CN116963746A - 选择性靶向cd6高细胞并降低teff细胞的活性的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明提供了包含抗CD6抗体的方法和组合物，所述抗体如伊立珠单抗，其选择性靶向CD6高T细胞，例如减少这些细胞上的细胞表面CD6水平，在受试者中或离体降低CD6高T细胞的总体水平和致病活性或CD6高:CD6低T细胞的比率，在受试者中或离体降低Teff细胞的总体水平和致病活性或Teff:Treg细胞的比率，和/或在受试者中或离体增加Treg细胞的产生，从而调节受试者的致病性免疫应答，以及其他方面。

Description

选择性靶向CD6高细胞并降低TEFF细胞的活性的方法
相关申请的交叉引用
本申请根据35U.S.C§119(e)要求2020年12月4日提交的美国临时申请号63/121,567的权益，其内容通过引用并入。
关于序列表的声明
与本申请相关联的序列表以文本格式代替纸质副本提供，并且据此通过引用并入说明书中。包含序列表的文本文件的名称为EQIL_010_01WO_ST25.txt。文本文件为约10.8KB，创建于2021年12月2日，并通过EFS-Web电子提交。
背景技术
技术领域
本公开的实施方案总体上涉及包含抗CD6抗体的方法和组合物，所述抗体如伊立珠单抗(Itolizumab)，其选择性靶向CD6高T细胞，例如，减少这些细胞上的细胞表面CD6的水平，降低受试者中或离体的CD6高T细胞的总水平和致病活性或CD6高:CD6低T细胞的比率，降低受试者中或离体的Teff细胞的总体水平和致病活性或Teff:Treg细胞的比率，和/或增加受试者中或离体的Treg细胞的产生，从而调节受试者的致病性免疫应答等方面。
相关技术的描述
T细胞或T淋巴细胞属于一组被称为淋巴细胞的白血细胞，在适应性免疫中发挥着核心作用。它们可以通过细胞表面上存在一种称为T细胞受体(TCR)的特殊受体而与其他淋巴细胞类型(如B细胞)区分开来。主要有两组——γδT细胞(gamma delta T细胞)和αβT细胞(alpha beta T细胞)；后者包括CD4和CD8 T细胞。CD4 T细胞包括辅助T细胞(Th)亚群，例如Th1、Th2、Th9、Th17、Th22、Tfh和Tph，它们各自具有不同的细胞因子谱和在免疫应答中不同的作用。CD8 T细胞包括细胞毒性T细胞(Tc细胞或CTL)。T细胞也由激活状态定义，包括幼稚、效应和记忆(中枢、效应和干记忆)亚群。其他相关细胞包括自然杀伤T细胞(NKT细胞)和先天淋巴细胞(ILC)。ILC是TCR阴性淋巴细胞，但具有亚群ILC1、ILC2和ILC3，就其分泌的细胞因子而言，这些亚群类似于不同的Th亚群。所有被激活(不再是幼稚的)的T细胞(或ILC)统称为效应T细胞(Teff)。
调节性T细胞(Treg细胞)，也称为抑制性T细胞，是一种特异化的T细胞亚群，其作用是抑制其他T细胞的免疫应答。例如，Treg细胞在免疫反应期间抑制T细胞介导的免疫以及在抑制逃避胸腺中阴性选择过程的自身反应性T细胞方面发挥主要作用。因此，Treg细胞提供了一种重要的“自我检查”，以防止过度的免疫原性反应，因此对维持免疫系统稳态和对自身抗原的耐受至关重要。Teff细胞数量和活性的增加导致Teff:Treg细胞比率的增加，这突出了自身免疫性和炎症性疾病。
Treg细胞的两大类是天然存在的Treg细胞和诱导的Treg细胞。天然存在的Treg细胞的最广泛使用的标志物是分化簇4(CD4)、分化簇25(CD25)、叉头状/翼状螺旋转录因子盒P3(FoxP3)、转录因子Helios、细胞毒性T淋巴细胞相关抗原4(CTLA-4)、糖皮质激素诱导的肿瘤坏死因子受体家族相关基因(GITR)、淋巴细胞激活基因-3(LAG-3)和分化簇127(CD127)。自然存在的Treg细胞(也称为CD4+CD25+FoxP3+Treg细胞)出现在胸腺中。诱导的Treg细胞(包括Tr1细胞、Th3细胞和HLA-G+Treg细胞)在正常免疫应答期间起源于外周，以响应与抗原呈递细胞和细胞因子的相互作用。
诱导的Treg细胞共有天然Treg细胞的许多特性，但在关键的细胞表面和细胞核生物标志物以及功能特性方面可能有所不同。例如，Tr1和Th3细胞已被描述为分别产生IL-10和T GF-β。分离、富集和扩增这些细胞亚群的能力导致了治疗免疫学疾病的新的治疗方法。
将天然存在的Treg细胞鉴定为自我耐受的重要组分，为免疫学和控制免疫耐受的基本过程开辟了一个重要的研究领域。调节性T细胞具有独特而稳健的治疗特性。细胞需要特异性T细胞受体(TCR)介导的激活来产生调节活性，但其效应功能似乎是非特异性的，通过细胞-细胞接触和抑制性细胞因子产生的组合来调节局部炎症应答。大量研究表明，天然存在的Treg细胞在自身免疫性疾病、移植和移植物抗宿主病中抑制病理性免疫应答方面具有强大的影响。然而，在人类环境中研究和应用天然存在的Treg细胞的主要障碍是缺乏单一的特异性细胞表面生物标志物来定义Treg细胞并将其与T细胞的其他亚群(例如Th细胞、Tc细胞)分离，以及区分Treg细胞的不同亚群。
在研究中采用了许多不同的方法来鉴定、分离、富集或以其他方式利用Treg细胞。标志物CD4、CD25、FoxP3、转录因子Helios、CTLA-4、GITR、LAG-3和CD127被协同用于鉴定Treg细胞，然而，上述标志物中没有一个可以单独用于鉴定Treg细胞，因为没有一个是严格的Treg细胞特异性的。例如，CD25和CD4表面标志物(CD4+CD25+细胞)的高表达最初用于鉴定天然存在的Treg细胞。然而，CD4也在Th细胞和TM细胞的亚群上表达。CD25在免疫激活的情况下，例如在对病原体的免疫应答期间，也在非调节性T细胞上表达。因此，如CD4和CD25表达所定义的，Treg细胞占成熟Th细胞的约5-10％。Foxp3的细胞表达的额外测量允许对天然存在的Treg细胞(CD4+CD25+Foxp3+细胞)进行更特异性的分析。然而，Foxp3也在激活的TEM细胞中瞬时表达，并且现在已经充分证明大多数人CD4+和CD8+T细胞在激活时瞬时表达Foxp3，包括CD4+CD25低/～T细胞、Th细胞、Tc细胞和记忆T细胞。此外，FoxP3是一种核标志物，在染色前需要细胞膜透化。因此，这种生物标志物的使用排除了随后的处理步骤，例如分开、分离、富集或扩增活细胞。
需要改进的选择性靶向T细胞亚群的方法、选择性抑制Teff细胞群体的方法以及调节个体免疫反应的方法。此外，需要开发包含免疫抑制调节性T细胞群体的组合物，用于调节个体中的免疫反应。
发明概述
本公开的实施方案包括用于在患有自身免疫性、免疫炎症性或炎症性疾病、移植物抗宿主病(GVHD)或器官移植排斥反应的人类受试者中测定伊立珠单抗的最佳用药量的方法，包括：
(a)测定来自受试者的组织样品中的细胞表面CD6水平的基线，其中组织样品包括T淋巴细胞，并且任选地定义受试者中的细胞表面CD6的目标水平；
(b)向受试者施用一系列的两个或三个或更多个用药量的伊立珠单抗，任选地增加用药量；
(c)在一系列的用药量之间监测来自受试者的组织样品中的细胞表面CD6水平，其中组织样品包括T淋巴细胞；
(d)如果步骤(c)中的细胞表面CD6水平为来自(a)的基线的约5、10、15、20、25、30、40、45或50％或小于约5、10、15、20、25、30、40、45或50％，或者在来自(a)的任选目标水平的约5、10、15或20％或小于约5、10、15或20％之内，并且如果在一系列的用药量之间没有观察到细胞表面CD6水平的进一步减少，则将来自一系列的用药量的最低用药量鉴定为最佳用药量。
特定的实施方案包括测定来自受试者的组织样品中CD4细胞和/或CD8细胞上的细胞表面CD6水平。在一些实施方案中，组织样品是血液样品。特定的实施方案包括基于疾病的临床参数或症状来定义受试者中的细胞表面CD6的目标水平。
还包括用于治疗有需要的人类受试者的自身免疫性、免疫炎症性或炎症性疾病、移植物抗宿主病(GVHD)或器官移植排斥反应的给药方案，包括：
(a)测定来自受试者的组织样品中的细胞表面CD6水平的基线，其中组织样品包括T淋巴细胞，并且任选地定义受试者中的细胞表面CD6的目标水平；
(b)向受试者施用一定用药量的伊立珠单抗，其将受试者的T淋巴细胞中的细胞表面CD6水平降低至来自(a)的基线的约5、10、15、20、25％或小于约5、10、15、20、25％；
(c)监测来自受试者的组织样品中的细胞表面CD6水平，其中组织样品包括T淋巴细胞；和
(d)在以下情况之前或如果是以下情况，向受试者施用进一步用药量的伊立珠单抗：(c)中的细胞表面CD6水平恢复到来自(a)的基线的约25、30、35、40、45、50、55、60、65、70或75％或大于约25、30、35、40、45、50、55、60、65、70或75％，或升高到大约或高于来自(a)的目标水平。
在一些实施方案中，给药方案将来自受试者的T淋巴细胞(任选地CD4和/或CD8细胞)中的细胞表面CD6水平维持在来自(a)的基线的约40、45、50、55、60、65、70或75％或小于约40、45、50、55、60、65、70或75％，或者在来自(a)的任选目标水平的约5、10、15或20％之内，任选地基于疾病的临床参数或症状来定义受试者中的细胞表面CD6的目标水平。
一些实施方案涉及用于治疗有需要的人类受试者的自身免疫性、免疫炎症性或炎症性疾病、移植物抗宿主病(GVHD)或器官移植排斥反应的给药方案，包括：
(a)测定来自受试者的血液样品中的CD6高T淋巴细胞的基线水平，并且任选地定义CD6高T-淋巴细胞的目标水平；
(b)向受试者施用一定用药量的伊立珠单抗，其将受试者中CD6高T淋巴细胞的水平减少至来自(a)的基线的约5、10、15、20、25、30或40％或小于约5、10、15、20、25、30或40％；
(c)监测来自受试者的血液样品中的CD6高T淋巴细胞的水平；和
(d)在以下情况之前，向受试者施用进一步用药量的伊立珠单抗：来自(c)的CD6高T淋巴细胞的水平恢复到来自(a)的基线水平的约25、30、35、40、45、50、55、60、65、70或75％或大于约25、30、35、40、45、50、55、60、65、70或75％，或升高到大约或高于来自(a)的目标水平，任选地基于疾病的临床参数或症状来定义受试者中CD6高T淋巴细胞的目标水平。
在一些实施方案中，给药方案将受试者中的CD6高T淋巴细胞的水平维持在来自(a)的基线水平的约45、50、55、60、65、70或75％或小于约45、50、55、60、65、70或75％，任选地其中T淋巴细胞是CD4细胞和/或CD8细胞。在一些实施方案中，给药方案将受试者中CD6高:CD6低T淋巴细胞的比率相对于对照或标准或基线降低约或至少约10、20、30、40、50、60、70、80、90、100、200、300、400、500％或更多或者降低约或至少约1.5、2、3、4、5、6、7、8、9、10倍或更多，任选地其中T淋巴细胞是CD4细胞和/或CD8细胞。在一些实施方案中，给药方案将受试者中的Teff:Treg细胞的比率相对于对照或标准或基线降低约或至少约10、20、30、40、50、60、70、80、90、100、200、300、400、500％或更多或者降低约或至少约1.5、2、3、4、5、6、7、8、9、10倍或更多，任选地CD4细胞和/或CD8细胞，任选地其中Teff细胞是Th17细胞。
特定的实施方案包括预防或缓解人类移植患者的移植物抗宿主病(GVHD)的方法，包括：
(a)将移植组织与抗CD6抗体(任选地为伊立珠单抗)孵育足以减少移植组织中CD6高T淋巴细胞上的CD6的细胞表面水平的时间；和
(b)将移植组织移植到患者中。
一些实施方案包括包括在步骤(a)之前和之后测定移植组织中T淋巴细胞上的CD6的细胞表面水平，并且如果在步骤(a)之后CD6的细胞表面水平相对于在步骤(a)之前减少约或至少约10、20、30、40、50、60、70、80、90、100、200、300、400、500％或更多，则执行步骤(b)。
在一些实施方案中，移植组织包括脐带血细胞、骨髓细胞、外周血细胞、动员的外周血细胞、间充质干细胞、造血干细胞、从干细胞/祖细胞分化的细胞、工程化的细胞(任选地嵌合抗原受体(CAR)细胞)或所述细胞的任何组合。在一些实施方案中，移植组织对于人类移植患者是自体的。在一些实施方案中，移植组织对于人类移植患者是同种异体的。
还包括用于治疗或缓解有需要的人类患者的自身免疫性、免疫炎症性或炎症性疾病的方法，包括：
(a)将移植组织与抗CD6抗体(任选地为伊立珠单抗)孵育足以减少移植组织中CD6高T淋巴细胞上的CD6的细胞表面水平的时间，从而产生富含CD6低T淋巴细胞的移植组织；
(b)将来自(a)的移植组织处理足以从CD6低T淋巴细胞产生Treg淋巴细胞的时间；以及
(c)将来自(c)的移植组织移植到患者内。
特定的实施方案包括在步骤(a)之前和之后测定移植组织中T淋巴细胞上的CD6的细胞表面水平，并且如果在步骤(a)之后CD6的细胞表面水平相对于在步骤(a)之前减少约或至少约10、20、30、40、50、60、70、80、90、100、200、300、400、500％或更多，则执行步骤(b)。在一些实施方案中，步骤(b)包括将富含CD6低T淋巴细胞的移植组织与细胞因子、生长因子和转录因子的组合孵育足以产生Treg淋巴细胞的时间。
在一些实施方案中，移植组织包括脐带血细胞、骨髓细胞、外周血细胞、动员的外周血细胞、间充质干细胞、造血干细胞、从干细胞/祖细胞分化的细胞、工程化的细胞(任选嵌合抗原受体(CAR)细胞)或所述细胞的任何组合。在一些实施方案中，移植组织对于人类患者是自体的。在一些实施方案中，移植组织对于人类患者是同种异体的。
还包括用于治疗有需要的人类受试者的自身免疫性、免疫炎症性或炎症性疾病、移植物抗宿主病(GVHD)或器官移植排斥反应的方法，包括：
(a)向受试者施用伊立珠单抗；和
(b)测定来自受试者的组织样品中的T淋巴细胞上细胞表面CD6的水平，测定来自受试者的组织样品中的CD6高和任选地CD6低T淋巴细胞的水平，和/或测定受试者中Teff和Treg细胞的水平，其中组织样品包括T淋巴细胞；
其中伊立珠单抗的施用减少以下中的一项或多项：(i)T淋巴细胞(任选地CD4和/或CD8细胞)上细胞表面CD6的水平；(ii)受试者中CD6高T淋巴细胞的水平；(iii)受试者中CD6高:CD6低T淋巴细胞的比率；和/或(iv)受试者中Teff:Treg细胞的比率，从而减少受试者中的致病性免疫应答。
在一些实施方案中，伊立珠单抗的施用：
将受试者中的T淋巴细胞上细胞表面CD6水平相对于对照或标准或基线降低约或至少约10、20、30、40、50、60、70、80、90、100、200、300、400、500％或更多，任选地其中T淋巴细胞是CD4细胞和/或CD8细胞；
将受试者中的CD6高T淋巴细胞的水平相对于对照或标准或基线降低约或至少约10、20、30、40、50、60、70、80、90、100、200、300、400、500％或更多，任选地其中T淋巴细胞是CD4细胞和/或CD8细胞；
将受试者中的CD6高:CD6低T淋巴细胞的比率相对于对照或标准或基线降低约或至少约10、20、30、40、50、60、70、80、90、100、200、300、400、500％或更多或者降低约或至少约1.5、2、3、4、5、6、7、8、9、10倍或更多，任选地其中T淋巴细胞是CD4细胞和/或CD8细胞；和/或
将受试者中的Teff:Treg细胞的比率相对于对照或标准或基线降低约或至少约10、20、30、40、50、60、70、80、90、100、200、300、400、500％或更多或者降低约或至少约1.5、2、3、4、5、6、7、8、9、10倍或更多，任选地其中Teff细胞是Th17细胞。
特别的实施方案包括用于分析试验批次的伊立珠单抗的体外基于细胞的(即基于细胞培养物的)方法，包括
(a)将测试批次的伊立珠单抗与在细胞表面上表达CD6的细胞孵育；
(b)测量细胞上的细胞表面CD6表达；和
(c)如果测试批次相对于对照或标准降低细胞表面CD6表达，则配制测试批次的伊立珠单抗作为药物组合物，并且如果测试批次相对于对照或标准没有降低细胞表面CD6表达，则拒绝测试批次的伊立珠单抗。
