KR20060088104A

KR20060088104A - Ｐ-셀렉틴 당단백질 리간드 1의 모듈레이터

Info

Publication number: KR20060088104A
Application number: KR1020067005222A
Authority: KR
Inventors: 롱-화 린; 충 난 창
Original assignee: 압제노믹스 코포레이션
Priority date: 2003-09-15
Filing date: 2004-09-09
Publication date: 2006-08-03
Also published as: AU2004273807A1; EP1663290A4; TW200513262A; BRPI0414402A; IL174172A; CA2538284A1; SG146670A1; CA2538284C; NO20061306L; AU2004273807B2; TWI359024B; RU2006112399A; ECSP066507A; JP2007533618A; KR101159140B1; UA91004C2; JP5808879B2; IL174172A0; CN1852730A; EP1663290A2

Abstract

본 발명의 T 세포나 자연 살상(NK) 세포의 표면에서 P-셀렉틴 당단백질 1(PSGL-1)에 결합하는 다중 화합물은, T 세포 또는 NK 세포의 고갈 및/또는 그의 세포자살 유도에 사용될 수 있다. 본 발명의 다중 화합물 및 방법은 염증 질환, 자가면역 질환, 이식 거부반응 및 알레르기성 질환과 같은 불필요한 매개성 면역반응을 조절하는데 사용될 수 있다.

다중 화합물, T 세포, NK 세포, 세포자살, 고갈

Description

Ｐ-셀렉틴 당단백질 리간드 1의 모듈레이터{MODULATORS OF P-SELECTIN GLYCOPROTEIN LIGAND 1}

본 발명은 면역반응을 조절하기 위한 조성물 및 방법에 관한 것이다.

염증 질환, 자가면역 질환, 이식 거부반응, 알레르기성 질환 및 T 세포성 암과 같은 질환들을 치료하는데, 핵심적인 사항은 원하지 않는 면역반응들을 통제하는 것이다. 과도하게 공격적인 T 세포 활성은, 면역억제나 면역학적 관용의 유발을 통해 조절할 수 있다. 관용은 면역 시스템이 항원에 대해 무반응성인 상태로 정의되며, 면역억제는 항원에 대한 면역 반응이 감소되는 것을 의미하는 것으로, 일반적으로 약물의 계속적인 사용이 요구된다. 기관 이식시, T 세포는 동종항원(alloantigen)에 대한 면역 반응에서 중요한 역할을 수행한다. 현재, 면역억제 요법에서는 일반적으로 코르티코스테로이드(corticosteroid), 사이클로스포린(cyclosporin) 또는 라파마이신(rapamycin)이 사용되고 있으며, 이들은 T 세포에 대한 주된 성장 인자인 IL-2의 전사를 차단하거나, 또는 IL-2 의존적 증식을 저해한다. 그러나, T 세포-고갈성 물질(예, CD3, CD4, CD8), 사이토카인 시그널링 저해자 또는 T 세포의 공동-자극 경로 저해자(CD25, B7-1, B7-2, CD152, CTLA4))로서 작용하는 다수의 단일클론 항체는, 제한된 부작용 또는 독성을 동반한 거부반응의 발생률을 감소시킨다는 점에서, 그 유효성이 입증되었다. 이들 물질중 일부는 자가면역질환의 치료 및 이식 생존율 연장에 어느 정도 성공을 거두는 것으로 확인되었다.

세포자살(Apoptosis)은 면역 시스템의 적절한 기능과 불필요한 세포를 제거하기 위한 주된 매커니즘의 유지에 매우 중요한 것으로 여겨지고 있다(Kabelitz et al. Immunol. Today 14: 338-340(1993); Raff, Nature: 356 : 397-399(1992)). 세포 내부 또는 외부로부터 유래된 여러가지 신호들은, 세포의 생존과 사멸에 영향을 미친다. Fas(또는 CD95, MW = 43 kD), TNFR2(MW = 75 kD), CD2(MW = 45 kD) 및 CTLA-4(MW = 33 kD)와 같은 T 세포의 표면 분자에 대한 항체는, T 세포의 세포자살을 유도한다(Osborne, Curr. Opin. Immunol. 8: 245- 248(1996); Lin et al. J. Immunol. 158 : 598-603(1997); Zhang et al. Nature: 377: 348- 350(1995); Lai et al. Eur. J. Immunol. 25: 3243-3248(1995); Mollereau et al. J. Immunol. 156: 3184-3190(1996); Gribben et al. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 92: 811- 815(1995)). 불필요한 T 세포를 통제하기 위해 Fas 및 TNFR2 분자들을 사용하고자 하는 시도들은, 상기 2종의 분자들이 단지 면역 세포뿐만 아니라 간과 같이 일부 다른 주요 장기에서도 발현된다는 점으로 인해 제한되었다. 이러한 발현 패턴은 잠재적으로 이들 2종의 항체를 치료학적으로 적용하는 것을 제한한다(Ogasawara et al. Nature 364: 806-809(1993); Pfeffer et al. Cell : 73: 457- 467(1993); Engelmann et al. J. Biological Chemistry 265: 14497-14504 (1990)).

