、４０、４５、もしくは５０パーセント以下であるか、または（ａ）からの任意の目標レベルの約５、１０、１５、もしくは２０パーセント以下であり、かつ細胞表面ＣＤ６レベルのさらなる低下が一連の投薬の間で観察されない場合に、一連の投薬からの最低投薬量を最適投薬量として同定すること。
ある態様は、対象からの組織試料中のＣＤ４細胞および／またはＣＤ８細胞の、細胞表面ＣＤ６レベルを決定することを含む。いくつかの態様において、組織試料は血液試料である。特定の態様は、対象における細胞表面ＣＤ６の目標レベルを、疾患の臨床パラメータまたは症状に基づいて定義することを含む。
さらに含まれるのは、それを必要とするヒト対象における、自己免疫疾患、免疫炎症性疾患、または炎症性疾患、移植片対宿主病（ＧＶＨＤ）、または臓器移植拒絶反応の処置のための投与計画であって、
（ａ）対象からの組織試料中の細胞表面ＣＤ６レベルのベースラインを決定すること、ここで組織試料はＴリンパ球を含み、および任意に、対象における細胞表面ＣＤ６の目標レベルを定義すること；
（ｂ）対象のＴリンパ球における細胞表面ＣＤ６レベルを、（ａ）からのベースラインの約５、１０、１５、２０、２５パーセント以下に低下させる投薬量のイトリズマブを、対象に投与すること；
（ｃ）対象からの組織試料中の細胞表面ＣＤ６レベルをモニタリングすること、ここで組織試料はＴリンパ球を含み；および
（ｄ）（ｃ）の細胞表面ＣＤ６レベルが、（ａ）からのベースラインの約２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、もしくは７５パーセント以上に戻るか、または（ａ）からの目標レベル付近またはそれ以上に上昇する前に、さらなる投薬量のイトリズマブを対象に投与すること、を含む、前記投与計画である。
いくつかの態様において、投与計画は、対象からのＴリンパ球（任意にＣＤ４および／またはＣＤ８細胞）における細胞表面ＣＤ６レベルを、（ａ）からのベースラインの約４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、もしくは７５パーセント以下に、または（ａ）からの任意の目標レベルの約５、１０、１５、もしくは２０パーセント以内に維持し、任意に、対象における細胞表面ＣＤ６の目標レベルを、疾患の臨床パラメータまたは症状に基づいて定義する。
いくつかの態様は、それを必要とするヒト対象における、自己免疫疾患、免疫炎症性疾患、または炎症性疾患、移植片対宿主病（ＧＶＨＤ）、または臓器移植拒絶反応の処置のための、以下を含む投与計画に関する：
（ａ）対象からの血液試料中のＣＤ６ｈｉｇｈＴリンパ球のベースラインレベルを決定すること、および任意に、ＣＤ６ｈｉｇｈＴリンパ球の目標レベルを定義すること；
（ｂ）対象におけるＣＤ６ｈｉｇｈＴリンパ球のレベルを（ａ）からのベースラインの約５、１０、１５、２０、２５、３０、または４０パーセント以下に低下させる投薬量のイトリズマブを、対象に投与すること；
（ｃ）対象からの血液試料中のＣＣＤ６ｈｉｇｈＴリンパ球のレベルをモニタリングすること；および
（ｄ）（ｃ）からのＣＤ６ｈｉｇｈＴリンパ球のレベルが、（ａ）からのベースラインレベルの約２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、もしくは７５パーセント以上に戻るか、または（ａ）からの目標レベル付近またはそれ以上に上昇する前に、さらなる投薬量のイトリズマブを対象に投与すること、任意に、対象におけるＣＤ６ｈｉｇｈＴリンパ球の目標レベルを、疾患の臨床パラメータまたは症状に基づいて定義すること。
いくつかの態様において、投与計画は、対象におけるＣＤ６ｈｉｇｈＴリンパ球のレベルを、（ａ）からのベースラインレベルの約４５、５０、５５、６０、６５、７０、または７５パーセント以下に維持し、任意にここでＴリンパ球は、ＣＤ４細胞および／またはＣＤ８細胞である。いくつかの態様において、投与計画は、対象におけるＣＤ６ｈｉｇｈＴリンパ球：ＣＤ６ｌｏｗＴリンパ球の比率を、対照または標準またはベースラインと比較して、約もしくは少なくとも約１０、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００、２００、３００、４００、５００パーセントもしくはそれ以上、または約もしくは少なくとも約１．５、２、３、４、５、６、７、８、９、１０倍もしくはそれ以上、低下させ、任意にここでＴリンパ球は、ＣＤ４細胞および／またはＣＤ８細胞である。いくつかの態様において、投与計画は、対象におけるＴｅｆｆ：Ｔｒｅｇ細胞の比率を、対照または標準またはベースライン、任意にＣＤ４細胞および／またはＣＤ８細胞と比較して、約もしくは少なくとも約１０、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００、２００、３００、４００、５００パーセントもしくはそれ以上、または約もしくは少なくとも約１．５、２、３、４、５、６、７、８、９、１０倍もしくはそれ以上、低下させ、任意にここでＴｅｆｆ細胞は、Ｔｈ１７細胞である。
ある態様は、ヒト移植患者における移植片対宿主病（ＧＶＨＤ）を予防または改善する方法であって、
（ａ）移植組織を、抗ＣＤ６抗体、任意にイトリズマブと、移植組織中のＣＤ６ｈｉｇｈＴリンパ球上のＣＤ６の細胞表面レベルを低下させるのに十分な時間、インキュベートすること；および
（ｂ）移植組織を患者に移植すること、を含む、前記方法を含む。
いくつかの態様は、移植組織中のＴリンパ球上のＣＤ６の細胞表面レベルを、ステップ（ａ）の前後で決定すること、および、ステップ（ａ）の後のＣＤ６の細胞表面レベルが、ステップ（ａ）の前と比較して、約または少なくとも約１０、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００、２００、３００、４００、５００パーセントまたはそれ以上低下した場合に、ステップ（ｂ）を実施すること、を含む。
いくつかの態様において、移植組織は、臍帯血細胞、骨髄細胞、末梢血細胞、動員末梢血細胞、間葉系幹細胞、造血幹細胞、幹細胞／前駆細胞から分化した細胞、操作された細胞（任意にキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）細胞）、または前記細胞の任意の組み合わせを含む。いくつかの態様において、移植組織は、ヒト移植患者にとって自己由来である。いくつかの態様において、移植組織は、ヒト移植患者にとって同種異系である。
さらに含まれるのは、それを必要とするヒト患者において、自己免疫疾患、免疫炎症性疾患、または炎症性疾患を処置または改善するための方法であって、
（ａ）移植組織を、抗ＣＤ６抗体、任意にイトリズマブと、移植組織中のＣＤ６ｈｉｇｈＴリンパ球上のＣＤ６の細胞表面レベルを低下させるのに十分な時間インキュベートし、それによってＣＤ６ｌｏｗＴリンパ球が豊富な移植組織を生成すること；
（ｂ）（ａ）からの移植組織を、ＣＤ６ｌｏｗＴリンパ球からＴｒｅｇリンパ球を生成するのに十分な時間、処理すること；および
（ｃ）（ｃ）からの移植組織を、患者に移植すること、を含む、前記方法である。
ある態様は、移植組織中のＴリンパ球上のＣＤ６の細胞表面レベルを、ステップ（ａ）の前後に決定すること、および、ステップ（ａ）の後のＣＤ６の細胞表面レベルが、ステップ（ａ）の前と比較して、約または少なくとも約１０、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００、２００、３００、４００、５００パーセントまたはそれ以上低下した場合に、ステップ（ｂ）を実施すること、を含む。いくつかの態様において、ステップ（ｂ）は、ＣＤ６ｌｏｗＴリンパ球が豊富化された移植組織を、サイトカイン、成長因子、および転写因子の組み合わせと共に、Ｔｒｅｇリンパ球を生成するのに十分な時間インキュベートすることを含む。
いくつかの態様において、移植組織は、臍帯血細胞、骨髄細胞、末梢血細胞、動員末梢血細胞、間葉系幹細胞、造血幹細胞、幹細胞／前駆細胞から分化した細胞、操作された細胞（任意にキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）細胞）、または前記細胞の任意の組み合わせを含む。いくつかの態様において、移植組織は、ヒト患者にとって自己由来である。いくつかの態様において、移植組織はヒト患者にとって同種異系である。
さらに含まれるのは、それを必要とするヒト対象における、自己免疫疾患、免疫炎症性疾患、または炎症性疾患、移植片対宿主病（ＧＶＨＤ）、または臓器移植拒絶反応の処置のための方法であって、
（ａ）イトリズマブを対象に投与すること；および
（ｂ）対象からの組織試料中のＴリンパ球上の細胞表面ＣＤ６のレベルを決定すること、対象からの組織試料中のＣＤ６ｈｉｇｈおよび任意にＣＤ６ｌｏｗＴリンパ球のレベルを決定すること、および／または対象からの組織試料中のＴｅｆｆおよびＴｒｅｇ細胞のレベルを決定すること、ここで組織試料は、Ｔリンパ球を含む；を含み、
ここで、イトリズマブの投与が、（ｉ）Ｔリンパ球上の、任意にＣＤ４および／またはＣＤ８細胞上の細胞表面ＣＤ６レベル；（ｉｉ）対象におけるＣＤ６ｈｉｇｈＴリンパ球のレベル；（ｉｉｉ）対象におけるＣＤ６ｈｉｇｈ：ＣＤ６ｌｏｗＴリンパ球の比率；および／または（ｉｖ）対象におけるＴｅｆｆ：Ｔｒｅｇ細胞の比率；のいずれか１つ以上を低下させ、それによって対象における病原性免疫応答を低下させる、前記方法である。
いくつかの態様において、イトリズマブの投与は：
対象におけるＴリンパ球上の細胞表面ＣＤ６レベルを、対照、標準、またはベースラインと比較して、約または少なくとも約１０、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００、２００、３００、４００、５００パーセントまたはそれ以上低下させ、任意にここで、Ｔリンパ球はＣＤ４細胞および／またはＣＤ８細胞であり；
対象におけるＣＤ６ｈｉｇｈＴリンパ球のレベルを、対照、標準、またはベースラインと比較して、約または少なくとも約１０、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００、２００、３００、４００、５００パーセントまたはそれ以上低下させ、任意にここで、Ｔリンパ球はＣＤ４細胞および／またはＣＤ８細胞であり；
対象におけるＣＤ６ｈｉｇｈ：ＣＤ６ｌｏｗＴリンパ球の比率を、対照、標準、またはベースラインと比較して、約もしくは少なくとも約１０、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００、２００、３００、４００、５００パーセントもしくはそれ以上、または約もしくは少なくとも約１．５、２、３、４、５、６、７、８、９、１０倍もしくはそれ以上、低下させ、任意にここで、Ｔリンパ球はＣＤ４細胞および／またはＣＤ８細胞であり；および／または
対象におけるＴｅｆｆ：Ｔｒｅｇ細胞の比率を、対照、標準、またはベースラインと比較して、約もしくは少なくとも約１０、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００、２００、３００、４００、５００パーセントもしくはそれ以上、または約もしくは少なくとも約１．５、２、３、４、５、６、７、８、９、１０倍もしくそれ以上、低下させ、任意にここで、Ｔｅｆｆ細胞はＴｈ１７細胞である。
特定の態様は、イトリズマブの試験ロットを分析するためのin vitro細胞ベースの（すなわち、細胞培養物ベースの）方法であって、以下を含む方法を含む：
（ａ）イトリズマブの試験ロットを、細胞表面でＣＤ６を発現する細胞とインキュベートすること；
（ｂ）細胞上の細胞表面ＣＤ６発現を測定すること；および
（ｃ）試験ロットが、細胞表面ＣＤ６発現を、対照または標準と比較して減少させる場合には、イトリズマブの試験ロットを医薬組成物として製剤化すること、および試験ロットが、細胞表面ＣＤ６発現を、対照または標準と比較して減少させない場合には、イトリズマブの試験ロットを棄却すること。
いくつかの態様において、ステップ（ｂ）は、細胞表面ＣＤ６発現を、フローサイトメトリー、飛行時間型サイトメトリー（ＣｙＴｏＦ）、細胞ＥＬＩＳＡ、または免疫蛍光顕微鏡法によって直接測定することを含むか、または（ｂ）は、上清中の可溶性ＣＤ６を、細胞表面ＣＤ６発現の指標として、任意に酵素結合免疫吸着測定法（ＥＬＩＳＡ）、化学発光アッセイ、電気化学発光アッセイ、高速液体クロマトグラフィー、ウェスタンブロット、または免疫沈降とそれに続くウェスタンブロットにより測定することを含む。いくつかの態様において、細胞は、末梢血単核球（ＰＢＭＣ）を含む。いくつかの態様において、細胞は、ヒトＴ細胞株、または、ＣＤ６、任意にヒトＣＤ６を発現するように操作された細胞株を含む。いくつかの態様において、細胞株は、MOLT-4、MOLT-3、MOLT-16、HuT 78、HuT 102、Jurkat、Jurkat NFAT、CCRF-CEM、12.1、MJ(G11)、LOUCY、SUP-T1、HEL.92.1.7、EF0-21、RPMI-8226、HPB-ALL、HH、KE37、P12ICHIKAWA、PEER、ALLSIL、RPMI8402、CMLT1、PF382、EHEB、およびDU4475細胞から選択される。いくつかの態様において、細胞は、単球、任意に単球細胞株を含む。いくつかの態様において、単球細胞株は、U937、THP1、MC-1010、TUR、AML-193、およびMV-4-11から選択される。いくつかの態様において、（ａ）ヒトＴ細胞株またはＣＤ６を発現するように操作された細胞株および（ｂ）単球、任意に単球細胞株は、約３０：１、２５：１、２０：１、１５：１、１０：１、５：１、４：１、３：１、２：１、１：１、１：２、１：３、１：４、１：５、または１：１０の比率で存在する。
ある態様は、イトリズマブの試験ロットを、これが細胞表面ＣＤ６発現を、対照または標準と比較して、約もしくは少なくとも約１０、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００、２００、３００、４００、５００パーセントもしくはそれ以上減少させる場合、および／または、これが上清中の可溶性ＣＤ６を、対照または標準と比較して、約もしくは少なくとも約１０、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００、２００、３００、４００、５００パーセントもしくはそれ以上増加させる場合に、医薬組成物として製剤化することを含む。
さらに含まれるのは、生物学的治療薬として使用するための、抗ＣＤ６抗体またはその抗原結合性断片をスクリーニングする方法であって、
（ａ）候補抗ＣＤ６抗体またはその抗原結合性断片を、細胞表面上でＣＤ６を発現する細胞とインキュベートすること；
（ｂ）細胞上の細胞表面ＣＤ６発現を測定すること；および
（ｃ）候補抗ＣＤ６抗体またはその抗原結合性断片を、これが細胞表面ＣＤ６発現を対照または標準と比較して減少させる場合、医薬組成物として製剤化すること、を含む、前記方法である。
いくつかの態様において、ステップ（ｂ）は、細胞表面ＣＤ６発現を、フローサイトメトリー、飛行時間型サイトメトリー（ＣｙＴｏＦ）、細胞ＥＬＩＳＡ、または免疫蛍光顕微鏡法によって直接測定することを含むか、または（ｂ）は、上清中の可溶性ＣＤ６を、細胞表面ＣＤ６発現の指標として、任意に酵素結合免疫吸着測定法（ＥＬＩＳＡ）、化学発光アッセイ、電気化学発光アッセイ、高速液体クロマトグラフィー、ウェスタンブロット、または免疫沈降とそれに続くウェスタンブロットにより測定することを含む。いくつかの態様において、細胞は、末梢血単核球（ＰＢＭＣ）を含む。いくつかの態様において、細胞は、ヒトＴ細胞株、または、ＣＤ６、任意にヒトＣＤ６を発現するように操作された細胞株を含む。いくつかの態様において、細胞株は、MOLT-4、MOLT-3、MOLT-16、HuT 78、HuT 102、Jurkat、Jurkat NFAT、CCRF-CEM、12.1、MJ(G11)、LOUCY、SUP-T1、HEL.92.1.7、EF0-21、RPMI-8226、HPB-ALL、HH、KE37、P12ICHIKAWA、PEER、ALLSIL、RPMI8402、CMLT1、PF382、EHEB、およびDU4475細胞から選択される。いくつかの態様において、細胞は、単球、任意に単球細胞株を含む。いくつかの態様において、単球細胞株は、U937、THP1、MC-1010、TUR、AML-193、およびMV-4-11から選択される。いくつかの態様において、（ａ）ヒトＴ細胞株またはＣＤ６を発現するように操作された細胞株および（ｂ）単球、任意に単球細胞株は、約３０：１、２５：１、２０：１、１５：１、１０：１、５：１、４：１、３：１、２：１、１：１、１：２、１：３、１：４、１：５、または１：１０の比率で存在する。
ある態様は、候補抗ＣＤ６抗体またはその抗原結合性断片を、これが細胞表面ＣＤ６発現を、対照または標準と比較して、約もしくは少なくとも約１０、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００、２００、３００、４００、５００パーセントもしくはそれ以上減少させる場合、および／または、これが上清中の可溶性ＣＤ６を、対照または標準と比較して、約もしくは少なくとも約１０、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００、２００、３００、４００、５００パーセントもしくはそれ以上増加させる場合に、医薬組成物として製剤化することを含む。
ある方法または投薬計画において、自己免疫疾患、免疫炎症性疾患、または炎症性疾患の対象または患者は、標準的または健康な対象と比較して、Ｔｅｆｆ：Ｔｒｅｇ細胞の増加した比率を有し、ここでＴｅｆｆ細胞はＴｈ１７細胞である。いくつかの態様において、Ｔｅｆｆ：Ｔｒｅｇ細胞の比率は、標準的または健康な対象と比較して、約または少なくとも約１．５、２、３、４、５、６、７、８、９または１０倍またはそれ以上増加される。いくつかの態様において、自己免疫疾患、免疫炎症性疾患、または炎症性疾患は、炎症性腸疾患（ＩＢＤ）、任意にクローン病または潰瘍性大腸炎、全身性エリテマトーデス（ＳＬＥ）、任意にループス腎炎を伴うＳＬＥ、関節リウマチ（ＲＡ）、多発性硬化症（ＭＳ）、乾癬、乾癬性関節炎、強直性脊椎炎、または喘息である。
図面の簡単な説明
イトリズマブは、細胞表面ＣＤ６発現の損失を引き起こす。図１は、アイソタイプ対照と比較した、ＣＤ４＋ＣＤ４５ＲＡ－細胞（エフェクターおよびメモリーＣＤ４ Ｔ細胞）におけるイトリズマブによる単回処理後のＣＤ６の表面発現レベル、および、１０分以降から２４時間にわたる細胞表面ＣＤ６の損失を、フローサイトメトリーで測定して示す。 イトリズマブは、in vitroでＣＤ４およびＣＤ８ Ｔ細胞におけるＣＤ６発現の用量依存的な損失を引き起こす。図２Ａ～２Ｄは、４つの異なる濃度：０．０１、０．１、１、１０、および１００μｇ／ｍＬのイトリズマブで処理した後の細胞表面ＣＤ６の平均蛍光強度のグラフである。図２Ａは、ＣＤ４＋ＣＤ４５ＲＡ＋細胞（ナイーブＴ細胞）であり；図２Ｂは、ＣＤ４＋ＣＤ４５ＲＡ－細胞であり；図２Ｃは、ＣＤ８＋ＣＤ４５ＲＡ＋細胞（ナイーブＣＤ８ Ｔ細胞）であり；図２Ｄは、ＣＤ８＋ＣＤ４５ＲＡ－細胞（エフェクターおよびメモリーＣＤ８ Ｔ細胞）である。それぞれにおいて、細胞表面ＣＤ６の平均蛍光強度は、アイソタイプ（１０μｇ／ｍＬ）処理の細胞に対して正規化されている。 イトリズマブは、in vitroでＣＤ４およびＣＤ８ Ｔ細胞におけるＣＤ６発現の用量依存的な損失を引き起こす。図２Ａ～２Ｄは、４つの異なる濃度：０．０１、０．１、１、１０、および１００μｇ／ｍＬのイトリズマブで処理した後の細胞表面ＣＤ６の平均蛍光強度のグラフである。図２Ａは、ＣＤ４＋ＣＤ４５ＲＡ＋細胞（ナイーブＴ細胞）であり；図２Ｂは、ＣＤ４＋ＣＤ４５ＲＡ－細胞であり；図２Ｃは、ＣＤ８＋ＣＤ４５ＲＡ＋細胞（ナイーブＣＤ８ Ｔ細胞）であり；図２Ｄは、ＣＤ８＋ＣＤ４５ＲＡ－細胞（エフェクターおよびメモリーＣＤ８ Ｔ細胞）である。それぞれにおいて、細胞表面ＣＤ６の平均蛍光強度は、アイソタイプ（１０μｇ／ｍＬ）処理の細胞に対して正規化されている。 図２Ｅは、細胞表面のＣＤ６の損失（左のグラフ）が、電気化学発光アッセイによる上清中の可溶性ＣＤ６（ｓＣＤ６）の増加と相関していること（右のグラフ）を示す。ここでは、３名の異なるドナーからのＰＢＭＣを１０μｇ／ｍＬのイトリズマブとインキュベートし、ＣＤ４ Ｔ細胞におけるＣＤ６の細胞表面発現（左のグラフ）を評価し、ＰＢＭＣ上清中の可溶性ＣＤ６（右のグラフ）を指定の時点で定量化した。フローサイトメトリーによって評価された、ベースラインでのＣＤ４ Ｔ細胞上のＣＤ６受容体の計算数を使用して、３名のドナーにわたり値を正規化した。＊＊＊ｐ＜０．００１、＊＊ｐ＜０．０１、＊ｐ＜０．０５。