在一些实施方案中，步骤(b)包括通过流式细胞术、飞行时间细胞术(CyToF)、细胞ELISA或免疫荧光显微术来直接测量细胞表面CD6表达，或其中(b)包括任选地通过酶联免疫吸附测定(ELISA)、化学发光测定、电化学发光测定、高效液相色谱、蛋白质印迹或免疫沉淀后进行蛋白质印迹，测量上清液中的可溶性CD6作为细胞表面CD6表达的指征。在一些实施方案中，细胞包括外周血单核细胞(PBMC)。在一些实施方案中，细胞包括人T细胞系或经工程化以表达CD6(任选地人CD6)的细胞系。在一些实施方案中，细胞系选自MOLT-4、MOLT-3、MOLT-16、HuT 78、HuT 102、Jurkat、Jurkate NFAT、CCRF-CEM、12.1、MJ(G11)、LOUCY、SUP-T1、HEL.92.1.7、EF0-21、RPMI-8226、HPB-ALL、HH、KE37、P12ICHIKAWA、PEER、ALLSIL、RPMI8402、CMLT1、PF382、EHEB和DU4475细胞。在一些实施方案中，细胞包括单核细胞，任选地单核细胞系。在一些实施方案中，单核细胞系选自U937、THP1、MC-1010、TUR、AML-193和MV-4-11。在一些实施方案中，(a)人T细胞系或经工程化以表达CD6的细胞系和(b)单核细胞，任选地单核细胞系，以约30:1、25:1、20:1、15:1、10:1、5:1、4:1、3:1、2:1、1:1、1:2、1:3、1:4、1:5或1:10的比率存在。
特定的实施方案包括如果试验批次的伊立珠单抗将细胞表面CD6表达相对于对照或标准降低约或至少约10、20、30、40、50、60、70、80、90、100、200、300、400、500％或更多和/或如果试验批次的伊立珠单抗将上清液中的可溶性CD6相对于对照或标准增加约或至少约10、20、30、40、50、60、70、80、90、100、200、300、400、500％或更多，则将所述试验批次的伊立珠单抗配制为药物组合物。
还包括筛选用作生物治疗剂的抗CD6抗体或其抗原结合片段的方法，包括：
(a)将候选抗CD6抗体或其抗原结合片段与在细胞表面上表达CD6的细胞孵育；
(b)测量细胞上的细胞表面CD6表达；和
(c)如果候选抗CD6抗体或其抗原结合片段相对于对照或标准降低细胞表面CD6表达，则将其配制为药物组合物。
在一些实施方案中，步骤(b)包括通过流式细胞术、飞行时间细胞术(CyToF)、细胞ELISA或免疫荧光显微术来直接测量细胞表面CD6表达，或其中(b)包括任选地通过酶联免疫吸附测定(ELISA)、化学发光测定、电化学发光测定、高效液相色谱、蛋白质印迹和免疫沉淀后进行蛋白质印迹，测量上清液中的可溶性CD6作为细胞表面CD6表达的指征。在一些实施方案中，细胞包括外周血单核细胞(PBMC)。在一些实施方案中，细胞包括人T细胞系或经工程化以表达CD6(任选地人CD6)的细胞系。在一些实施方案中，细胞系选自MOLT-4、MOLT-3、MOLT-16、HuT 78、HuT 102、Jurkat、Jurkate NFAT、CCRF-CEM、12.1、MJ(G11)、LOUCY、SUP-T1、HEL.92.1.7、EF0-21、RPMI-8226、HPB-ALL、HH、KE37、P12ICHIKAWA、PEER、ALLSIL、RPMI8402、CMLT1、PF382、EHEB和DU4475细胞。在一些实施方案中，细胞包括单核细胞，任选地单核细胞系。在一些实施方案中，单核细胞系选自U937、THP1、MC-1010、TUR、AML-193和MV-4-11。在一些实施方案中，(a)人T细胞系或经工程化以表达CD6的细胞系和(b)单核细胞，任选地单核细胞系，以约30:1、25:1、20:1、15:1、10:1、5:1、4:1、3:1、2:1、1:1、1:2、1:3、1:4、1:5或1:10的比率存在。
特定的实施方案包括如果候选抗CD6抗体或其抗原结合片段将细胞表面CD6表达相对于对照或标准降低约或至少约10、20、30、40、50、60、70、80、90、100、200、300、400、500％或更多和/或候选抗CD6抗体或其抗原结合片段将上清液中的可溶性CD6相对于对照或标准增加约或至少约10、20、30、40、50、60、70、80、90、100、200、300、400、500％或更多，将所述候选抗CD6抗体或其抗原结合片段配制为药物组合物。
在特定的方法或给药方案中，患有自身免疫性、免疫炎症性或炎症性疾病的受试者或患者相对于标准或健康受试者具有增加的Teff:Treg细胞的比率，包括其中Teff细胞是Th17细胞。在一些实施方案中，Teff:Treg细胞的比率相对于所述标准或健康受试者增加约或至少约1.5、2、3、4、5、6、7、8、9或10倍或更多。在一些实施方案中，自身免疫性、免疫炎症性或炎症性疾病是：炎症性肠病(IBD)，任选地克罗恩病或溃疡性结肠炎；系统性红斑狼疮(SLE)，任选地伴有狼疮性肾炎的SLE；类风湿性关节炎(RA)；多发性硬化症(MS)；银屑病；银屑病关节炎；强直性脊柱炎或哮喘。
附图的简要说明
伊立珠单抗导致细胞表面CD6表达的损失。图1显示了与同种型对照相比，用伊立珠单抗单次处理后CD4+CD45RA-细胞(效应和记忆CD4 T细胞)中CD6的表面表达水平，以及通过流式细胞术测量的细胞表面CD6在10分钟开始和24小时内的损失。
伊立珠单抗在体外引起CD4和CD8 T细胞CD6表达的用药量依赖性损失。图2A-2D是用四种不同浓度的伊立珠单抗(0.01、0.1、1、10和100ug/mL)处理后细胞表面CD6的平均荧光强度的图。图2A为CD4+CD45RA+细胞(幼稚T细胞)；图2B为CD4+CD45RA-细胞；图2C为CD8+CD45RA+细胞(幼稚的CD8 T细胞)；和图2D为CD8+CD45RA-细胞(效应和记忆CD8 T细胞)。在每种情况下，将细胞表面CD6的平均荧光强度针对同种型(10ug/mL)处理的细胞进行标准化。图2E显示，通过电化学发光测定，CD6的细胞表面损失(左图)与上清液中可溶性CD6(sCD6)的增加(右图)相关。在此，将来自3个不同供体的PBMC与10ug/mL的伊立珠单抗孵育，并在CD4 T细胞上评估CD6的细胞表面表达(左图)，并在所示时间点对PBMC上清液中的可溶性CD6(右图)进行定量。通过流式细胞术评估的基线时CD4 T细胞上的CD6受体的计算数量用于在3个供体之间对值进行标准化。***p＜0.001，**p＜0.01，*p＜0.05。
用伊立珠单抗治疗的患者在CD4和CD8 T细胞上的CD6表达降低。图3A-3J显示了细胞表面CD6的平均荧光强度在Y轴上以基线的百分比表示，在X轴上以初始治疗后的天数表示，在从用伊立珠单抗治疗的GVHD患者中分离的所有CD4阳性细胞和所有CD8阳性细胞中进行测量。图3A-3D为用每两周施用1至5个剂量的0.4mg/kg伊立珠单抗进行治疗的四名患者。图3A是在第1、15、29、43和57天用0.4mg/kg伊立珠单抗治疗的患者的CD4和CD8阳性细胞中细胞表面CD6与基线相比的百分比图。图3B是在第1、15和29天用0.4mg/kg伊立珠单抗治疗的患者的CD4和CD8阳性细胞中细胞表面CD6与基线相比的百分比图。图3C是在第1、15、29、43和57天用0.4mg/kg伊立珠单抗治疗的患者的CD4和CD8阳性细胞中细胞表面CD6与基线相比的百分比图。图3D是在第1天用0.4mg/kg伊立珠单抗治疗的患者的CD4和CD8阳性细胞中细胞表面CD6与基线相比的百分比图。图3E-3G为用每两周或间隔的每两周施用2至4个剂量的0.8mg/kg的伊立珠单抗进行治疗的三名患者。图3E是在第1、15和29天用0.8mg/kg伊立珠单抗治疗的患者的CD4和CD8阳性细胞中细胞表面CD6与基线相比的百分比图。图3F是在第1、15、43和57天用0.8mg/kg伊立珠单抗治疗的患者的CD4和CD8阳性细胞中细胞表面CD6与基线相比的百分比图。图3G是在第1和15天用0.8mg/kg伊立珠单抗治疗的患者的CD4和CD8阳性细胞中细胞表面CD6与基线相比的百分比图。图3H-3J是用每两周施用2至5个剂量的1.6mg/kg伊立珠单抗进行治疗的三名患者。图3H是在第1、15、29、43和57天用1.6mg/kg伊立珠单抗治疗的患者的CD4和CD8阳性细胞中细胞表面CD6与基线相比的百分比图。图3I是在第1和15天用1.6mg/kg伊立珠单抗治疗的患者的CD4和CD8阳性细胞中细胞表面CD6与基线相比的百分比图。图3J是在第1、15、29和43天用1.6mg/kg伊立珠单抗治疗的患者的CD4和CD8阳性细胞中细胞表面CD6与基线相比的百分比图。
伊立珠单抗治疗的患者中CD6的剂量应答性损失。图4A-4D是用0.4mg/kg、0.8mg/kg和1.6mg/kg伊立珠单抗(在每个图的部分从左到右)治疗的患者的细胞表面CD6的平均荧光强度的条形图。图4A是在1个剂量的0.4mg/kg、0.8mg/kg或1.6mg/kg伊立珠单抗后24小时，CD4阳性细胞和CD8阳性细胞中CD6表面表达与基线相比的条形图。图4B是在1个剂量的0.4mg/kg、0.8mg/kg或1.6mg/kg伊立珠单抗后8天，CD4阳性细胞和CD8阳性细胞中表面CD6表达与基线相比的强度百分比条形图。图4C是在1个剂量的0.4mg/kg、0.8mg/kg或1.6mg/kg伊立珠单抗后第15天，CD4阳性细胞和CD8阳性细胞中表面CD6表达与基线相比的强度百分比条形图。图4D是在2个每两周剂量的0.4mg/kg、0.8mg/kg或1.6mg/kg伊立珠单抗后第29天，CD4阳性细胞和CD8阳性细胞中表面CD6表达与基线相比的强度百分比条形图。
伊立珠单抗的结合降低快于CD6损失的速度。图5A-5F是每个时间点的阳性事件百分比的绘图数据点，显示在两种不同浓度的伊立珠单抗的两种细胞类型上的CD6标记，包括未结合的受体和与非竞争性抗CD6抗体克隆结合的受体。通过用荧光标记的伊立珠单抗对细胞进行染色，在每个时间点检测未结合的受体(正方形)。荧光标记的伊立珠单抗将结合到所有未被未标记的伊立珠单抗结合的可用CD6，其中CD6仍存在于细胞表面上。专有非竞争性抗体(圆圈)的结合用于检测每个时间点细胞表面上的总CD6水平。当用伊立珠单抗处理细胞时，表面CD6的总水平降低，这也反映为未结合受体(正方形)的量减少。CD6的损失率是通过取每条线的10到120分钟之间的斜率来计算的。图5A绘制了用1.0ug/mL同种型处理CD4+CD45RA+细胞后的数据点，抗体结合受体和未结合受体的计算斜率分别为0.00和-0.01。图5B绘制了用0.1ug/mL伊立珠单抗处理CD4+CD45RA+细胞后的数据点，抗体结合受体和未结合受体的计算斜率分别为-0.05和-0.18。图5C绘制了用1.0ug/mL伊立珠单抗处理CD4+CD45RA+细胞后的数据点，抗体结合受体和未结合受体的计算斜率分别为-0.20和-0.33。图5D绘制了用1.0ug/mL同种型处理CD4+CD45RA-细胞后的数据点，抗体结合受体和未结合受体的计算斜率分别为0.00和-0.03。图5E绘制了用0.1ug/mL伊立珠单抗处理CD4+CD45RA-细胞后的数据点，抗体结合受体和未结合受体的计算斜率分别为-0.09和-0.30。图5F绘制了用1.0ug/mL伊立珠单抗处理CD4+CD45RA-细胞后的数据点，抗体结合受体和未结合受体的计算斜率分别为-0.36和-0.49。
如图6A-6D所示，在细胞表面CD6密度和量较低的细胞上，伊立珠单抗的受体占有率较低。图6A显示，相对于CD4细胞，CD8细胞具有低水平的细胞表面CD6水平，图6B显示，通过流式细胞术测量，伊立珠单抗与CD8细胞结合的占有率远低于与CD4细胞结合的占有率(细胞均在同一管内孵育和染色)。这里，如果伊立珠单抗与CD6结合而与细胞表面密度无关，那么在CD8细胞中，％占有率(由伊立珠单抗结合的CD6分子的比例)应该相同或更高。然而，CD8 T细胞中的％占有率低于CD4 T细胞，这证明伊立珠单抗的结合受到细胞表面CD6密度的影响。
图6C显示在给药的患者中占用率低。虚线显示了给药前第一天基线时的血液，在用50ug/ml的伊立珠单抗加标后以测定每位患者中可能的最高受体占有率。在第1天CD4 T细胞上的CD6平均荧光强度高，但在第一次给药后24小时内降低，表明细胞表面CD6的降低。CD6在给药后仍然在CD4 T细胞上可检测到(如针对对照的MFI和门控所示，正方形)；然而，受体占有率(圆圈)基本上表明很少至没有结合的伊立珠单抗。如果伊立珠单抗能够与CD6结合而与受体密度无关，则预期会有一定水平的占有率。图6D显示了CD6存在时检测到的占用率。将来自正常受试者的全血收集到含有EDTA或柠檬酸钠的管中，并与伊立珠单抗孵育25分钟。然后裂解血液并针对受体占有率测定细胞。
伊立珠单抗诱导CD4 T细胞的外周减少。图7A-7D显示了在用伊立珠单抗治疗后的患者中CD4+T细胞的外周减少，通过测量来自抽取的外周血的CD4+细胞并计算6名不同患者在四种不同条件下的基线百分比：安慰剂和1.6、2.4和3.6mg/kg的伊立珠单抗。图7A显示了在基线建立的第1天、在用安慰剂治疗后第8天和第15天的变化(作为基线百分比)。图7B显示了在基线建立的第1天、在用1.6mg/kg伊立珠单抗治疗后第8天和第15天的变化(作为基线百分比)。图7C显示了在基线建立的第1天、在用2.4mg/kg伊立珠单抗治疗后第8天和第15天的变化(作为基线百分比)。图7D显示了在基线建立的第1天、在用3.2mg/kg伊立珠单抗治疗后第8天和第15天的变化(作为基线百分比)。
伊立珠单抗诱导CD8 T细胞的外周减少。图8A-8D显示了在用伊立珠单抗治疗后患者中CD8+T细胞的外周减少，通过测量来自抽取的外周血的CD8+细胞并计算6名不同患者在四种不同条件下的基线百分比：安慰剂和1.6、2.4和3.6mg/kg的伊立珠单抗。图8A显示了在基线建立的第1天、在用安慰剂治疗后第8天和第15天的变化(作为基线百分比)。图8B显示了在基线建立的第1天、在用1.6mg/kg伊立珠单抗治疗后第8天和第15天的变化(作为基线百分比)。图8C显示了在基线建立的第1天、在用2.4mg/kg伊立珠单抗治疗后第8天和第15天的变化(作为基线百分比)。图8D显示了在基线建立的第1天、在用3.2mg/kg伊立珠单抗治疗后第8天和第15天的变化(作为基线百分比)。
外周Treg计数不受伊立珠单抗治疗的影响。图9A-9D显示了在四种治疗条件后，以第1天(基线)Treg细胞计数的百分比计算的第8天和第15天的变化：安慰剂、1.6mg/kg伊立珠单抗、2.4mg/kg伊立珠单抗和3.2mg/kg伊立珠单抗。图9A显示了用安慰剂治疗的对照组的Treg细胞计数的变化性。图9B显示了6名不同患者用1.6mg/kg伊立珠单抗治疗后在第8天和第15天基线的百分比变化。图9C显示了6名不同患者用2.4mg/kg伊立珠单抗治疗后在第8天和第15天基线的百分比变化。图9D显示了6名不同患者用3.2mg/kg伊立珠单抗治疗后在第8天和第15天基线的百分比变化。
伊立珠单抗导致CD4:Treg细胞的比率降低。图10A-10D显示了在四种治疗条件后，6名患者在第8天和第15天CD4+T细胞与Treg细胞的比率从第1天基线的变化：安慰剂、1.6mg/kg伊立珠单抗、2.4mg/kg伊立珠单抗和3.2mg/kg伊立珠单抗。图10A显示了用安慰剂治疗后作为基线的百分比的CD4:Treg比率。图10B显示了用1.6mg/kg伊立珠单抗治疗后作为基线的百分比的CD4:Treg比率。图10C显示了用2.4mg/kg伊立珠单抗治疗后作为基线的百分比的CD4:Treg比率。图10D显示了用3.2mg/kg伊立珠单抗治疗后作为基线的百分比的CD4:Treg比率。
用伊立珠单抗治疗的患者中Treg:CD4 T细胞的比例增加。图11A-11D显示了在第1、8、15、29和57天用0.8mg/kg伊立珠单抗或安慰剂治疗后，患者中Treg:CD4的比率和Th17:CD4细胞的比率。通过从指定的时间点提取冷冻保存的PBMC，分离DNA，并使用Epiontis ID(一种专有的qPCR测定)测量DNA中的细胞类型特异性表观遗传学标志物来收集数据。图11A显示了伊立珠单抗治疗后的Treg:CD4比率，而图11B显示了安慰剂治疗后的Treg:CD4比率。图11C显示了伊立珠单抗治疗后的Th17:CD4比率，而图11D显示了安慰剂治疗后的Th17:CD4比率。
伊立珠单抗具有较慢的与较高密度CD6结合的解离速率。图12A-12F显示了对于用于表面等离子体共振的三种不同CD6密度，伊立珠单抗(上线)和伊立珠单抗fab(下线)的解离速率时间。低密度由每平方微米7个rhu CD6和120个结合位点组成。中等密度由每平方微米55个rhu CD6和783个结合位点组成。高密度由每平方微米255个rhu CD6和3493个结合位点组成。图12A显示了低密度芯片在2000秒内的解离速率。图12B显示了中等密度芯片在2000秒内的解离速率。图12C显示了高密度芯片在2000秒内的解离速率。图12D显示了低密度芯片在12000秒内的解离速率。图12E显示了中等密度芯片在12000秒内的解离速率。图12F显示了高密度芯片在12000秒内的解离速率。