셀렉틴(Selectin), 인테그린(integrin) 및 면역글로불린(Ig)의 슈퍼패밀리계 일원들은, 백혈구와 혈소판간의 상호작용이나 또는 백혈구와 혈소판의 세포외 기질 및 혈관 내피와의 상호작용에 중요한, 3가지 주된 분류이다(Springer, Nature 346: 425(1990); Osborn, Cell 62: 3(1990); Hynes, Cell 69: 11(1992) ). 하나의 세포 타입에 대한 부착 분자는, 종종 여러가지 세포 타입에서 발현된 다른 부착 분자에 결합하여, 리간드-리셉터 쌍을 형성한다.

셀렉틴 패밀리는, P-셀렉틴(또한, CD62, CD62P, GMP140 및 PADGEM로 통용됨), E-셀렉틴(또한, ELAM-1 및 CD62E로 통용됨), 및 L-셀렉틴(또한, LECAM-1, Mel-14, LAM-1 및 CD62L로 통용됨)로 구성된다. 이들 셀렉틴은 매우 상동적이며, 120개의 아미노산으로 이루어진 N-말단 렉틴 도메인, EGF계 도메인, 보체 조절성 단백질(complement regulatory protein)에서 발견되는 것과 상보적인 다양한 갯수의 다중 SCR(short consensus repeat) 도메인과, 막관통 도메인 및 짧은 세포질 꼬리로 구성되어 있다(Siegelman et al., Science 243: 1165-1172(1989) ; Lasky et al., Cell 56: 1045-1055(1989); Tedder et al., J. Exp. Med. 170: 123-133(1989); Johnson et al., Cell 56: 1033-1044(1989); Bevilacqua et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 84: 9238-9242(1987), Bevilacqua et al., Science 243: 1160-1165(1989), Bevilacqua et al., J. Clin. Invest. 91: 379-387 (1993), Camerini et al., Nature 280: 496-498(1989)). 셀렉틴은 중첩되면서도 세포의 표면 리셉터에 대해 구별되는 특이성을 가지고 있다(Bevilacqua et al., J. Clin. Invest. 91: 379-387(1993); Feize, Current Opinion in Struct. Biol. 3: 701-710(1993); Berg et al., Biochem. Biophys. Res. Comm. 184: 1048-1055(1992); Foxall et al., J. Cell Biol. 117: 895-902(1992); Larsen et al., J. Biol. Chem. 267: 11104-11110(1992); Polley et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88: 6224-6228(1991)).

P-셀렉틴, E-셀렉틴 및 L-셀렉틴은 염증 과정중에 제일 먼저 백혈구-내피세포와 혈소판-백혈구의 부착성 상호작용을 매개한다(Bevilacqua et al., 1993, supra). 이들 3종의 셀렉틴은, 백혈구의 활성화된 내피와의 초기 "롤링(rolling)" 상호작용에 참여하는 것으로 입증되었다(von Andrian et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88: 7538-7542(1991); Ley et al., Blood 77: 2553-2555(1991); Abassi et al., J. Clin. Invest. 92: 2719-2730(1993); Dore et al., Blood 82: 1308-1316(1993); Jones et al., Biophys. J. 65: 1560-1569(1993); Mayadas et al., Cell 74: 541-554(1993)). 활성화된 혈소판과 내피 세포에서 발현된 P-셀렉틴은, 대부분의 백혈구의 세포 표면 단백질에 결합한다(McEver et al., J. Biol. Chem. 250: 9799-9804(1984); Hsu-Lin et al., J. Biol. Chem. 264: 8121-9126(1984)). 사이토킨에 의해 활성화된(예, TNF-알파 또는 IL-1 자극 후 6-8시간 동안) 내피 세포에서 발현된 E-셀렉틴은, 대부분의 백혈구의 세포 표면 단백질에 결합한다(McEver et al., J. Clin. Invest. 100: 485-492(1997); Bevilacqua et al., 1987, supra; Bevilacqua et al., 1989, supra). 대부분의 백혈구에서 발현되는 L-셀렉틴은, 일부 내피 세포와 다른 백혈구의 세포 표면 단백질에 결합한다(Gallatin et al., Nature 304: 30-34(1983); Berg et al., Immunol. Rev. 108: 5-18(1989); Berg et al., J. Cell. Biol. 114: 343-349(1991); Hallman et al., Biochem. Biophys. Res. Comm. 174: 236-243(1991); Smith et al., J. Clin. Invest. 87: 609-618(1991); Spertini et al., J. Immunol. 147: 2565-2573 (1991)). 3종의 셀렉틴 모두, 발현이 대체적으로 백혈구, 특히 T 세포 및 NK 세포로 한정되는 세포의 표면 단백질인 PSGL-1에 결합하는 것으로 알려져 있다. PSGL-1의 번역후 수정은 P-셀렉틴, E-셀렉틴 및 L-셀렉틴과의 결합에 필수적이다(McEver et al., J. Clin. Invest., 1997, supra).