イトリズマブで処置した患者は、ＣＤ４およびＣＤ８ Ｔ細胞上の減少したＣＤ６発現を有する。図３Ａ～３Ｊは、イトリズマブで処置したＧＶＨＤ患者から単離されたすべてのＣＤ４陽性細胞およびすべてのＣＤ８陽性細胞において測定された、ベースラインのパーセンテージとしての細胞表面ＣＤ６の平均蛍光強度をＹ軸に、初回処置後の日数をＸ軸に表したグラフを示す。図３Ａ～３Ｄは、隔週投与される０．４ｍｇ／ｋｇのイトリズマブの１～５用量で処置した４名の患者である。図３Ａは、１、１５、２９、４３、および５７日目に０．４ｍｇ／ｋｇのイトリズマブで処置した患者のベースラインと比較した、ＣＤ４およびＣＤ８陽性細胞における細胞表面ＣＤ６のパーセンテージのグラフである。図３Ｂは、１、１５、および２９日目に０．４ｍｇ／ｋｇのイトリズマブで処置した患者のベースラインと比較した、ＣＤ４およびＣＤ８陽性細胞における細胞表面ＣＤ６のパーセンテージのグラフである。 イトリズマブで処置した患者は、ＣＤ４およびＣＤ８ Ｔ細胞上の減少したＣＤ６発現を有する。図３Ａ～３Ｊは、イトリズマブで処置したＧＶＨＤ患者から単離されたすべてのＣＤ４陽性細胞およびすべてのＣＤ８陽性細胞において測定された、ベースラインのパーセンテージとしての細胞表面ＣＤ６の平均蛍光強度をＹ軸に、初回処置後の日数をＸ軸に表したグラフを示す。図３Ａ～３Ｄは、隔週投与される０．４ｍｇ／ｋｇのイトリズマブの１～５用量で処置した４名の患者である。図３Ｃは、１、１５、２９、４３、および５７日目に０．４ｍｇ／ｋｇのイトリズマブで処置した患者のベースラインと比較した、ＣＤ４およびＣＤ８陽性細胞における細胞表面ＣＤ６のパーセンテージのグラフである。図３Ｄは、１日目に０．４ｍｇ／ｋｇのイトリズマブで処置した患者のベースラインと比較した、ＣＤ４およびＣＤ８陽性細胞における細胞表面ＣＤ６のパーセンテージのグラフである。 イトリズマブで処置した患者は、ＣＤ４およびＣＤ８ Ｔ細胞上の減少したＣＤ６発現を有する。図３Ａ～３Ｊは、イトリズマブで処置したＧＶＨＤ患者から単離されたすべてのＣＤ４陽性細胞およびすべてのＣＤ８陽性細胞において測定された、ベースラインのパーセンテージとしての細胞表面ＣＤ６の平均蛍光強度をＹ軸に、初回処置後の日数をＸ軸に表したグラフを示す。図３Ｅ～３Ｇは、隔週投与または断続的に隔週投与の０．８ｍｇ／ｋｇのイトリズマブの２～４用量で処置した、３名の患者である。図３Ｅは、１、１５、および２９日目に０．８ｍｇ／ｋｇのイトリズマブで処置した患者のベースラインと比較した、ＣＤ４およびＣＤ８陽性細胞における細胞表面ＣＤ６のパーセンテージのグラフである。図３Ｆは、１、１５、４３、および５７日目に０．８ｍｇ／ｋｇのイトリズマブで処置した患者のベースラインと比較した、ＣＤ４およびＣＤ８陽性細胞の細胞表面ＣＤ６のパーセンテージのグラフである。 イトリズマブで処置した患者は、ＣＤ４およびＣＤ８ Ｔ細胞上の減少したＣＤ６発現を有する。図３Ａ～３Ｊは、イトリズマブで処置したＧＶＨＤ患者から単離されたすべてのＣＤ４陽性細胞およびすべてのＣＤ８陽性細胞において測定された、ベースラインのパーセンテージとしての細胞表面ＣＤ６の平均蛍光強度をＹ軸に、初回処置後の日数をＸ軸に表したグラフを示す。図３Ｅ～３Ｇは、隔週投与または断続的に隔週投与の０．８ｍｇ／ｋｇのイトリズマブの２～４用量で処置した、３名の患者である。図３Ｇは、１および１５日目に０．８ｍｇ／ｋｇのイトリズマブで処置した患者のベースラインと比較した、ＣＤ４およびＣＤ８陽性細胞における細胞表面ＣＤ６のパーセンテージのグラフである。図３Ｈ～３Ｊは、隔週投与の１．６ｍｇ／ｋｇのイトリズマブの２～５用量で処置した、３名の患者である。図３Ｈは、１、１５、２９、４３、および５７日目に１．６ｍｇ／ｋｇのイトリズマブで処置した患者のベースラインと比較した、ＣＤ４およびＣＤ８陽性細胞における細胞表面ＣＤ６のパーセンテージのグラフである。 イトリズマブで処置した患者は、ＣＤ４およびＣＤ８ Ｔ細胞上の減少したＣＤ６発現を有する。図３Ａ～３Ｊは、イトリズマブで処置したＧＶＨＤ患者から単離されたすべてのＣＤ４陽性細胞およびすべてのＣＤ８陽性細胞において測定された、ベースラインのパーセンテージとしての細胞表面ＣＤ６の平均蛍光強度をＹ軸に、初回処置後の日数をＸ軸に表したグラフを示す。図３Ｈ～３Ｊは、隔週投与の１．６ｍｇ／ｋｇのイトリズマブの２～５用量で処置した、３名の患者である。図３Ｉは、１および１５日目に１．６ｍｇ／ｋｇのイトリズマブで処置した患者のベースラインと比較した、ＣＤ４およびＣＤ８陽性細胞における細胞表面ＣＤ６のパーセンテージのグラフである。図３Ｊは、１、１５、２９、および４３日目に１．６ｍｇ／ｋｇのイトリズマブで処置した患者のベースラインと比較した、ＣＤ４およびＣＤ８陽性細胞における細胞表面ＣＤ６のパーセンテージのグラフである。
イトリズマブ処置患者における用量反応性のＣＤ６損失。図４Ａ～４Ｄは、０．４ｍｇ／ｋｇ、０．８ｍｇ／ｋｇ、および１．６ｍｇ／ｋｇのイトリズマブで処置した患者（各グラフの左から右の部分）の細胞表面ＣＤ６の平均蛍光強度の棒グラフである。図４Ａは、０．４ｍｇ／ｋｇ、０．８ｍｇ／ｋｇ、または１．６ｍｇ／ｋｇのイトリズマブの１回投与の２４時間後の、ＣＤ４陽性細胞およびＣＤ８陽性細胞におけるベースラインと比較した、ＣＤ６表面発現の棒グラフである。図４Ｂは、０．４ｍｇ／ｋｇ、０．８ｍｇ／ｋｇ、または１．６ｍｇ／ｋｇのイトリズマブの１回投与後の８日目の、ＣＤ４陽性細胞およびＣＤ８陽性細胞におけるベースラインと比較した、表面ＣＤ６発現のパーセント強度の棒グラフである。 イトリズマブ処置患者における用量反応性のＣＤ６損失。図４Ａ～４Ｄは、０．４ｍｇ／ｋｇ、０．８ｍｇ／ｋｇ、および１．６ｍｇ／ｋｇのイトリズマブで処置した患者（各グラフの左から右の部分）の細胞表面ＣＤ６の平均蛍光強度の棒グラフである。図４Ｃは、０．４ｍｇ／ｋｇ、０．８ｍｇ／ｋｇ、または１．６ｍｇ／ｋｇのイトリズマブの１回投与後の１５日目の、ＣＤ４陽性細胞およびＣＤ８陽性細胞におけるベースラインと比較した、表面ＣＤ６発現のパーセント強度の棒グラフである。図４Ｄは、０．４ｍｇ／ｋｇ、０．８ｍｇ／ｋｇ、または１．６ｍｇ／ｋｇのイトリズマブの隔週での２回投与後の２９日目の、ＣＤ４陽性細胞およびＣＤ８陽性細胞におけるベースラインと比較した、表面ＣＤ６発現のパーセント強度の棒グラフである。
イトリズマブの結合は、ＣＤ６の損失速度よりも早く減少する。図５Ａ～５Ｆは、２つの異なる濃度のイトリズマブでの２つの異なる細胞型における、非結合受容体および非競合抗ＣＤ６抗体クローンに結合した受容体の両方の、各時点でＣＤ６標識を示す陽性事象のパーセンテージのデータポイントをプロットしたものである。未結合の受容体（四角）は、蛍光標識されたイトリズマブで細胞を染色することにより、各時点で検出される。蛍光標識されたイトリズマブは、ＣＤ６が未だに細胞表面に存在する非標識イトリズマブによってまだ結合されていない、すべての利用可能なＣＤ６に結合する。独自の非競合抗体（丸）の結合を使用して、各時点での細胞表面の総ＣＤ６レベルを検出する。細胞をイトリズマブで処理すると、表面ＣＤ６の総レベルが低下し、これは未結合の受容体（四角）の量の減少にも反映される。ＣＤ６の損失の速度は、各線の１０～１２０分の傾きを取得することによって計算される。図５Ａは、ＣＤ４＋ＣＤ４５ＲＡ＋細胞の１．０μｇ／ｍＬアイソタイプによる処理後のデータポイントをプロットし、計算された傾きは、抗体結合受容体および非結合受容体について、それぞれ０．００および－０．０１である。図５Ｂは、ＣＤ４＋ＣＤ４５ＲＡ＋細胞の０．１μｇ／ｍＬのイトリズマブによる処理後のデータポイントをプロットし、計算された傾きは、抗体結合受容体および非結合受容体について、それぞれ－０．０５および－０．１８である。 イトリズマブの結合は、ＣＤ６の損失速度よりも早く減少する。図５Ａ～５Ｆは、２つの異なる濃度のイトリズマブでの２つの異なる細胞型における、非結合受容体および非競合抗ＣＤ６抗体クローンに結合した受容体の両方の、各時点でＣＤ６標識を示す陽性事象のパーセンテージのデータポイントをプロットしたものである。未結合の受容体（四角）は、蛍光標識されたイトリズマブで細胞を染色することにより、各時点で検出される。蛍光標識されたイトリズマブは、ＣＤ６が未だに細胞表面に存在する非標識イトリズマブによってまだ結合されていない、すべての利用可能なＣＤ６に結合する。独自の非競合抗体（丸）の結合を使用して、各時点での細胞表面の総ＣＤ６レベルを検出する。細胞をイトリズマブで処理すると、表面ＣＤ６の総レベルが低下し、これは未結合の受容体（四角）の量の減少にも反映される。ＣＤ６の損失の速度は、各線の１０～１２０分の傾きを取得することによって計算される。図５Ｃは、ＣＤ４＋ＣＤ４５ＲＡ＋細胞の１．０μｇ／ｍＬのイトリズマブによる処理後のデータポイントをプロットし、計算された傾きは、抗体結合受容体および非結合受容体について、それぞれ－０．２０および－０．３３である。図５Ｄは、ＣＤ４＋ＣＤ４５ＲＡ－細胞の１．０μｇ／ｍＬアイソタイプによる処理後のデータポイントをプロットし、計算された傾きは、抗体結合受容体および非結合受容体について、それぞれ０．００および－０．０３である。 イトリズマブの結合は、ＣＤ６の損失速度よりも早く減少する。図５Ａ～５Ｆは、２つの異なる濃度のイトリズマブでの２つの異なる細胞型における、非結合受容体および非競合抗ＣＤ６抗体クローンに結合した受容体の両方の、各時点でＣＤ６標識を示す陽性事象のパーセンテージのデータポイントをプロットしたものである。未結合の受容体（四角）は、蛍光標識されたイトリズマブで細胞を染色することにより、各時点で検出される。蛍光標識されたイトリズマブは、ＣＤ６が未だに細胞表面に存在する非標識イトリズマブによってまだ結合されていない、すべての利用可能なＣＤ６に結合する。独自の非競合抗体（丸）の結合を使用して、各時点での細胞表面の総ＣＤ６レベルを検出する。細胞をイトリズマブで処理すると、表面ＣＤ６の総レベルが低下し、これは未結合の受容体（四角）の量の減少にも反映される。ＣＤ６の損失の速度は、各線の１０～１２０分の傾きを取得することによって計算される。図５Ｅは、ＣＤ４＋ＣＤ４５ＲＡ－細胞の０．１μｇ／ｍＬのイトリズマブによる処理後のデータポイントをプロットし、計算された傾きは、抗体結合受容体および非結合受容体について、それぞれ－０．０９および－０．３０である。図５Ｆは、ＣＤ４＋ＣＤ４５ＲＡ－細胞の１．０μｇ／ｍＬのイトリズマブによる処理後のデータポイントをプロットし、計算された傾きは、抗体結合受容体および非結合受容体について、それぞれ－０．３６および－０．４９である。
イトリズマブの受容体占有率は、図６Ａ～６Ｄに示すように、細胞表面ＣＤ６の密度および量が低い細胞ではより低い。フローサイトメトリーで測定したところ、図６Ａは、ＣＤ８細胞の細胞表面ＣＤ６レベルがＣＤ４細胞と比較して低いことを示し、図６Ｂは、イトリズマブが、ＣＤ４細胞に対するよりもはるかに低い占有率でＣＤ８細胞に結合することを示す（細胞はすべて同じチューブ内でインキュベートおよび染色した）。ここで、イトリズマブが細胞表面密度に関係なくＣＤ６に結合する場合、占有率％（イトリズマブが結合するＣＤ６分子の割合）は、ＣＤ８細胞でも同じかそれ以上になるはずである。しかし、ＣＤ８ Ｔ細胞での占有率％はＣＤ４ Ｔ細胞よりも低く、イトリズマブ結合が細胞表面ＣＤ６密度の影響を受けることを証明する。 イトリズマブの受容体占有率は、図６Ａ～６Ｄに示すように、細胞表面ＣＤ６の密度および量が低い細胞ではより低い。図６Ｃは、占有率が、投与された患者で低いことを示す。点線は、各患者における可能な限り最高の受容体占有率を決定するために、５０μｇ／ｍｌのイトリズマブをスパイクした後の、投与前１日目のベースラインにおける血液を示す。ＣＤ４ Ｔ細胞上のＣＤ６平均蛍光強度は、１日目には高いが、最初の投与から２４時間以内に減少し、細胞表面ＣＤ６の減少を示す。ＣＤ６は、投与後もＣＤ４ Ｔ細胞上で検出可能である（ＭＦＩおよび対照に対するゲートによって示される、四角印）；しかし、受容体占有率（丸印）は本質的に、イトリズマブがほとんどまたはまったく結合していないことを示す。イトリズマブが受容体密度に関係なくＣＤ６に結合できるのであれば、ある程度の占有率が期待される。 イトリズマブの受容体占有率は、図６Ａ～６Ｄに示すように、細胞表面ＣＤ６の密度および量が低い細胞ではより低い。図６Ｄは、ＣＤ６が存在する場合に占有が検出されることを示す。正常な対象からの全血を、ＥＤＴＡまたはクエン酸ナトリウムを含有するチューブに採取し、イトリズマブと共に２５分間インキュベートした。次に血液を溶解し、細胞の受容体占有率を分析した。
イトリズマブは、ＣＤ４ Ｔ細胞の末梢での減少を誘導する。図７Ａ～７Ｄは、イトリズマブによる処置後の患者におけるＣＤ４＋Ｔ細胞の末梢での減少を示し、これは、末梢血採取からＣＤ４＋細胞を測定し、４つの異なる条件（プラセボおよび１．６、２．４、および３．６ｍｇ／ｋｇのイトリズマブ）に対し６名の異なる患者についてベースラインのパーセントとして計算することによる。図７Ａは、ベースラインを１日目に確立し、プラセボによる処置後の８日目および１５日目におけるベースラインのパーセントの変化を示す。図７Ｂは、ベースラインを１日目に確立し、１．６ｍｇ／ｋｇのイトリズマブによる処置後の８日目および１５日目におけるベースラインのパーセントの変化を示す。 イトリズマブは、ＣＤ４ Ｔ細胞の末梢での減少を誘導する。図７Ａ～７Ｄは、イトリズマブによる処置後の患者におけるＣＤ４＋Ｔ細胞の末梢での減少を示し、これは、末梢血採取からＣＤ４＋細胞を測定し、４つの異なる条件（プラセボおよび１．６、２．４、および３．６ｍｇ／ｋｇのイトリズマブ）に対し６名の異なる患者についてベースラインのパーセントとして計算することによる。図７Ｃは、ベースラインを１日目に確立し、２．４ｍｇ／ｋｇのイトリズマブでの処置後の８日目および１５日目におけるベースラインのパーセントの変化を示す。図７Ｄは、ベースラインを１日目に確立し、３．２ｍｇ／ｋｇのイトリズマブでの処置後の８日目および１５日目におけるベースラインのパーセントの変化を示す。
イトリズマブは、ＣＤ８ Ｔ細胞の末梢での減少を誘導する。図８Ａ～８Ｄは、イトリズマブによる処置後の患者におけるＣＤ８＋Ｔ細胞の末梢での減少を示し、これは、末梢血採取からＣＤ８＋細胞を測定し、４つの異なる条件（プラセボおよび１．６、２．４、および３．６ｍｇ／ｋｇのイトリズマブ）に対し６名の異なる患者についてベースラインのパーセントとして計算することによる。図８Ａは、ベースラインを１日目に確立し、プラセボによる処置後の８日目および１５日目における、ベースラインのパーセントの変化を示す。図８Ｂは、ベースラインを１日目に確立し、１．６ｍｇ／ｋｇのイトリズマブによる処置後の８日目および１５日目における、ベースラインのパーセントの変化を示す。 イトリズマブは、ＣＤ８ Ｔ細胞の末梢での減少を誘導する。図８Ａ～８Ｄは、イトリズマブによる処置後の患者におけるＣＤ８＋Ｔ細胞の末梢での減少を示し、これは、末梢血採取からＣＤ８＋細胞を測定し、４つの異なる条件（プラセボおよび１．６、２．４、および３．６ｍｇ／ｋｇのイトリズマブ）に対し６名の異なる患者についてベースラインのパーセントとして計算することによる。図８Ｃは、ベースラインを１日目に確立し、２．４ｍｇ／ｋｇのイトリズマブでの処置後の８日目および１５日目におけるベースラインのパーセントの変化を示す。図８Ｄは、ベースラインを１日目に確立し、３．２ｍｇ／ｋｇのイトリズマブでの処置後の８日目および１５日目における、ベースラインのパーセントの変化を示す。
末梢Ｔｒｅｇ数は、イトリズマブ処置の影響を受けない。図９Ａ～９Ｄは、４つの処置条件：プラセボ、１．６ｍｇ／ｋｇイトリズマブ、２．４ｍｇ／ｋｇイトリズマブ、および３．２ｍｇ／ｋｇイトリズマブの後の、１日目（ベースライン）のＴｒｅｇ細胞数のパーセンテージとして計算された、８日目および１５日目の変化を示す。図９Ａは、プラセボで処置した対照群の、Ｔｒｅｇ細胞数のばらつきを示す。図９Ｂは、１．６ｍｇ／ｋｇイトリズマブによる処置後８日目および１５日目における６名の異なる患者の、ベースラインのパーセントの変化を示す。 末梢Ｔｒｅｇ数は、イトリズマブ処置の影響を受けない。図９Ａ～９Ｄは、４つの処置条件：プラセボ、１．６ｍｇ／ｋｇイトリズマブ、２．４ｍｇ／ｋｇイトリズマブ、および３．２ｍｇ／ｋｇイトリズマブの後の、１日目（ベースライン）のＴｒｅｇ細胞数のパーセンテージとして計算された、８日目および１５日目の変化を示す。図９Ｃは、２．４ｍｇ／ｋｇのイトリズマブによる処置後８日目および１５日目における６名の異なる患者の、ベースラインのパーセントの変化を示す。図９Ｄは、３．２ｍｇ／ｋｇのイトリズマブによる処置後８日目および１５日目における６名の異なる患者についての、ベースラインのパーセントの変化を示す。
イトリズマブは、ＣＤ４：Ｔｒｅｇ細胞の比率を低下させる。図１０Ａ～１０Ｄは、４つの処置条件：プラセボ、１．６ｍｇ／ｋｇイトリズマブ、２．４ｍｇ／ｋｇイトリズマブ、および３．２ｍｇ／ｋｇのイトリズマブの後の、８日目および１５日目の、６名の患者におけるＣＤ４＋ Ｔ細胞対Ｔｒｅｇ細胞の比率における、１日目のベースラインからの変化を示す。図１０Ａは、プラセボによる処置後の、ベースラインのパーセンテージとしてのＣＤ４：Ｔｒｅｇの比率を示す。図１０Ｂは、１．６ｍｇ／ｋｇのイトリズマブによる処置後の、ベースラインのパーセンテージとしてのＣＤ４：Ｔｒｅｇの比率を示す。 イトリズマブは、ＣＤ４：Ｔｒｅｇ細胞の比率を低下させる。図１０Ａ～１０Ｄは、４つの処置条件：プラセボ、１．６ｍｇ／ｋｇイトリズマブ、２．４ｍｇ／ｋｇイトリズマブ、および３．２ｍｇ／ｋｇのイトリズマブの後の、８日目および１５日目の、６名の患者におけるＣＤ４＋ Ｔ細胞対Ｔｒｅｇ細胞の比率における、１日目のベースラインからの変化を示す。図１０Ｃは、２．４ｍｇ／ｋｇのイトリズマブによる処置後の、ベースラインのパーセンテージとしてのＣＤ４：Ｔｒｅｇの比率を示す。図１０Ｄは、３．２ｍｇ／ｋｇのイトリズマブによる処置後の、ベースラインのパーセンテージとしてのＣＤ４：Ｔｒｅｇの比率を示す。
イトリズマブで処置した患者におけるＴｒｅｇ：ＣＤ４ Ｔ細胞の比率の増加。図１１Ａ～１１Ｄは、０．８ｍｇ／ｋｇのイトリズマブまたはプラセボによる処置後の患者の１、８、１５、２９、および５７日目における、Ｔｒｅｇ：ＣＤ４細胞の比率およびＴｈ１７：ＣＤ４細胞の比率を示す。データの収集は、凍結保存したＰＢＭＣを指定された時点で取り出し、ＤＮＡを単離し、ＤＮＡ内の細胞型特異的エピジェネティックマーカーを、独自のｑＰＣＲアッセイであるEpiontis IDを用いて測定して行った。図１１Ａは、イトリズマブ処置後のＴｒｅｇ：ＣＤ４比率を示し、図１１Ｂは、プラセボ処置後の同じ比率を示す。図１１Ｃは、イトリズマブ処置後のＴｈ１７：ＣＤ４比率を示し、図１１Ｄは、プラセボ処置後の同じ比率を示す。