在高密度的CD6下观察到更复杂的伊立珠单抗结合。图13A-13F显示了与更低密度的CD6相比，伊立珠单抗与更高密度的CD6复合结合。使用240秒的缔合期和1800秒的解离期以三种不同的CD6密度收集数据。图13A-13C来自浓度范围为900nM至0.137nM的伊立珠单抗的重复注射。图13D-13F来自浓度范围为900nM到11.1nM的伊立珠单抗fab的重复注入。图13A显示了不同浓度的伊立珠单抗与低密度CD6的结合。图13B显示了不同浓度的伊立珠单抗与中等密度CD6的结合。图13C显示了不同浓度的伊立珠单抗与高密度CD6的结合。伊立珠单抗与CD6结合的传感图显示了在CD6的最高芯片密度下的复合结合。图13D显示了不同浓度的伊立珠单抗fab与低密度CD6的结合。图13E显示了不同浓度的伊立珠单抗fab与中等密度CD6的结合。图13F显示了不同浓度的伊立珠单抗fab与高密度CD6的结合。伊立珠单抗fab与CD6结合的传感图显示，在CD6的所有三种(低、中等、高)芯片密度下的最小复合结合。这些结果表明，伊立珠单抗表现出强烈的亲合性(avidity)效应，其赋予与芯片上更高密度的CD6的优先结合，从而支持伊立珠单抗在体内与CD6高细胞的优先结合和选择性的观察结果。
伊立珠单抗导致细胞系上细胞表面CD6的损失。图14显示，在表达CD6的T细胞系上，伊立珠单抗降低了细胞表面CD6水平。在此，将Jurkat NFAT细胞解冻并以1x106个细胞/ml的浓度重悬，然后以1x106个细胞/ml等分到单管中。加入伊立珠单抗或同种型对照抗体，轻轻地将细胞在37℃孵育6小时。通过流式细胞术评估总细胞表面CD6(染色期间将细胞保持在4℃)。
CD6低细胞对TCR刺激的低响应。图15A-15B显示了CD6低细胞对刺激的低响应。在此，将PBMC与伊立珠单抗孵育24小时以去除细胞表面CD6(见图15A；CD6高左柱；CD6低右柱)，洗涤至少3次以去除过量和结合的伊立珠单抗，并用0.25μg/ml抗CD3和1μg/ml ALCAM刺激24小时。通过流式细胞术评估激活标志物，通过基于流式ELISA评估细胞因子。如图15B所示，CD6低细胞(每张图中的右柱)显示，相对于CD6高细胞(每张表中的左柱)，表面激活标志物和细胞因子释放减少，这证明伊立珠单抗不仅降低了PBMC中的细胞表面CD6水平，而且使细胞对T细胞激活因子(如CD3)的应答更少。
基于CD6表达的剂量选择图。图16显示了使用细胞表面CD6来告知伊立珠单抗的剂量选择。一种方法是向一名患者或一组患者给药增加量的伊立珠单抗。当通过增加的剂量或通过固定间隔的后续剂量添加更多药物而没有观察到CD6水平的进一步降低时，确定CD6的更低水平。一旦确定了将CD6水平降低到更低水平的最佳用药量，CD6水平也可用于确定最佳给药方案。
基于CD6表达的给药方案图。图17A-17B说明了合适给药方案的选择。一种方法是随着时间的推移监测细胞表面CD6水平，以确定任何给定剂量提供细胞表面CD6损失的持续药效作用的时间。图17A的示例图说明了每两周和每月的用药量是合适的，但该水平的每季度剂量是不合适的，因为细胞表面CD6水平在八周时超过了阈值。这一信息可能表明需要更多的药物来实现每季度给药的细胞表面CD6的持续损失。在一些情况下，上限或阈值是细胞表面CD6的基线水平的约25-50％、小于约25-50％或在约25-50％之间。图17B说明了在短期的伊立珠单抗疗法中的这种方法，其中细胞表面CD6的水平可以用来告知重新开始给药的必要性或疾病爆发的可能性。在初始给药期结束后，可以随着时间的推移监测CD6的细胞表面水平，并且一旦这些水平相对于基线(例如，细胞表面CD6的处理前水平)上升到或接近阈值，或者相对于定义的阈值或目标水平(例如，临床上合适或期望的细胞表面CD6水平，例如，通过其他疾病参数或症状所定义的)，可以决定再次向患者给药伊立珠单抗。
图18A-18B显示了伊立珠单抗治疗后的CD6蛋白水平。图18A显示了细胞缔合的CD6水平，图18B显示了细胞上清液中的可溶性CD6(sCD6)水平。
图19显示了伊立珠单抗诱导细胞表面CD6的裂解和可溶性CD6的相伴增加。
图20A-20B说明了单核细胞在伊立珠单抗诱导的CD6从T淋巴细胞的细胞表面裂解中的作用。
图21A-21E说明了伊立珠单抗诱导的CD6细胞表面水平的降低与T细胞激活的降低相关。
图22显示了通过用伊立珠单抗初始孵育产生的CD6低细胞不仅保持CD6低，而且在随后用CD3+ALCAM刺激后，其Teff样细胞也较少(例如，Th1和Th17样细胞较少)。
图23A-23D显示了伊立珠单抗降低了T淋巴细胞的同种反应性。
图24A-24B显示了初始伊立珠单抗处理对随后的Treg淋巴细胞产生的影响。图24A显示了从先前用同种型或伊立珠单抗处理以分别产生CD6高或CD6低幼稚T细胞的PBMC中分离的幼稚CD4+T细胞(CD3+CD4+CD45RA+CD45RO-)中的幼稚CD4+T细胞分离和CD6损失。图24B显示了用同种型对照(CD6高)或伊立珠单抗(CD6低)预处理后Treg的产生，如FoxP3和Helios的阳性染色所示。
图25显示了相对于CD6高Treg，CD6低Treg具有增加的抑制活性。
图26A显示了伊立珠单抗诱导的CD6细胞表面损失以剂量依赖的方式发生(如所示，在伊立珠单抗浓度范围内孵育24小时后，在来自两个供体的PBMC上检测到CD6)。图26B显示了该测定能够区分糖基化状态的变化。
图27A-27E显示了用伊立珠单抗治疗的SLE患者的T细胞中细胞表面CD6的损失。
图28A-28B显示了在SLE患者中在第一剂量的伊立珠单抗后，CD4(28A)和CD8(28B)T细胞上的细胞表面CD6减少，并且在更高剂量的伊立珠单抗下观察到表面CD6的更大损失。
图29A-29B显示了与安慰剂相比，用0.8mg/kg的伊立珠单抗治疗导致Th17细胞减少3倍，Treg细胞增加2.5倍。
详细说明
以下是提供的详细描述，以帮助本领域技术人员实践本公开内容。本领域普通技术人员可以在不脱离本公开的精神或范围的情况下对本文所描述的实施方案进行修改和变化。本文提及的所有出版物、专利申请、专利、附图和其他参考文献以引用的方式全部明确并入本文。
某些实施方案包括鉴定优化的抗CD6抗体的方法。在一些实施方案中，鉴定优化的抗CD6抗体的方法基于选择性的测量，包括亲合力的测量。在一些实施方案中，鉴定优化的抗CD6抗体的方法包括测量处理后细胞表面CD6随时间的损失。在一些实施方案中，优化的抗CD6抗体是fab、f(ab)2或融合蛋白。
一些实施方案包括用于选择性结合具有高水平细胞表面CD6的细胞或CD6高细胞的方法。在一些实施方案中，所述方法包括从CD6高细胞的细胞表面去除或以其他方式减少CD6。在一些实施方案中，CD6高细胞是T淋巴细胞。在一些实施方案中，T淋巴细胞是CD4 T辅助细胞(Th1、Th2、Th22、Th9、Th17、Tfh、Tph)、CD8幼稚细胞、效应、效应记忆、干记忆或中央记忆CD4或CD8细胞、自然杀伤(NK)细胞和先天淋巴细胞(ILC)中的一种或多种，例如ILC1、ILC2和/或ILC3细胞。
一些实施方案提供了用于从CD6高细胞选择性地去除或降低细胞表面CD6的方法。在一些实施方案中，所述方法包括用优化的抗CD6抗体进行治疗。在一些实施方案中，测量CD6表面表达。一些实施方案提供了确定优化的抗CD6抗体的治疗用药量的方法，包括测量治疗后细胞表面CD6随时间的损失。在一些实施方案中，抗体是伊立珠单抗。一些实施方案提供了降低细胞致病性的方法，包括施用优化的抗CD6抗体。一些实施方案包括筛选用作生物治疗剂的抗CD6抗体或其抗原结合片段的方法，包括：将候选抗CD6肽或其抗原连接片段与在细胞表面上表达CD6的细胞孵育；测量在细胞上的细胞表面CD6表达；以及如果候选抗CD6抗体或其抗原结合片段相对于对照或标准降低细胞表面CD6表达，则将所述候选抗CD6抗体或其抗原结合片段配制为药物组合物。
某些实施方案包括选择性降低受试者中T淋巴细胞上的细胞表面CD6水平和选择性降低CD6高T淋巴细胞和/或Teff细胞的水平的方法。如本文所用，“Teff细胞”包括激活的T辅助细胞，如Th1细胞和Th17细胞。在具体实施方案中，“Teff细胞”是Th17细胞。
某些实施方案包括获得基线细胞表面CD6测量和/或定义细胞表面CD6的阈值或目标水平，以及施用治疗剂量的抗CD6抗体，例如伊立珠单抗。在一些实施方案中，所述方法包括监测来自受试者的组织样品中的CD6水平，其中组织样品包括T淋巴细胞。在一些实施方案中，所述方法包括如果细胞表面CD6水平恢复到基线细胞表面CD6测量值的大约或大于约25、30、35、40、45、50、55、60、65、70或75％，则向受试者施用另外剂量的伊立珠单抗。某些实施方案包括，如果细胞表面CD6水平升高至大约或高于细胞表面CD6的目标水平，则施用另外剂量的伊立珠单抗(参见，例如，图17A-17B)。
某些实施方案提供了在需要移植的患者中预防或缓解GVHD的方法，包括用抗CD6抗体孵育待移植的组织，所述抗体选择性地从CD6高细胞剥离、去除或以其他方式减少细胞表面CD6；以及将组织移植到患者体内。在一些实施方案中，所述方法包括测量患者CD6水平。在一些实施方案中，所述方法包括基线测量。
一些实施方案提供了调节Teff细胞与Treg细胞的比率的方法。本文还公开了用于增加Treg细胞与Teff细胞的比率的方法。
还包括将Teff细胞转化为Treg细胞的方法，包括用优化的抗CD6抗体的处理/治疗。在某些实施方案中，优化的抗CD6抗体是伊立珠单抗。
某些实施方案包括选择性靶向Teff细胞的方法。一些实施方案提供了选择性靶向Teff细胞的方法，包括施用优化的抗CD6抗体。在一些实施方案中，抗CD6抗体是伊立珠单抗。
一些实施方案提供了从致病性T细胞选择性地去除CD6的方法。在一些实施方案中，所述方法包括施用优化的抗CD6抗体。在一些实施方案中，抗体是伊立珠单抗。某些实施方案提供了用于选择性地衰减致病性T细胞的方法。在某些实施方案中，所述方法包括施用优化的抗CD6抗体。在一些实施方案中，抗体是伊立珠单抗。
某些实施方案涉及产生低应答性T细胞的方法。在某些实施方案中，所述方法包括施用优化的抗CD6抗体。在一些实施方案中，抗体是伊立珠单抗。一些实施方案提供了减少T细胞中自身反应性的方法。一些实施方案提供了减少T细胞中同种异体反应性的方法。
本文公开了选择性靶向CD6高细胞的方法。在一些实施方案中，选择性靶向的CD6细胞包括CD4 T辅助细胞(Th1、Th2、Th22、Th9、Th17、Tfh、Tph)的亚群以及幼稚、效应、效应记忆、干记忆和中央记忆亚型的CD8细胞；自然杀伤T细胞和先天淋巴细胞。本文还公开了用于调节Teff细胞与Treg细胞的比率的方法。本文还公开了用于保留Treg细胞的方法。本文还公开了用于将Teff细胞转化为Treg细胞的方法。本文还公开了使用优化的抗CD6抗体来改变T细胞应答和减轻疾病的方法。
在一些实施方案中，本公开提供了使CD6与抗CD6抗体结合的方法，使得抗CD6抗体仅结合具有高水平的细胞表面CD6表达的细胞，并且其中抗体诱导细胞表面CD6的持续损失。本文描述了本公开的其他方面。
除非另有定义，否则本文中使用的所有技术和科学术语具有与本公开所属领域的普通技术人员通常理解的相同的含义。尽管在本公开的实践或测试中可以使用与本文所述的方法和材料类似或等效的任何方法和材料，但是描述了优选的方法和材料。本说明书中引用的所有出版物和参考文献，包括但不限于专利和专利申请，均通过引用的方式整体并入本文，如同每个单独的出版物或参考文献被具体地和单独地指示通过引用的方式并入本文一样。本申请要求优先权的任何专利申请也以上述关于出版物和参考文献的方式通过引用整体并入本文。为了本公开的目的，以下术语定义如下。
本文使用的冠词“一种”和“一个”是指一种或多于一种(即至少一种/至少一个)该冠词的语法对象。举例而言，“一个要素”意指一个要素或多于一个要素。
除非另外指出，否则术语“和/或”在本发明中用于表示“和”或者“或”。
本文所使用的术语“例如”意指“诸如”，并且将被理解为暗示包括所述的步骤或要素、或者步骤或要素的组，而不排除任何其他步骤或要素、或者步骤或要素的组。
“约”意指数量、水平、值、数目、频率、百分比、尺寸、大小、量、重量或长度相对于参考数量、水平、值、数目、频率、百分比、尺寸、大小、量、重量或长度相差至多30、25、20、15、10、9、8、7、6、5、4、3、2或1％。
如本文所用，术语“施用”是指以任何模式向受试者转移、递送、引入或运输物质，例如化合物(例如药物化合物)或其他试剂(如抗原)。施用模式包括口服施用、局部接触、静脉内、腹膜内、肌内、鼻内或皮下施用。与诸如一种或多种治疗剂的另一种物质“组合”施用包括同时(并行的)和连续施用(以任何顺序)。
本文中使用的术语“亲合力”是指抗原结合分子(如抗CD6抗体)与相关抗原之间结合强度的测量。亲合力与抗原决定簇及其在抗原结合分子上的抗原结合位点之间的亲和性以及存在于抗原结合分子上的相关结合位点的数量有关。
如本文所用，术语“结合伴侣”是指可以通过足以使试剂与核酸分子、肽、蛋白质或糖、多糖或脂质形成复合物的相互作用(通常通过非共价键合)而能够与核酸分子(例如DNA或RNA分子，包括mRNA分子)、以及肽、蛋白质、糖、多糖或脂质结合的物质，例如分子，特别是聚合物分子。在一些实施方案中，结合伴侣是免疫球蛋白或具有如下定义的免疫球蛋白样功能的蛋白质性质结合分子。在一些实施方案中，结合伴侣是适体。在一些实施方案中，结合伴侣对特定靶标具有特异性。在一些实施方案中，结合伴侣包括多个结合位点，每个结合位点对于特定靶标是特异性的。作为说明性示例，结合伴侣可以是具有两个结合位点的具有免疫球蛋白样功能的蛋白质性质试剂。例如，结合伴侣可以是抗体的抗原结合片段。例如，结合伴侣可以是双特异性双抗体，例如双特异性单链双抗体。
如本公开内容中所使用的，术语“载体”涵盖载体、赋形剂和稀释剂，并且意指材料、组合物或媒介物，例如液体或固体填充剂、稀释剂、赋形剂、溶剂或封装材料，其参与将药物制剂从受试者的身体的一个器官或一部分运载或运输到受试者的身体的另一器官或另一部分。
如本文所用，术语“嵌合抗体”是指包含来自多于一个物种的序列的免疫球蛋白多肽或结构域抗体。在嵌合抗体中，重链或轻链可包含来自一种物种(例如人)的可变区序列和来自另一物种(例如小鼠)的恒定区序列。例如，“嵌合抗体”可以是具有与另一分子(例如，衍生自人抗体的恒定结构域)融合的、衍生自动物抗体(例如大鼠或小鼠抗体)的可变区的免疫球蛋白。术语“嵌合抗体”旨在涵盖以下抗体，其中：(i)重链是嵌合的，但轻链包含来自仅一个物种的Y区和C区；(ii)轻链是嵌合的，但重链包含来自仅一个物种的Y区和C区；以及(iii)重链和轻链都是嵌合的。
当与化合物结合使用时，“有效量”是引起期望应答所需的化合物(例如抗CD6抗体(例如，伊立珠单抗或EQ001))的量。在一些实施方案中，期望应答是例如在受试者中的生物应答。在一些实施方案中，可以将化合物(例如抗CD6抗体)以有效量施用至受试者，以在受试者中产生生物应答。在一些实施方案中，有效量是“治疗有效量”。
术语“治疗有效量”和“治疗剂量”在本文中互换使用，是指化合物，例如抗CD6抗体(例如，伊立珠单抗或EQ001)的量，其在施用于受试者后有效用于治疗如本文所述的受试者的疾病或病症。
术语“致病性”在本文中是指T细胞在细胞因子增殖和分泌增加方面表现出致病应答的能力。
术语“预防有效量”在本文中用于指一定量的化合物，例如抗CD6抗体(例如，伊立珠单抗或EQ001)，其在向受试者施用后有效，用于预防或延迟本文所述的受试者的疾病或病症的发作。
在这方面，本文所用的“人源化抗体”是包含人抗体的结构元件和非人抗体的抗原结合位点的免疫球蛋白多肽或结构域抗体。“人源化抗体”含有来自其来源的非人抗体的最小数量的残基。例如，它们可以仅包含非人抗体的CDR区，或者仅包含构成非人抗体的高可变区的那些残基。它们还可以包含来自非人多肽可变区之外的某些残基，例如模拟非人抗体结构或使空间干扰最小化所必需的残基。通常，人源化抗体包含人框架，至少一个来自非人抗体的CDR，其中存在的任何恒定区与人免疫球蛋白恒定区基本相同，即至少约85-90％，例如至少95％相同。因此，在某些情况下，人源化免疫球蛋白的所有部分，可能除了CDR之外，基本上与一个或多个天然人免疫球蛋白序列的相应部分相同。此外，人源化抗体可能含有与人或非人抗体都不对应的残基。
如本文所用，术语“抗体片段”是指除全长形式外的任何形式的抗体。本文中的抗体片段包括存在于全长抗体中的较小组分的抗体和经工程化的抗体。抗体片段包括但不限于Fv、Fc、Fab和(Fab’)2、单链Fv(scFv)、双抗体、三抗体、四抗体、双功能杂交抗体、CDR1、CDR2、CDR3、CDR的组合、可变区、框架区、恒定区、重链、轻链、替代支架非抗体分子和双特异性抗体。除非另有特别说明，否则使用术语“抗体”或“多种抗体”的声明和权利要求可以特别地包括“抗体片段”和“多种抗体片段。”
术语“VH”在本文中用于表示抗体的可变重链。
术语“VL”在本文中用于表示抗体的可变轻链。