발명의 개시

본 발명은 T 세포의 표면 항원인 P-셀렉틴 당단백질 리간드-1(PSGL-1)를 사용함으로써 T 세포를 고갈시킬 수 있으며/있거나 세포자살로 진행되도록 유도할 수 있다는 발견을 근간으로 한다. 특히, T 세포의 고갈은 과도하거나 불필요한 T 세포 매개성 면역반응과 관련된 증상의 치료나, 또는 과도하거나 불필요한 T 세포 증식과 관련된 증상의 치료에 유용할 수 있다. 예컨대, T 세포의 고갈로 염증성 질환, 자가면역 질환, 이식 거부반응, 알레르기 질환 및/또는 T 세포성 암과 관련된 부적절한 T 세포 활성이나 증식을 감소 또는 제거할 수 있다. 본 발명은 T 세포 매개성 면역반응을 방지 또는 감소시키기 위한 PSGL-1 기능의 모듈레이터를 이용하는 방법 및 PSGL-1 기능의 모듈레이터의 스크리닝 방법을 포함한다.

본 발명의 일측면은, 개체의 T 세포 매개성 면역반응을 방지 또는 감소시키는 방법에 관한 것이다. 상기 방법은 하기 단계를 포함한다: 과도하거나 또는 불필요한 T 세포 매개성 면역반응을 특징으로 하는 증상을 가지거나, 상기 증상을 가질 위험이 있을 것으로 진단된 개체를 선별하는 단계; 및 T 세포 표면상에서 PSGL-1에 결합하는 다중 화합물(multimeric compound)을 상기 개체에게 투여하는 단계로서, T 세포의 표면에서 상기 다중 화합물이 PSGL-1 단백질에 결합함으로써 T 세포 사멸을 초래하는 신호 전달 경로가 유도되고, 그에 따라 개체의 T 세포 매개성 면역반응이 방지 또는 감소된다.

이러한 방법에 사용된 화합물로는, 항체. 또는 PSGL-1에 특이적으로 결합하는 그것의 항원 결합성 단편을 포함할 수 있다. 일 예로, 상기 화합물은 PSGL-1에 특이적으로 결합하는 단일클론 항체이다. 일 예로, 상기 방법은 단일클론 항체에 결합하며, T 세포의 표면에서 복수의 PSGL-1 항원과 가교 결합을 유도하는 물질을 투여하는 추가적인 단계를 포함한다.

일부 예들에서, 상기 방법은 T 세포의 표면에서 복수개의 PSGL-1 항원과의 가교 결합을 유도하는 단계를 포함하며, 상기 가교 결합은 T 세포의 사멸을 발생시키는 신호 전달 경로를 유도한다.

일부 예들에서, 상기 방법은 다음의 단계를 포함한다: (i) 과도하거나 또는 불필요한 T 세포 매개성 면역반응을 특징으로 하는 증상을 가지거나, 상기 증상을 가질 위험이 있을 것으로 진단된 개체를 선별하는 단계; 및 (ii) T 세포 표면상에서 적어도 2개의 PSGL-1에 결합하는 다중 화합물을 상기 개체에게 투여하는 단계로서, 상기 다중 화합물은 각각 (a) PSGL-1에 결합하는 결합성 도메인과 (b) 이종의 아미노산 서열을 포함하는 두개의 폴리펩티드 체인을 포함하며, 상기 폴리펩티드 체인들은 이종의 아미노산 서열을 통해 연결되어 다중 화합물을 형성하며, T 세포 표면에서 상기 다중 화합물이 적어도 2개의 PSGL-1 단백질에 결합함으로써 T 세포 사멸을 초래하는 신호 전달 경로가 유도되고, 그에 따라 개체의 T 세포 매개성 면역반응이 방지 또는 감소되는 단계.

상기 다중 화합물은 동형-다중 화합물(homo-multimeric compound) 또는 이형-다중 화합물(hetero-multimeric compound)일 수 있다. 상기 결합성 도메인은, 선택적으로, P-셀렉틴의 세포외 도메인 또는 그것의 PSGL-1-결합성 단편, E-셀렉틴의 세포외 도메인 또는 그것의 PSGL-1-결합성 단편, L-셀렉틴의 세포외 도메인 또는 그것의 PSGL-1-결합성 단편, 항-PSGL-1 항체 또는 그것의 PSGL-1-결합성 단편, 파지 디스플레이 라이브러리(phage display library)로부터 선택된 PSGL-1 결합성 폴리펩티드, 또는 이들의 임의의 조합을 포함할 수 있다.