イトリズマブは、ＣＤ６の密度が高くなるほど、結合のオフレート（off rate）が遅くなる。図１２Ａ～１２Ｆは、表面プラズモン共鳴の３つの異なるＣＤ６密度についての、イトリズマブ（上の線）およびイトリズマブｆａｂ（下の線）のオフレート時間を示す。低密度は、平方マイクロメートルあたり７個のｒｈｕ ＣＤ６と１２０の結合部位からなる。中密度は、平方マイクロメートル当たり５５のｒｈｕ ＣＤ６と７８３の結合部位からなる。高密度は、平方マイクロメートルあたり２５５のｒｈｕ ＣＤ６と３４９３の結合部位からなる。図１２Ａは、低密度チップの２０００秒にわたるオフレートを示す。図１２Ｂは、中密度チップの２０００秒にわたるオフレートを示す。 イトリズマブは、ＣＤ６の密度が高くなるほど、結合のオフレート（off rate）が遅くなる。図１２Ａ～１２Ｆは、表面プラズモン共鳴の３つの異なるＣＤ６密度についての、イトリズマブ（上の線）およびイトリズマブｆａｂ（下の線）のオフレート時間を示す。低密度は、平方マイクロメートルあたり７個のｒｈｕ ＣＤ６と１２０の結合部位からなる。中密度は、平方マイクロメートル当たり５５のｒｈｕ ＣＤ６と７８３の結合部位からなる。高密度は、平方マイクロメートルあたり２５５のｒｈｕ ＣＤ６と３４９３の結合部位からなる。図１２Ｃは、高密度チップの２０００秒にわたるオフレートを示す。図１２Ｄは、低密度チップの１２０００秒にわたるオフレートを示す。 イトリズマブは、ＣＤ６の密度が高くなるほど、結合のオフレート（off rate）が遅くなる。図１２Ａ～１２Ｆは、表面プラズモン共鳴の３つの異なるＣＤ６密度についての、イトリズマブ（上の線）およびイトリズマブｆａｂ（下の線）のオフレート時間を示す。低密度は、平方マイクロメートルあたり７個のｒｈｕ ＣＤ６と１２０の結合部位からなる。中密度は、平方マイクロメートル当たり５５のｒｈｕ ＣＤ６と７８３の結合部位からなる。高密度は、平方マイクロメートルあたり２５５のｒｈｕ ＣＤ６と３４９３の結合部位からなる。図１２Ｅは、中密度チップの１２０００秒にわたるオフレートを示す。図１２Ｆは、高密度チップの１２０００秒にわたるオフレートを示す。
イトリズマブのより複雑な結合が、高密度のＣＤ６で観察される。図１３Ａ～１３Ｆは、高密度のＣＤ６に対するイトリズマブの複合体結合を、低密度のＣＤ６と比較して示す。データは、２４０秒の結合相と１８００秒の解離相を使用して、３つの異なるＣＤ６密度について収集した。図１３Ａ～１３Ｃは、９００ｎＭ～０．１３７ｎＭ範囲の濃度のイトリズマブの二重注射から得たものである。図１３Ａは、異なる濃度のイトリズマブの、低密度のＣＤ６への結合を示す。図１３Ｂは、異なる濃度のイトリズマブの、中密度のＣＤ６への結合を示す。ＣＤ６へのイトリズマブｆａｂ結合のセンサーグラムは、最小限の複合体結合を、ＣＤ６の３つの（低、中、高）チップ密度すべてで示す。これらの結果は、イトリズマブが、チップ上のより高密度のＣＤ６への優先的結合を与える強力な結合活性（avidity）効果を示し、したがって、in vivoでのＣＤ６ｈｉｇｈ細胞に対するイトリズマブの優先的結合および選択性の観察を支持することを、実証する。 イトリズマブのより複雑な結合が、高密度のＣＤ６で観察される。図１３Ａ～１３Ｆは、高密度のＣＤ６に対するイトリズマブの複合体結合を、低密度のＣＤ６と比較して示す。データは、２４０秒の結合相と１８００秒の解離相を使用して、３つの異なるＣＤ６密度について収集した。図１３Ａ～１３Ｃは、９００ｎＭ～０．１３７ｎＭ範囲の濃度のイトリズマブの二重注射から得たものである。図１３Ｄ～１３Ｆは、９００ｎＭ～１１．１ｎＭ範囲のイトリズマブｆａｂ濃度の二重注射から得たものである。図１３Ｃは、異なる濃度のイトリズマブの、高密度ＣＤ６への結合を示す。イトリズマブのＣＤ６への結合のセンサーグラムは、ＣＤ６の最高チップ密度での複雑な結合を示す。図１３Ｄは、異なる濃度のイトリズマブｆａｂの、低密度のＣＤ６への結合を示す。ＣＤ６へのイトリズマブｆａｂ結合のセンサーグラムは、最小限の複合体結合を、ＣＤ６の３つの（低、中、高）チップ密度すべてで示す。これらの結果は、イトリズマブが、チップ上のより高密度のＣＤ６への優先的結合を与える強力な結合活性（avidity）効果を示し、したがって、in vivoでのＣＤ６ｈｉｇｈ細胞に対するイトリズマブの優先的結合および選択性の観察を支持することを、実証する。 イトリズマブのより複雑な結合が、高密度のＣＤ６で観察される。図１３Ａ～１３Ｆは、高密度のＣＤ６に対するイトリズマブの複合体結合を、低密度のＣＤ６と比較して示す。データは、２４０秒の結合相と１８００秒の解離相を使用して、３つの異なるＣＤ６密度について収集した。図１３Ｄ～１３Ｆは、９００ｎＭ～１１．１ｎＭ範囲のイトリズマブｆａｂ濃度の二重注射から得たものである。図１３Ｅは、異なる濃度のイトリズマブｆａｂの、中密度のＣＤ６への結合を示す。図１３Ｆは、異なる濃度のイトリズマブｆａｂの、高密度ＣＤ６への結合を示す。ＣＤ６へのイトリズマブｆａｂ結合のセンサーグラムは、最小限の複合体結合を、ＣＤ６の３つの（低、中、高）チップ密度すべてで示す。これらの結果は、イトリズマブが、チップ上のより高密度のＣＤ６への優先的結合を与える強力な結合活性（avidity）効果を示し、したがって、in vivoでのＣＤ６ｈｉｇｈ細胞に対するイトリズマブの優先的結合および選択性の観察を支持することを、実証する。
イトリズマブは、細胞株上の細胞表面ＣＤ６の損失を引き起こす。図１４は、イトリズマブが、ＣＤ６を発現するＴ細胞株上の細胞表面ＣＤ６レベルを低下させることを示す。ここでは、Jurkat NFAT細胞を解凍し、１×１０６細胞／ｍｌの濃度で再懸濁し、その後単一チューブに１×１０６細胞／ｍｌで分注した。イトリズマブまたはアイソタイプ対照抗体を添加し、細胞を穏やかに３７℃で６時間インキュベートした。全細胞表面ＣＤ６をフローサイトメトリーによって評価した（細胞は、染色中４℃に維持した）。 ＣＤ６ｌｏｗ細胞は、ＴＣＲ刺激に対して低反応性である。図１５Ａ～１５Ｂは、ＣＤ６ｌｏｗ細胞が、刺激に対して低反応性であることを示す。ここで、ＰＢＭＣをイトリズマブと２４時間インキュベートして、細胞表面ＣＤ６を除去し（図１５Ａを参照；ＣＤ６ｈｉｇｈ左列；ＣＤ６ｌｏｗ右列）、少なくとも３回洗浄して過剰のおよび結合イトリズマブを除去し、０．２５μｇ／ｍｌの抗ＣＤ３および１μｇ／ｍｌのＡＬＣＡＭで２４時間刺激した。活性化マーカーはフローサイトメトリーによって評価し、サイトカインはフローベースのＥＬＩＳＡによって評価した。 ＣＤ６ｌｏｗ細胞は、ＴＣＲ刺激に対して低反応性である。図１５Ａ～１５Ｂは、ＣＤ６ｌｏｗ細胞が、刺激に対して低反応性であることを示す。ここで、ＰＢＭＣをイトリズマブと２４時間インキュベートして、細胞表面ＣＤ６を除去し（図１５Ａを参照；ＣＤ６ｈｉｇｈ左列；ＣＤ６ｌｏｗ右列）、少なくとも３回洗浄して過剰のおよび結合イトリズマブを除去し、０．２５μｇ／ｍｌの抗ＣＤ３および１μｇ／ｍｌのＡＬＣＡＭで２４時間刺激した。活性化マーカーはフローサイトメトリーによって評価し、サイトカインはフローベースのＥＬＩＳＡによって評価した。図１５Ｂに示すように、ＣＤ６ｌｏｗ細胞（各グラフの右列）は、ＣＤ６ｈｉｇｈ細胞（各グラフの左列）と比較して、表面活性化マーカーの減少およびサイトカイン放出を示し、イトリズマブがＰＢＭＣにおける細胞表面ＣＤ６レベルを低下させるだけでなく、細胞の、ＣＤ３などのＴ細胞活性化因子に対する反応性も低下させることを証明する。
ＣＤ６発現に基づく用量選択の図。図１６は、イトリズマブの用量選択を報知するための、細胞表面ＣＤ６の使用を示す。１つのアプローチは、患者または患者グループに増加量のイトリズマブを投与することである。ＣＤ６のより低いレベルが決定されるのは、用量を増加させることによりまたは一定の間隔でのその後の用量により、さらに薬物を添加しても、ＣＤ６レベルのさらなる低下が観察されない場合である。ＣＤ６レベルをより低いレベルまで低下させる最適用量が決定されると、ＣＤ６レベルを用いて最適な投与計画を決定することもできる。
ＣＤ６発現に基づく投与計画の図。図１７Ａ～１７Ｂは、適切な投与計画の選択を示す。１つのアプローチは、細胞表面ＣＤ６レベルを経時的に監視して、任意の所定の用量が、細胞表面ＣＤ６損失の持続的な薬力学的効果をどのくらい持続させるかを決定することである。図１７Ａの例示的なグラフは、隔週および月１回の投薬量が適切であるが、細胞表面ＣＤ６レベルが８週間で閾値を超えるため、そのレベルでの四半期ごとの用量は適切ではないことを示している。この情報は、細胞表面ＣＤ６の持続的な損失を四半期ごとの投与で達成するには、より多くの薬物が必要であることを示している可能性がある。いくつかの例では、上限または閾値は、細胞表面ＣＤ６のベースラインレベルの約２５～５０％、約２５～５０％未満、または約２５～５０％の間である。 ＣＤ６発現に基づく投与計画の図。図１７Ａ～１７Ｂは、適切な投与計画の選択を示す。１つのアプローチは、細胞表面ＣＤ６レベルを経時的に監視して、任意の所定の用量が、細胞表面ＣＤ６損失の持続的な薬力学的効果をどのくらい持続させるかを決定することである。図１７Ｂは、イトリズマブ治療の短期コースにおけるこのアプローチを示しており、ここでは細胞表面ＣＤ６のレベルを用いて、投与再開の必要性または疾患再燃の可能性を知らせることができる。最初の投与期間が終了した後、ＣＤ６の細胞表面レベルを経時的に監視することができ、これらのレベルがベースライン（例として、細胞表面ＣＤ６の処置前レベル）と比較して、または規定の閾値もしくは目標レベル（例として、細胞表面ＣＤ６の臨床的に適切または望ましいレベル、例えば、他の疾患パラメータまたは症状によって定義されるものなど）と比較して閾値に上昇するか閾値に近づくと、患者にイトリズマブを再度投与するとの決定を下すことができる。
図１８Ａ～１８Ｂは、イトリズマブ処理後のＣＤ６タンパク質レベルを示す。図１８Ａは細胞上清中の細胞関連ＣＤ６レベルを示し、図１８Ｂは細胞上清中の可溶性ＣＤ６（ｓＣＤ６）レベルを示す。 図１８Ａ～１８Ｂは、イトリズマブ処理後のＣＤ６タンパク質レベルを示す。図１８Ａは細胞上清中の細胞関連ＣＤ６レベルを示し、図１８Ｂは細胞上清中の可溶性ＣＤ６（ｓＣＤ６）レベルを示す。 図１９は、イトリズマブが細胞表面ＣＤ６の切断を誘導し、それに付随して可溶性ＣＤ６の増加を誘導することを示す。 図２０Ａ～２０Ｂは、Ｔリンパ球細胞表面からのイトリズマブ誘導性ＣＤ６切断における、単球の役割を示す。 図２０Ａ～２０Ｂは、Ｔリンパ球細胞表面からのイトリズマブ誘導性ＣＤ６切断における、単球の役割を示す。 図２１Ａ～２１Ｅは、イトリズマブ誘導性のＣＤ６細胞表面レベルの低下が、Ｔ細胞活性化の低下と相関することを示す。 図２１Ａ～２１Ｅは、イトリズマブ誘導性のＣＤ６細胞表面レベルの低下が、Ｔ細胞活性化の低下と相関することを示す。 図２１Ａ～２１Ｅは、イトリズマブ誘導性のＣＤ６細胞表面レベルの低下が、Ｔ細胞活性化の低下と相関することを示す。 図２２は、イトリズマブとの最初のインキュベーションによって生成されたＣＤ６ｌｏｗ細胞が、ＣＤ６ｌｏｗを維持しただけでなく、その後のＣＤ３＋ＡＬＣＡＭによる刺激後にＴｅｆｆ様が減少した（例えば、Ｔｈ１およびＴｈ１７様が減少した）ことを示す。 図２３Ａ～２３Ｄは、イトリズマブがＴリンパ球の同種反応性を低下させることを示す。
図２４Ａ～２４Ｂは、最初のイトリズマブ処理の、Ｔｒｅｇリンパ球のその後の世代に対する効果を示す。図２４Ａは、それぞれＣＤ６ｈｉｇｈまたはＣＤ６ｌｏｗナイーブＴ細胞を生成するための、アイソタイプまたはイトリズマブで事前に処理したＰＢＭＣから単離されたナイーブＣＤ４＋ Ｔ細胞（ＣＤ３＋ＣＤ４＋ＣＤ４５ＲＡ＋ＣＤ４５ＲＯ－）における、ナイーブＣＤ４＋ Ｔ細胞単離およびＣＤ６損失を示す。 図２４Ａ～２４Ｂは、最初のイトリズマブ処理の、Ｔｒｅｇリンパ球のその後の世代に対する効果を示す。図２４Ｂは、ＦｏｘＰ３およびＨｅｌｉｏｓによる陽性染色によって示される、アイソタイプ対照（ＣＤ６ｈｉｇｈ）またはイトリズマブ（ＣＤ６ｌｏｗ）での前処理後の、Ｔｒｅｇの生成を示す。 図２５は、ＣＤ６ｌｏｗＴｒｅｇが、ＣＤ６ｈｉｇｈＴｒｅｇと比較して、増加した抑制活性を有することを示す。 図２６Ａは、イトリズマブ誘導性のＣＤ６細胞表面損失が、用量依存的に生じることを示す（示されるように、濃度範囲のイトリズマブで２４時間インキュベーション後の、２名のドナーからのＰＢＭＣにおけるＣＤ６検出）。 図２６Ｂは、アッセイが、グリコシル化状態の変化を区別できることを示す。 図２７Ａ～２７Ｅは、イトリズマブで処置されたＳＬＥ患者からのＴ細胞における細胞表面ＣＤ６の損失を示す。 図２８Ａ～２８Ｂは、ＳＬＥ患者におけるイトリズマブの初回用量後に、ＣＤ４（２８Ａ）およびＣＤ８（２８Ｂ）Ｔ細胞上の細胞表面ＣＤ６が減少すること、および、表面ＣＤ６のより大きな損失が、より高用量のイトリズマブで観察されることを示す。 図２９Ａ～２９Ｂは、０．８ｍｇ／ｋｇのイトリズマブによる処置が、プラセボと比較して、Ｔｈ１７細胞での３倍の減少およびＴｒｅｇ細胞での２．５倍の増加を引き起こしたことを示す。
詳細な説明
以下は、当業者による本開示の実施を助けるために提供される、詳細な説明である。当業者は、本開示の精神または範囲から逸脱することなく、本明細書に記載された態様に改変および変更を加えることができる。本明細書で言及されるすべての出版物、特許出願、特許、図面、およびその他の参考文献は、参照によりその全体が明示的に組み込まれる。
ある態様は、最適化された抗ＣＤ６抗体を同定する方法を含む。いくつかの態様において、最適化された抗ＣＤ６抗体を同定する方法は、結合活性の測定を含む、選択性の測定に基づく。いくつかの態様において、最適化された抗ＣＤ６抗体を同定する方法は、処置後の経時的な細胞表面ＣＤ６の損失を測定することを含む。いくつかの態様において、最適化された抗ＣＤ６抗体は、ｆａｂ、ｆ（ａｂ）２、または融合タンパク質である。
いくつかの態様は、高レベルの細胞表面ＣＤ６、またはＣＤ６ｈｉｇｈ細胞を有する細胞に、選択的に結合するための方法を含む。いくつかの態様において、方法は、ＣＤ６ｈｉｇｈ細胞の細胞表面からＣＤ６を除去するか、そうでなければＣＤ６を減少させることを含む。いくつかの態様において、ＣＤ６ｈｉｇｈ細胞はＴリンパ球である。いくつかの態様において、Ｔリンパ球は、以下の１つ以上である：ＣＤ４ Ｔヘルパー（Ｔｈ１、Ｔｈ２、Ｔｈ２２、Ｔｈ９、Ｔｈ１７、Ｔｆｈ、Ｔｐｈ）、ＣＤ８ナイーブ細胞、エフェクター細胞、エフェクター記憶細胞、幹記憶細胞または中央記憶ＣＤ４細胞またはＣＤ８細胞、ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞、および自然リンパ球（ＩＬＣ）、例えば、ＩＬＣ１、ＩＬＣ２、および／またはＩＬＣ３細胞。
いくつかの態様は、ＣＤ６ｈｉｇｈ細胞から細胞表面ＣＤ６を、選択的に除去または減少させる方法を提供する。いくつかの態様において、方法は、最適化された抗ＣＤ６抗体による処置を含む。いくつかの態様において、ＣＤ６表面発現が測定される。いくつかの態様は、処置後の経時的な細胞表面ＣＤ６の損失を測定することを含む、最適化された抗ＣＤ６抗体の治療投薬量を決定する方法を提供する。いくつかの態様において、抗体はイトリズマブである。いくつかの態様は、最適化された抗ＣＤ６抗体を投与することを含む、細胞の病原性を低下する方法を提供する。いくつかの態様は、生物学的治療薬として使用するための、抗ＣＤ６抗体またはその抗原結合性断片をスクリーニングする方法を含み、これは以下を含む：候補抗ＣＤ６抗体またはその抗原結合性断片を、ＣＤ６を細胞表面に発現する細胞とインキュベートすること；細胞上の細胞表面ＣＤ６発現を測定すること；候補抗ＣＤ６抗体またはその抗原結合性断片を、これが細胞表面ＣＤ６発現を対照または標準と比較して減少させる場合に、医薬組成物として製剤化すること。
ある態様は、対象におけるＴリンパ球の細胞表面ＣＤ６レベルを選択的に低下させる方法、並びにＣＤ６ｈｉｇｈＴリンパ球及び／またはＴｅｆｆ細胞のレベルを選択的に低下させる方法を含む。本明細書において使用される場合、「Ｔｅｆｆ細胞」には、Ｔｈ１細胞およびＴｈ１７細胞などの活性化ヘルパーＴ細胞が含まれる。特定の態様において、「Ｔｅｆｆ細胞」は、Ｔｈ１７細胞である。
ある態様は、ベースライン細胞表面ＣＤ６測定値を取得すること、および／または細胞表面ＣＤ６の閾値もしくは目標レベルを定義すること、およびイトリズマブなどの抗ＣＤ６抗体の治療用量を投与することを含む。いくつかの態様において、方法は、対象からの組織試料中のＣＤ６レベルをモニタリングすることを含み、ここで組織試料は、Ｔリンパ球を含む。いくつかの態様において、方法は、細胞表面ＣＤ６レベルが、ベースライン細胞表面ＣＤ６測定値の約２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、または７５パーセント以上に戻った場合に、対象に追加用量のイトリズマブを投与することを含む。ある態様は、細胞表面ＣＤ６レベルが、細胞表面ＣＤ６の標的レベル付近またはそれ以上に上昇した場合に、追加用量のイトリズマブを投与することを含む（例えば、図１７Ａ～１７Ｂを参照）。
ある態様は、移植を必要とする患者におけるＧＶＨＤを予防または改善する方法を提供し、この方法は、移植される組織を、ＣＤ６ｈｉｇｈ細胞から細胞表面ＣＤ６を選択的に剥離、除去、または他の方法で減少させる抗ＣＤ６抗体と共にインキュベートすること；および、組織を患者に移植すること、を含む。いくつかの態様において、方法は、患者のＣＤ６レベルを測定することを含む。いくつかの態様において、方法はベースラインの測定を含む。
いくつかの態様は、Ｔｅｆｆ細胞対Ｔｒｅｇ細胞の比率を調節する方法を提供する。また、本明細書では、Ｔｒｅｇ細胞対Ｔｅｆｆ細胞の比率を増加する方法も開示される。
また、最適化された抗ＣＤ６抗体で処置することを含む、Ｔｅｆｆ細胞をＴｒｅｇ細胞に変換する方法も含まれる。ある態様において、最適化された抗ＣＤ６抗は、イトリズマブである。
ある態様は、Ｔｅｆｆ細胞を選択的に標的化する方法を含む。いくつかの態様は、最適化された抗ＣＤ６抗体を投与することを含む、Ｔｅｆｆ細胞を選択的に標的化する方法を提供する。いくつかの態様において、抗ＣＤ６抗体はイトリズマブである。
いくつかの態様は、病原性Ｔ細胞からＣＤ６を選択的に除去する方法を提供する。いくつかの態様において、方法は、最適化された抗ＣＤ６抗体を投与することを含む。いくつかの態様において、抗体はイトリズマブである。ある態様は、病原性Ｔ細胞を選択的に軽減する方法を提供する。ある態様において、方法は、最適化された抗ＣＤ６抗体を投与することを含む。いくつかの態様において、抗体はイトリズマブである。
ある態様は、低応答性Ｔ細胞を生成する方法に関する。ある態様において、方法は、最適化された抗ＣＤ６抗体を投与することを含む。いくつかの態様において、抗体はイトリズマブである。いくつかの態様は、Ｔ細胞における自己反応性を低下させる方法を提供する。いくつかの態様は、Ｔ細胞における同種反応性を低下させる方法を提供する。
本明細書で開示されるのは、ＣＤ６ｈｉｇｈ細胞を選択的に標的化する方法である。いくつかの態様において、選択的に標的化されるＣＤ６細胞には以下が含まれる：ＣＤ４ Ｔヘルパー（Ｔｈ１、Ｔｈ２、Ｔｈ２２、Ｔｈ９、Ｔｈ１７、Ｔｆｈ、Ｔｐｈ）のサブセット、およびＣＤ８細胞のナイーブ、エフェクター、エフェクター記憶、幹記憶および中央記憶サブタイプ；ナチュラルキラーＴ細胞および自然リンパ球。また本明細書で開示されるのは、Ｔｅｆｆ細胞対Ｔｒｅｇ細胞の比率を調節する方法である。また、本明細書では、Ｔｒｅｇ細胞を温存する方法も開示される。また、本明細書では、Ｔｅｆｆ細胞をＴｒｅｇ細胞に変換する方法も開示される。また、本明細書では、最適化された抗ＣＤ６抗体を使用して、Ｔ細胞応答を改変し、疾患を軽減する方法も開示される。