提及抗体的术语“抗原结合片段”是指对亲本全长抗体结合的抗原保持结合亲和力的任何抗体片段，并且抗原结合片段包括但不限于Fv、Fab、(Fab’)2、scFv、双抗体、三抗体、四抗体、双功能杂交抗体、CDR1、CDR2、CDR3、CDR的组合、可变区、重链、轻链和双特异性抗体。
在整个说明书中，除非上下文另有要求，否则词语“包括”、“包含”和“含有”将被理解为意味着包括所述的步骤或要素或者步骤或要素的组，而不是排除任何其他步骤或要素或者步骤或要素的组。“由…组成”是指包括并限于短语“由…组成”中间的任何内容。因此，短语“由…组成”表示所列要素是必需的或强制性的，并且不可能存在其他要素。“基本上由…组成”是指包括该短语中间列出的任何要素，并且限于不干扰或有助于公开中为所列要素指定的活性或作用的其他要素。因此，短语“基本上由…组成”表示所列要素是必需的或强制性的，但其他要素是可选的，并且可能存在也可能不存在，这取决于它们是否对所列要素的活性或作用产生实质性影响。
术语“调节”包括“增加”、“增强”或“刺激”，以及“降低”或“减少”，通常是与对照相比统计学显著的或生理学显著的量。“增加的”、“刺激的”或“增强的”量通常是“统计学显著的”量，并且可以包括是无组合物(例如，在不存在本公开的任何抗CD6抗体的情况下)或由对照组合物、样品或测试受试者产生的量的1.1、1.2、2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20、30或更多倍(例如500、1000倍)(包括介于1与大于1之间的所有整数和小数点，例如1.5、1.6、1.7、1.8等)的增加。“降低”或“减少”的量通常是“统计学显著的”量，可以包括无组合物(不存在试剂或化合物)或由对照组合物产生的量减少1％、2％、3％、4％、5％、6％、7％、8％、9％、10％、11％、12％、13％、14％、15％、16％、17％、18％、19％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％或100％(包括其间的所有整数)。
术语“多肽”和“蛋白质”在本文中可互换地用于指氨基酸残基的聚合物以及其变体和合成类似物。因此，这些术语适用于其中一个或多个氨基酸残基是合成的非天然存在的氨基酸(例如相应的天然存在氨基酸的化学类似物)的氨基酸聚合物，以及自然存在的氨基酸聚合物。
本文所用的“受试者”或“患者”包括任何表现出症状或有表现出症状风险的动物，其可以用抗CD6抗体或其抗原结合片段进行治疗或诊断。合适的受试者(患者)优选地包括人类患者。合适的受试者还包括实验室动物(如小鼠、大鼠、兔子或豚鼠)、农场动物(如猪、马、牛)和家畜或宠物(如猫或狗)。非人类灵长类动物(如猴子、黑猩猩、狒狒或恒河猴)也包括在内。
“基本上”或“实质上”是指几乎全部或完全，例如，某个给定数量的95％或更大。
本文所用的“治疗”或“进行治疗”包括对疾病或病况的症状或病理学的任何期望作用，并且可以包括正在治疗的疾病或病况的一个或多个可测量标志物的甚至最小的变化或改善。“治疗”或“进行治疗”并不一定意味着疾病或病况或其相关症状的完全根除或治愈。接受这种治疗的受试者是有此需要的任何受试者。临床改善的示例性标志物对于本领域技术人员来说将是显而易见的。
例如，本公开涉及鉴定能够从CD6高细胞中去除细胞表面CD6的抗CD6抗体的方法，和使用抗CD6抗体将Teff转化为Treg细胞的方法，和治疗、预防或减轻自身或同种反应性T细胞、自然杀伤(NK)细胞或先天性淋巴细胞(ILC)的方法，包括向受试者施用抗CD6抗体。
CD6是一种重要的细胞表面蛋白，主要由人NK细胞、ILC、T细胞和B细胞亚群以及一些B细胞慢性淋巴细胞白血病和神经元表达[Aruffo等人，J.Exp.Med.1991,174:949；Kantoun等人，J.Immunol.1981,127:987；Mayer等人，J.Neuroimmunol.1990,29:193]。CD6是一个大的蛋白质家族的成员，其特征在于具有至少一个与I型巨噬细胞的清除剂受体富含半胱氨酸结构域(SRCR)同源的结构域[Matsumoto等人，J.Exp.Med.1991,173:55和Resnick等人，Trends Biochem.Sci.1994,19:5]。该家族的其他成员包括CD5[Jones等人，Nature.1986,323:346]；亲环蛋白C[Friedman等人,1993，PNAS 90:6815]；补体因子I，其结合激活的补体蛋白C3b和C4b[Goldberger等，J.Biol.Chem.1987,262:10065]；由τ/ΔT细胞表达的牛WC-l[Wijingaard等人，J.Immunol.1992,149:3273]和M130[Law等人，EurJ.Immunol.1993，23:2320]，巨噬细胞激活标志物。
成熟CD6蛋白的胞外结构域由三个SRCR结构域(以下称为D1、D2和D3)组成。D3对应于膜近端SRCR结构域，后面是短的33氨基酸柄区。这些细胞外结构域通过短跨膜结构域锚定至细胞膜，之后是可变长度的细胞质结构域[Aruffo等人，J.Exp.Med.1991,174:949]。
据报道，来源不明的可溶性形式的CD6(sCD6)在健康个体的血清中以非常低的水平(皮摩尔/纳摩尔范围)循环。在全身炎症应答综合征和原发性干燥综合征个体中观察到sCD6水平升高，但这些事件之间缺乏直接的机制和功能关系。报告表明，sCD6是通过金属蛋白酶ADAM家族成员的蛋白水解作用使膜结合受体脱落而形成的(Carrasco等人，Frontiersin Immunology 2017.8:769)。此外，尽管sCD6在T细胞生理学中的功能作用尚不清楚，但体外结果表明，sCD6抑制T细胞激活和免疫突触的成熟，这促使一些研究人员认为sCD6作为诱饵受体，使炎症部位附近的旁观者T细胞失活。
使用含有与人IgG1恒定结构域融合的所选CD6细胞外结构域的CD6免疫球蛋白融合蛋白(CD6-Rgs)的研究导致了对CD6配体的鉴定和克隆，该配体被命名为“激活的白细胞细胞粘附分子”(ALCAM)，也称为CD166[Patel等人，J.Exp.Med.1995,181:1563-1568；Bowen等人，J.Exp.Med.,1995，181：2213-2220]
ALCAM是一种100-105kD的I型跨膜糖蛋白，是免疫球蛋白超家族的成员，包括五个细胞外免疫球蛋白结构域(2个NH2-末端、膜远端可变-(V)型(VI、V2或D1、D2)和3个膜近端恒定-(C2)型Ig折叠)[C1、C2、C3]、跨膜区和短的细胞质尾部。N-末端结构域(D1)仅参与配体结合，而膜近端结构域(C2、C3或D4、D5)是嗜同种相互作用(homophilic interaction)所必需的。
ALCAM与CD6的对应于膜近端SRCR结构域的结构域3结合[Whitney等人，J.Biol.Chem 1995,270:18187-18190]。
对CD6/ALCAM相互作用在T细胞调节中的作用的研究表明，这种受体-配体对能够介导表达CD6的细胞与胸腺上皮细胞的粘附。这表明CD6/ALCAM相互作用对于调节T细胞的发育和激活是重要的。此外，ALCAM脱落也有报道，与sCD6一样，该过程似乎是ADAM家族金属蛋白酶介导的切割的产物。
CD6在体内调节T细胞功能中起着重要作用。CD6也被报道为免疫突触的一部分，介导早期和晚期T细胞-抗原呈递细胞(APC)相互作用。此外，已经表明CD6高T细胞是致病性的，而CD6低T细胞不是致病性的(例如，参见Ma等人，Journal of Crohn’s and Colitis.13:510–524,2019)。建立高与低CD6表达的方法在本领域是已知的，并且CD6高和CD6低细胞可以通过比较各种细胞亚群上的蛋白质和/或mRNA表达来进行定义(参见，例如，Ma等人，上文；和Santana等人，Cytometry A.85:901-8,2014)。
美国专利号6,372,215公开了特异性结合人CD6(hCD6)的SRCR结构域3(D3)或人CD6柄结构域(CD6S)并抑制激活的白细胞粘附分子(ALCAM)结合CD6的抗体和其他结合剂。
更早的出版物和专利公开了鼠抗CD6(IOR-Tl)单克隆抗体的序列和进行的将IOR-T1人源化为Tlh(人源化IOR-T1)的氨基酸修饰。美国专利号5,712,120及其等价的EP0699755公开了使鼠单克隆抗体人源化的特定方法和IOR-T1和Tlh的序列。美国专利号6,572,857及其等价的EP 0807125公开了IOR-T1和Tlh(人源化IOR-T1)的序列。题为“AMonoclonal Antibody and a Method Thereof(单克隆抗体及其方法)”的PCT/IN2008/00562公开了在NS0细胞中生产抗CD6抗体，其具有其中提供为SEQ ID NO:1和2的重链和轻链序列。这种抗体的INN名称是伊立珠单抗。伊立珠单抗在小鼠来源的NS0细胞系和中国仓鼠卵巢(CHO)细胞中产生，当在CHO细胞中产生时，本文以其商品名EQ001引用，当在NSO细胞中产生则以其商品名ALZUMAB引用。EQ001(即在CHO细胞中产生的伊立珠单抗)在本领域中也被称为“Bmab-600”。某些实施方案通过其INN名称伊立珠单抗来指代抗体本身，而不管其生产方法如何。因此，本文所用的术语伊立珠单抗包括ALZUMAB和EQ001，它们各自具有与伊立珠单抗相同的序列(见表S1)。本文分别以SEQ ID NO:1和2提供了伊立珠单抗(和EQ001/ALZUMAB)的可变重链(VH)和可变轻链(VL)的氨基酸序列。本文分别以SEQ ID NO:3和4提供了伊立珠单抗(和EQ001/ALZUMAB)的VH和VL的核苷酸(DNA)序列。分别以SEQ ID NO:5-7提供伊立珠单抗(和EQ001/ALZUMAB)VH CDR 1-3的氨基酸序列。分别以SEQ ID NOS:8-10提供伊立珠单抗(和EQ001/ALZUMAB)VL CDR 1-3的氨基酸序列。
靶向CD6的抗体已显示出作为治疗多种疾病和病症的前景，这些疾病和病症至少部分是由异常T细胞活性引起的。例如，PCT/IN2008/000562公开了使用伊立珠单抗来抑制幼稚T细胞的增殖并治疗各种炎症性病症，包括多发性硬化症、移植排斥反应、类风湿性关节炎和银屑病。事实上，ALZUMAB目前在印度上市，用于治疗银屑病。此外，在PCT/IB2017/056428中公开了使用伊立珠单抗来治疗狼疮。然而，由于这些疾病的异质性及其在T细胞、B细胞、树突状细胞、单核细胞和中性粒细胞介导的不同疾病形式之间循环的趋势，需要更具针对性的治疗方法来更充分地挖掘这些抗体的潜力。
到目前为止，临床上还没有采用生物标志物策略来确定患者何时最有可能对用抗CD6抗体(例如，伊立珠单抗)的治疗或更普遍地对CD6高细胞上细胞表面CD6表达的减少产生有利应答。本公开的实施方案包括鉴定给药方案以获得CD6高细胞的期望衰减的方法。
特定的实施方案包括用于在患有自身免疫性、免疫炎症性或炎症性疾病、移植物抗宿主病(GVHD)或器官移植排斥反应的人类受试者中测定伊立珠单抗的最佳用药量的方法，包括：
(a)测定来自受试者的组织样品中的细胞表面CD6水平的基线，其中组织样品包括T淋巴细胞，并且任选地定义受试者中的细胞表面CD6的目标水平；
(b)向受试者施用一系列的两个或三个或更多个用药量的伊立珠单抗(例如，3、4、5或6个用药量)，任选地增加用药量(例如，高至约4mg/kg)，例如，随着各个其它用药量或每隔一个用药量而增加(例如，每个剂量或每隔一个剂量增加约0.1mg/kg、0.2mg/kg、0.3mg/kg、0.4mg/kg、0.5mg/kg、0.6mg/kg、0.7mg/kg、0.8mg/kg、0.9mg/kg或1.0mg/kg或更多)；
(c)在一系列的用药量之间监测来自受试者的组织样品中的细胞表面CD6水平，其中组织样品包括T淋巴细胞；
(d)如果步骤(c)中的细胞表面CD6水平为来自(a)的基线的约5、10、15、20、25、30、40、45或50％或小于约5、10、15、20、25、30、40、45或50％，或者在来自(a)的任选目标水平的约5、10、15或20％或小于约5、10、15或20％之内，并且如果在一系列的用药量之间没有观察到细胞表面CD6水平的进一步减少(例如，统计学显著的减少)，则将来自一系列的用药量的最低用药量鉴定为最佳用药量。特定的实施方案包括测定来自受试者的组织样品中CD4细胞和/或CD8细胞上的细胞表面CD6水平。在特定的实施方案中，组织样品是血液样品。一些实施方案包括基于疾病的临床参数或症状来定义受试者中的细胞表面CD6的目标水平。
一些实施方案涉及用于治疗有需要的人类受试者的自身免疫性、免疫炎症性或炎症性疾病、移植物抗宿主病(GVHD)或器官移植排斥反应的给药方案，包括：
(a)测定来自受试者的组织样品中的细胞表面CD6水平的基线，其中组织样品包括T淋巴细胞，并且任选地定义受试者中的细胞表面CD6的目标水平；
(b)向受试者施用一定用药量的伊立珠单抗，其将受试者的T淋巴细胞中的细胞表面CD6水平降低至来自(a)的基线的约或小于约5、10、15、20、25％；
(c)监测来自受试者的组织样品中的细胞表面CD6水平，其中组织样品包括T淋巴细胞；和
(d)在以下情况之前或如果是以下情况，向受试者施用进一步用药量的伊立珠单抗：(c)中的细胞表面CD6水平恢复到来自(a)的基线的约25、30、35、40、45、50、55、60、65、70或75％或大于约25、30、35、40、45、50、55、60、65、70或75％，或升高到大约或高于来自(a)的目标水平。
在一些实施方案中，给药方案将来自受试者的T淋巴细胞(例如，CD4和/或CD8细胞)中的细胞表面CD6水平维持在来自(a)的基线的约40、45、50、55、60、65、70或75％或小于约40、45、50、55、60、65、70或75％，或者在来自(a)的任选目标水平的约5、10、15或20％之内，并且特定的实施方案包括基于疾病的临床参数或症状来定义受试者中的细胞表面CD6的目标水平。
还包括用于治疗有需要的人类受试者的自身免疫性、免疫炎症性或炎症性疾病、移植物抗宿主病(GVHD)或器官移植排斥反应的给药方案，包括：
(a)测定来自受试者的血液样品中的CD6高T淋巴细胞的基线水平，并且任选地定义CD6高T-淋巴细胞的目标水平；
(b)向受试者施用一定用药量的伊立珠单抗，其将受试者中CD6高T淋巴细胞的水平减少至来自(a)的基线的约5、10、15、20、25、30或40％或小于约5、10、15、20、25、30或40％；
(c)监测来自受试者的血液样品中的CD6高T淋巴细胞的水平；和
(d)在以下情况之前，向受试者施用进一步用药量的伊立珠单抗：来自(c)的CD6高T淋巴细胞的水平恢复到来自(a)的基线水平的约25、30、35、40、45、50、55、60、65、70或75％或大于约25、30、35、40、45、50、55、60、65、70或75％，或升高到大约或高于来自(a)的目标水平，并且在一些情况下，基于疾病的临床参数或症状来定义受试者中的CD6高T淋巴细胞的目标水平。
在一些实施方案中，给药方案将受试者中的CD6高T淋巴细胞的水平维持在来自(a)的基线水平的约45、50、55、60、65、70或75％或小于约45、50、55、60、65、70或75％，包括其中T淋巴细胞是CD4细胞和/或CD8细胞。在一些实施方案中，给药方案将受试者中CD6高:CD6低T淋巴细胞的比率相对于对照或标准或基线降低约或至少约10、20、30、40、50、60、70、80、90、100、200、300、400、500％或更多或者降低约或至少约1.5、2、3、4、5、6、7、8、9、10倍或更多，任选地其中T淋巴细胞是CD4细胞和/或CD8细胞。
在一些实施方案中，给药方案将受试者中的Teff:Treg细胞的比率相对于对照或标准或基线降低约或至少约10、20、30、40、50、60、70、80、90、100、200、300、400、500％或更多或者降低约或至少约1.5、2、3、4、5、6、7、8、9、10倍或更多，任选地CD4细胞和/或CD8细胞。
还包括预防或缓解人类移植患者的移植物抗宿主病(GVHD)的基于细胞的治疗方法，包括：
(a)将移植组织与抗CD6抗体(任选地为伊立珠单抗)孵育足以减少移植组织中CD6高T淋巴细胞上的CD6的细胞表面水平的时间；和
(b)将移植组织移植到患者中。