특정 예에서, 상기 다중 화합물은 항-PSGL-1 항체 또는 PSGL-1에 결합하는 항체 단편을 함유하지 않는다.

상기 이종의 아미노산 서열은, 선택적으로 임의의 세포 표면 리셉터에 대한 결합 부위, 예컨대 면역글로불린의 중쇄 불변 부위(immunoglobulin heavy chain constant region)를 포함할 수 있다. 일부 예들에서, 상기 폴리펩티드 체인은 상기 이종의 아미노산 서열을 통해 공유결합, 예컨대 이황화 결합으로 결합하여 다중 화합물을 형성한다.

특정 예에서, 상기 방법은 이종의 아미노산 서열을 통해 다중 화합물에 결합하며, T 세포의 표면에서 복수개의 PSGL-1 항원의 가교 결합을 유도하는 물질을 개체에게 투여하는 추가적인 단계를 포함할 수 있다.

일부 예들로, 본원에 기재된 방법은 자가면역 질환을 가지는 것으로 진단된 개체를 선별하는 단계를 포함한다. 다른 예로, 상기 방법은 염증성 질환을 가지는 것으로 진단된 개체를 선별하는 단계를 포함한다. 다른 예로, 상기 방법은 동종 이식 또는 이종 이식을 받았거나 받을 개체를 선별하는 단계를 포함한다. 다른 예로, 상기 방법은 알레르기성 질환을 가지는 것으로 진단된 개체를 선별하는 단계를 포함한다. 다른 예로, 상기 방법은 T 세포 암을 가지는 것으로 진단된 개체를 선별하는 단계를 포함한다.

일부 예들에서, T 세포는 활성화된 T 세포이다. 일 예로, 상기 T 세포는 CD4+ T 세포이다. 다른 예로, 상기 T 세포는 CD8+ T 세포이다.

일부 예들에서, 상기 방법은 화합물(예, 다중 화합물)을 투여하기 전에 개체에서 채취한 제1 생물학적 샘플에서 T 세포의 수를 검출하는 단계 및 상기 화합물(예, 다중 화합물)을 투여한 이후에 개체에서 채취한 제2 생물학적 샘플의 T 세포 수와 비교하는 단계를 포함한다.

일부 예들에서, 상기 방법은 화합물(예, 다중 화합물)을 투여하기 전에 개체에서 채취한 제1 생물학적 샘플에서 T 세포의 생물학적 활성을 검출하는 단계 및 상기 화합물(예, 다중 화합물)을 투여한 이후에 개체에서 채취한 제2 생물학적 샘플의 T 세포의 생물학적 활성과 비교하는 단계를 포함한다.

일부 예들에서, 상기 투여로 개체의 활성화된 T 세포가 적어도 10% 고갈된다. 일부 예들에서, 투여시 개체에서 활성화된 T 세포는 적어도 10%, 20%, 30%, 40%, 50% 또는 그 이상으로 고갈된다.

일부 예들에서, 항체, 그것의 항원 결합 단편이나, 다중 화합물에 노출된 후, 항체, 그것의 항원 결합 단편이나 다중 화합물은 개체에서 활성화된 T 세포의 적어도 10%가 사멸되도록 유도한다. 일부 예들에서, 투여시 개체에서 활성화된 T 세포의 적어도 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 또는 그 이상이 사멸되도록 유도된다. 세포 사멸은 임의의 시간에, 예컨대 항체, 그것의 항원 결합 단편이나 다중 화합물에 노출된 후 1일, 2일, 3일, 4일, 5일, 6일, 7일 또는 7일 이상의 시기에 측정할 수 있다.

또한, 본 발명은 T 세포 또는 자연 살상(NK) 세포의 사멸 유도 방법에 관한 것이다. 상기 방법은 세포 표면에서 PSGL-1을 발현하는 T 세포 또는 NK 세포를 제공하는 단계, 및 T 세포 또는 NK 세포의 표면에서 PSGL-1에 결합하는 화합물을 T 세포 또는 NK 세포에 접촉시키는 단계를 포함하며, 상기 T 세포 또는 NK 세포의 표면에서 상기 화합물이 PSGL-1에 결합함으로써, T 세포 또는 NK 세포의 사멸을 발생시키는 신호 전달 경로가 유도된다.

상기 방법에 사용된 화합물은, PSGL-1에 특이적으로 결합하는 항체 또는 그의 항원 결합성 단편을 포함할 수 있다. 일 예로, 화합물은 PSGL-1에 특이적으로 결합하는 단일클론 항체이다. 일 예로, 상기 방법은 상기 단일클론 항체에 결합하여 T 세포 또는 NK 세포의 표면에서 복수개의 PSGL-1 항원과의 가교 결합을 유도하는 물질을 상기 단일클론 항체에 접촉시키는 단계를 포함한다.