いくつかの態様において、本開示は、抗ＣＤ６抗体が細胞表面ＣＤ６の発現レベルが高い細胞にのみ結合するように、ＣＤ６を抗ＣＤ６抗体と結合させる方法を提供し、ここで抗体は、細胞表面ＣＤ６の持続的損失を誘導する。本開示の他の側面が、本明細書に記載される。
別段に定義されない限り、本明細書で使用するすべての技術用語および科学用語は、本開示が属する当業者によって一般に理解されるのと同じ意味を有する。本明細書に記載のものと同様または同等の任意の方法および材料が、本開示の実施または試験において使用され得るが、好ましい方法および材料が記載されている。本明細書で引用される、特許および特許出願を含むがこれらに限定されないすべての刊行物および参考文献は、あたかも個々の刊行物または参考文献の各々が、完全に記載されているものとして参照により本明細書に組み込まれることが具体的かつ個別に示されているかのように、それらの全体が参照により本明細書に組み込まれる。この出願が優先権を主張する任意の特許出願もまた、刊行物および参考文献について上述した様式で、その全体が参照により本明細書に組み込まれる。本開示の目的のために、次の用語を以下に定義する。
冠詞「a」および「an」は、本明細書では、冠詞の文法的な目的語の１つまたは複数（すなわち、少なくとも１つ）を指すために使用される。一例として、「an element」は、１つの要素または複数の要素を意味する。
本開示において用語「および／または」は、別様に明記されない限り、「および」または「または」のいずれかを意味するために使用される。
用語「例として（e.g.）」は、本明細書では「例えば（for example）」を意味するために使用され、記載されたステップもしくは要素またはステップもしくは要素の群を含むことを意味するが、他のステップもしくは要素またはステップもしくは要素の群を排除しないことを意味すると理解される。
「約」は、参照分量、レベル、値、数、頻度、パーセンテージ、寸法、サイズ、量、重量または長さに対して、３０、２５、２０、１５、１０、９、８、７、６、５、４、３、２または１％まで変化する分量、レベル、値、数、頻度、パーセンテージ、寸法、サイズ、量、重量または長さを意味する
用語「投与すること」は、本明細書に使用されるとき、化合物などの物質（例として、医薬化合物、または抗原などの他の剤）を対象に移動、送達、導入、または輸送する任意の方法を指す。投与の方法は、経口投与、局所接触、静脈内、腹腔内、筋肉内、鼻腔内、または皮下投与を含む。１以上の治療剤などのさらなる物質と「組み合わせた」投与は、同時（併用）投与および任意の順序での連続的な投与を含む。
本明細書で使用される用語「結合活性」は、抗原結合分子（抗ＣＤ６抗体など）と適切な抗原との間の結合の強さの尺度を指す。結合活性は、抗原決定基と抗原結合分子上のその抗原結合部位との間の親和性、および抗原結合分子上に存在する関連結合部位の数の両方に関連する。
本明細書で使用される用語「結合パートナー」は、分子、とりわけポリマー分子などの物質であって、ＤＮＡまたはｍＲＮＡ分子を含むＲＮＡ分子などの核酸分子ならびにペプチド、タンパク質、糖、多糖または脂質と、剤が核酸分子、ペプチド、タンパク質または糖、多糖または脂質と複合体を形成することを可能にするのに十分な相互作用を介して、一般に非共有結合を介して、結合し得る、前記物質を指す。いくつかの態様において、結合パートナーは、免疫グロブリンまたは以下に定義されるような免疫グロブリン様機能を有するタンパク質性結合分子である。いくつかの態様において、結合パートナーは、アプタマーである。いくつかの態様において、結合パートナーは、特定の標的に特異的である。いくつかの態様において、結合パートナーは、複数の結合部位を含み、各結合部位は、特定の標的に特異的である。実例として、結合パートナーは、２つの結合部位を有する免疫グロブリン様機能を有するタンパク性剤であり得る。それは、例えば、抗体の抗原結合性断片であり得る。それは、例えば、二重特異性の一本鎖ダイアボディなどの、二重特異性ダイアボディであり得る。
用語「担体」は、本開示において使用されるとき、担体、賦形剤、および希釈剤を含み、対象のある臓器または体の一部から対象の別の臓器または体の一部へ医薬品を運搬または輸送することに関わる、液体または固体の充填剤、希釈剤、賦形剤、溶媒または封入材料などの材料、組成物またはビヒクルを意味する。
用語「キメラ抗体」は、本明細書に使用されるとき、複数の種からの配列を含む免疫グロブリンポリペプチドまたはドメイン抗体を指す。キメラ抗体では、重鎖または軽鎖は、ヒトなどのある種からの可変領域配列およびマウスなどの別の種からの定常領域配列を含有し得る。一例として、「キメラ抗体」は、別の分子、例えば、ヒト抗体に由来する定常ドメインに融合された、ラットまたはマウス抗体などの動物抗体に由来する可変領域を有する免疫グロブリンであり得る。用語「キメラ抗体」は、以下の抗体を包含することを意図する：（ｉ）重鎖はキメラであるが、軽鎖は１つの種のみからのＹおよびＣ領域を含む；（ｉｉ）軽鎖はキメラであるが、重鎖は１つの種のみからのＹおよびＣ領域を含む；および（ｉｉｉ）重鎖および軽鎖の両方がキメラである。
「有効量」は、化合物に関連して使用されるとき、所望される応答を引き出すのに必要な、抗ＣＤ６抗体（例として、イトリズマブまたはEQ001）などの化合物の量である。いくつかの態様において、所望される応答は、例えば対象における生物学的応答である。いくつかの態様において、化合物（例として、抗ＣＤ６抗体）は、対象において生物学的応答をもたらすために有効量で対象に投与され得る。いくつかの態様において、有効量は「治療有効量」である。
用語「治療有効量」および「治療用量」は、本明細書では互換的に使用され、抗ＣＤ６抗体（例として、イトリズマブまたはEQ001）などの化合物の量を指し、これは、本明細書に記載の対象における疾患または障害を処置するための対象への投与後に有効である。
「病原性」という用語は、本明細書では、サイトカインの増殖および分泌の増加に関して、病原性応答を示すＴ細胞の能力を指すために使用される。
用語「予防的有効量」は、本明細書では、本明細書に記載の対象における疾患または障害の発病を予防または遅延させるために、対象への投与後に有効である抗ＣＤ６抗体（例として、イトリズマブまたはEQ001）などの化合物の量を指すために使用される。
この点に関し、「ヒト化抗体」は、本明細書に使用されるとき、ヒト抗体の構造要素および非ヒト抗体の抗原結合部位を含有する免疫グロブリンポリペプチドまたはドメイン抗体である。「ヒト化抗体」は、それらが由来する非ヒト抗体からの最小数の残基を含有する。例えば、それらは、非ヒト抗体のＣＤＲ領域のみ、または非ヒト抗体の超可変領域を構成するそれらの残基のみを含有し得る。それらはまた、非ヒト抗体の構造を模倣するために、または立体障害を最小限にするために必要な残基など、非ヒトポリペプチドの可変領域の外側からのある残基を含み得る。典型的には、ヒト化抗体は、ヒトフレームワーク、非ヒト抗体からの少なくとも１つのＣＤＲを含有し、存在する任意の定常領域は、ヒト免疫グロブリン定常領域と実質的に同一、すなわち、少なくとも約８５～９０％（少なくとも９５％など）同一である。ゆえに、いくつかの場合において、おそらくＣＤＲを除いて、ヒト化免疫グロブリンのすべての部分が、１以上のネイティブなヒト免疫グロブリン配列の対応する部分と実質的に同一である。加えて、ヒト化抗体は、ヒトまたは非ヒト抗体のいずれにも対応しない残基を含有し得る。
本明細書に使用されるとき、用語「抗体断片」は、全長形態以外の任意の形態の抗体を指す。本明細書の抗体断片は、全長抗体内に存在するより小さな構成要素である抗体、および操作された抗体を含む。抗体断片は、Ｆｖ、Ｆｃ、Ｆａｂ、および（Ｆａｂ’）２、一本鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）、ダイアボディ、トリアボディ（triabody）、テトラボディ（tetrabody）、二機能性ハイブリッド抗体、ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、ＣＤＲ３、ＣＤＲの組み合わせ、可変領域、フレームワーク領域、定常領域、重鎖、軽鎖、代替スキャフォールド非抗体分子、および二重特異性抗体を含むが、これらに限定されない。特に明記しない限り、用語「抗体（単数）」または「抗体（複数）」を使用する陳述および請求項は、具体的に言うと「抗体断片（単数）」および「抗体断片（複数）」を含み得る。
用語「ＶＨ」は、本明細書では、抗体の可変重鎖を示すために使用される。
用語「ＶＬ」は、本明細書では、抗体の可変軽鎖を示すために使用される。
抗体に関する用語「抗原結合性断片」は、親全長抗体が結合する抗原に対する結合親和性を保持する任意の抗体断片を指し、抗原結合性断片は、Ｆｖ、Ｆａｂ、（Ｆａｂ’）２、ｓｃＦｖ、ダイアボディ、トリアボディ、テトラボディ、二機能性ハイブリッド抗体、ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、ＣＤＲ３、ＣＤＲの組み合わせ、可変領域、重鎖、軽鎖、および二重特異性抗体を含むが、これらに限定されない。
本明細書全体を通して、文脈が別段の定めをしない限り、語「含む（comprise）」、「含む（comprises）」および「含むこと（comprising）」は、記載されたステップもしくは要素またはステップもしくは要素の群を含むことを意味するが、他のステップもしくは要素またはステップもしくは要素の群を排除しないことを意味すると理解される。「からなる（consisting of）」は、句「からなる（consisting of）」に続くものを含み、これに限定されることを意味する。よって、句「からなる（consisting of）」は、列挙された要素が必要または必須であり、他の要素が存在しない可能性があることを示す。「本質的にからなる（consisting essentially of）」は、句の後に列挙された任意の要素を含むことを意味し、列挙された要素について本開示で特定された活性または作用に干渉または寄与しない他の要素に限定されることを意味する。よって、句「本質的にからなる（consisting essentially of）」は、列挙された要素が必要または必須であるが、他の要素は任意であり、それらが列挙された要素の活性または作用に実質的に影響を与えるかどうかに応じて存在する場合と存在しない場合があることを示す。
用語「調節する」は、「増加する」、「増強する」または「刺激する」、ならびに「減少する」または「低下する」を含み、典型的には、対照と比較して、統計的に有意または生理学的に有意な量である。「増加した」、「刺激された」または「増強された」量は、典型的には「統計的に有意な」量であり、組成物なし（例として、本開示の抗ＣＤ６抗体のいずれも存在しない）または対照組成物、試料または試験対象によって産生される量の１．１、１．２、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１５、２０、または３０倍以上（例として、５００、１０００倍）（その間および１より大きいもののすべての整数および小数点を含む、例として、１．５、１．６、１．７、１．８など）の増加を含み得る。「減少した」または「低下した」量は、典型的には「統計的に有意な」量であり、組成物なし（剤または化合物の不在）または対照組成物によって産生される量の１％、２％、３％、４％、５％、６％、７％、８％、９％、１０％、１１％、１２％、１３％、１４％、１５％、１６％、１７％、１８％、１９％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、または１００％（その間にあるすべての整数を含む）の減少を含み得る。
用語「ポリペプチド」および「タンパク質」は、本明細書では互換的に使用され、アミノ酸残基のポリマー、およびそのバリアントおよび合成類似体を指す。よって、これらの用語は、１以上のアミノ酸残基が、対応する天然に存在するアミノ酸の化学的類似体などの合成の天然に存在しないアミノ酸であるアミノ酸ポリマー、ならびに天然に存在するアミノ酸ポリマーに適用される。
「対象」または「患者」は、本明細書に使用されるとき、抗ＣＤ６抗体またはその抗原結合性断片で処置または診断され得る、症状を示す、または症状を呈するリスクがある任意の動物を含む。好適な対象（患者）は、好ましくは、ヒトの患者を含む。好適な対象は、実験動物（マウス、ラット、ウサギ、またはモルモットなど）、家畜（ブタ、ウマ、ウシなど）、および飼育動物またはペット（ネコまたはイヌなど）も含む。霊長目の非ヒト動物（サル、チンパンジー、ヒヒ、またはアカゲザルなど）も含まれる。
「実質的に」または「本質的に」は、ほぼ完全にまたは完全に、例えば、ある所与の分量の９５％以上を意味する。
「処置（treatment）」または「処置する（treating）」は、本明細書に使用されるとき、疾患または状態の症状または病理に対する任意の所望の効果を含み、処置される疾患または状態の１以上の測定可能なマーカーの最小限の変化または改善さえ含み得る。「処置（treatment）」または「処置する（treating）」は、必ずしも、疾患または状態、またはそれらに関連する症状の完全な根絶または治癒を示すものではない。この処置を受ける対象は、それを必要とする任意の対象である。臨床的改善の例示のマーカーは、当業者には明らかであろう。
本開示は、例えば、細胞表面ＣＤ６をＣＤ６ｈｉｇｈ細胞から除去することができる抗ＣＤ６抗体を同定する方法、および、ＴｅｆｆをＴｒｅｇに変換するための抗ＣＤ６抗体の使用方法、および、自己反応性もしくは同種反応性Ｔ細胞、ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞、または自然リンパ球細胞（ＩＬＣ）の処置、予防、または軽減の方法であって、抗ＣＤ６抗体を対象に投与することを含む、前記方法に関する。
ＣＤ６は、ヒトＮＫ細胞、ＩＬＣ、Ｔ細胞、およびＢ細胞のサブセット、ならびに一部のＢ細胞慢性リンパ性白血病およびニューロンによって主に発現される、重要な細胞表面タンパク質である[Aruffo et ah, J. Exp. Med. 1991, 174:949; Kantoun et ah, J. Immunol. 1981, 127:987; Mayer et al., J. Neuroimmunol. 1990. 29: 193]。ＣＤ６は、Ｉ型マクロファージのスカベンジャー受容体システインリッチドメイン（ＳＲＣＲ）と相同な少なくとも１つのドメインを有することを特徴とする、タンパク質の大きなファミリーのメンバーである[Matsumoto, et al., J. Exp. Med. 1991, 173 :55 and Resnick et al., Trends Biochem. Sci. 1994, 19:5]。このファミリーの他のメンバーには、以下が含まれる：ＣＤ５[Jones et al., Nature. 1986, 323 :346];シクロフィリンＣ[Friedman et al. 1993, PNAS 90:6815]；活性化補体タンパク質Ｃ３ｂおよびＣ４ｂに結合する補体因子Ｉ[Goldberger, et al., J. Biol. Chem. 1987, 262: 10065]；τ／δＴ細胞により発現されるウシＷＣ－１[Wijingaard et al., J. Immunol. 1992, 149:3273]、およびＭ１３０[Law et al., Eur J. Immunol. 1993, 23 :2320]、すなわちマクロファージ活性化マーカー。
成熟ＣＤ６タンパク質の細胞外ドメインは、３つのＳＲＣＲドメイン（以下、Ｄ１、Ｄ２、およびＤ３と呼ぶ）から構成される。Ｄ３は、膜近位ＳＲＣＲドメインに対応し、短い３３アミノ酸の茎（stalk）領域がこれに続く。これらの細胞外ドメインは、短い膜貫通ドメインとこれに続く可変長の細胞質ドメインを介して細胞膜に固定される[Aruffo et al., J. Exp. Med. 1991, 174:949]。
未知の起源のＣＤ６の可溶性形態（ｓＣＤ６）が、健康な個体からの血清において極めて低いレベル（ピコ／ナノモル濃度範囲）で循環することが報告されている。さらに、全身性炎症反応症候群および原発性シェーグレン症候群を有する個体では、ｓＣＤ６の上昇したレベルが観察されたが、これらの事象間の直接的な機構的および機能的関係性は欠如している。報告は、ｓＣＤ６がメタロプロテイナーゼのＡＤＡＭファミリーのメンバーのタンパク質分解作用を介して膜結合受容体の脱落によって形成されることを示唆する（Carrasco, et al., Frontiers in Immunology 2017. 8:769）。さらに、Ｔ細胞生理学におけるｓＣＤ６の機能的役割はまだ知られていないが、in vitroの結果は、ｓＣＤ６がＴ細胞の活性化および免疫シナプスの成熟を阻害することを示唆しており、いくらかの研究者に対して、ｓＣＤ６がデコイ受容体として作用して炎症の部位の近くのバイスタンダーＴ細胞を不活性化すると仮定することを促す。
ヒトＩｇＧ１定常ドメイン（ＣＤ６－Ｒｇｓ）に融合されたＣＤ６の選択された細胞外ドメインを含有するＣＤ６－免疫グロブリン融合タンパク質を使用する研究は、「活性化白血球細胞接着分子」（ＡＬＣＡＭ）（ＣＤ１６６としても知られている）と呼ばれるＣＤ６リガンドの同定およびクローニングをもたらした[Patel, et al. , J . Exp. Med. 1995. 181 : 1563-1568; Bowen et al., J . Exp. Med 1995, 181 :2213-2220]。
ＡＬＣＡＭは、免疫グロブリンスーパーファミリーのメンバーであり、５つの細胞外免疫グロブリンドメイン（２つのＮＨ２末端、膜遠位可変（Ｖ）型（Ｖ１、Ｖ２またはＤ１、Ｄ２）および３つの膜近位定常（Ｃ２）Ｉｇ型フォールド）［Ｃ１、Ｃ２、Ｃ３］、膜貫通領域、および短い細胞質尾部を含む、１００～１０５ｋＤのＩ型膜貫通糖タンパク質である。Ｎ末端ドメイン（Ｄ１）はリガンド結合にもっぱら関与するが、膜近位ドメイン（Ｃ２、Ｃ３またはＤ４、Ｄ５）は同種親和性相互作用に必要とされる。
ＡＬＣＡＭは、膜近位ＳＲＣＲドメインに対応するＣＤ６のドメイン３へ結合する[Whitney, et. al., J. Biol. Chem 1995, 270: 18187-18190]。
Ｔ細胞調節におけるＣＤ６／ＡＬＣＡＭ相互作用の役割の研究は、この受容体－リガンド対が、胸腺上皮細胞へのＣＤ６発現細胞の接着を媒介することができることを示した。これは、ＣＤ６／ＡＬＣＡＭ相互作用がＴ細胞の発達および活性化を調節するために重要であることを示唆する。その上、ＡＬＣＡＭの脱落も報告されており、ｓＣＤ６と同様に、プロセスはＡＤＡＭファミリーメタロプロテイナーゼ媒介性切断の産物であるように思われる。
ＣＤ６は、in vivoでのＴ細胞機能の調節に重要な役割を果たす。ＣＤ６はまた、初期および後期Ｔ細胞－抗原提示細胞（ＡＰＣ）相互作用を媒介する、免疫シナプスの一部であることも報告されている。さらに、ＣＤ６ｈｉｇｈＴ細胞は病原性であるが、ＣＤ６ｌｏｗＴ細胞は病原性ではないことが示されている（例えばMa et al., Journal of Crohn’s and Colitis. 13: 510-524, 2019を参照）。高ｖｓ低のＣＤ６発現を確立するための方法は、当技術分野で知られており、ＣＤ６ｈｉｇｈおよびＣＤ６ｌｏｗ細胞は、様々な細胞サブセットにおけるタンパク質および／またはｍＲＮＡ発現を比較することによって、定義することができる（例えば、Ma et al., supra; and Santana et al., Cytometry A. 85:901-8, 2014を参照）