特定的方法包括在步骤(a)之前和之后测定移植组织中T淋巴细胞上的CD6的细胞表面水平，并且如果在步骤(a)之后CD6的细胞表面水平相对于在步骤(a)之前减少约或至少约10、20、30、40、50、60、70、80、90、100、200、300、400、500％或更多，则执行步骤(b)。在一些实施方案中，移植组织包括脐带血细胞、骨髓细胞、外周血细胞、动员的外周血细胞、间充质干细胞、造血干细胞、从干细胞/祖细胞分化的细胞、工程化的细胞(例如，嵌合抗原受体(CAR)细胞例如CAR T细胞)或所述细胞的任何组合。在一些实施方案中，移植组织对于人类移植患者是自体的，即是其中移植组织是从患者移取的，如本文所述处理，并且随后施用至同一患者。在一些实施方案中，移植组织是同种移植组织，或对于人类移植患者是同种异体的组织，例如其中移植组织获自遗传上不相同的人类供体，如本文所述处理，并且随后施用至人类患者。
还包括用于治疗或缓解有需要的人类患者的自身免疫性、免疫炎症性或炎症性疾病的基于细胞的治疗方法(例如，Treg疗法)，包括：
(a)将移植组织与抗CD6抗体(任选地为伊立珠单抗)孵育足以减少移植组织中CD6高T淋巴细胞上的CD6的细胞表面水平的时间，从而产生富含CD6低(幼稚)T淋巴细胞的移植组织；
(b)将来自(a)的移植组织处理足以从CD6低(幼稚)T淋巴细胞产生Treg淋巴细胞的时间；以及
(c)将来自(c)的移植组织移植到患者内。
与上文相似，特定的实施方案包括以下步骤：在步骤(a)之前和之后测定移植组织中T淋巴细胞上的CD6的细胞表面水平，并且如果在步骤(a)之后CD6的细胞表面水平相对于在步骤(a)之前减少约或至少约10、20、30、40、50、60、70、80、90、100、200、300、400、500％或更多，则执行步骤(b)。
在一些实施方案中，如上的步骤(b)包括将富含CD6低(幼稚)T淋巴细胞的移植组织与T细胞激活剂/刺激性信号、细胞因子、生长因子、转录因子和/或稳定化试剂(例如，CD3/CD28激活剂，Treg分化混合物，如STEMCELL TECHNOLOGIESTM的IMMUNOCULTTM人Treg分化补充剂)的组合孵育足以产生或富集Treg淋巴细胞的时间。这种用于生成(例如，分化、扩增)Treg的处理或方案的实例是本领域中已知的(例如，参见Golovina等人，PLoS ONE(2011)6:e15868.doi:10.1371/journal.pone.0015868；Scottà等人，Haematologica 98:1291-9,2013；Dons等人，Hum Immunol.73:328-34,2012；Fraser等人，Mol Ther Methods ClinDev.8:198–209,2018；Romano等人，Front.Immunol.2019年1月31日，doi.org/10.3389/fimmu.2019.00043；Haddadi等人，Clinical and Experimental Immunol.201(2):205-221,2020)，包括组合RORγ特异性反向激动剂(SR)和TGF-β信号传导启动子[N-乙酰嘌呤霉素(N-Ac)]的方案。
用于产生Treg淋巴细胞的附加方案描述于例如Chen等人(The Journal ofExperimental Med.198(12):1875-1886,2003)，其描述了用TCR和TGF-β共刺激幼稚T细胞；Zheng等人(J.Immunol.178:18-2027,2007)，其描述了用IL-2和TGF-β的刺激；Schiavon等人(PNAS.116:6298-6307,2019)，其描述了用IL-2、TGF-β和PGE2的刺激；和Ferreira等人(Nat Rev Drug Discov.18(10):749–769,2019)，其描述了说明Treg淋巴细胞离体生成的各种技术和临床试验。Zagury等人(WO 2018/024896)描述了包括在γδT细胞激活剂和以下试剂存在下培养T细胞的示例性方案：i)cAMP(环磷酸腺苷)激活剂，ii)TGFP(转化生长因子β)途径激活剂，iii)mTOR抑制剂，任选地iv)选自IL-2、IL-7、IL-15和TSLP的组的至少一种细胞因子，和任选地v)至少一种TET酶激活剂和/或至少一种DNMT抑制剂。Alvarez-Salazer等人(Front.Immunol.11:375.doi:10.3389/fimmu.2020.00375)描述了大规模产生具有功能稳定性的人Treg淋巴细胞，用于移植中的免疫疗法，例如，通过在TGF-β1、IL-2和视黄酸存在下将幼稚T细胞与树突状细胞共培养以产生Treg，并在TGF-β1、IL-22和雷帕霉素存在下扩增Treg。本文所述的方法(例如，上述步骤(b))可以采用任何一种或多种前述方法，或本领域的其他方法，以从伊立珠单抗富集的CD6低(幼稚)T淋巴细胞群体产生Treg。
在一些实施方案中，移植组织包括脐带血细胞、骨髓细胞、外周血细胞、动员的外周血细胞、间充质干细胞、造血干细胞、从干细胞/祖细胞分化的细胞、工程化的细胞(例如，嵌合抗原受体(CAR)细胞例如CAR T细胞)或所述细胞的任何组合。在一些实施方案中，移植组织对于人类患者是自体的，例如自体Treg疗法。在一些实施方案中，移植组织是同种移植组织，或对于人类患者是同种异体的组织。
特定的实施方案包括用于治疗有需要的人类受试者的自身免疫性、免疫炎症性或炎症性疾病、移植物抗宿主病(GVHD)或器官移植排斥反应的方法，包括：
(a)向受试者施用伊立珠单抗；和
(b)测定来自受试者的组织样品中的T淋巴细胞上细胞表面CD6的水平，测定来自受试者的组织样品中的CD6高和任选地CD6低T淋巴细胞的水平，和/或测定受试者中Teff和Treg细胞的水平/比率，其中组织样品包括T淋巴细胞；
其中伊立珠单抗的施用减少以下中的一项或多项：(i)T淋巴细胞、任选地CD4和/或CD8细胞上细胞表面CD6的水平；(ii)受试者中CD6高T淋巴细胞的水平；(iii)受试者中CD6高:CD6低T淋巴细胞的比率；和/或(iv)受试者中Teff:Treg细胞的比率，从而减少受试者中的致病性免疫应答。用于测定如上(i)-(iv)中一项或多项的方法如本文所述(参见实施例)并且是本领域已知的。
在一些实例中，伊立珠单抗的施用将受试者中T淋巴细胞上的细胞表面CD6水平相对于对照或标准或基线降低约或至少约10、20、30、40、50、60、70、80、90、100、200、300、400、500％或更多，任选地其中T淋巴细胞是CD4细胞和/或CD8细胞；将受试者中的CD6高T淋巴细胞的水平相对于对照或标准或基线降低约或至少约10、20、30、40、50、60、70、80、90、100、200、300、400、500％或更多，任选地其中T淋巴细胞是CD4细胞和/或CD8细胞；将受试者中的CD6高:CD6低T淋巴细胞的比率相对于对照或标准或基线降低约或至少约10、20、30、40、50、60、70、80、90、100、200、300、400、500％或更多或者降低约或至少约1.5、2、3、4、5、6、7、8、9、10倍或更多，任选地其中T淋巴细胞是CD4细胞和/或CD8细胞；和/或将受试者中的Teff:Treg细胞的比率相对于对照或标准或基线降低约或至少约10、20、30、40、50、60、70、80、90、100、200、300、400、500％或更多或者降低约或至少约1.5、2、3、4、5、6、7、8、9、10倍或更多。
在一些实施方案中，患者或受试者的自身免疫性、免疫炎症性或炎症性疾病的特征在于相对于标准或健康受试者，Teff:Treg细胞的比率增加。在特定实施方案中，受试者或患者中的Teff:Treg细胞的比率相对于标准或健康受试者增加约1.5、2、3、4、5、6、7、8、9或10倍或更多。在具体实施方案中，自身免疫性、免疫炎症性或炎症性疾病是：炎症性肠病(IBD)，任选地克罗恩病或溃疡性结肠炎；系统性红斑狼疮(SLE)，任选地伴有狼疮性肾炎的SLE；类风湿性关节炎(RA)；多发性硬化症(MS)；银屑病；银屑病关节炎；强直性脊柱炎；或哮喘。
特定的实施方案包括用于分析试验批次的伊立珠单抗的体外基于细胞的(即，基于细胞培养物的)方法，包括
(a)将测试批次的伊立珠单抗与在细胞表面上表达CD6的细胞孵育；
(b)测量细胞上的细胞表面CD6表达；和
(c)如果测试批次相对于对照或标准降低细胞表面CD6表达(例如，在T淋巴细胞上的)，则配制测试批次的伊立珠单抗作为药物组合物，并且如果测试批次相对于对照或标准没有降低细胞表面CD6表达，则拒绝测试批次的伊立珠单抗。
在一些实施方案中，步骤(b)包括直接测量细胞(例如T淋巴细胞)上的细胞表面CD6表达。细胞表面CD6水平可以根据本领域的多种技术进行测量，例如通过流式细胞术、飞行时间细胞术(CyToF)、细胞ELISA或免疫荧光显微术。在一些实施方案中，步骤(b)包括通过测量细胞上清液中的可溶性CD6作为细胞表面CD6表达的指征或代替物，来测量/测定细胞表面CD6表达。在这些和相关实施方案中，上清液中的可溶性CD6的增加表明细胞表面CD6表达的降低。用于测量细胞上清液中的可溶性CD6的示例性方法包括酶联免疫吸附测定(ELISA)、化学发光测定、电化学发光测定、高效液相色谱、蛋白质印迹和免疫沉淀后进行蛋白质印迹，以及本领域已知的其他方法。
在一些实施方案中，细胞包括外周血单核细胞(PBMC)，其通常包含祖细胞群体，例如CD14+单核细胞和淋巴细胞，例如CD19+B细胞、CD4+辅助性T细胞、CD8+细胞毒性T细胞和CD56+自然杀伤(NK)细胞。在特定实施方案中，细胞包括人T细胞系或经工程设计以表达CD6(例如人CD6)的细胞系。细胞系的实例包括MOLT-4、MOLT-3、MOLT-16、HuT 78、HuT 102、Jurkat、Jurkate NFAT、CCRF-CEM、12.1、MJ(G11)、LOUCY、SUP-T1、HEL.92.1.7、EF0-21、RPMI-8226、HPB-ALL、HH、KE37、P12ICHIKAWA、PEER、ALLSIL、RPMI8402、CMLT1、PF382、EHEB和DU4475细胞。
在一些实施方案中，细胞包括单核细胞，例如人类单核细胞，例如单核细胞系。在一些实施方案中，单核细胞系选自U937、THP1、MC-1010、TUR、AML-193和MV-4-11细胞。在一些实施方案中，细胞包括(a)人T细胞系(例如，人T细胞系)或经工程化以表达CD6的其他人细胞系，和(b)人单核细胞(例如，人单核细胞系)。在一些实施方案中，(a):(b)的混合物以约、至少约或不超过约30:1、25:1、20:1、15:1、10:1、5:1、4:1、3:1、2:1、1:1、1:2、1:3、1:4、1:5或1:10的比率存在。
特定的实施方案包括如果试验批次的伊立珠单抗将细胞表面CD6表达相对于对照或标准降低约或至少约10、20、30、40、50、60、70、80、90、100、200、300、400、500％或更多和/或如果试验批次的伊立珠单抗将细胞上清液中的可溶性CD6相对于对照或标准增加约或至少约10、20、30、40、50、60、70、80、90、100、200、300、400、500％或更多，则将所述试验批次的伊立珠单抗配制为药物组合物的步骤。
更一般地，特定的实施方案包括筛选用作生物治疗剂的抗CD6抗体或其抗原结合片段的方法，包括：
(a)将候选抗CD6抗体或其抗原结合片段与在细胞表面上表达CD6的细胞孵育；
(b)测量细胞上的细胞表面CD6表达；和
(c)如果候选抗CD6抗体或其抗原结合片段相对于对照或标准降低细胞表面CD6表达，则将其配制为药物组合物。这样的方法可以用于鉴定具有临床相关的生物学性质(如本文对于伊立珠单抗所描述的)的候选抗CD6抗体。
如上所述，细胞表面CD6表达水平可以根据本领域的各种技术直接或间接测量。例如，可以通过流式细胞术、飞行时间细胞术(CyToF)、细胞ELISA或免疫荧光显微术来直接测量细胞表面CD6表达。也可以通过例如ELISA、化学发光测定、电化学发光测定、高效液相色谱、蛋白质印迹、和免疫沉淀后进行蛋白质印迹以及本领域的其他技术，测量细胞上清液中的可溶性CD6来间接测量或测定细胞表面CD6表达水平。
在一些实施方案中，细胞包括PBMC。在特定实施方案中，细胞包括人T细胞系或经工程设计以表达CD6(例如人CD6)的细胞系。细胞系的实例包括MOLT-4、MOLT-3、MOLT-16、HuT 78、HuT 102、Jurkat、Jurkate NFAT、CCRF-CEM、12.1、MJ(G11)、LOUCY、SUP-T1、HEL.92.1.7、EF0-21、RPMI-8226、HPB-ALL、HH、KE37、P12ICHIKAWA、PEER、ALLSIL、RPMI8402、CMLT1、PF382、EHEB和DU4475细胞。
在一些实施方案中，细胞包括单核细胞，例如人类单核细胞，例如单核细胞系。在一些实施方案中，单核细胞系选自U937、THP1、MC-1010、TUR、AML-193和MV-4-11细胞。在一些实施方案中，细胞包括(a)人T细胞系(例如，人T细胞系)或经工程化以表达CD6的其他人细胞系，和(b)人单核细胞(例如，人单核细胞系)。在一些实施方案中，(a):(b)的混合物以约、至少约或不超过约30:1、25:1、20:1、15:1、10:1、5:1、4:1、3:1、2:1、1:1、1:2、1:3、1:4、1:5或1:10的比率存在。
特定的实施方案包括如果候选抗CD6抗体或其抗原结合片段将细胞表面CD6表达相对于对照或标准降低约或至少约10、20、30、40、50、60、70、80、90、100、200、300、400、500％或更多和/或如果候选抗CD6抗体或其抗原结合片段将细胞上清液中的可溶性CD6相对于对照或标准增加约或至少约10、20、30、40、50、60、70、80、90、100、200、300、400、500％或更多，则将所述候选抗CD6抗体或其抗原结合片段配制为药物组合物。
在特定的实施方案中，本公开内容提供了减少患者中T细胞上的CD6的水平的方法，包括通过皮下或静脉内施用来施用治疗剂量的伊立珠单抗。
在一些实施方案中，每两周施用治疗有效量的抗CD6单克隆抗体，直到确定患者正在康复或出院。在一些实施方案中，剂量是3.2mg/kg或更少。在一些实施方案中，向患者给药0.1至3.2mg/kg。在一些实施方案中，施用单一剂量。在一些实施方案中，施用两个剂量。在一些实施方案中，施用1-12个剂量。在一些实施方案中，施用两个剂量。在一些实施方案中，施用三个剂量。在一些实施方案中，施用四个剂量。在一些实施方案中，给药是长期的。在一些实施方案中，剂量是100mg。在一些实施方案中，剂量是200mg。在某些实施方案中，每两周施用剂量。在一些实施方案中，每月施用剂量。在一些实施方案中，每隔一个月施用剂量。在一些实施方案中，每六周施用剂量。在一些实施方案中，每八周施用剂量。在一些实施方案中，每十周施用剂量。在一些实施方案中，每十二周施用剂量。在一些实施方案中，每三个月施用剂量。在一些实施方案中，每四个月施用剂量。在一些实施方案中，每五个月施用剂量。在一些实施方案中，每六个月施用剂量。在一些实施方案中，间隔超过六个月施用剂量。
本公开中使用的抗CD6单克隆抗体的治疗有效量的示例性非限制性范围是约0.01-100mg/kg每受试者体重，例如约0.01-50mg/kg，例如，约0.01-25mg/kg。在一些实施方案中，相对患者身高的理想体重用于确定剂量。在一些实施方案中，向受试者给予超过一个剂量。在一些实施方案中，向患者给予更大的初始剂量。在一些实施方案中，在一周后施用第二剂量。在一些实施方案中，在两周后施用第二剂量。在一些实施方案中，第二剂量具有与第一剂量相同的强度。在一些实施方案中，第二剂量是初始剂量的四分之三或更少。在一些实施方案中，第二剂量是初始剂量的一半。在一些实施方案中，施用第三治疗。在一些实施方案中，每两周施用治疗有效量的抗CD6单克隆抗体，直到确定患者正在康复或出院。在一些实施方案中，剂量是0.8mg/kg或1.6mg/kg。在一些实施方案中，施用的剂量是1.6mg/kg和0.8mg/kg。治疗有效量的抗CD6单克隆抗体的示例性非限制性剂量是约0.8mg/kg至1.6mg/kg或在0.8mg/kg至1.6mg/kg之间。具有本领域普通技术的医学专业人员可以容易地确定和开具所需药物组合物的有效量。例如，医生可以以低于达到所需的治疗效果所需水平的抗CD6单克隆抗体的剂量开始，并逐渐增加用药量，直到达到所需效果。