일 예로, 상기 방법은 다음과 같은 단계를 포함한다: (i) 세포 표면에 PSGL-1을 발현하는 T 세포 또는 NK 세포를 제공하는 단계; 및 (ii) T 세포 또는 NK 세포의 표면에서 적어도 2개의 PSGL-1 단백질에 결합하며, 각각의 폴리펩티드 체인이 (a) PSGL-1에 결합하는 결합성 도메인 및 (b) 이종의 아미노산 서열을 함유하는 2개의 폴리펩티드 체인을 포함하며, 상기 폴리펩티드 체인은 상기 이종의 아미노산 서열을 통해 연결되어 다중 화합물을 형성하며, T 세포 또는 NK 세포의 표면에서 상기 다중 화합물이 적어도 2개의 PSGL-1 단백질과 결합함으로써 T 세포 또는 NK 세포의 사멸을 발생시키는 신호 전달 경로를 유도하는, 다중 화합물을 T 세포 또는 NK 세포와 접촉시키는 단계.

다중 화합물은 동형-다중 화합물 또는 이형-다중 화합물일 수 있다. 결합성 도메인은 선택적으로 P-셀렉틴의 세포외 도메인 또는 그것의 PSGL-1-결합성 단편, E-셀렉틴의 세포외 도메인 또는 그것의 PSGL-1-결합성 단편, L-셀렉틴의 세포외 도메인 또는 그것의 PSGL-1-결합성 단편, 항-PSGL-1 항체 또는 그것의 PSGL-1-결합성 단편, 파지 디스플레이 라이브러리로부터 선택된 펩티드, 또는 이들의 임의의 조합을 포함할 수 있다.

상기 이종의 아미노산 서열은, 선택적으로 세포 표면 리셉터에 대한 결합 부위, 예컨대 면역글로불린의 중쇄 불변 부위를 포함할 수 있다. 일부 예들에서, 상기 폴리펩티드 체인은 상기 이종의 아미노산 서열을 통해 공유결합, 예컨대 이황화 결합으로 결합되어 다중 화합물을 형성한다.

일부 예들로, 상기 방법은 이종의 아미노산 서열을 통해 다중 화합물에 결합하며, T 세포의 표면에서 복수개의 PSGL-1 항원과의 가교 결합을 유발하는 물질을 상기 다중 화합물에 접촉시키는 추가적인 단계를 포함할 수 있다.

일부 예로, 상기 방법은 T 세포 또는 NK 세포의 표면에서 복수개의 PSGL-1 항원과의 가교결합을 유도하는 단계를 포함하며, 상기 가교결합은 T 세포 또는 NK 세포의 사멸을 발생시키는 신호 전달 경로를 유발한다.

본 발명의 일부 예로, T 세포는 활성화된 T 세포이다. 일 예로, T 세포는 CD4+ T 세포이다. 다른 예로, T 세포는 CD8+ T 세포이다.

본 발명의 일부 예로, 상기 방법은 상기 화합물(다중 화합물)로 접촉시킨 이후에 T 세포 또는 NK 세포의 생존성을 평가하는 단계를 포함한다.

본 발명의 일부 예로, 상기 방법은 상기 화합물(다중 화합물)로 접촉시킨 이후에 T 세포 또는 NK 세포의 생물학적 활성을 평가하는 단계를 포함한다.

일부 예로, 상기 방법은 활성화된 T 세포의 사멸을 유도하는 단계를 포함한다.

또한, 본 발명은 PSGL-1 기능의 모듈레이터를 스크리닝하는 방법에 관한 것이다. 상기 방법은 세포의 표면에 PSGL-1을 발현하는 세포를 제공하는 단계; 상기 세포과 테스트 물질을 접촉시키는 단계; 및 상기 세포를 테스트 물질과 접촉시킨 후 세포의 생존성을 측정하여, 상기 테스트 물질이 PSGL-1 기능의 모듈레이터인지를 결정하는 단계를 포함한다.

일 예로, 상기 방법은 상기 테스트 물질에 의해 유도된 세포의 사멸을 검출하여, 상기 테스트 물질이 PSGL-1 기능의 모듈레이터인지 여부를 결정하는 단계를 포함한다.

일 예로, 상기 테스트 물질은 PSGL-1에 특이적으로 결합하는 항체 또는 그것의 항원 결합성 단편이다. 일 예로, 상기 테스트 물질은 PSGL-1에 특이적으로 결합하는 단일클론 항체이다. 일 예로, 상기 방법은 단일클론 항체에 결합하며, 세포 표면에서 복수개의 PSGL-1 항원과의 가교 결합을 유도하는 물질과 단일클론 항체를 접촉시키는 단계를 포함한다.