米国特許第6,372,215号は、ヒトＣＤ６（ｈＣＤ６）またはヒトＣＤ６茎ドメイン（ＣＤ６Ｓ）のＳＲＣＲドメイン３（Ｄ３）に特異的に結合し、活性化白血球細胞接着分子（ＡＬＣＡＭ）のＣＤ６への結合を阻害する抗体および他の結合剤を開示する。
初期の刊行物および特許は、マウス抗ＣＤ６（ＩＯＲ－Ｔ１）モノクローナル抗体の配列およびＩＯＲ－Ｔ１をＴ１ｈ（ヒト化ＩＯＲ－Ｔ１）にヒト化するために実施されたアミノ酸改変を開示した。米国特許第5,712,120号およびそれに相当するEP 0699755は、マウスモノクローナル抗体をヒト化するための特定の方法およびＩＯＲ－Ｔ１およびＴ１ｈの配列を開示する。米国特許第6,572,857号およびその同等のEP 0807125は、ＩＯＲ－Ｔ１およびＴ１ｈ（ヒト化ＩＯＲ－Ｔ１）の配列を開示する。「モノクローナル抗体およびその方法」と題されたPCT/IN2008/00562は、ＮＳ０細胞における抗ＣＤ６抗体の産生を開示し、これは、本明細書に配列番号１および２として提供される重鎖および軽鎖配列を有する。この抗体のＩＮＮ名はイトリズマブである。イトリズマブは、マウス由来のＮＳ０細胞株およびチャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞で産生され、本明細書では、ＣＨＯ細胞で産生されるときはその商品名EQ001で、ＮＳＯ細胞で産生されるときはその商品名ALZUMABで呼ばれる。EQ001（すなわち、ＣＨＯ細胞で産生されるイトリズマブ）は、当該技術分野において「Bmab-600」としても知られている。本明細書の様々な態様において、我々は、その産生方法に関係なく、そのＩＮＮ名、イトリズマブによって抗体自体を指す。よって、用語イトリズマブは、本明細書に使用されるとき、その各々がイトリズマブと同じ配列を有するALZUMABおよびEQ001を含む。イトリズマブ（およびEQ001／ALZUMAB）の可変重（ＶＨ）および可変軽（ＶＬ）のアミノ酸配列は、それぞれ配列番号１および２として本明細書に提供される。イトリズマブ（およびEQ001／ALZUMAB）のＶＨおよびＶＬのヌクレオチド（ＤＮＡ）配列は、それぞれ配列番号３および４として本明細書に提供される。イトリズマブ（およびEQ001／ALZUMAB）ＶＨ ＣＤＲ１～３のアミノ酸配列は、それぞれ配列番号５～７として提供される。イトリズマブ（およびEQ001／ALZUMAB）ＶＬ ＣＤＲ１～３のアミノ酸配列は、それぞれ配列番号８～１０として提供される。
ＣＤ６を標的とする抗体は、少なくとも部分的に、異常なＴ細胞活性によって引き起こされる広範囲の疾患および状態の治療として有望であることが示されている。例えば、PCT/IN2008/000562は、ナイーブＴ細胞の増殖を阻害し、多発性硬化症、移植拒絶反応、関節リウマチ、および乾癬を含む様々な炎症性障害を処置するためのイトリズマブの使用を開示する。実際、ALZUMABは現在、乾癬の処置のためにインドで販売されている。さらに、ループスを処置するためのイトリズマブの使用は、PCT/IB2017/056428に開示されている。しかしながら、これらの疾患の不均一性およびＴ細胞、Ｂ細胞、樹状細胞、単球、および好中球によって媒介される種々の疾患形態間を循環するそれらの傾向に起因して、これらの抗体の可能性をより十分に活用するには、より的を絞った処置治療が必要である。
現時点では、バイオマーカー戦略は、患者が抗ＣＤ６抗体（例として、イトリズマブ）による処置またはより一般的にはＣＤ６ｈｉｇｈ細胞上の細胞表面ＣＤ６発現の減少に、最も有利に応答する可能性が高い時期を決定するために、臨床的に用いられてはいない。本開示の態様は、ＣＤ６ｈｉｇｈ細胞の所望される軽減を達成するための、投与計画を特定する方法を含む。
ある態様は、自己免疫疾患、免疫炎症性疾患、または炎症性疾患、移植片対宿主病（ＧＶＨＤ）、または臓器移植拒絶反応を有するヒト対象における、イトリズマブの最適投薬量を決定するための、以下を含む方法を含む：
（ａ）対象からの組織試料中の細胞表面ＣＤ６レベルのベースラインを決定すること、ここで組織試料はＴリンパ球を含み、および任意に、対象における細胞表面ＣＤ６の目標レベルを定義すること；
（ｂ）対象に、一連の２または３投薬量以上のイトリズマブ（例として、３、４、５、または６投薬量）を投与すること、任意に、投薬量を増加すること（例として、１投薬量当たりまたは１回おきの投薬量当たり、約０．１ｍｇ／ｋｇ、０．２ｍｇ／ｋｇ、０．３ｍｇ／ｋｇ、０．４ｍｇ／ｋｇ、０．５ｍｇ／ｋｇ、０．６ｍｇ／ｋｇ、０．７ｍｇ／ｋｇ、０．８ｍｇ／ｋｇ、０．９ｍｇ／ｋｇ、または１．０ｍｇ／ｋｇ以上増加すること）；
（ｃ）対象からの組織試料中の細胞表面ＣＤ６レベルを、一連の投薬の間でモニタリングすること、ここで組織試料はＴリンパ球を含み；
（ｄ）ステップ（ｃ）の細胞表面ＣＤ６レベルが、（ａ）からのベースラインの約５、１０、１５、２０、２５、３０、４０、４５、もしくは５０パーセント以下であるか、または（ａ）からの任意の目標レベルの約５、１０、１５、もしくは２０パーセント以下であり、かつ細胞表面ＣＤ６レベルのさらなる低下（例として、統計的に有意な低下）が一連の投薬の間で観察されない場合に、一連の投薬からの最低投薬量を最適投薬量として同定すること。ある態様は、対象からの組織試料中のＣＤ４細胞および／またはＣＤ８細胞の、細胞表面ＣＤ６レベルを決定することを含む。特定の態様において、組織試料は血液試料である。いくつかの態様は、対象における細胞表面ＣＤ６の目標レベルを、疾患の臨床パラメータまたは症状に基づいて定義することを含む。
いくつかの態様は、それを必要とするヒト対象における、自己免疫疾患、免疫炎症性疾患、または炎症性疾患、移植片対宿主病（ＧＶＨＤ）、または臓器移植拒絶反応の処置のための、以下を含む投与計画に関する：
（ａ）対象からの組織試料中の細胞表面ＣＤ６レベルのベースラインを決定すること、ここで組織試料はＴリンパ球を含み、および任意に、対象における細胞表面ＣＤ６の目標レベルを定義すること；
（ｂ）対象のＴリンパ球における細胞表面ＣＤ６レベルを、（ａ）からのベースラインの約５、１０、１５、２０、２５パーセント以下に低下させる投薬量のイトリズマブを、対象に投与すること；
（ｃ）対象からの組織試料中の細胞表面ＣＤ６レベルをモニタリングすること、ここで組織試料はＴリンパ球を含み；および
（ｄ）（ｃ）の細胞表面ＣＤ６レベルが、（ａ）からのベースラインの約２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、もしくは７５パーセント以上に戻るか、または（ａ）からの目標レベル付近またはそれ以上に上昇する前に、さらなる投薬量のイトリズマブを対象に投与すること。
いくつかの態様において、投与計画は、対象からのＴリンパ球（例えば、ＣＤ４および／またはＣＤ８細胞）における細胞表面ＣＤ６レベルを、（ａ）からのベースラインの約４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、もしくは７５パーセント以下に、または（ａ）からの任意の目標レベルの約５、１０、１５、もしくは２０パーセント以内に維持し、およびある態様は、対象における細胞表面ＣＤ６の目標レベルを、疾患の臨床パラメータまたは症状に基づいて定義することを含む。
さらに含まれるのは、それを必要とするヒト対象における、自己免疫疾患、免疫炎症性疾患、または炎症性疾患、移植片対宿主病（ＧＶＨＤ）、または臓器移植拒絶反応の処置のための、以下を含む投与計画である：
（ａ）対象からの血液試料中のＣＤ６ｈｉｇｈＴリンパ球のベースラインレベルを決定すること、および任意に、ＣＤ６ｈｉｇｈＴリンパ球の目標レベルを定義すること；
（ｂ）対象におけるＣＤ６ｈｉｇｈＴリンパ球のレベルを（ａ）からのベースラインの約５、１０、１５、２０、２５、３０、または４０パーセント以下に低下させる投薬量のイトリズマブを、対象に投与すること；
（ｃ）対象からの血液試料中のＣＣＤ６ｈｉｇｈＴリンパ球のレベルをモニタリングすること；および
（ｄ）（ｃ）からのＣＤ６ｈｉｇｈＴリンパ球のレベルが、（ａ）からのベースラインレベルの約２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、もしくは７５パーセント以上に戻るか、または（ａ）からの目標レベル付近またはそれ以上に上昇する前に、さらなる投薬量のイトリズマブを対象に投与すること、およびいくつかの場合においては、対象におけるＣＤ６ｈｉｇｈＴリンパ球の目標レベルを、疾患の臨床パラメータまたは症状に基づいて定義すること。
いくつかの態様において、投与計画は、対象におけるＣＤ６ｈｉｇｈＴリンパ球のレベルを、（ａ）からのベースラインレベルの約４５、５０、５５、６０、６５、７０、または７５パーセント以下に維持し、ここでＴリンパ球は、ＣＤ４細胞および／またはＣＤ８細胞である。いくつかの態様において、投与計画は、対象におけるＣＤ６ｈｉｇｈＴリンパ球：ＣＤ６ｌｏｗＴリンパ球の比率を、対照または標準またはベースラインと比較して、約もしくは少なくとも約１０、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００、２００、３００、４００、５００パーセントもしくはそれ以上、または約もしくは少なくとも約１．５、２、３、４、５、６、７、８、９、１０倍もしくはそれ以上低下させ、任意にここでＴリンパ球は、ＣＤ４細胞および／またはＣＤ８細胞である。
いくつかの態様において、投与計画は、対象におけるＴｅｆｆ：Ｔｒｅｇ細胞の比率を、対照または標準またはベースライン、任意にＣＤ４細胞および／またはＣＤ８細胞と比較して、約もしくは少なくとも約１０、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００、２００、３００、４００、５００パーセントもしくはそれ以上、または約もしくは少なくとも約１．５、２、３、４、５、６、７、８、９、１０倍もしくはそれ以上低下させる。
さらに含まれるのは、ヒト移植患者における移植片対宿主病（ＧＶＨＤ）を予防または改善する、以下を含む、細胞ベースの治療方法である：
（ａ）移植組織を、抗ＣＤ６抗体、任意にイトリズマブと、移植組織中のＣＤ６ｈｉｇｈＴリンパ球上のＣＤ６の細胞表面レベルを低下させるのに十分な時間、インキュベートすること；および
（ｂ）移植組織を患者に移植すること。
ある方法は以下を含む：移植組織中のＴリンパ球上のＣＤ６の細胞表面レベルを、ステップ（ａ）の前後で決定すること、および、ステップ（ａ）の後のＣＤ６の細胞表面レベルが、ステップ（ａ）の前と比較して、約または少なくとも約１０、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００、２００、３００、４００、５００パーセントまたはそれ以上低下した場合に、ステップ（ｂ）を実施すること。いくつかの態様において、移植組織は、臍帯血細胞、骨髄細胞、末梢血細胞、動員末梢血細胞、間葉系幹細胞、造血幹細胞、幹細胞／前駆細胞から分化した細胞、操作された細胞（例えばＣＡＲ Ｔ細胞などのキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）細胞）、または前記細胞の任意の組み合わせを含む。いくつかの態様において、移植組織はヒト移植患者にとって自己由来であり、すなわち移植組織は患者から採取され、本明細書に記載のように処理され、その後同じ患者に投与される。いくつかの態様において、移植組織は、同種移植組織、またはヒト移植患者にとって同種異系である組織であり、例えば移植組織は、遺伝的に同一でないヒトドナーから得られ、本明細書に記載のように処理され、その後ヒト患者に投与される。
さらに含まれるのは、それを必要とするヒト患者において、自己免疫疾患、免疫炎症性疾患、または炎症性疾患を処置または改善するための、以下を含む方法である：
（ａ）移植組織を、抗ＣＤ６抗体、任意にイトリズマブと、移植組織中のＣＤ６ｈｉｇｈＴリンパ球上のＣＤ６の細胞表面レベルを低下させるのに十分な時間インキュベートし、それによってＣＤ６ｌｏｗ（ナイーブ）Ｔリンパ球が豊富な移植組織を生成すること；
（ｂ）（ａ）からの移植組織を、ＣＤ６ｌｏｗ（ナイーブ）Ｔリンパ球からＴｒｅｇリンパ球を生成するのに十分な時間、処理すること；および
（ｃ）（ｃ）からの移植組織を、患者に移植すること。
上記と同様に、ある態様は、以下のステップ（単数または複数）を含む：移植組織中のＴリンパ球上のＣＤ６の細胞表面レベルを、ステップ（ａ）の前後に決定すること、および、ステップ（ａ）の後のＣＤ６の細胞表面レベルが、ステップ（ａ）の前と比較して、約または少なくとも約１０、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００、２００、３００、４００、５００パーセントまたはそれ以上低下した場合に、ステップ（ｂ）を実施すること。
いくつかの態様において、上記のステップ（ｂ）は、ＣＤ６ｌｏｗ（ナイーブ）Ｔリンパ球が豊富な移植組織を、Ｔ細胞活性化因子／刺激シグナル、サイトカイン、成長因子、転写因子、および／または安定化剤（例えば、、ＣＤ３／ＣＤ２８アクチベーター、STEMCELL TECHNOLOGIES（商標）によるIMMUNOCULT（商標） Human Treg Differentiation SupplementなどのＴｒｅｇ分化カクテル）の組み合わせと共に、Ｔｒｅｇリンパ球を生成または豊富化するのに十分な時間インキュベートすることを含む。Ｔｒｅｇを生成する（例えば分化する、増大する）ためのかかる処置またはプロトコルの例は、当技術分野で知られており（例えば以下を参照：Golovina et al., PLoS ONE (2011) 6:e15868. doi: 10.1371/journal.pone.0015868；Scotta et al., Haematologica 98:1291-9, 2013；Dons et al., Hum Immunol. 73:328-34, 2012；Fraser et al., Mol Ther Methods Clin Dev. 8:198-209, 2018；Romano et al., Front. Immunol. 31 January 2019, doi.org/10.3389/fimmu.2019.00043；Haddadi et al., Clinical and Experimental Immunol. 201(2):205-221, 2020）、ＲＯＲγ特異的インバースアゴニスト（ＳＲ）およびＴＧＦ－βシグナル伝達プロモーター［Ｎ－アセチルピューロマイシン（Ｎ－Ａｃ）］）を組み合わせたプロトコルを含む。
Ｔｒｅｇリンパ球を生成するための追加のプロトコルは以下に記載されており、例えば、Chen et al. (The Journal of Experimental Med. 198(12):1875-1886, 2003)には、ナイーブＴ細胞の、ＴＣＲとＴＧＦ－βによる共刺激が記載され；Zheng et al. (J. Immunol. 178:2018-2027, 2007)には、ＩＬ－２とＴＧＦ－βによる刺激が記載され；Schiavon et al. (PNAS. 116:6298-6307, 2019)には、ＩＬ－２、ＴＧＦ－β、およびＰＧＥ２による刺激が記載され；およびFerreira et al. (Nat Rev Drug Discov. 18(10): 749-769, 2019)には、Ｔｒｅｇリンパ球のex vivo生成を説明する様々な技法および臨床試験が記載されている。Zagury et al. (WO 2018/024896)は例示的なプロトコルを記載しており、これはＴ細胞を、次の存在の下で培養することを含む：γδＴ細胞活性化因子および以下の薬剤：ｉ）ｃＡＭＰ（環状アデノシン一リン酸）活性化因子、ｉｉ）ＴＧＦＰ（トランスフォーミング成長因子ベータ）経路活性化因子、ｉｉｉ）ｍＴＯＲ阻害剤、任意にｉｖ）ＩＬ－２、ＩＬ－７、ＩＬ－１５およびＴＳＬＰの群から選択される少なくとも１つのサイトカイン、ならびに任意に、ｖ）少なくとも１つのＴＥＴ酵素活性化因子および／または少なくとも１つのＤＮＭＴ阻害剤。Alvarez-Salazer et al. (Front. Immunol. 11:375. doi: 10.3389/fimmu.2020.00375)には、移植における免疫療法に使用する機能的安定性を備えたヒトＴｒｅｇリンパ球の大規模な生成が記載され、これは例えば、ナイーブＴ細胞を樹状細胞と共に、ＴＧＦ－β１、ＩＬ－２、およびレチノイン酸の存在下で共培養することによってＴｒｅｇを生成し、Ｔｒｅｇを、ＴＧＦ－β１、ＩＬ－２、およびラパマイシンの存在下で増大させることによる。本明細書に記載の方法（例として、上記のステップ（ｂ））は、任意の１つ以上の前述の方法、または当技術分野における他の方法を使用して、Ｔｒｅｇを、イトリズマブが豊富なＣＤ６ｌｏｗ（ナイーブ）Ｔリンパ球集団から生成することができる。
いくつかの態様において、移植組織は、臍帯血細胞、骨髄細胞、末梢血細胞、動員末梢血細胞、間葉系幹細胞、造血幹細胞、幹細胞／前駆細胞から分化した細胞、操作された細胞（例えばＣＡＲ Ｔ細胞などのキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）細胞）、または前記細胞の任意の組み合わせを含む。いくつかの態様において、移植組織はヒト患者にとって自己由来であり、例えば、自己Ｔｒｅｇ療法である。ある態様において、移植組織は、同種移植組織、またはヒト患者にとって同種異系の組織である。
ある態様は、それを必要とするヒト対象における、自己免疫疾患、免疫炎症性疾患、または炎症性疾患、移植片対宿主病（ＧＶＨＤ）、または臓器移植拒絶反応の処置のための、以下を含む方法を含む：
（ａ）イトリズマブを対象に投与すること；および
（ｂ）対象からの組織試料中のＴリンパ球上の細胞表面ＣＤ６のレベルを決定すること、対象からの組織試料中のＣＤ６ｈｉｇｈおよび任意にＣＤ６ｌｏｗＴリンパ球のレベル／比率を決定すること、および／または対象からの組織試料中のＴｅｆｆおよびＴｒｅｇ細胞のレベルを決定すること、ここで組織試料は、Ｔリンパ球を含み；
ここで、イトリズマブの投与は、（ｉ）Ｔリンパ球上の、任意にＣＤ４および／またはＣＤ８細胞上の細胞表面ＣＤ６レベル；（ｉｉ）対象におけるＣＤ６ｈｉｇｈＴリンパ球のレベル；（ｉｉｉ）対象におけるＣＤ６ｈｉｇｈ：ＣＤ６ｌｏｗＴリンパ球の比率；および／または（ｉｖ）対象におけるＴｅｆｆ：Ｔｒｅｇ細胞の比率；のいずれか１つ以上を低下させ、それによって対象における病原性免疫応答を低下させる。上記（ｉ）～（ｉｖ）のいずれか１つ以上を決定するための方法は本明細書に記載されており（実施例を参照）、当技術分野で知られている。