在一些实施方案中，施用的剂量是0.1mg/kg、0.2mg/kg、0.3mg/kg、0.4mg/kg、0.5mg/kg、0.6mg/kg、0.7mg/kg、0.8mg/kg、0.9mg/kg、1.0mg/kg、1.1mg/kg、1.2mg/kg、1.3mg/kg、1.4mg/kg、1.5mg/kg、1.6mg/kg、1.7mg/kg、1.8mg/kg、1.9mg/kg、2.0mg/kg、2.1mg/kg、2.2mg/kg、2.3mg/kg、2.4mg/kg、2.5mg/kg、2.6mg/kg、2.7mg/kg、2.8mg/kg、2.9mg/kg、3.0mg/kg、3.1mg/kg、3.2mg/kg、3.3mg/kg、3.4mg/kg、3.5mg/kg、3.6mg/kg、3.7mg/kg、3.8mg/kg、3.9mg/kg或4.0mg/kg。在一些实施方案中，施用的剂量是0.2mg/kg、0.4mg/kg、0.8mg/kg、1.2mg/kg、1.6mg/kg、2.0mg/kg或2.2mg/kg。在一些实施方案中，伊立珠单抗剂量是0.4mg/kg、0.8mg/kg、1.6mg/kg或3.2mg/kg。在一些实施方案中，施用的剂量是约25mg、50mg、75mg、100mg、125mg、150mg、175mg、200mg、225mg、250mg、275mg、300mg、325、350、375、400、425、450、475或500mg。本申请中包括本公开中使用的治疗有效量的抗CD6单克隆抗体的示例性非限制性剂量。具有本领域普通技术的医学专业人员可以容易地确定和开具所需药物组合物的有效量。例如，医生可以以低于达到所需的治疗效果所需水平的抗CD6单克隆抗体的剂量开始，并逐渐增加用药量，直到达到所需效果。在一些实施方案中，所述方法包括分析患者的血液以确定给药的频率。在一些实施方案中，对患者样品分析细胞表面CD6表达。在一些实施方案中，对患者血清分析可溶性CD6。
在一些实施方案中，以0.1至50mg/kg/受试者体重，例如0.5至3mg/kg的每周用药量通过输注施用抗CD6单克隆抗体。这种施用可以重复，例如1至8次，例如2至4次，或3至5次。在一些情况下，施用可以通过持续输注2至24小时(例如2至12小时)的时间段来进行。
在一些实施方案中，以每周用药量施用抗CD6单克隆抗体。在一些实施方案中，以每两周用药量施用抗CD6单克隆抗体。在一些实施方案中，以间隔的每周用药量施用抗CD6单克隆抗体。在某些实施方案中，以间隔的每两周用药量施用抗CD6单克隆抗体。在这些和相关实施方案中的一些中，施用约50mg至约350mg的用药量的伊立珠单抗多至7次，例如2-4次。在一些实施方案中，每两周施用抗CD6抗体。在一些实施方案中，间隔的每两周施用抗CD6抗体。在一些实施方案中，间隔的每两周给药是第一次剂量，随后每两周评估以确定是否需要后续剂量。施用可以通过持续输注进行约1小时的时间段，或约1至24小时，约1至12小时，约1至6小时，约1至2小时，或约1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23或24小时的时间段。这种方案可以根据需要重复一次或多次，例如，在一周后或两周后重复。
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本文使用的章节标题仅用于组织目的，不得解释为限制所述主题。
以下实施例旨在帮助理解本公开，但不旨在并且也不应被解释为以任何方式限制其范围。实施例不包括对测定程序中使用的常规方法的详细描述。这样的方法对于本领域的普通技术人员来说是公知的，并且在包括实施例在内的许多出版物中进行了描述。
实施例
提供这些实施例仅用于说明目的并不是限制本文提供的权利要求的范围。
实施例1
使用流式细胞术在冷冻保存的PBMC上分析CD6表面水平的体外损失将冷冻保存的外周血单核细胞(PBMC)解冻并重悬于完全培养基(RPMI+10％ FBS+1X青霉素/链霉素)中。对PBMC进行计数，并在完全培养基中将细胞浓度调节至400万个细胞/mL。在完全培养基中以2X最终处理浓度来制备伊立珠单抗和同种型处理物。在24W TC处理板中，通过将250uL的PBMC和250uL的2X处理物组合到单个孔中达到最终体积为500uL，用伊立珠单抗或同种型处理PBMC。经处理的PBMC在37℃孵育特定时间点(10、30、60、120、180、1440分钟)。在每个时间点，从指定的孔中收获所有细胞，并将其转移到4℃的FAC洗涤缓冲剂中(FWB，1X PBS+2％FBS+0.5g NaN3)。将细胞以1500rpm沉淀5分钟，并除去上清液。在室温发生活力染色和Fc阻断。使用专有的PE缀合的抗CD6抗体克隆来检测CD6的表面水平，该抗体克隆不竞争伊立珠单抗结合。结果如图1所示。实验也在细胞系上进行(见图14)。
实施例2
使用流式细胞术在新鲜全血上分析伊立珠单抗治疗后患者的CD6表面水平
根据临床方案，在特定时间点从患者采集全血(WB)，并连夜运送，第二天进行分析。以9:1的比例(1X裂解缓冲剂：WB)裂解红细胞(RBC)。红细胞裂解后，将细胞重悬于染色缓冲剂中，并转移到染色板上，用于检测CD6表面水平。用专有的非竞争性抗CD6抗体克隆对细胞进行染色，并用PE进行荧光标记以测量细胞表面上CD6受体的总量。
实施例3
对正常健康志愿者的PBMC进行免疫表型分析以鉴别用伊立珠单抗治疗后免疫细胞群体的变化
用伊立珠单抗治疗后，从正常健康志愿者中采集全血，并通过密度梯度离心从WB中分离PBMC，并以标准方式冷冻保存。为了进行分析，将冷冻保存的PBMC解冻、洗涤并用靶向CD3、CD4、CD6、CD8、CD25、CCR6、HELIOS和FOXP3的抗体进行荧光标记，以通过流式细胞术来鉴别免疫细胞亚群的变化，例如幼稚T细胞、Teff和Treg细胞。
实施例4
通过使用Epiontis ID测量DNA中细胞类型特异性表观遗传学标志物来测定Treg细胞与CD4+细胞的比率
Epiontis ID通过使用qPCR测量细胞类型特异性表观遗传学标志物，能够准确计数细胞类型。来自用伊立珠单抗治疗的患者的冷冻保存的PBMC含有靶细胞和非靶细胞的混合物，通过亚硫酸氢盐序列转化仅在靶细胞中脱甲基的特定脱甲基DNA序列。纯化DNA，加入专门设计的仅扩增亚硫酸氢盐转化的靶标的PCR引物，进行qPCR。以下表观遗传学qPCR测定用于分析患者样本(测定/细胞类型)：FOXP3(Treg细胞)、CD4(CD4 T细胞)、CD8B(CD8 T细胞)，PD1阳性细胞，LRP5(B细胞)，LCN2(中性粒细胞)，MVD(NK细胞)，S1PR1阳性细胞、PRG2(嗜酸性粒细胞)、CBX6(记忆B细胞)、CCR7阳性细胞、S1PR5阳性细胞、IL17A(Th17细胞)。
实施例5
使用表面等离子体共振(SPR)分析了伊立珠单抗与低、中等、高密度CD6的结合特性
使用配备有链亲和素(SA)传感器芯片的Biacore 3000光学生物传感器，在25℃的HBS-P缓冲液系统(10mM HEPES pH 7.4、150mM NaCl和0.05％表面活性剂P20)中进行分析。将生物素化的重组人CD6捕获到传感器芯片的Fc2、Fc3和Fc4分别至低(7RU)、中等(55RU)和高(255RU)密度。这些密度类似于在T细胞上观察到的低、中等、高水平的CD6。
芯片表面 Rhu CD6(RU) 估计的CD6结合位点/μm2
低 7 120
中等 55 783
高 255 3493
在运行缓冲剂中使用3倍稀释液来制备范围为900nM或0.137nM的分析物浓度系列。以50uL/min的流速监测所有分析物浓度的缔合相240s，而以50uL/min的流速收集离解相1800s。用1M MgCl2以50uL/min的流速使表面再生15s。结果如图12A-12F和图13A-13F所示。
实施例6
伊立珠单抗诱导细胞表面CD6的裂解
PBMC用同种型或伊立珠单抗在37℃处理72小时。72小时后，收集细胞和上清液。
细胞缔合的CD6。通过流式细胞术分析细胞表面上的CD6水平。使用含有0.1％triton的RIPA缓冲液将细胞沉淀用于分离总蛋白。使用识别CD6的细胞外部分的特异性抗CD6抗体从上清液中免疫沉淀可溶性CD6。还通过MSD分析上清液中的可溶性CD6水平。
细胞上清液中的CD6。通过蛋白质印迹进一步分析免疫沉淀的上清液和细胞裂解物中的CD6水平。将蛋白质加载在4-12％ Nu-Page凝胶上，并转移到PVDF膜上。将膜用丽春红(Ponceau)染色，然后用一级抗体抗CD6或抗gapdh在4℃孵育过夜。第二天，膜用TBS+吐温进行洗涤，并用HRP缀合的二级抗体在RT孵育1h，再次用TBS+吐温进行洗涤，在加入HRP底物后，使用化学发光成像仪捕获信号。结果如图18A-18B和图19所示。
实施例7
单核细胞在伊立珠单抗诱导的CD6裂解中的作用
为了评估其他细胞类型对伊立珠单抗诱导的CD6裂解的贡献，通过负磁分离从PBMC中分离T细胞、单核细胞、NK细胞和B细胞。然后在单核细胞、NK细胞或B细胞存在下用同种型或伊立珠单抗处理分离的T细胞。在存在增加比率的T细胞与单核细胞的情况下，也用同种型或伊立珠单抗处理分离的T细胞。
处理后，通过流式细胞术使用不干扰伊立珠单抗结合的抗CD6检测抗体在T细胞表面上检测CD6的表面水平。结果如图20A-20B所示。图20A显示，只有在处理过程中存在单核细胞，以及在较小程度上存在NK细胞时，才能观察到T细胞上CD6的损失。图20B显示，随着单核细胞数量的增加，CD6的损失增加。
实施例8
伊立珠单抗对T细胞特性和功能的影响
96孔平底板在37℃用CD3+ALCAM(在PBS中)包被2小时。孵育2小时后，用1x PBS洗涤板一次，然后在37℃用5％BSA封闭30min。封闭后，用1xPBS洗涤板两次。
将冷冻的PBMC在完全RPMI中缓慢解冻。将细胞调节为2x10^6个细胞/ml。然后将细胞以200k个细胞/孔接种在100ul中。在完全培养基中以3x制备以3倍稀释曲线的伊立珠单抗。在96孔平底板中，最终测定体积为200ul。
将PBMC在37℃总共孵育24小时。将板离心旋转，其中收集上清液以检测细胞因子。然后收集细胞以检测CD4和CD8 T细胞上CD6的损失以及激活标志物的减少。使用非竞争性CD6抗体以通过流式细胞术评估CD6的损失。将CD6报告为几何平均荧光(gMFI)。结果如图21A-21E所示，这证明CD6的细胞表面水平降低与T细胞激活标志物CD71、PD-1、CD25、IL-2和TNFa的降低相关。
用同种型对照或伊立珠单抗处理PBMC 24小时以分别产生CD6高和CD6低细胞。24小时处理后，收集细胞并用培养基反复洗涤以去除残留的抗体处理物。对洗涤过的细胞进行计数，并将浓度调节至1x10^6个细胞/mL。
96孔平底板在37℃用PBS中的CD3+ALCAM包被2小时。孵育2小时后，用PBS洗涤板两次。将洗涤的CD6高和CD6低细胞以200k个细胞/孔接种并孵育24、48、72和96小时。在每个指定的时间点，使用流式细胞术通过转录因子的表面和细胞内染色来评估T细胞激活。结果如图22所示，这证明通过用伊立珠单抗初始孵育产生的CD6低细胞在随后用CD3+ALCAM刺激后不仅保持CD6低，而且更少的Teff样(例如，更少的Th1和Th17样)。相反，通过与同种型对照孵育产生的CD6高细胞在随后的刺激后其特征更多Teff样。
实施例9
伊立珠单抗降低T淋巴细胞的同种反应性
单向混合淋巴细胞反应用于评估伊立珠单抗在降低T细胞的同种反应性方面的效用。鉴定PBMC应答细胞和刺激细胞配对，并使用取下时的应答细胞计数作为读数。将应答PBMC解冻，用细胞追踪紫进行标记，并用同种型或伊立珠单抗预处理2小时。将刺激PBMC解冻并用丝裂霉素C处理20分钟以抑制增殖。在丝裂霉素C处理后，用培养基反复洗涤刺激PBMC。对应答和刺激PBMC进行计数，并在96孔U形底板中以1:1的比率与伊立珠单抗或同种型处理物混合。
大约96-168小时后，在刺激细胞存在的情况下刺激应答细胞。在每个时间点，收集细胞，并通过流式细胞术评估应答细胞的增殖和激活。结果如图23A-23D所示。在此，用伊立珠单抗处理的应答细胞表达较低水平的CD6(图23A)，增殖性较低，如168小时后较低的CD4+计数(图23B)和CD71水平所示(图23D)，并且较低的激活，如168小时后较低水平CD25所示(图23C)。
实施例10
伊立珠单抗可用于富集Treg淋巴细胞
相对于从CD6高T细胞产生Treg淋巴细胞，使用伊立珠单抗富集CD6低T细胞的能力作为测试从伊立珠单抗富集的CD6低T细胞产生Treg淋巴细胞的效用的基础。
CD6低和CD6高T细胞的产生。将冷冻的PBMC在完全RPMI中缓慢解冻。将总PBMC用同种型对照或伊立珠单抗在37℃处理24小时。24小时后收集细胞以确认CD4 T细胞上CD6的损失并分离幼稚T细胞。
从幼稚T细胞分化Treg 。用STEMCELL试剂盒富集如上所述处理的那些PBMC中的幼稚T细胞。为了从CD6低和CD6高分化Treg，将CD3/CD28激活剂与来自STEMCELL的Treg分化混合物组合添加总共7天。
Treg表型的确认。在Treg分化条件下7天后，收集CD6低和CD6高用于细胞内染色，并通过流式细胞仪捕获。细胞通过Foxp3和Helios的共表达得到证实。图24A-24B中的结果证明，用伊立珠单抗预处理PBMC富集了CD6低幼稚T细胞，其相对于用同种型对照预处理，可用于更有效地产生更高数量的Treg。
Treg抑制测定。在分化的第7天，收集CD6低和CD6高Treg。对Treg进行计数，并以100k、50k和25k接种，以产生1:1、1:2和1:4的三种比例。
T应答细胞的产生。将来自同一供体的冷冻PBMC缓慢解冻。针对为CD25-的CD4 T细胞对PBMC进行富集，将总共两个试剂盒组合以产生这些细胞。两个试剂盒均来自STEMCELL。一旦分离出这些细胞，就用细胞追踪紫标记细胞。
T应答细胞的刺激并与Treg共同培养。将T应答细胞添加到具有Treg的孔中。测试的条件是无刺激的和有不同水平的刺激。抑制测定在37℃总共培养4天。
计算T应答细胞的抑制。对用不同水平的刺激单独培养的T应答细胞针对其细胞追踪紫的增殖进行测量。传统的门控方法计算了对T应答细胞增殖的抑制。结果如图25所示。这里，在所有Treg与应答T细胞的比率，由CD6低幼稚T细胞产生的Treg相对于CD6高Treg具有增加的抑制活性；在1:1的Treg:T应答细胞比率下观察到最大的抑制。
这些观察结果证明，表面CD6的损失(由伊立珠单抗诱导)使幼稚T细胞分化为Treg，Treg具有更大的能力来抑制过度活跃和致病的免疫细胞功能，这有助于恢复免疫系统的平衡。
总之，用伊立珠单抗预处理幼稚T细胞导致具有增加的Foxp3和HELIOS共表达的Treg表型，并且已显示频率和MFI的这种增加与更大的抑制活性相关。
实施例11
从待移植组织中选择性富集CD6低/消耗CD6高细胞来预防有风险患者的GVHD
本领域技术人员将清楚如何使用已知方法与本公开的方法相组合，通过在移植前使用优化的抗CD6抗体从脐带血细胞或骨髓细胞或HLA匹配的兄弟细胞的群体中的CD6高细胞中剥离CD6来降低患者的GVHD风险。细胞可以在用优化的抗CD6抗体处理之前或之后离体扩增，以降低CD6的细胞表面表达，从而防止移植受体中的GVHD。
例如，伊立珠单抗可用于处理从正常足月分娩中获得的人类脐带血样品。脐带血单位可以是红细胞消耗的，并且可以在用抗-CD6抗体、抗原结合片段或融合抗-C％6抗体处理之前进行CD34+细胞的临床级选择。
可以将CD6剥离的样品施用给需要干细胞疗法并且有GVHD风险的患者。将测量一个或多个生物标志物，并密切监测患者的阳性和阴性临床应答。
用抗CD6抗体、其抗原结合片段或融合抗体预处理的祖细胞可用于在需要干细胞移植的患者中预防GVHD。在移植之前，脐带血移植物或骨髓移植物或HLA匹配的移植物用足以使移植的CD6量减少10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％或超过80％的量的伊立珠单抗进行处理。可以使用本领域已知的常规技术来监测CD6水平，例如通过细胞的FACS分析或从患者抽取的血液样品的血清分析。例如，本领域医师可以在不同的时间点从患者抽取血液样品，并通过进行FACS分析来确定细胞表面CD6的水平。本领域医师可以在向人类患者施用抗体、其抗原结合片段、ADC或能够结合CD6的可溶性配体(例如本文所述的抗CD6抗体)后评估GVHD的临床表现。
实施例12
伊立珠单抗效价测定
已经开发了一种通过CD6的损失来评估托立珠单抗功能性的效价测定。将PBMC以200k个细胞/孔接种在100ul中。在完全培养基中以3x制备以3倍稀释曲线的伊立珠单抗。在96孔平底板中，最终测定体积为200ul。
将PBMC在37℃总共孵育24小时。将板离心旋转，其中收集上清液以检测可溶性CD6。然后收集细胞以检测CD4和CD8 T细胞上CD6的损失。使用非竞争性CD6抗体以通过流式细胞术评估CD6的损失。将CD6报告为几何平均荧光(gMFI)。结果如图26A-26B所示。这里的结果证明，该测定是稳健和可重复的，对蛋白质浓度的变化显示出极好的灵敏性(见图26A)，并且足够灵敏，可以检测抗体Fc区内的变化(见图26B)。影响与CD6或Fc受体结合的mAb的变化将导致CD6的损失减少，因此可以作为伊立珠单抗批次效力的良好测量。