일 예로, 상기 방법은 세포 표면에서 복수개의 PSGL-1 항원과의 가교 결합을 유도하며, 상기 가교 결합은 세포의 사멸을 발생시키는 신호 전달 경로를 유도하는 단계를 포함한다.

일 예로, T 세포는 활성화된 T 세포이다. 일 예로, T 세포는 CD4+ T 세포이다. 다른 예로, T 세포는 CD8+ T 세포이다.

일 예로, 상기 방법은 벌크 양의 테스트 물질을 제조하는 단계 및 테스트 물질을 약학적으로 허용가능한 담체내에 제형화하는 단계를 포함한다.

또한, 본 발명은 T 세포의 표면상에서 PSGL-1에 결합하며, PSGL-1에 결합함으로써 T 세포의 사멸을 발생시키는 신호 전달 경로를 유도하는 화합물; 및 과도하거나 또는 불필요한 T 세포 매개성 면역반응이나, 과도하거나 또는 불필요한 T 세포의 증식과 관련된 증상, 예컨대 염증, 자가면역, 이식 거부 반응, 알레르기 증상 또는 T 세포 암을 치료하기 위한 상기 화합물의 사용 설명서를 포함하는 키트에 관한 것이다.

일 예로, 상기 키트는 (i) T 세포의 표면에서 적어도 2개의 PSGL-1 단백질에 결합하며, 각각의 폴리펩티드가 (a) PSGL-1에 결합하는 결합성 도메인 및 (b) 이종의 아미노산 서열을 함유하는 두개의 폴리펩티드 체인을 포함하며, 상기 폴리펩티드 체인들은 이종의 아미노산 서열을 통해 연결되어 다중 화합물을 형성하며, 다중 화합물이 T 세포의 표면에서 적어도 2개의 PSGL-1 단백질에 결합함으로써 T 세포의 사멸을 발생시키는 신호 전달 경로가 유도되는, 다중 화합물과, (ii) 과도하거나 또는 원하지 않는 T 세포 매개성 면역반응이나, 과도하거나 또는 불필요한 T 세포의 증식과 관련된 증상, 예컨대 염증, 자가면역, 이식 거부 반응, 알레르기 증상 또는 T 세포 암을 치료하기 위한 상기 화합물의 사용 설명서를 포함하는 키트를 포함한다.

본 발명의 이점은 불필요하거나 또는 해로운 관련 면역 반응을 초래하지 않으면서도 T 세포의 고갈 및/또는 세포자살을 유도할 수 있다는 것이다. 예를 들면, 개체에 항-PSGL-1 항체나 본원의 다중 화합물을 투여하여도, IL-2 또는 TNF-알파와 같은 염증성 사이토카인의 수치를 불필요하게 상승시키는 결과를 발생시키지 않는다.

본 발명의 다른 이점은, T 세포의 세포자살을 유도하는 작용성 조성물을 사용함으로써 T 세포의 고갈을 발생시킨다는 것이다. 따라서, 본 발명은 면역 리셉터에 결합하여 상기 리셉터에 의해 매개된 면역 활성화를 방지하는 것으로 작용하는 길항성 조성물(예, 길항성 항-PSGL-1 항체 또는 가용의 길항성 셀렉틴 단편)을 사용함으로써 발생되는 수동적 면역억제가 아닌 능동적인 면역억제 방법을 제공한다.

본 발명의 또다른 이점은, 발현이 대개 백혈구, 특히 T 세포 및 NK 세포에 한정적인 세포 표면 단백질인 PSGL-1의 표적화를 허용한다는 것이다. 따라서, 본원의 화합물은 통상적으로 간 세포와 같이 다른 세포 종의 세포자살을 유의한 수준으로 유도하지 않는다. 생명을 위협하는 전신성 사이토카인 반응을 유의할만한 수준으로 유도하지 않으며 다른 기관 시스템에 손실을 입히지 않는, 선별적 고갈을 위한 T 세포 및 NK 세포(이식 거부반응에 관여하는 중요한 CD3^- 세포 종)의 표적화는 면역억제제로서 적합한 특징이다.

별도로 한정하지 않는 한, 본원의 모든 기술적 용어와 과학적 용어는 본 발명이 속하는 기술분야의 당업자가 통상적으로 이해하는 바와 동일한 의미를 가진다. 본원에 기재된 바와 유사하거나 등가의 방법 또는 물질이, 본 발명의 실시 또는 테스트에 사용될 수 있으나, 적합한 방법 및 물질은 아래에 개시되어 있다. 본 발명에서 언급된 모든 공개물, 특허 출원, 특허 및 기타 참고자료들은 원용에 의해 본 발명에 포함된다. 용어가 상충되는 경우, 본 명세서에서 조절할 것이다. 또한 기술된 재료 및 방법들은 단시 예시된 것일 뿐, 한정되는 것은 아니다.