いくつかの例において、イトリズマブの投与は、対象におけるＴリンパ球上の細胞表面ＣＤ６レベルを、対照または標準またはベースラインと比較して、約または少なくとも約１０、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００、２００、３００、４００、５００パーセントまたはそれ以上低下させ、任意にここで、Ｔリンパ球はＣＤ４細胞および／またはＣＤ８細胞であり；対象におけるＣＤ６ｈｉｇｈＴリンパ球のレベルを、対照または標準またはベースラインと比較して、約または少なくとも約１０、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００、２００、３００、４００、５００パーセントまたはそれ以上低下させ、任意にここで、Ｔリンパ球はＣＤ４細胞および／またはＣＤ８細胞であり；対象におけるＣＤ６ｈｉｇｈ：ＣＤ６ｌｏｗＴリンパ球の比率を、対照または標準またはベースラインと比較して、約もしくは少なくとも約１０、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００、２００、３００、４００、５００パーセントもしくはそれ以上、または約もしくは少なくとも約１．５、２、３、４、５、６、７、８、９、１０倍もしくはそれ以上、低下させ、任意にここで、Ｔリンパ球はＣＤ４細胞および／またはＣＤ８細胞であり；および／または対象におけるＴｅｆｆ：Ｔｒｅｇ細胞の比率を、対照または標準またはベースラインと比較して、約もしくは少なくとも約１０、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００、２００、３００、４００、５００パーセントもしくはそれ以上、または約もしくは少なくとも約１．５、２、３、４、５、６、７、８、９、１０倍もしくそれ以上、低下させる。
いくつかの態様において、患者または対象における自己免疫疾患、免疫炎症性疾患、または炎症性疾患は、Ｔｅｆｆ：Ｔｒｅｇ細胞の比率が標準的または健康な対象と比較して増加していることを特徴とする。特定の態様において、対象または患者におけるＴｅｆｆ：Ｔｒｅｇ細胞の比率は、標準的または健康な対象と比較して、約または少なくとも約１．５、２、３、４、５、６、７、８、９または１０倍またはそれ以上増加する。特定の態様において、自己免疫疾患、免疫炎症性疾患、または炎症性疾患は、炎症性腸疾患（ＩＢＤ）、任意にクローン病または潰瘍性大腸炎、全身性エリテマトーデス（ＳＬＥ）、任意にループス腎炎を伴うＳＬＥ、関節リウマチ（ＲＡ）、多発性硬化症（ＭＳ）、乾癬、乾癬性関節炎、強直性脊椎炎、または喘息である。
ある態様は、イトリズマブの試験ロットを分析するための、in vitro細胞ベース（すなわち、細胞培養物ベース）の、以下を含む方法を含む：
（ａ）イトリズマブの試験ロットを、細胞表面でＣＤ６を発現する（培養）細胞とインキュベートすること；
（ｂ）細胞上の細胞表面ＣＤ６発現を測定すること；および
（ｃ）試験ロットが、細胞表面ＣＤ６発現（例えば、Ｔリンパ球上の）を、対照または標準と比較して減少させる場合には、イトリズマブの試験ロットを医薬組成物として製剤化すること、および試験ロットが、細胞表面ＣＤ６発現を、対照または標準と比較して減少させない場合には、イトリズマブの試験ロットを棄却すること。
いくつかの態様において、ステップ（ｂ）は、細胞、例えばＴリンパ球上の、細胞表面ＣＤ６発現を直接測定することを含む。細胞表面ＣＤ６レベルは、当技術分野の様々な技術、例えば、フローサイトメトリー、飛行時間型サイトメトリー（ＣｙＴｏＦ）、細胞ＥＬＩＳＡ、または免疫蛍光顕微鏡法によって測定することができる。ある態様において、ステップ（ｂ）は、細胞表面ＣＤ６発現の指標または代用として機能する、細胞上清中の可溶性ＣＤ６を測定することによって、細胞表面ＣＤ６発現を間接的に測定／決定することを含む。これらおよび関連する態様において、上清中の可溶性ＣＤ６の増加は、細胞表面ＣＤ６発現の減少を示す。細胞上清中の可溶性ＣＤ６を測定するための例示的な方法には、当技術分野で知られている他の方法の中でも、酵素結合免疫吸着測定法（ＥＬＩＳＡ）、化学発光アッセイ、電気化学発光アッセイ、高速液体クロマトグラフィー、ウェスタンブロット、および免疫沈降とそれに続くウェスタンブロットが含まれる。
いくつかの態様において、細胞は、末梢血単核球（ＰＢＭＣ）を含み、これは典型的には、ＣＤ１４＋単球などの前駆細胞集団、およびＣＤ１９＋Ｂ細胞、ＣＤ４＋ヘルパーＴ細胞、ＣＤ８＋細胞傷害性Ｔ細胞、およびＣＤ５６＋ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞などのリンパ球を含む。特定の態様において、細胞は、ヒトＴ細胞株、または例えばヒトＣＤ６などのＣＤ６を発現するように操作された細胞株を含む。細胞株の例には、MOLT-4、MOLT-3、MOLT-16、HuT 78、HuT 102、Jurkat、Jurkat NFAT、CCRF-CEM、12.1、MJ(G11)、LOUCY、SUP-T1、HEL.92.1.7、EF0-21、RPMI-8226、HPB-ALL、HH、KE37、P12ICHIKAWA、PEER、ALLSIL、RPMI8402、CMLT1、PF382、EHEB、およびDU4475細胞が含まれる。
いくつかの態様において、細胞は、単球、例えばヒト単球、例えば単球細胞株などを含む。いくつかの態様において、単球細胞株は、U937、THP1、MC-1010、TUR、AML-193、およびMV-4-11から選択される。いくつかの態様において、細胞は、（ａ）ヒトＴ細胞（例えば、ヒトＴ細胞株）またはＣＤ６を発現するように操作された他のヒト細胞株、および（ｂ）ヒト単球（例えば、ヒト単球細胞株）の、混合物を含む。いくつかの態様において、（ａ）：（ｂ）の混合物は、約または少なくとも約３０：１、２５：１、２０：１、１５：１、１０：１、５：１、４：１、３：１、２：１、１：１、１：２、１：３、１：４、１：５、または１：１０、またはこれらのおよその数値を超えないような、比率である。
ある態様は、イトリズマブの試験ロットを、これが細胞表面ＣＤ６発現を、対照または標準と比較して、約または少なくとも約１０、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００、２００、３００、４００、５００パーセントまたはそれ以上減少させる場合、および／または、これが上清中の可溶性ＣＤ６を、対照または標準と比較して、約または少なくとも約１０、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００、２００、３００、４００、５００パーセントまたはそれ以上増加させる場合に、医薬組成物として製剤化することを含む。
より一般的には、ある態様は、生物学的治療薬として使用するための、抗ＣＤ６抗体またはその抗原結合性断片をスクリーニングする、以下を含む方法を含む：
（ａ）候補抗ＣＤ６抗体またはその抗原結合性断片を、細胞表面上でＣＤ６を発現する細胞とインキュベートすること；
（ｂ）細胞上の細胞表面ＣＤ６発現を測定すること；および
（ｃ）候補抗ＣＤ６抗体またはその抗原結合性断片を、これが細胞表面ＣＤ６発現を対照または標準と比較して減少させる場合、医薬組成物として製剤化すること。かかる方法は、臨床関連の生物学的特性を有する候補抗ＣＤ６抗体を同定するために、イトリズマブについて本明細書に記載のように、使用することができる。
上記のように、細胞表面ＣＤ６発現レベルは、直接的または間接的に、当技術分野の様々な技術に従って測定することができる。例えば、細胞表面ＣＤ６発現レベルは直接的に、フローサイトメトリー、飛行時間型サイトメトリー（ＣｙＴｏＦ）、細胞ＥＬＩＳＡ、または免疫蛍光顕微鏡法によって測定することができる。また、細胞表面ＣＤ６発現レベルは、細胞上清中の可溶性ＣＤ６を測定することによって間接的に、測定または決定することができ、例えば、当技術分野の他の技術のうち、ＥＬＩＳＡ、化学発光アッセイ、電気化学発光アッセイ、高速液体クロマトグラフィー、ウェスタンブロット、および免疫沈降とそれに続くウェスタンブロットによる。
いくつかの態様において、細胞は、ＰＢＭＣを含む。特定の態様において、細胞は、ヒトＴ細胞株、または、例えばヒトＣＤ６などのＣＤ６を発現するように操作された細胞株を含む。細胞株の例には、MOLT-4、MOLT-3、MOLT-16、HuT 78、HuT 102、Jurkat、Jurkat NFAT、CCRF-CEM、12.1、MJ(G11)、LOUCY、SUP-T1、HEL.92.1.7、EF0-21、RPMI-8226、HPB-ALL、HH、KE37、P12ICHIKAWA、PEER、ALLSIL、RPMI8402、CMLT1、PF382、EHEB、およびDU4475細胞が含まれる。
いくつかの態様において、細胞は、単球、例えばヒト単球、例えば単球細胞株などを含む。いくつかの態様において、単球細胞株は、U937、THP1、MC-1010、TUR、AML-193、およびMV-4-11細胞から選択される。いくつかの態様において、細胞は、（ａ）ヒトＴ細胞（例えば、ヒトＴ細胞株）またはＣＤ６を発現するように操作された他のヒト細胞株、および（ｂ）ヒト単球（例えば、ヒト単球細胞株）の、混合物を含む。いくつかの態様において、（ａ）：（ｂ）の混合物は、約、または少なくとも約３０：１、２５：１、２０：１、１５：１、１０：１、５：１、４：１、３：１、２：１、１：１、１：２、１：３、１：４、１：５、または１：１０（およびその間のすべての比率範囲を含む）、またはこれらのおよその数値を超えないような、比率である。。
特定の態様は、候補抗ＣＤ６抗体またはその抗原結合性断片を、これが細胞表面ＣＤ６発現を、対照または標準と比較して、約または少なくとも約１０、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００、２００、３００、４００、５００パーセントまたはそれ以上減少させる場合、および／または、これが上清中の可溶性ＣＤ６を、対照または標準と比較して、約または少なくとも約１０、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００、２００、３００、４００、５００パーセントまたはそれ以上増加させる場合に、医薬組成物として製剤化することを含む。
ある態様において、本開示は、治療用量のイトリズマブを皮下投与または静脈内投与のいずれかによって投与することを含む、患者におけるＴ細胞上のＣＤ６レベルを低下する方法を提供する。
いくつかの態様において、治療有効量の抗ＣＤ６モノクローナル抗体は、患者が回復または退院と判断されるまで、２週間ごとに投与される。いくつかの態様において、用量は３．２ｍｇ／ｋｇ以下である。いくつかの態様において、患者には０．１～３．２ｍｇ／ｋｇが投与される。いくつかの態様において、単回用量が投与される。いくつかの態様において、２回の用量が投与される。いくつかの態様において、１～１２回の用量が投与される。いくつかの態様において、２回の用量が投与される。いくつかの態様において、３回の用量が投与される。いくつかの態様において、４回の用量が投与される。いくつかの態様において、投与は長期間である。いくつかの態様において、用量は１００ｍｇである。いくつかの態様において、用量は２００ｍｇである。いくつかの態様において、用量は隔週で投与される。いくつかの態様において、用量は毎月投与される。いくつかの態様において、用量は隔月で投与される。いくつかの態様において、用量は６週間ごとに投与される。いくつかの態様において、用量は８週間ごとに投与される。いくつかの態様において、用量は１０週間ごとに投与される。いくつかの態様において、用量は１２週間ごとに投与される。いくつかの態様において、用量は３か月ごとに投与される。いくつかの態様において、用量は４か月ごとに投与される。いくつかの態様において、用量は５か月ごとに投与される。いくつかの態様において、用量は６か月ごとに投与される。いくつかの態様において、用量は６か月より長く離して投与される。
本開示で使用される抗ＣＤ６モノクローナル抗体の治療有効量の、例示的非限定的な範囲は、対象の体重当たり約０．０１～１００ｍｇ／ｋｇ、例えば約０．０１～５０ｍｇ／ｋｇ、例えば約０．０１～２５ｍｇ／ｋｇである。いくつかの態様において、患者の身長に対する理想的な体重を使用して、用量を決定する。いくつかの態様において、複数回の用量が対象に与えられる。いくつかの態様において、より多量の初回用量が患者に与えられる。いくつかの態様において、２回目の用量は１週間後に投与される。いくつかの態様において、２回目の用量は２週間後に投与される。いくつかの態様において、２回目の用量は、１回目の用量と同じ強度である。いくつかの態様において、２回目の用量は、初回用量の４分の３以下である。いくつかの態様において、２回目の用量は、初回用量の半分である。いくつかの態様において、第３の処置が施される。いくつかの態様において、治療有効量の抗ＣＤ６モノクローナル抗体が２週間ごとに、患者が回復または退院と判断されるまで投与される。いくつかの態様において、用量は、０．８ｍｇ／ｋｇまたは１．６ｍｇ／ｋｇのいずれかである。いくつかの態様において、投与される用量は、１．６ｍｇ／ｋｇおよび０．８ｍｇ／ｋｇである。抗ＣＤ６モノクローナル抗体の治療有効量の例示的非限定的な用量は、約０．８ｍｇ／ｋｇおよび１．６ｍｇ／ｋｇまたは約０．８ｍｇ／ｋｇ～１．６ｍｇ／ｋｇの間である。医療従事者の当業者は、必要な医薬組成物の有効量を容易に決定し、処方することができる。例えば、医師は、抗ＣＤ６モノクローナル抗体の用量を、所望の治療効果を達成するために必要なレベルよりも低いレベルで開始し、所望の効果が達成されるまで投薬量を徐々に増加することができる。
いくつかの態様において、投与される用量は、０．１ｍｇ／ｋｇ、０．２ｍｇ／ｋｇ、０．３ｍｇ／ｋｇ、０．４ｍｇ／ｋｇ、０．５ｍｇ／ｋｇ、０．６ｍｇ／ｋｇ、０．７ｍｇ／ｋｇ、０．８ｍｇ／ｋｇ、０．９ｍｇ／ｋｇ、１．０ｍｇ／ｋｇ、１．１ｍｇ／ｋｇ、１．２ｍｇ／ｋｇ、１．３ｍｇ／ｋｇ、１．４ｍｇ／ｋｇ、１．５ｍｇ／ｋｇ、１．６ｍｇ／ｋｇ、１．７ｍｇ／ｋｇ、１．８ｍｇ／ｋｇ、１．９ｍｇ／ｋｇ、２．０ｍｇ／ｋｇ、２．１ｍｇ／ｋｇ、２．２ｍｇ／ｋｇ、２．３ｍｇ／ｋｇ、２．４ｍｇ／ｋｇ、２．５ｍｇ／ｋｇ、２．６ｍｇ／ｋｇ、２．７ｍｇ／ｋｇ、２．８ｍｇ／ｋｇ、２．９ｍｇ／ｋｇ、３．０ｍｇ／ｋｇ、３．１ｍｇ／ｋｇ、３．２ｍｇ／ｋｇ、３．３ｍｇ／ｋｇ、３．４ｍｇ／ｋｇ、３．５ｍｇ／ｋｇ、３．６ｍｇ／ｋｇ、３．７ｍｇ／ｋｇ、３．８ｍｇ／ｋｇ、３．９ｍｇ／ｋｇ、または４．０ｍｇ／ｋｇである。いくつかの態様において、投与される用量は、０．２ｍｇ／ｋｇ、０．４ｍｇ／ｋｇ、０．８ｍｇ／ｋｇ、１．２ｍｇ／ｋｇ、１．６ｍｇ／ｋｇ、２．０ｍｇ／ｋｇ、または２．２ｍｇ／ｇである。いくつかの態様において、イトリズマブの投薬量は、０．４ｍｇ／ｋｇ、０．８ｍｇ／ｋｇ、１．６ｍｇ／ｋｇ、または３．２ｍｇ／ｋｇである。いくつかの態様において、投与される用量は、約２５ｍｇ、５０ｍｇ、７５ｍｇ、１００ｍｇ、１２５ｍｇ、１５０ｍｇ、１７５ｍｇ、２００ｍｇ、２２５ｍｇ、２５０ｍｇ、２７５ｍｇ、３００ｍｇ、３２５、３５０、３７５、４００、４２５、４５０、４７５、または５００ｍｇである。本出願に含まれるのは、本開示で使用される抗ＣＤ６モノクローナル抗体の治療有効量のための、例示的で非限定的な用量である。医療従事者の当業者は、必要な医薬組成物の有効量を容易に決定し、処方することができる。例えば、医師は、抗ＣＤ６モノクローナル抗体の用量を、所望の治療効果を達成するために必要なレベルよりも低いレベルで開始し、所望の効果が達成されるまで投薬量を徐々に増加することができる。いくつかの態様において、方法は、患者の血液を分析して投与頻度を決定することを含む。いくつかの態様において、患者試料を、細胞表面ＣＤ６発現について分析する。いくつかの態様において、患者の血清を可溶性ＣＤ６について分析する。
いくつかの態様において、抗ＣＤ６モノクローナル抗体は、点滴により、対象の体重当たり０．１～５０ｍｇ／ｋｇの毎週投薬量で、例えば０．５～３ｍｇ／ｋｇで投与される。かかる投与は、例えば、１～８回、例えば２～４回、または３～５回反復され得る。いくつかの例において、投与は、２～２４時間、例えば２～１２時間にわたる連続注入によって、実施され得る。
いくつかの態様において、抗ＣＤ６モノクローナル抗体は、毎週投薬量で投与される。いくつかの態様において、抗ＣＤ６モノクローナル抗体は、隔週投薬量で投与される。いくつかの態様において、抗ＣＤ６モノクローナル抗体は、断続的な毎週投薬量で投与される。ある態様において、抗ＣＤ６モノクローナル抗体は、断続的な隔週投薬量で投与される。これらおよび関連する態様のいくつかでは、約５０ｍｇ～約３５０ｍｇの投薬量のイトリズマブが、７回まで、例えば２～４回投与される。いくつかの態様において、抗ＣＤ６抗体は隔週で投与される。いくつかの態様において、抗ＣＤ６抗体は隔週で断続的に投与される。いくつかの態様において、断続的な隔週投与は、最初の投与とそれに続く隔週の評価であり、その後の投与が必要かどうかを決定する。投与は、持続注入によって、約１時間の期間にわたり、または約１～２４時間、約１～１２時間、約１～６時間、約１～２時間、または約１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、もしくは２４時間の期間にわたり、実施され得る。かかる計画は、必要に応じて、例えば１週間後または２週間後に、１回以上繰り返すことができる。
本明細書で使用するセクションの見出しは、整理のみを目的としており、記載の主題を限定するものとして解釈されるべきではない。
以下の実施例は、本開示の理解を助けるために記載されるが、決してその範囲を限定することを意図するものではなく、またそのように解釈されるべきではない。実施例には、アッセイ手順で使用される従来の方法についての詳細な説明は含まれていない。かかる方法は当業者にはよく知られており、例を含む数多くの刊行物に記載されている。
これらの例は、例示のみを目的として提供されており、本明細書に提供される特許請求の範囲を限定するものではない。
例１
ＣＤ６の表面レベルのin vitro損失を凍結保存ＰＢＭＣにフローサイトメトリーを用いて分析した
凍結保存した末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）を解凍し、完全培地（ＲＰＭＩ＋１０％ＦＢＳ＋１×ペニシリン／ストレプトマイシン）に再懸濁した。ＰＢＭＣを計数し、細胞濃度を完全培地中１ｍＬあたり４００万細胞に調整した。イトリズマブおよびアイソタイプ処理物は、完全培地中、最終処理物濃度の２倍に調製した。ＰＢＭＣを、イトリズマブまたはアイソタイプのいずれかで、２４Ｗ ＴＣ処理プレートにおいて、２５０μＬのＰＢＭＣと２５０μＬの２×処理物を単一ウェル中で最終容量５００μＬとなるように混合することにより処理した。処理したＰＢＭＣを、３７℃で特定の時点（１０、３０、６０、１２０、１８０、１４４０分間）までインキュベートした。各時点において、すべての細胞を指定のウェルから収集し、４℃のＦＡＣ洗浄緩衝液（ＦＷＢ、１×ＰＢＳ＋２％ＦＢＳ＋０．５ｇのＮａＮ３）に移した。細胞を、１５００ｒｐｍで５分間ペレット化し、上清を除去した。生存染色およびＦｃブロッキングは室温で行った。ＣＤ６の表面レベルは、イトリズマブ結合と競合しない独自のＰＥ結合抗ＣＤ６抗体クローンを使用して検出した。結果を図１に示す。実験は細胞株でも実施した（図１４を参照）。
例２
イトリズマブによる処置後の患者の表面ＣＤ６レベルを、新鮮な全血のフローサイトメトリーを用いて分析した
全血（ＷＢ）は患者から特定の時点で臨床プロトコルに従って収集し、翌日の分析のために一晩かけて輸送した。赤血球（ＲＢＣ）を、９：１の比率（１×溶解緩衝液対ＷＢ）で溶解した。ＲＢＣ溶解後、細胞を染色緩衝液に再懸濁し、ＣＤ６の表面レベルを検出するために染色プレートに移した。細胞を独自の非競合抗ＣＤ６抗体クローンで染色し、ＰＥで蛍光標識して、細胞表面上のＣＤ６受容体の総量を測定した。
例３
正常で健康なボランティアからのＰＢＭＣの免疫表現型を特定して、イトリズマブによる処置後の免疫細胞集団の変化を同定した