总之，伊立珠单抗以剂量依赖性和时间依赖性的方式诱导CD6的裂解，并且CD6损失的程度与T细胞激活和细胞因子表达的减少相关。在给药伊立珠单抗的患者中观察到CD6的损失，并且伊立珠单抗在多个供体之间以稳健的方式诱导裂解。如本文所示，CD6的裂解因此是药物效果的替代品，并且测量CD6裂解的体外测定提供了与临床相关的稳健且可重复的方法。
实施例13
用伊立珠单抗治疗的狼疮患者具有在CD4和CD8 T细胞上的CD6表达降低
分析伊立珠单抗治疗后SLE受试者(来自EQUALISE试验)的CD4和CD8 T细胞上的CD6的表面水平，并表示为CD6的平均荧光。虽然CD6的基线(给药前)水平在受试者之间是可变的，但在所有剂量之间都观察到表面CD6的损失(见图27A-27E)。在整个研究过程中，用较低剂量的伊立珠单抗(0.4mg/kg)治疗的受试者上的CD6表面水平变化更大。用更高剂量的伊立珠单抗(0.8–3.2mg/kg)治疗的受试者在最后一次剂量后数周保持低水平的CD6。箭头指示受试者何时接受伊立珠单抗剂量。虚线指示没有通过荧光减一(fluorescence minusone，FMO)对照测定的表面CD6。CD4 T细胞上CD6与基线相比显示的统计数据。共有N＝26名受试者被纳入五个剂量群组之间的分析。图28A-28B显示，CD4(图28A)和CD8(图28B)T细胞上的细胞表面CD6在第一剂量的伊立珠单抗后减少，并且观察到更高剂量的伊立珠单抗导致表面CD6的更大损失。数据以％基线(给药前)表示，并显示第15天(第一次剂量后的14天，第二次剂量前)。**p<0.01，*p<0.05。
实施例14
伊立珠单抗调节患者的Th17:Treg比率
从EQUIP研究中的受试者(4名受试者以0.8mg/kg给药，1名安慰剂受试者)中取样的PBMC使用epontisID进行免疫分型。如图29A-29B所示，与安慰剂相比，用0.8mg/kg的伊立珠单抗治疗导致Th17细胞的3倍减少，Treg细胞的2.5倍增加。
尽管本公开已经示出和描述了本公开的某些实施方案，但是对于本领域的技术人员来说显而易见的是，这些实施方案仅通过举例的方式提供。在不脱离本公开的情况下，本领域技术人员现在将会想到许多变化、改变和替代物。应当理解，在实践本公开时可以采用本文所描述的本公开的实施方案的各种替代方案。以下权利要求旨在限定本公开的范围，并且由此涵盖在这些权利要求及其等价物的范围内的方法和结构。
本文提及的所有专利、专利申请和出版物通过引用的方式全部并入本文。
尽管为了清楚理解的目的已经通过说明和举例的方式提供了一些细节的公开，但是对于本领域的技术人员来说显而易见的是，在不脱离本公开的精神或范围的情况下，可以实践各种改变和改进。因此，上述描述和实施例不应被解释为限制性的。
序列表
<110> 伊奎利厄姆股份有限公司（Equillium, Inc.）
<120> 选择性靶向CD6高细胞并降低TEFF细胞的活性的方法
<130> 330372-2066 EQIL-010/01WO
<150> US 63/121,567
<151> 2020-12-04
<160> 12
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 107
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体 - 人源化抗体序列
<400> 1
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Lys Ala Ser Arg Asp Ile Arg Ser Tyr
20 25 30
Leu Thr Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Thr Leu Ile
35 40 45
Tyr Tyr Ala Thr Ser Leu Ala Asp Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Gln Asp Tyr Ser Leu Thr Ile Ser Ser Leu Glu Ser
65 70 75 80
Asp Asp Thr Ala Thr Tyr Tyr Cys Leu Gln His Gly Glu Ser Pro Phe
85 90 95
Thr Leu Gly Ser Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys
100 105
<210> 2
<211> 119
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体 - 人源化抗体序列
<400> 2
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Lys Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Lys Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Lys Phe Ser Arg Tyr
20 25 30
Ala Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Arg Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ala Thr Ile Ser Ser Gly Gly Ser Tyr Ile Tyr Tyr Pro Asp Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Val Lys Asn Thr Leu Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Met Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Arg Asp Tyr Asp Leu Asp Tyr Phe Asp Ser Trp Gly Gln Gly
100 105 110
Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
115
<210> 3
<211> 357
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体 – 编码人源化抗体序列的多核苷酸
<400> 3
gaagtgcagc tggtggagtc tgggggaggc ttagtgaagc ctggagggtc cctgaaactc 60
tcctgtgcag cctctggatt caagtttagt agatatgcca tgtcttgggt tcgccaggct 120
ccggggaaga ggctggagtg ggtcgcaacc attagtagtg gtggtagtta catctactat 180
ccagacagtg tgaagggtcg attcaccatc tccagagaca atgtcaagaa caccctgtat 240
ctgcaaatga gcagtctgag gtctgaggac acggccatgt attactgtgc aagacgagat 300
tacgacctgg actactttga ctcctggggc caaggcaccc ttgtcaccgt ctcctca 357
<210> 4
<211> 321
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体 - 编码人源化抗体序列的多核苷酸
<400> 4
gacatccaga tgacccagtc tccatcctcc ctgtctgcat cggtgggaga cagagtcact 60
atcacttgca aggcgagtcg ggacattaga agctatttaa cctggtacca gcagaaacca 120
gggaaagctc ctaagaccct gatctattat gcaacaagct tggcagatgg ggtcccgtcg 180
agattcagtg gcagtggatc tgggcaagat tattctctca ccatcagcag cctggagtct 240
gacgatacag caacttacta ctgtctacaa catggtgaga gtccattcac gctcggctcg 300
gggaccaagc tggaaatcaa a 321
<210> 5
<211> 449
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体 - 人源化抗体序列
<400> 5
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Lys Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Lys Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Lys Phe Ser Arg Tyr
20 25 30
Ala Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Arg Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ala Thr Ile Ser Ser Gly Gly Ser Tyr Ile Tyr Tyr Pro Asp Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Val Lys Asn Thr Leu Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Met Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Arg Asp Tyr Asp Leu Asp Tyr Phe Asp Ser Trp Gly Gln Gly
100 105 110
Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe
115 120 125
Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu
130 135 140
Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp
145 150 155 160
Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu
165 170 175
Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser
180 185 190
Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro
195 200 205
Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys
210 215 220
Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro
225 230 235 240
Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser
245 250 255
Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp
260 265 270
Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn
275 280 285
Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val
290 295 300
Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu
305 310 315 320
Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys
325 330 335
Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr
340 345 350
Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr
355 360 365
Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu
370 375 380
Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu
385 390 395 400
Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys
405 410 415
Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu
420 425 430
Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly
435 440 445
Lys
<210> 6
<211> 214
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体 - 人源化抗体序列
<400> 6
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Lys Ala Ser Arg Asp Ile Arg Ser Tyr
20 25 30
Leu Thr Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Thr Leu Ile
35 40 45
Tyr Tyr Ala Thr Ser Leu Ala Asp Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Gln Asp Tyr Ser Leu Thr Ile Ser Ser Leu Glu Ser
65 70 75 80
Asp Asp Thr Ala Thr Tyr Tyr Cys Leu Gln His Gly Glu Ser Pro Phe
85 90 95
Thr Leu Gly Ser Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Arg Thr Val Ala Ala
100 105 110
Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser Gly
115 120 125
Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala
130 135 140
Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser Gln
145 150 155 160
Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser
165 170 175
Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val Tyr
180 185 190
Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys Ser
195 200 205
Phe Asn Arg Gly Glu Cys
210
<210> 7
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体 - 人源化抗体序列
<400> 7
Gly Phe Lys Phe Ser Arg Tyr Ala Met Ser
1 5 10
<210> 8
<211> 17
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体 - 人源化抗体序列
<400> 8
Thr Ile Ser Ser Gly Gly Ser Tyr Ile Tyr Tyr Pro Asp Ser Val Lys
1 5 10 15
Gly
<210> 9
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体 - 人源化抗体序列
<400> 9
Arg Asp Tyr Asp Leu Asp Tyr Phe Asp Ser