본 발명의 다른 특징 및 이점은 아래 첨부된 상세한 설명 및 특허청구범위에서 명확해질 것이다.

발명의 상세한 설명

본 발명은 T 세포의 표면에 존재하는 PSGL-1 분자의 기능을 조절함으로써 T 세포의 활성을 조절하는 방법에 관한 것이다. 본원에 기재된 작용제 조성물을 이용한 PSGL-1의 채용은, T 세포의 고갈을 초래할 수 있으며/있거나, T 세포의 세포자살을 유도할 수 있다. 이러한 작용제 조성물은, 면역 관련 질환, 예컨대 염증성 질환, 자가면역 질환, 이식 거부반응, 알레르기 질환 및/또는 T 세포 유래 암을 통제하기 위한 치료제로서 유용하다. 또한, 작용제 조성물은 T 세포의 활성 또는 존재가 바람직하지 않는 임의의 생물학적 샘플에서 T 세포의 고갈을 초래하는데 유용한다.

PSGL-1 단백질

PSGL-1은 호중구, T-림프구 및 B-림프구, NK 세포, 단핵구, 수지상 세포, 및 원시 인간 CD34 조혈모세포에서 발현되는, 세포 표면 부착 분자이다. PSGL-1은 셀렉틴과 상호작용하는 능력을 통해, 내피에서의 백혈구의 롤링(rolling) 및 염증 조직으로의 백혈구 유출을 매개한다. E-셀렉틴 및 P-셀렉틴에 대한 T 세포의 PSGL-1-매개성 결합 또는 이동은 차별적으로 조절된다. 예를 들면, CLA(피부 림프구 항원) 에피토프의 출현은, T 세포의 성향을 메모리 변환이 되도록 유도하는 것으로 생각된다. 헬퍼 2T 세포가 아닌 활성화된 헬퍼 1만이 기능적 PSGL-1을 발현하며, 피부의 염증 구역으로 이동할 수 있다.

PSGL-1은 P-셀렉틴에 결합하기 위해, 특이적으로 시알릴화(sialylated), 푸코실화(fucosylated), 및 설페이트화되어야 하는 시알로뮤신(sialomucin)이다. PSGL-1 분자는 그의 N-말단의 글리코실화 및 설페이트화 정도 차이에 따라 특징지어지는 아이소폼(isoform)으로서 존재한다. 휴지기 상태의 말초혈액 T 및 B 세포, 임파성 세포주, 및 시험관내에서 활성화된 말초혈액 T 세포는, PGSL-1을 유사한 수준으로 발현한다. 그러나, 활성화된 T 세포만이 PSGL-1의 기능적 형태를 나타내며, P-셀렉틴에 활발하게 결합한다. 이러한 활성화-의존적 결합 활성은 활성화된 T 세포 내에서 알파 (1,3) 푸코실트랜스퍼라아제 활성 수준의 증가로부터 판단할 때, 번역후 상이한 수정의 결과인 것으로 여겨진다. 또한, PSGL-1 아이소폼은 L-셀렉틴 및 E-셀렉틴에 대하여 상이한 친화성을 보인다. 예를 들면, CLA-양성 아이소폼을 나타내는 인간 T 세포는 E-셀렉틴 및 P-셀렉틴 모두에 결합하여 롤링할 수 있는 반면에, CLA 에피토프 없이 PSGL-1을 발현시키는 T 세포는 오직 P-셀렉틴에만 결합한다. 나아가, P-셀렉틴에 대한 PSGL-1의 결합에는 설페이트화를 위한 3개의 티로신 잔기 및 글리코실화를 위한 1개의 트레오닌 잔기를 함유하는 말단 데카펩티드의 존재를 조건으로 하다.

PSGL-1 단백질은 재조합 방법 및/또는 생물학적 재료로부터 천연 PSGL-1 단백질의 분리를 통해 제조할 수 있다. 재조합 PSGL-1 단백질은 원핵생물 또는 진핵생물 세포 내에서 시험관내 또는 생체내로 생산될 수 있다. PSGL-1을 코딩하는 핵산은 상기 단백질의 재조합 생산에 사용될 수 있다(예, PSGL-1 폴리펩티드를 코딩하는 핵산의 경우는 GenBank 수탁번호 NM_003006). PSGL-1에 대한 항체도 공지되어 있으며, 항원의 정제(예, Herron et al. (2000) Science Jun 2; 288 (5471): 1653-56; WO 00/25808) 및 본 명세서에 제시된 방법에 사용될 수 있다. 또한, PSGL-1은 비제한적으로 Sako et al. (1993) Cell 75: 1179; Vachino et al. (1995) J. Biol. Chem. 270: 21966; 및 Veldman et al. (1995) J. Biol. Chem. 270: 16470을 비롯한 잠고자료에 제시되어 있다.