全血を、正常で健康なボランティアからイトリズマブによる処置後に採取し、ＰＢＭＣを、密度勾配遠心分離によりＷＢから単離し、標準的な方法で凍結保存した。分析のために、凍結保存されたＰＢＭＣを解凍、洗浄し、ＣＤ３、ＣＤ４、ＣＤ６、ＣＤ８、ＣＤ２５、ＣＣＲ６、Ｈｅｌｉｏｓ、およびＦｏｘＰ３を標的とする抗体で蛍光標識し、ナイーブＴ細胞、Ｔｅｆｆ細胞、Ｔｒｅｇ細胞などの免疫細胞サブセットにおける変化を、フローサイトメトリーにより特定した。
例４
Ｔｒｅｇ細胞のＣＤ４＋細胞に対する比率を、ＤＮＡ内の細胞型特異的エピジェネティックマーカーをEpiontis IDを用いて測定することにより決定した
Epiontis IDは、細胞型特異的エピジェネティックマーカーをｑＰＣＲを用いて測定することにより、細胞型の正確な計数を可能にする。標的細胞と非標的細胞の混合物を含有する、イトリズマブで処置された患者からの凍結保存されたＰＢＭＣを、標的細胞内でのみ脱メチル化される特定の脱メチル化ＤＮＡ配列の亜硫酸水素塩配列変換にかけた。ＤＮＡを精製し、亜硫酸水素塩で変換された標的のみを増幅する特別に設計されたＰＣＲプライマーを追加して、ｑＰＣＲを実施した。以下のエピジェネティックｑＰＣＲアッセイを使用して、患者試料（アッセイ／細胞型）を分析した：ＦＯＸＰ３（Ｔｒｅｇ細胞）、ＣＤ４（ＣＤ４ Ｔ細胞）、ＣＤ８Ｂ（ＣＤ８ Ｔ細胞）、ＰＤ１陽性細胞、ＬＲＰ５（Ｂ細胞）、ＬＣＮ２（好中球）、ＭＶＤ（ＮＫ細胞）、Ｓ１ＰＲ１陽性細胞、ＰＲＧ２（好酸球）、ＣＢＸ６（メモリーＢ細胞）、ＣＣＲ７陽性細胞、Ｓ１ＰＲ５陽性細胞、ＩＬ１７Ａ（Ｔｈ１７細胞）。
例５
イトリズマブの、低、中、および高密度のＣＤ６に対する結合特性を、表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）を用いて分析した
分析は、ＨＢＳ－Ｐ緩衝剤系（１０ｍＭのHEPES、ｐＨ７．４、１５０ｍＭのＮａＣｌ、および０．０５％の界面活性剤Ｐ２０）中２５℃で、ストレプトアビジン（ＳＡ）センサーチップを備えたBiacore 3000光学バイオセンサーを用いて実施した。ビオチン化組換えヒトＣＤ６を、センサーチップのＦｃ２、Ｆｃ３、およびＦｃ４にそれぞれ低密度（７ＲＵ）、中密度（５５ＲＵ）、および高密度（２５５ＲＵ）で捕捉した。これらの密度は、Ｔ細胞で観察される低、中、高レベルのＣＤ６と同様である。
９００ｎＭまたは０．１３７ｎＭの範囲の分析物濃度シリーズを、ランニングバッファーで３倍希釈して調製した。すべての分析物濃度の結合相は、流速５０μＬ／分で２４０秒間監視し、一方解離相は、流速５０μＬ／分で１８００秒間収集した。表面は、１ＭのＭｇＣｌ２を１５秒間、流速５０μＬ／分で用いて再生した。結果を、図１２Ａ～１２Ｆおよび図１３Ａ～１３Ｆに示す。
例６
イトリズマブは細胞表面ＣＤ６の切断を誘導する
ＰＢＭＣを、アイソタイプまたはイトリズマブで３７℃で７２時間処理した。７２時間後、細胞と上清を収集した。
細胞関連ＣＤ６。細胞表面のＣＤ６レベルをフローサイトメトリーで分析した。細胞ペレットを使用して、総タンパク質を、０．１％トリトンを含むＲＩＰＡバッファーを使用して単離した。可溶性ＣＤ６は、上清から、ＣＤ６の細胞外部分を認識する特異的抗ＣＤ６抗体を使用して免疫沈降させた。上清中の可溶性ＣＤ６レベルも、ＭＳＤによって分析した。
細胞上清中のＣＤ６。ＣＤ６レベルをさらに、免疫沈降させた上清中および細胞溶解物中でウェスタンブロットによって分析した。タンパク質を、４～１２％のNu-Pageゲルに負荷し、ＰＶＤＦ膜に転写した。膜をポンソー（Ponceau）で染色し、次いで一次抗体抗ＣＤ６または抗gapdhと共に、４℃で一晩インキュベートした。翌日、膜をＴＢＳ＋tweenで洗浄し、ＨＲＰ結合二次抗体と共に室温で１時間インキュベートし、ＴＢＳ＋tweenで再度洗浄し、ＨＲＰ基質を添加した後、化学発光イメージャーを使用してシグナルを取得した。結果を図１８Ａ～１８Ｂおよび図１９に示す。
例７
イトリズマブ誘導性のＣＤ６切断における単球の役割
イトリズマブ誘導性のＣＤ６の切断に対する、他の細胞型の寄与を評価するために、Ｔ細胞、単球、ＮＫ細胞、およびＢ細胞をネガティブ磁気分離によってＰＢＭＣから単離した。次に、単離されたＴ細胞を、単球、ＮＫ細胞、またはＢ細胞の存在下で、アイソタイプまたはイトリズマブで処理した。単離されたＴ細胞はまた、単球に対するＴ細胞の比率を増加させた状態でも、アイソタイプまたはイトリズマブで処理した。
処理後、Ｔ細胞表面のＣＤ６の表面レベルを、イトリズマブの結合を妨げない抗ＣＤ６検出抗体を使用したフローサイトメトリーにより検出した。結果を図２０Ａ～２０Ｂに示す。図２０Ａは、Ｔ細胞上のＣＤ６の損失が、単球、および程度は低いがＮＫ細胞が処理中に存在する場合にのみ、観察されることを示す。図２０Ｂは、ＣＤ６の損失の増加が、単球数の増加に伴って観察されることを示す。
例８
イトリズマブの、Ｔ細胞の特性および機能に対する影響
９６ウェル平底プレートを、ＣＤ３＋ＡＬＣＡＭ（ＰＢＳ中）で３７℃で２時間コーティングした。２時間のインキュベーション後、プレートを１×ＰＢＳで１回洗浄し、続いて５％ＢＳＡを用いたブロッキングステップを３７℃で３０分間行った。ブロッキング後、プレートを１×ＰＢＳで２回洗浄した。
凍結したＰＢＭＣを、完全ＲＰＭＩでゆっくり解凍した。細胞は２×１０６細胞／ｍｌに調整した。次いで、細胞を１００μｌ中２０万細胞／ウェルで播種した。イトリズマブは、３倍希釈曲線において完全培地中３倍に調製した。最終アッセイ容量は、９６平底プレートで２００μｌである。
ＰＢＭＣを、３７℃で合計２４時間インキュベートした。プレートを遠心して上清を収集し、サイトカインを検出した。次に細胞を収集して、ＣＤ４およびＣＤ８ Ｔ細胞上のＣＤ６の損失と活性化マーカーの減少を検出した。非競合ＣＤ６抗体を使用して、ＣＤ６の損失をフローサイトメトリーによって評価した。ＣＤ６は、幾何平均蛍光（ｇＭＦＩ）として報告した。結果を図２１Ａ～２１Ｅに示すが、これは、ＣＤ６の細胞表面レベルの低下が、Ｔ細胞活性化マーカーＣＤ７１、ＰＤ‐１、ＣＤ２５、ＩＬ‐２、およびＴＮＦαの減少と相関することを証明する。
ＰＢＭＣを、アイソタイプ対照またはイトリズマブで２４時間処理し、それぞれＣＤ６ｈｉｇｈ細胞とＣＤ６ｌｏｗ細胞を生成した。２４時間の処理後、細胞を収集し、培地で繰り返し洗浄して残留抗体処理物を除去した。洗浄した細胞を計数し、濃度を１×１０６細胞／ｍＬに調整した。
９６ウェル平底プレートを、ＰＢＳ中のＣＤ３＋ＡＬＣＡＭで３７℃で２時間コーティングした。２時間のインキュベーション後、プレートをＰＢＳで２回洗浄した。洗浄したＣＤ６ｈｉｇｈおよびＣＤ６ｌｏｗ細胞を、２０万細胞／ウェルでプレーティングし、２４、４８、７２、および９６時間インキュベートした。指定された各時点で、Ｔ細胞の活性化を、転写因子の表面および細胞内染色により、フローサイトメトリーを使用して評価した。結果を図２２に示す。これは、イトリズマブとの最初のインキュベーションによって生成されたＣＤ６ｌｏｗ細胞が、ＣＤ６ｌｏｗとして留まるだけでなく、その後のＣＤ３＋ＡＬＣＡＭによる刺激後にＴｅｆｆ様が減少する（例えば、Ｔｈ１およびＴｈ１７様が減少する）ことを証明する。対照的に、アイソタイプ対照とのインキュベーションによって生成されたＣＤ６ｈｉｇｈ細胞は、その後の刺激後の特性においてよりＴｅｆｆ様であった。
例９
イトリズマブはＴリンパ球の同種反応性を低下させる
一方向の混合リンパ球反応を使用して、イトリズマブの、Ｔ細胞の同種反応性の低下における有用性を評価した。ＰＢＭＣのレスポンダーと刺激要因のペアリングを特定し、テイクダウン時のレスポンダー数を読み取り値として使用した。レスポンダーＰＢＭＣを解凍し、Cell Trace Violetで標識し、アイソタイプまたはイトリズマブで２時間、前処理した。刺激要因ＰＢＭＣを解凍し、マイトマイシンＣで２０分間処理して増殖を阻害した。マイトマイシンＣ処理後、刺激要因ＰＢＭＣを培地で繰り返し洗浄した。レスポンダーおよび刺激要因ＰＢＭＣを計数し、Ｕ底９６ウェル中１：１の比率で、イトリズマブまたはアイソタイプ処理物と混合した。
レスポンダー細胞を、刺激細胞の存在下で約９６～１６８時間後に刺激した。各時点で細胞を収集し、レスポンダー細胞の増殖および活性化をフローサイトメトリーで評価した。結果を図２３Ａ～２３Ｄに示す。ここで、イトリズマブで処理したレスポンダー細胞は、より低いレベルのＣＤ６を発現し（２３Ａ）、１６８時間後のより低いＣＤ４＋数（２３Ｂ）およびＣＤ７１レベルによって示されるように増殖性が低く（２３Ｄ）、１６８時間後のより低いレベルのＣＤ２５によって示されるように活性化が低かった（２３Ｃ）。
例１０
イトリズマブはＴｒｅｇリンパ球の豊富化に有用である
イトリズマブのＣＤ６ｌｏｗＴ細胞を豊富化する能力を、イトリズマブが豊富なＣＤ６ｌｏｗＴ細胞からＴｒｅｇリンパ球を生成することの有用性を試験するための基礎として、Ｔｒｅｇリンパ球のＣＤ６ｈｉｇｈＴ細胞からの生成と比較して用いた。
ＣＤ６ ｌｏｗ およびＣＤ６ ｈｉｇｈ Ｔ細胞の生成。凍結したＰＢＭＣを、完全ＲＰＭＩでゆっくり解凍した。全ＰＢＭＣを、アイソタイプ対照またはイトリズマブで３７℃で２４時間処理した。２４時間後、細胞を収集し、ＣＤ４ Ｔ細胞上のＣＤ６の損失を確認し、ナイーブＴ細胞を単離した。
Ｔ ｒｅｇ のナイーブＴ細胞からの分化。上記のように処理したＰＢＭＣを、STEMCELLキットを使用して、ナイーブＴ細胞を豊富にした。ＴｒｅｇをＣＤ６ｌｏｗおよびＣＤ６ｈｉｇｈから区別するために、ＣＤ３／ＣＤ２８アクチベーターをSTEMCELLからのＴｒｅｇ分化カクテルと組み合わせて合計７日間、追加した。
Ｔ ｒｅｇ 表現型の確認。Ｔｒｅｇ分化条件下で７日後、ＣＤ６ｌｏｗおよびＣＤ６ｈｉｇｈを細胞内染色のために収集し、フローサイトメーターで取得した。細胞は、ＦｏｘＰ３とＨｅｌｉｏｓの共発現によって確認した。図２４Ａ～２４Ｂの結果は、ＰＢＭＣのイトリズマブによる前処理が、ＣＤ６ｌｏｗナイーブＴ細胞を豊富化し、これを使用して、アイソタイプ対照による前処理と比較して、より効率的により多くの数のＴｒｅｇを生成することができることを証明する。
Ｔ ｒｅｇ 抑制アッセイ。分化の７日目に、ＣＤ６ｌｏｗおよびＣＤ６ｈｉｇｈＴｒｅｇを収集した。Ｔｒｅｇを計数し、１００，０００、５０，０００、および２５，０００個で播種して、１：１、１：２、および１：４の３つの比率を生成した。
Ｔレスポンダー細胞の生成。同じドナーからの凍結ＰＢＭＣを、ゆっくり解凍した。ＰＢＭＣは、ＣＤ２５－であるＣＤ４ Ｔ細胞が豊富であり、合計２つのキットを組み合わせてこれらの細胞を生成した。どちらのキットもSTEMCELL製であった。これらの細胞を単離して、細胞をCell Trace Violetで標識した。
Ｔ レスポンダー の刺激およびＴ ｒｅｇ との共培養。Ｔレスポンダーを、Ｔｒｅｇを有するウェルに加えた。試験条件は、刺激なし、および様々なレベルの刺激であった。抑制アッセイは、３７℃で合計４日間培養した。
Ｔレスポンダーの抑制の計算。様々なレベルの刺激を与えて単独で培養したＴレスポンダーを、Cell Trace Violetの増殖について測定した。従来のゲーティング法で、Ｔレスポンダー増殖の抑制を計算した。結果を図２５に示す。ここで、ＣＤ６ｌｏｗナイーブＴ細胞から生成されたＴｒｅｇは、すべてのＴｒｅｇ対レスポンダーＴ細胞比率において、ＣＤ６ｈｉｇｈＴｒｅｇと比較して抑制活性が増加している；最大の抑制は、１：１のＴｒｅｇ：Ｔレスポンダー比率で観察される。
これらの観察は、（イトリズマブによって誘導されるような）表面ＣＤ６の損失が、ナイーブＴ細胞の、過剰活性および病原性免疫細胞機能を抑制するより大きな能力を持つＴｒｅｇへの分化を歪ませ、これが免疫系のバランスの回復に寄与することを証明する。
要約すると、ナイーブＴ細胞をイトリズマブで前処理すると、ＦｏｘＰ３とＨｅｌｉｏｓの共発現が増加したＴｒｅｇ表現型が得られ、この頻度およびＭＦＩの増加は、より大きな抑制活性と相関することが示される。
例１１
生着される組織からのＣＤ６ｌｏｗ細胞の選択的豊富化／ＣＤ６ｈｉｇｈ細胞の除去を使用した、リスクのある患者におけるＧＶＨＤの予防
患者におけるＧＶＨＤのリスクを低減する目的で、移植前の臍帯血細胞、骨髄細胞、またはＨＬＡ適合同胞細胞の集団中のＣＤ６ｈｉｇｈ細胞からＣＤ６を取り除くために最適化された抗ＣＤ６抗体を使用することにより、いかにして既知の方法を本開示の方法と組み合わせる使用するかは、当業者には明らかであろう。細胞は、最適化された抗ＣＤ６抗体による処理の前または後に、ex vivoで増大させて、ＣＤ６の細胞表面発現を減少させ、移植レシピエントにおけるＧＶＨＤを防ぐことができる。
例えば、イトリズマブを使用して、正常な正期産で得られたヒト臍帯血試料を処理することができる。臍帯血単位は、抗ＣＤ６抗体、抗原結合性断片、もしくは融合抗ＣＤ６抗体による処理の前に、赤血球が除去されてもよく、およびＣＤ３４＋細胞の臨床グレードの選択を受けてもよい。
ＣＤ６が取り除かれた試料は、幹細胞治療が必要でありＧＶＨＤのリスクがある患者に投与することができる。１つ以上のバイオマーカーを測定して、患者は陽性および陰性の臨床応答がないか、注意深くモニタリングされる。
抗ＣＤ６抗体、その抗原結合性断片、または融合抗体で前処理した前駆細胞を使用して、幹細胞移植を必要とする患者のＧＶＨＤを予防することができる。移植前に、臍帯血移植、または骨髄移植、またはＨＬＡ適合移植は、移植されるＣＤ６の量を１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、または８０％より多く減少させるのに十分な量のイトリズマブで処理される。ＣＤ６レベルは、当技術分野で知られている従来の技術、例えば細胞のＦＡＣＳ分析または患者から採取した血液試料からの血清分析などを使用して、モニタリングすることができる。例えば、当分野の医師は、様々な時点で患者から血液試料を採取し、ＦＡＣＳ分析を行うことによって細胞表面ＣＤ６の程度を決定することができる。当分野の医師は、ヒト患者に対して、本明細書に記載の抗ＣＤ６抗体などの、抗体、その抗原結合性断片、ＡＤＣ、またはＣＤ６に結合できる可溶性リガンドを投与した後、ＧＶＨＤの臨床症状を評価することができる。
例１２
イトリズマブ効能アッセイ
イトリズマブの機能をＣＤ６の損失によって評価する効能アッセイが開発された。ＰＢＭＣを、１００μｌ中２０万細胞／ウェルで播種した。イトリズマブは、３倍希釈曲線において完全培地中３倍に調製した。最終アッセイ容量は、９６平底プレート中２００μｌである。
ＰＢＭＣを、３７℃で合計２４時間インキュベートした。プレートを遠心して上清を回収し、可溶性ＣＤ６を検出した。次に細胞を収集して、ＣＤ４およびＣＤ８ Ｔ細胞上のＣＤ６の損失を検出した。非競合ＣＤ６抗体を使用し、ＣＤ６の損失をフローサイトメトリーによって評価した。ＣＤ６は、幾何平均蛍光（ｇＭＦＩ）として報告した。結果を図２６Ａ～２６Ｂに示す。ここでの結果は、アッセイが堅牢かつ再現可能であり、タンパク質濃度の変化に対して優れた感度を示し（２６Ａを参照）、抗体のＦｃ領域内の変化を検出するのに十分な感度を有する（２６Ｂを参照）ことを証明する。ＣＤ６またはＦｃ受容体への結合に影響を与えるｍＡｂの変化は、ＣＤ６損失の減少をもたらすため、イトリズマブバッチの効能の良好な尺度として機能する。
要約すると、イトリズマブは、用量依存的および時間依存的様式でＣＤ６の切断を誘導し、ＣＤ６損失の程度はＴ細胞活性化およびサイトカイン発現の減少と相関する。イトリズマブを投与された患者では、ＣＤ６の損失が観察され、イトリズマブは、複数のドナーにわたって強力な方法で切断を誘導する。したがって、本明細書に示すように、ＣＤ６の切断は薬物の効果の代用であり、ＣＤ６の切断を測定するためのin vitroアッセイは、臨床に関連する強力で再現性のあるアプローチを提供する。
例１３
イトリズマブで処置されたループス（ＳＬＥ）患者はＣＤ４およびＣＤ８ Ｔ細胞上で減少したＣＤ６発現を有する
イトリズマブ処置後のＳＬＥ対象（EQUALIZE試験から）のＣＤ４およびＣＤ８ Ｔ細胞上のＣＤ６の表面レベルを分析し、ＣＤ６の平均蛍光によって表した。ＣＤ６のベースライン（薬物投与前）レベルは対象によって異なるが、表面ＣＤ６の損失はすべての用量にわたって観察された（図２７Ａ～２７Ｅを参照）。研究期間中のＣＤ６の表面レベルは、より低用量のイトリズマブ（０．４ｍｇ／ｋｇ）で処置された対象ではより変動しやすい。より高用量のイトリズマブ（０．８～３．２ｍｇ／ｋｇ）で処置された対象は、最後の投与から何週間後も低レベルのＣＤ６を維持する。矢印は、対象がいつイトリズマブを投与されたかを示す。破線は、蛍光マイナス１（ＦＭＯ）対照によって決定された、表面ＣＤ６の不在を示す。統計を、ベースラインと比較したＣＤ４ Ｔ細胞上のＣＤ６について示す。合計Ｎ＝２６名の対象が、５つの用量コホートにわたる分析に含まれた。図２８Ａ～２８Ｂは、ＣＤ４（２８Ａ）およびＣＤ８（２８Ｂ）Ｔ細胞上の細胞表面ＣＤ６が、イトリズマブの初回用量後に減少すること、および表面ＣＤ６のより大きな損失が、イトリズマブの用量が高くなるにつれて観察されることを示す。データは、ベースライン（薬物投与前）の％として表され、１５日目（最初の投与から１４日、２回目の投与前）について示されている。＊＊ｐ＜０．０１、＊ｐ＜０．０５。
例１４
イトリズマブは患者におけるＴｈ１７：Ｔｒｅｇ比率を調節する
EQUIP研究の対象（０．８ｍｇ／ｋｇで投与された４名の対象およびプラセボ対象１名）からサンプリングされたＰＢＭＣは、Epiontis IDを使用して免疫表現型解析した。図２９Ａ～２９Ｂに示すように、０．８ｍｇ／ｋｇのイトリズマブによる処置は、プラセボと比較して、Ｔｈ１７細胞の３倍の減少およびＴｒｅｇ細胞の２．５倍の増加を引き起こした。
本開示のある態様を本明細書に示し説明してきたが、当業者には、かかる態様が単なる例として提供されたことは明らかであろう。当業者であれば、本開示から逸脱することなく、数多くの変形、変化、および置換を思いつくであろう。本明細書に記載された本開示の態様に対する様々な代替案が、本開示を実施する際に採用され得ることを理解されたい。以下の特許請求の範囲が本開示の範囲を定義すること、および、これらの特許請求の範囲内の方法および構造、ならびにそれらの均等物がそれによってカバーされることが、意図されている。
本明細書で言及されるすべての特許、特許出願および刊行物は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。
本開示は、理解を明確にする目的で、図面および例によってある程度詳細に提供されているが、当業者には、本開示の精神または範囲から逸脱することなく、様々な変化および改変を実施できることが明らかであろう。したがって、前述の説明および例は、限定するものとして解釈されるべきではない。

Claims (44)

  1. 自己免疫疾患、免疫炎症性疾患、または炎症性疾患、移植片対宿主病（ＧＶＨＤ）、または臓器移植拒絶反応を有するヒト対象における、イトリズマブの最適投薬量を決定するための方法であって、
    （ａ）対象からの組織試料中の細胞表面ＣＤ６レベルのベースラインを決定すること、ここで組織試料はＴリンパ球を含み、および任意に、対象における細胞表面ＣＤ６の目標レベルを定義すること；
    （ｂ）対象に、一連の２または３投薬量以上のイトリズマブを投与すること、任意に、投薬量を増加すること；
    （ｃ）対象からの組織試料中の細胞表面ＣＤ６レベルを、一連の投薬の間でモニタリングすること、ここで組織試料はＴリンパ球を含み；