1 5 10
<210> 10
<211> 11
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体 - 人源化抗体序列
<400> 10
Lys Ala Ser Arg Asp Ile Arg Ser Tyr Leu Thr
1 5 10
<210> 11
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体 - 人源化抗体序列
<400> 11
Tyr Ala Thr Ser Leu Ala Asp
1 5
<210> 12
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体 - 人源化抗体序列
<400> 12
Leu Gln His Gly Glu Ser Pro
1 5

Claims (44)

1.一种用于在患有自身免疫性、免疫炎症性或炎症性疾病、移植物抗宿主病(GVHD)或器官移植排斥反应的人类受试者中测定伊立珠单抗的最佳用药量的方法，包括：
(a)测定来自受试者的组织样品中的细胞表面CD6水平的基线，其中组织样品包括T淋巴细胞，并且任选地定义受试者中的细胞表面CD6的目标水平；
(b)向受试者施用一系列的两个或三个或更多个用药量的伊立珠单抗，任选地增加用药量；
(c)在一系列的用药量之间监测来自受试者的组织样品中的细胞表面CD6水平，其中组织样品包括T淋巴细胞；
(d)如果步骤(c)中的细胞表面CD6水平为来自(a)的基线的约5、10、15、20、25、30、40、45或50％或小于约5、10、15、20、25、30、40、45或50％，或者在来自(a)的任选目标水平的约5、10、15或20％或小于约5、10、15或20％之内，并且如果在一系列的用药量之间没有观察到细胞表面CD6水平的进一步减少，则将来自一系列的用药量的最低用药量鉴定为最佳用药量。
2.权利要求1所述的方法，包括测定来自受试者的组织样品中CD4细胞和/或CD8细胞上的细胞表面CD6水平。
3.权利要求1或2所述的方法，其中组织样品是血液样品。
4.权利要求1-3中任一项所述的方法，包括基于疾病的临床参数或症状来定义受试者中的细胞表面CD6的目标水平。
5.一种用于治疗有需要的人类受试者的自身免疫性、免疫炎症性或炎症性疾病、移植物抗宿主病(GVHD)或器官移植排斥反应的给药方案，包括：
(a)测定来自受试者的组织样品中的细胞表面CD6水平的基线，其中组织样品包括T淋巴细胞，并且任选地定义受试者中的细胞表面CD6的目标水平；
(b)向受试者施用一定用药量的伊立珠单抗，其将受试者中的T淋巴细胞中的细胞表面CD6水平降低至来自(a)的基线的约5、10、15、20、25％或小于约5、10、15、20、25％；
(c)监测来自受试者的组织样品中的细胞表面CD6水平，其中组织样品包括T淋巴细胞；和
(d)在以下情况之前或如果是以下情况，向受试者施用进一步用药量的伊立珠单抗：(c)中的细胞表面CD6水平恢复到来自(a)的基线的约25、30、35、40、45、50、55、60、65、70或75％或大于约25、30、35、40、45、50、55、60、65、70或75％，或者升高到大约或高于来自(a)的目标水平。
6.权利要求5所述的给药方案，其将来自受试者的T淋巴细胞(任选地CD4和/或CD8细胞)中的细胞表面CD6水平维持在来自(a)的基线的约40、45、50、55、60、65、70或75％或小于约40、45、50、55、60、65、70或75％，或者在来自(a)的任选目标水平的约5、10、15或20％之内，任选地基于疾病的临床参数或症状来定义受试者中的细胞表面CD6的目标水平。
7.一种用于治疗有需要的人类受试者的自身免疫性、免疫炎症性或炎症性疾病、移植物抗宿主病(GVHD)或器官移植排斥反应的给药方案，包括：
(a)测定来自受试者的血液样品中的CD6高T淋巴细胞的基线水平，并且任选地定义CD6高T-淋巴细胞的目标水平；
(b)向受试者施用一定用药量的伊立珠单抗，其将受试者中的CD6高T淋巴细胞的水平减少至来自(a)的基线的约5、10、15、20、25、30或40％或小于约5、10、15、20、25、30或40％；
(c)监测来自受试者的血液样品中的CD6高T淋巴细胞的水平；和
(d)在以下情况之前，向受试者施用进一步用药量的伊立珠单抗：来自(c)的CD6高T淋巴细胞的水平恢复到来自(a)的基线水平的约25、30、35、40、45、50、55、60、65、70或75％或大于约25、30、35、40、45、50、55、60、65、70或75％，或升高到大约或高于来自(a)的目标水平，任选地基于疾病的临床参数或症状来定义受试者中CD6高T淋巴细胞的目标水平。
8.权利要求5所述的给药方案，其将受试者中的CD6高T淋巴细胞的水平维持在来自(a)的基线水平的约45、50、55、60、65、70或75％或小于约45、50、55、60、65、70或75％，任选地其中T淋巴细胞是CD4细胞和/或CD8细胞。
9.权利要求5-8中任一项所述的给药方案，其将受试者中的CD6高:CD6低T淋巴细胞的比率相对于对照或标准或基线降低约或至少约10、20、30、40、50、60、70、80、90、100、200、300、400、500％或更多或者降低约或至少约1.5、2、3、4、5、6、7、8、9、10倍或更多，任选地其中T淋巴细胞是CD4细胞和/或CD8细胞。
10.权利要求5-8中任一项所述的给药方案，其将受试者中的Teff:Treg细胞的比率相对于对照或标准或基线降低约或至少约10、20、30、40、50、60、70、80、90、100、200、300、400、500％或更多或者降低约或至少约1.5、2、3、4、5、6、7、8、9、10倍或更多，任选地CD4细胞和/或CD8细胞，任选地其中Teff细胞是Th17细胞。
11.一种预防或缓解人类移植患者的移植物抗宿主病(GVHD)的方法，包括：
(a)将移植组织与抗CD6抗体孵育足以减少移植组织中CD6高T淋巴细胞上的CD6的细胞表面水平的时间，所述抗CD6抗体任选地为伊立珠单抗；和
(b)将移植组织移植到患者中。
12.权利要求11所述的方法，包括在步骤(a)之前和之后测定移植组织中T淋巴细胞上的CD6的细胞表面水平，并且如果在步骤(a)之后CD6的细胞表面水平相对于在步骤(a)之前减少约或至少约10、20、30、40、50、60、70、80、90、100、200、300、400、500％或更多，则执行步骤(b)。
13.权利要求11或12所述的方法，其中移植组织包括脐带血细胞、骨髓细胞、外周血细胞、动员的外周血细胞、间充质干细胞、造血干细胞、从干细胞/祖细胞分化的细胞、工程化的细胞(任选地嵌合抗原受体(CAR)细胞)或所述细胞的任何组合。
14.权利要求11-13中任一项所述的方法，其中移植组织对于人类移植患者是自体的。
15.权利要求11-13中任一项所述的方法，其中移植组织对于人类移植患者是同种异体的。
16.一种用于治疗或缓解有需要的人类患者的自身免疫性、免疫炎症性或炎症性疾病的方法，包括：
(a)将移植组织与抗CD6抗体孵育足以减少移植组织中CD6高T淋巴细胞上的CD6的细胞表面水平的时间，从而产生富含CD6低T淋巴细胞的移植组织，所述抗CD6抗体任选地为伊立珠单抗；
(b)将来自(a)的移植组织处理足以从CD6低T淋巴细胞产生Treg淋巴细胞的时间；以及
(c)将来自(c)的移植组织移植到患者内。
17.权利要求16所述的方法，包括在步骤(a)之前和之后测定移植组织中T淋巴细胞上的CD6的细胞表面水平，并且如果在步骤(a)之后CD6的细胞表面水平相对于在步骤(a)之前减少约或至少约10、20、30、40、50、60、70、80、90、100、200、300、400、500％或更多，则执行步骤(b)。
18.权利要求16或17所述的方法，其中(b)包括将富含CD6低T淋巴细胞的移植组织与细胞因子、生长因子和转录因子的组合孵育足以产生Treg淋巴细胞的时间。
19.权利要求16-18中任一项所述的方法，其中移植组织包括脐带血细胞、骨髓细胞、外周血细胞、动员的外周血细胞、间充质干细胞、造血干细胞、从干细胞/祖细胞分化的细胞、工程化的细胞(任选嵌合抗原受体(CAR)细胞)或所述细胞的任何组合。
20.权利要求16-19中任一项所述的方法，其中移植组织对于人类患者是自体的。
21.权利要求16-19中任一项所述的方法，其中移植组织对于人类患者是同种异体的。
22.一种用于治疗有需要的人类受试者的自身免疫性、免疫炎症性或炎症性疾病、移植物抗宿主病(GVHD)或器官移植排斥反应的方法，包括：
(a)向受试者施用伊立珠单抗；和
(b)测定来自受试者的组织样品中的T淋巴细胞上细胞表面CD6的水平，测定来自受试者的组织样品中的CD6高和任选地CD6低T淋巴细胞的水平，和/或测定受试者中Teff和Treg细胞的水平，其中组织样品包括T淋巴细胞；
其中伊立珠单抗的施用减少以下中的一项或多项：(i)T淋巴细胞、任选地CD4和/或CD8细胞上细胞表面CD6的水平；(ii)受试者中CD6高T淋巴细胞的水平；(iii)受试者中CD6高:CD6低T淋巴细胞的比率；和/或(iv)受试者中Teff:Treg细胞的比率，从而减少受试者中的致病性免疫应答。
23.权利要求22所述的方法，其中伊立珠单抗的施用：
将受试者中的T淋巴细胞上细胞表面CD6水平相对于对照或标准或基线降低约或至少约10、20、30、40、50、60、70、80、90、100、200、300、400、500％或更多，任选地其中T淋巴细胞是CD4细胞和/或CD8细胞；
将受试者中的CD6高T淋巴细胞的水平相对于对照或标准或基线降低约或至少约10、20、30、40、50、60、70、80、90、100、200、300、400、500％或更多，任选地其中T淋巴细胞是CD4细胞和/或CD8细胞；
将受试者中的CD6高:CD6低T淋巴细胞的比率相对于对照或标准或基线降低约或至少约10、20、30、40、50、60、70、80、90、100、200、300、400、500％或更多或者降低约或至少约1.5、2、3、4、5、6、7、8、9、10倍或更多，任选地其中T淋巴细胞是CD4细胞和/或CD8细胞；和/或
将受试者中的Teff:Treg细胞的比率相对于对照或标准或基线降低约或至少约10、20、30、40、50、60、70、80、90、100、200、300、400、500％或更多或者降低约或至少约1.5、2、3、4、5、6、7、8、9、10倍或更多，任选地其中Teff细胞是Th17细胞。
24.一种用于分析试验批次的伊立珠单抗的体外基于细胞的方法，包括
(a)将测试批次的伊立珠单抗与在细胞表面上表达CD6的细胞孵育；
(b)测量细胞上的细胞表面CD6表达；和
(c)如果测试批次相对于对照或标准降低细胞表面CD6表达，则配制测试批次的伊立珠单抗作为药物组合物，并且如果测试批次相对于对照或标准没有降低细胞表面CD6表达，则拒绝测试批次的伊立珠单抗。
25.权利要求24所述的方法，其中(b)包括通过流式细胞术、飞行时间细胞术(CyToF)、细胞ELISA或免疫荧光显微术来直接测量细胞表面CD6表达，或其中(b)包括任选地通过酶联免疫吸附测定(ELISA)、化学发光测定、电化学发光测定、高效液相色谱、蛋白质印迹或免疫沉淀后进行蛋白质印迹，测量上清液中的可溶性CD6作为细胞表面CD6表达的指征。
26.权利要求24或25所述的方法，其中细胞包括外周血单核细胞(PBMC)。
27.权利要求24-26中任一项所述的方法，其中细胞包括人T细胞系或经工程化以表达CD6、任选地人CD6的细胞系。
28.权利要求27所述的方法，其中细胞系选自MOLT-4、MOLT-3、MOLT-16、HuT 78、HuT102、Jurkat、Jurkate NFAT、CCRF-CEM、12.1、MJ(G11)、LOUCY、SUP-T1、HEL.92.1.7、EF0-21、RPMI-8226、HPB-ALL、HH、KE37、P12ICHIKAWA、PEER、ALLSIL、RPMI8402、CMLT1、PF382、EHEB和DU4475细胞。
29.权利要求24-28中任一项所述的方法，其中细胞包括单核细胞，任选地单核细胞系。
30.权利要求29所述的方法，其中单核细胞系选自U937、THP1、MC-1010、TUR、AML-193和MV-4-11。
31.权利要求27-30中任一项所述的方法，其中(a)人T细胞系或经工程化以表达CD6的细胞系和(b)单核细胞，任选地单核细胞系，以约30:1、25:1、20:1、15:1、10:1、5:1、4:1、3:1、2:1、1:1、1:2、1:3、1:4、1:5或1:10的比率存在。
32.权利要求24-31中任一项所述的方法，包括如果试验批次的伊立珠单抗将细胞表面CD6表达相对于对照或标准降低约或至少约10、20、30、40、50、60、70、80、90、100、200、300、400、500％或更多和/或如果试验批次的伊立珠单抗将上清液中的可溶性CD6相对于对照或标准增加约或至少约10、20、30、40、50、60、70、80、90、100、200、300、400、500％或更多，则将所述试验批次的伊立珠单抗配制为药物组合物。
33.一种筛选用作生物治疗剂的抗CD6抗体或其抗原结合片段的方法，包括：
(a)将候选抗CD6抗体或其抗原结合片段与在细胞表面上表达CD6的细胞孵育；
(b)测量细胞上的细胞表面CD6表达；和
(c)如果候选抗CD6抗体或其抗原结合片段相对于对照或标准降低细胞表面CD6表达，则将其配制为药物组合物。
34.权利要求21所述的方法，其中(b)包括通过流式细胞术、飞行时间细胞术(CyToF)、细胞ELISA或免疫荧光显微术来直接测量细胞表面CD6表达，或其中(b)包括任选地通过酶联免疫吸附测定(ELISA)、化学发光测定、电化学发光测定、高效液相色谱、蛋白质印迹或免疫沉淀后进行蛋白质印迹，测量上清液中的可溶性CD6作为细胞表面CD6表达的指征。
35.权利要求33或34所述的方法，其中细胞包括外周血单核细胞(PBMC)。
36.权利要求33-35中任一项所述的方法，其中细胞包括人T细胞系或经工程化以表达CD6、任选地人CD6的细胞系。
37.权利要求36所述的方法，其中细胞系选自MOLT-4、MOLT-3、MOLT-16、HuT 78、HuT102、Jurkat、Jurkate NFAT、CCRF-CEM、12.1、MJ(G11)、LOUCY、SUP-T1、HEL.92.1.7、EF0-21、RPMI-8226、HPB-ALL、HH、KE37、P12ICHIKAWA、PEER、ALLSIL、RPMI8402、CMLT1、PF382、EHEB和DU4475细胞。
38.权利要求33-37中任一项所述的方法，其中细胞包括单核细胞，任选地单核细胞系。
39.权利要求38所述的方法，其中单核细胞系选自U937、THP1、MC-1010、TUR、AML-193和MV-4-11。
40.权利要求33-39中任一项所述的方法，其中(a)人T细胞系或经工程化以表达CD6的细胞系和(b)单核细胞，任选地单核细胞系，以约30:1、25:1、20:1、15:1、10:1、5:1、4:1、3:1、2:1、1:1、1:2、1:3、1:4、1:5或1:10的比率存在。
41.权利要求33-40中任一项所述的方法，包括如果候选抗CD6抗体或其抗原结合片段将细胞表面CD6表达相对于对照或标准降低约或至少约10、20、30、40、50、60、70、80、90、100、200、300、400、500％或更多和/或如果候选抗CD6抗体或其抗原结合片段将上清液中的可溶性CD6相对于对照或标准增加约或至少约10、20、30、40、50、60、70、80、90、100、200、300、400、500％或更多，则将所述果候选抗CD6抗体或其抗原结合片段配制为药物组合物。
42.权利要求1-23中任一项所述的方法或给药方案，其中患有自身免疫性、免疫炎症性或炎症性疾病的受试者或患者相对于标准或健康受试者具有增加的Teff:Treg细胞的比率，任选地其中Teff细胞是Th17细胞。
43.权利要求42所述的方法或给药方案，其中Teff:Treg细胞的比率相对于所述标准或健康受试者增加约或至少约1.5、2、3、4、5、6、7、8、9或10倍或更多。
44.权利要求1-23或42-43中任一项所述的方法或给药方案，其中自身免疫性、免疫炎症性或炎症性疾病是：炎症性肠病(IBD)，任选地克罗恩病或溃疡性结肠炎；系统性红斑狼疮(SLE)，任选地伴有狼疮性肾炎的SLE；类风湿性关节炎(RA)；多发性硬化症(MS)；银屑病；银屑病关节炎；强直性脊柱炎或哮喘。
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