    （ｄ）ステップ（ｃ）の細胞表面ＣＤ６レベルが、（ａ）からのベースラインの約５、１０、１５、２０、２５、３０、４０、４５、もしくは５０パーセント以下であるか、または（ａ）からの任意の目標レベルの約５、１０、１５、もしくは２０パーセント以下であり、かつ細胞表面ＣＤ６レベルのさらなる低下が一連の投薬の間で観察されない場合に、一連の投薬からの最低投薬量を最適投薬量として同定すること、
    を含む、前記方法。
  2. 対象からの組織試料中のＣＤ４細胞および／またはＣＤ８細胞の、細胞表面ＣＤ６レベルを決定することを含む、請求項１に記載の方法。
  3. 組織試料が血液試料である、請求項１または２に記載の方法。
  4. 対象における細胞表面ＣＤ６の目標レベルを、疾患の臨床パラメータまたは症状に基づいて定義することを含む、請求項１～３のいずれか一項に記載の方法。
  5. それを必要とするヒト対象における、自己免疫疾患、免疫炎症性疾患、または炎症性疾患、移植片対宿主病（ＧＶＨＤ）、または臓器移植拒絶反応の処置のための投与計画であって、
    （ａ）対象からの組織試料中の細胞表面ＣＤ６レベルのベースラインを決定すること、ここで組織試料はＴリンパ球を含み、および任意に、対象における細胞表面ＣＤ６の目標レベルを定義すること；
    （ｂ）対象のＴリンパ球における細胞表面ＣＤ６レベルを、（ａ）からのベースラインの約５、１０、１５、２０、２５パーセント以下に低下させる投薬量のイトリズマブを、対象に投与すること；
    （ｃ）対象からの組織試料中の細胞表面ＣＤ６レベルをモニタリングすること、ここで組織試料はＴリンパ球を含み；および
    （ｄ）（ｃ）の細胞表面ＣＤ６レベルが、（ａ）からのベースラインの約２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、もしくは７５パーセント以上に戻るか、または（ａ）からの目標レベル付近またはそれ以上に上昇する前に、さらなる投薬量のイトリズマブを対象に投与すること、
    を含む、前記投与計画。
  6. 対象からのＴリンパ球（任意にＣＤ４および／またはＣＤ８細胞）における細胞表面ＣＤ６レベルを、（ａ）からのベースラインの約４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、もしくは７５パーセント以下に、または（ａ）からの任意の目標レベルの約５、１０、１５、もしくは２０パーセント以内に維持し、任意に、対象における細胞表面ＣＤ６の目標レベルを、疾患の臨床パラメータまたは症状に基づいて定義する、請求項５に記載の投与計画。
  7. それを必要とするヒト対象における、自己免疫疾患、免疫炎症性疾患、または炎症性疾患、移植片対宿主病（ＧＶＨＤ）、または臓器移植拒絶反応の処置のための投与計画であって、
    （ａ）対象からの血液試料中のＣＤ６ｈｉｇｈＴリンパ球のベースラインレベルを決定すること、および任意に、ＣＤ６ｈｉｇｈＴリンパ球の目標レベルを定義すること；
    （ｂ）対象におけるＣＤ６ｈｉｇｈＴリンパ球のレベルを、（ａ）からのベースラインの約５、１０、１５、２０、２５、３０、または４０パーセント以下に低下させる投薬量のイトリズマブを、対象に投与すること；
    （ｃ）対象からの血液試料中のＣＣＤ６ｈｉｇｈＴリンパ球のレベルをモニタリングすること；および
    （ｄ）（ｃ）からのＣＤ６ｈｉｇｈＴリンパ球のレベルが、（ａ）からのベースラインレベルの約２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、もしくは７５パーセント以上に戻るか、または（ａ）からの目標レベル付近またはそれ以上に上昇する前に、さらなる投薬量のイトリズマブを対象に投与すること、任意に、対象におけるＣＤ６ｈｉｇｈＴリンパ球の目標レベルを、疾患の臨床パラメータまたは症状に基づいて定義すること、
    を含む、前記投与計画。
  8. 対象におけるＣＤ６ｈｉｇｈＴリンパ球のレベルを、（ａ）からのベースラインレベルの約４５、５０、５５、６０、６５、７０、または７５パーセント以下に維持し、任意にここでＴリンパ球がＣＤ４細胞および／またはＣＤ８細胞である、請求項５に記載の投与計画。
  9. 対象におけるＣＤ６ｈｉｇｈＴリンパ球：ＣＤ６ｌｏｗＴリンパ球の比率を、対照または標準またはベースラインと比較して、約もしくは少なくとも約１０、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００、２００、３００、４００、５００パーセントもしくはそれ以上、または約もしくは少なくとも約１．５、２、３、４、５、６、７、８、９、１０倍もしくはそれ以上、低下させ、任意にここでＴリンパ球がＣＤ４細胞および／またはＣＤ８細胞である、請求項５～８のいずれか一項に記載の投与計画。
  10. 対象におけるＴｅｆｆ：Ｔｒｅｇ細胞の比率を、対照または標準またはベースライン、任意にＣＤ４細胞および／またはＣＤ８細胞と比較して、約もしくは少なくとも約１０、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００、２００、３００、４００、５００パーセントもしくはそれ以上、または約もしくは少なくとも約１．５、２、３、４、５、６、７、８、９、１０倍もしくはそれ以上、低下させ、任意にここでＴｅｆｆ細胞がＴｈ１７細胞である、請求項５～８のいずれか一項に記載の投与計画。
  11. ヒト移植患者における移植片対宿主病（ＧＶＨＤ）を予防または改善する方法であって、
    （ａ）移植組織を、抗ＣＤ６抗体、任意にイトリズマブと、移植組織中のＣＤ６ｈｉｇｈＴリンパ球上のＣＤ６の細胞表面レベルを低下させるのに十分な時間、インキュベートすること；および
    （ｂ）移植組織を患者に移植すること、
    を含む、前記方法。
  12. 移植組織中のＴリンパ球上のＣＤ６の細胞表面レベルを、ステップ（ａ）の前後で決定すること、および、ステップ（ａ）の後のＣＤ６の細胞表面レベルが、ステップ（ａ）の前と比較して、約または少なくとも約１０、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００、２００、３００、４００、５００パーセントまたはそれ以上低下した場合に、ステップ（ｂ）を実施すること、を含む、請求項１１に記載の方法。
  13. 移植組織が、臍帯血細胞、骨髄細胞、末梢血細胞、動員末梢血細胞、間葉系幹細胞、造血幹細胞、幹細胞／前駆細胞から分化した細胞、操作された細胞（任意にキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）細胞）、または前記細胞の任意の組み合わせを含む、請求項１１または１２に記載の方法。
  14. 移植組織が、ヒト移植患者にとって自己由来である、請求項１１～１３のいずれか一項に記載の方法。
  15. 移植組織が、ヒト移植患者にとって同種異系である、請求項１１～１３のいずれか一項に記載の方法。
  16. それを必要とするヒト患者において、自己免疫疾患、免疫炎症性疾患、または炎症性疾患を処置または改善するための方法であって、
    （ａ）移植組織を、抗ＣＤ６抗体、任意にイトリズマブと、移植組織中のＣＤ６ｈｉｇｈＴリンパ球上のＣＤ６の細胞表面レベルを低下させるのに十分な時間インキュベートし、それによってＣＤ６ｌｏｗＴリンパ球が豊富な移植組織を生成すること；
    （ｂ）（ａ）からの移植組織を、ＣＤ６ｌｏｗＴリンパ球からＴｒｅｇリンパ球を生成するのに十分な時間、処理すること；および
    （ｃ）（ｃ）からの移植組織を、患者に移植すること、
    を含む、前記方法。
  17. 移植組織中のＴリンパ球上のＣＤ６の細胞表面レベルを、ステップ（ａ）の前後に決定すること、および、ステップ（ａ）の後のＣＤ６の細胞表面レベルが、ステップ（ａ）の前と比較して、約または少なくとも約１０、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００、２００、３００、４００、５００パーセントまたはそれ以上低下した場合に、ステップ（ｂ）を実施すること、を含む、請求項１６に記載の方法。
  18. （ｂ）が、ＣＤ６ｌｏｗＴリンパ球が豊富化された移植組織を、サイトカイン、成長因子、および転写因子の組み合わせと共に、Ｔｒｅｇリンパ球を生成するのに十分な時間インキュベートすることを含む、請求項１６または１７に記載の方法。
  19. 移植組織が、臍帯血細胞、骨髄細胞、末梢血細胞、動員末梢血細胞、間葉系幹細胞、造血幹細胞、幹細胞／前駆細胞から分化した細胞、操作された細胞（任意にキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）細胞）、または前記細胞の任意の組み合わせを含む、請求項１６～１８のいずれか一項に記載の方法。
  20. 移植組織が、ヒト患者にとって自己由来である、請求項１６～１９のいずれか一項に記載の方法。
  21. 移植組織が、ヒト患者にとって同種異系である、請求項１６～１９のいずれか一項に記載の方法。
  22. それを必要とするヒト対象における、自己免疫疾患、免疫炎症性疾患、または炎症性疾患、移植片対宿主病（ＧＶＨＤ）、または臓器移植拒絶反応の処置のための方法であって、
    （ａ）イトリズマブを対象に投与すること；および
    （ｂ）対象からの組織試料中のＴリンパ球上の細胞表面ＣＤ６のレベルを決定すること、対象からの組織試料中のＣＤ６ｈｉｇｈおよび任意にＣＤ６ｌｏｗＴリンパ球のレベルを決定すること、および／または対象からの組織試料中のＴｅｆｆおよびＴｒｅｇ細胞のレベルを決定すること、ここで組織試料は、Ｔリンパ球を含む；を含み、
    ここで、イトリズマブの投与が、（ｉ）Ｔリンパ球上の、任意にＣＤ４および／またはＣＤ８細胞上の細胞表面ＣＤ６レベル；（ｉｉ）対象におけるＣＤ６ｈｉｇｈＴリンパ球のレベル；（ｉｉｉ）対象におけるＣＤ６ｈｉｇｈ：ＣＤ６ｌｏｗＴリンパ球の比率；および／または（ｉｖ）対象におけるＴｅｆｆ：Ｔｒｅｇ細胞の比率；のいずれか１つ以上を低下させ、それによって対象における病原性免疫応答を低下させる、前記方法。
  23. イトリズマブの投与が：
    対象におけるＴリンパ球上の細胞表面ＣＤ６レベルを、対照、標準、またはベースラインと比較して、約または少なくとも約１０、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００、２００、３００、４００、５００パーセントまたはそれ以上低下させ、任意にここで、Ｔリンパ球はＣＤ４細胞および／またはＣＤ８細胞であり；
    対象におけるＣＤ６ｈｉｇｈＴリンパ球のレベルを、対照、標準、またはベースラインと比較して、約または少なくとも約１０、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００、２００、３００、４００、５００パーセントまたはそれ以上低下させ、任意にここで、Ｔリンパ球はＣＤ４細胞および／またはＣＤ８細胞であり；
    対象におけるＣＤ６ｈｉｇｈ：ＣＤ６ｌｏｗＴリンパ球の比率を、対照、標準、またはベースラインと比較して、約もしくは少なくとも約１０、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００、２００、３００、４００、５００パーセントもしくはそれ以上、または約もしくは少なくとも約１．５、２、３、４、５、６、７、８、９、１０倍もしくはそれ以上、低下させ、任意にここで、Ｔリンパ球はＣＤ４細胞および／またはＣＤ８細胞であり；および／または
    対象におけるＴｅｆｆ：Ｔｒｅｇ細胞の比率を、対照、標準、またはベースラインと比較して、約もしくは少なくとも約１０、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００、２００、３００、４００、５００パーセントもしくはそれ以上、または約もしくは少なくとも約１．５、２、３、４、５、６、７、８、９、１０倍もしくそれ以上、低下させ、任意にここで、Ｔｅｆｆ細胞はＴｈ１７細胞である、
    請求項２２に記載の方法。
  24. イトリズマブの試験ロットを分析するための、in vitro細胞ベースの方法であって、
    （ａ）イトリズマブの試験ロットを、細胞表面でＣＤ６を発現する細胞とインキュベートすること；
    （ｂ）細胞上の細胞表面ＣＤ６発現を測定すること；および
    （ｃ）試験ロットが、細胞表面ＣＤ６発現を、対照または標準と比較して減少させる場合には、イトリズマブの試験ロットを医薬組成物として製剤化すること、および試験ロットが、細胞表面ＣＤ６発現を、対照または標準と比較して減少させない場合には、イトリズマブの試験ロットを棄却すること、
    を含む、前記方法。
  25. （ｂ）が、細胞表面ＣＤ６発現を、フローサイトメトリー、飛行時間型サイトメトリー（ＣｙＴｏＦ）、細胞ＥＬＩＳＡ、または免疫蛍光顕微鏡法によって直接測定することを含むか、または（ｂ）が、上清中の可溶性ＣＤ６を、細胞表面ＣＤ６発現の指標として、任意に酵素結合免疫吸着測定法（ＥＬＩＳＡ）、化学発光アッセイ、電気化学発光アッセイ、高速液体クロマトグラフィー、ウェスタンブロット、または免疫沈降とそれに続くウェスタンブロットにより測定することを含む、請求項２４に記載の方法。
  26. 細胞が、末梢血単核球（ＰＢＭＣ）を含む、請求項２４または２５に記載の方法。
  27. 細胞が、ヒトＴ細胞株、または、ＣＤ６、任意にヒトＣＤ６を発現するように操作された細胞株を含む、請求項２４～２６のいずれか一項に記載の方法。
  28. 細胞株が、MOLT-4、MOLT-3、MOLT-16、HuT 78、HuT 102、Jurkat、Jurkat NFAT、CCRF-CEM、12.1、MJ(G11)、LOUCY、SUP-T1、HEL.92.1.7、EF0-21、RPMI-8226、HPB-ALL、HH、KE37、P12ICHIKAWA、PEER、ALLSIL、RPMI8402、CMLT1、PF382、EHEB、およびDU4475細胞から選択される、請求項２７に記載の方法。
  29. 細胞が、単球、任意に単球細胞株を含む、請求項２４～２８のいずれか一項に記載の方法。
  30. 単球細胞株が、U937、THP1、MC-1010、TUR、AML-193、およびMV-4-11から選択される、請求項２９に記載の方法。
  31. （ａ）ヒトＴ細胞株またはＣＤ６を発現するように操作された細胞株および（ｂ）単球、任意に単球細胞株が、約３０：１、２５：１、２０：１、１５：１、１０：１、５：１、４：１、３：１、２：１、１：１、１：２、１：３、１：４、１：５、または１：１０の比率で存在する、請求項２７～３０のいずれか一項に記載の方法。
  32. イトリズマブの試験ロットを、これが細胞表面ＣＤ６発現を、対照または標準と比較して、約または少なくとも約１０、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００、２００、３００、４００、５００パーセントまたはそれ以上減少させる場合、および／または、これが上清中の可溶性ＣＤ６を、対照または標準と比較して、約または少なくとも約１０、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００、２００、３００、４００、５００パーセントまたはそれ以上増加させる場合に、医薬組成物として製剤化すること、を含む、請求項２４～３１のいずれか一項に記載の方法。
  33. 生物学的治療薬として使用するための、抗ＣＤ６抗体またはその抗原結合性断片をスクリーニングする方法であって、
    （ａ）候補抗ＣＤ６抗体またはその抗原結合性断片を、細胞表面上でＣＤ６を発現する細胞とインキュベートすること；
    （ｂ）細胞上の細胞表面ＣＤ６発現を測定すること；および
    （ｃ）候補抗ＣＤ６抗体またはその抗原結合性断片を、これが細胞表面ＣＤ６発現を対照または標準と比較して減少させる場合、医薬組成物として製剤化すること、
    を含む、前記方法。
  34. （ｂ）が、細胞表面ＣＤ６発現を、フローサイトメトリー、飛行時間型サイトメトリー（ＣｙＴｏＦ）、細胞ＥＬＩＳＡ、または免疫蛍光顕微鏡法によって直接測定することを含むか、または（ｂ）が、上清中の可溶性ＣＤ６を、細胞表面ＣＤ６発現の指標として、任意に酵素結合免疫吸着測定法（ＥＬＩＳＡ）、化学発光アッセイ、電気化学発光アッセイ、高速液体クロマトグラフィー、ウェスタンブロット、または免疫沈降とそれに続くウェスタンブロットにより測定することを含む、請求項２１に記載の方法。
  35. 細胞が、末梢血単核球（ＰＢＭＣ）を含む、請求項３３または３４に記載の方法。
  36. 細胞が、ヒトＴ細胞株、または、ＣＤ６、任意にヒトＣＤ６を発現するように操作された細胞株を含む、請求項３３～３５のいずれか一項に記載の方法。
  37. 細胞株が、MOLT-4、MOLT-3、MOLT-16、HuT 78、HuT 102、Jurkat、Jurkat NFAT、CCRF-CEM、12.1、MJ(G11)、LOUCY、SUP-T1、HEL.92.1.7、EF0-21、RPMI-8226、HPB-ALL、HH、KE37、P12ICHIKAWA、PEER、ALLSIL、RPMI8402、CMLT1、PF382、EHEB、およびDU4475細胞から選択される、請求項３６に記載の方法。
  38. 細胞が、単球、任意に単球細胞株を含む、請求項３３～３７のいずれか一項に記載の方法。
  39. 単球細胞株が、U937、THP1、MC-1010、TUR、AML-193、およびMV-4-11から選択される、請求項３８に記載の方法。
  40. （ａ）ヒトＴ細胞株またはＣＤ６を発現するように操作された細胞株および（ｂ）単球、任意に単球細胞株が、約３０：１、２５：１、２０：１、１５：１、１０：１、５：１、４：１、３：１、２：１、１：１、１：２、１：３、１：４、１：５、または１：１０の比率で存在する、請求項３３～３９のいずれか一項に記載の方法。
  41. 候補抗ＣＤ６抗体またはその抗原結合性断片を、これが細胞表面ＣＤ６発現を、対照または標準と比較して、約もしくは少なくとも約１０、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００、２００、３００、４００、５００パーセントもしくはそれ以上減少させる場合、および／または、これが上清中の可溶性ＣＤ６を、対照または標準と比較して、約もしくは少なくとも約１０、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００、２００、３００、４００、５００パーセントもしくはそれ以上増加させる場合に、医薬組成物として製剤化すること、を含む、請求項３３～４０のいずれか一項に記載の方法。
  42. 自己免疫疾患、免疫炎症性疾患、または炎症性疾患の対象または患者が、標準的または健康な対象と比較して、Ｔｅｆｆ：Ｔｒｅｇ細胞の増加した比率を有し、任意にここで、Ｔｅｆｆ細胞がＴｈ１７細胞である、請求項１～２３にいずれか一項に記載の方法または投与計画。
  43. Ｔｅｆｆ：Ｔｒｅｇ細胞の比率が、標準的または健康な対象と比較して、約または少なくとも約１．５、２、３、４、５、６、７、８、９または１０倍またはそれ以上増加する、請求項４２に記載の方法または投与計画。
  44. 自己免疫疾患、免疫炎症性疾患、または炎症性疾患が、炎症性腸疾患（ＩＢＤ）、任意にクローン病または潰瘍性大腸炎、全身性エリテマトーデス（ＳＬＥ）、任意にループス腎炎を伴うＳＬＥ、関節リウマチ（ＲＡ）、多発性硬化症（ＭＳ）、乾癬、乾癬性関節炎、強直性脊椎炎、または喘息である、請求項１～２３または４２～４３のいずれか一項に記載の方法または投与計画。
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