PSGL-1의 재조합 생산을 위해선, PSGL-1 및 그의 변형성 알파-(1,3) 푸코실트랜스퍼라아제인 Fuc-TVII의 동시 발현이 PSGL-1의 기능적 발현에 필요할 수 있다. 부가적으로 또는 대안적으로, PSGL-1의 재조합 생산은 티로신 설포트랜스퍼라아제를 코딩하는 핵산 및/또는 프로펩티드를 제거하기 위하여 PACE를 코딩하는 핵산을 공동-형질전환시킴으로써 이룰 수 있다.

항-PSGL-1 항체는 생물학적 재료로부터 PSGL-1 항원의 분리 및 정제에 사용할 수 있다. PSGL-1 단백질을 발현하는 임의의 세포, 예를 들면 개체 또는 T 세포주에서 유래된 T 세포는 상기 단백질의 공급원으로서 사용될 수 있다. 정제한 후, 상기 단백질은 본 명세서에 제시된 다양한 방법에 사용할 수 있다. 예를 들면, 정제된 PSGL-1 단백질은 T 세포 상에서 PSGL-1 기능의 조절자를 시험관내에서 스크리닝하거나, 상기 단백질에 대한 항체를 제조하는 면역원으로서 사용할 수도 있다.

항-PSGL-1 항체

PSGL-1 폴리펩티드(또는 면역원성 단편 또는 그의 유사체)는 본 발명의 방법에 유용한 항체의 생산에 사용될 수 있다. 상술한 바와 같이, PSGL-1 폴리펩티드 또는 그의 펩티드 단편은 재조합 기술로 생산하거나, 고상 합성법에 의하여 합성할 수도 있다. 재조합 PSGL-1 폴리펩티드 또는 그의 펩티드 단편은 항-PSGL-1 항체를 생산하는 면역원으로서 사용할 수 있다. 그 외에도, TAB4 단일클론 항체와 같은 항-PSGL-1 항체는, PSGL-1 폴리펩티드, 예를 들면, 천연 배위 상태의 PSGL-1 폴리펩티드를 정제하는 데 사용할 수 있으며, 그런 뒤에는 추가적인 항-PSGL-1 항체를 생산하는 면역원으로서 사용할 수 있다.

본 발명의 항체는 PSGL-1 폴리펩티드에 특이적으로 결합하는 단일클론, 다중클론, 또는 조작 항체일 수 있다. 특정 항원, 예를 들면 PSGL-1 폴리펩티드에 "특이적으로 결합하는" 항체는, 한 샘플 내의 다른 분자들을 실질적으로 인지하거나 결합하지 않는다. 따라서, 본 발명은, 폴리펩티드와 테스트 화합물을 접촉시키는 단계; 상기 폴리펩티드가 상기 테스트 화합물에 결합하는 지의 여부를 결정하는 단계(예, 결합의 직접 검출, 폴리펩티드에 대한 테스트 화합물의 결합을 파괴하는 경쟁 분자의 검출, 및/또는 세포자살 유도성 활성 분석을 이용한 결합성 검출)에 의한, 폴리펩티드에 결합하는 테스트 화합물(예, 항체)의 동정 방법을 포함한다.

일반적으로, PSGL-1 폴리펩티드는 KLH와 같은 보강제(adjuvant)와 혼합될 수 있으며, 담체 단백질과 커플링되어, 포유류 숙주 내로 주입될 수 있다. 이후, 그러한 동물에서 생산된 항체는 펩티드 항원 친화성 크로마토그래피로 정제할 수 있다.

특히, 다양한 숙주 동물을 PSGL-1 폴리펩티드 또는 그의 항원성 단편의 주입에 의하여 면역화시킬 수 있다. 통상적으로 사용되는 숙주 동물로는 토끼, 마우스, 기니아피그, 및 랫을 포함한다. 면역 반응을 증가시키기 위하여 사용될 수 있는 각종 보강제는 숙주의 종류에 따라 결정되며, 프레운드의 보강제(완전 및 불완전), 수산화알루미늄과 같은 미네랄 겔, 표면 활성 물질, 예를 들면 라이솔렉시틴, 플루로닌 폴리올, 폴리아니온, 펩티드, 오일 에멀젼, 키홀 림페트 헤모시아닌, 및 디니트로페놀이 포함된다. 잠재적으로 유용한 인간 보강제로는 BCG(bacille Calmette-Guerin) 및 코리네박테리움 파르붐(Corynebacterium parvum)이 있다. 다중클론 항체는 면역화된 동물의 혈청 내에 함유된 이형적인 항체 분자들의 군집이다.

따라서, 본 발명에 속하는 항체들은 다중클론 항체 및 단일클론 항체, 인간화 또는 키메라 항체, 단쇄 항체, Fab 단편, F(ab')2 단편, 및 Fab 발현 라이브러리를 이용하여 생산된 분자들을 포함한다.

특정 항원에 대하여 동질적인 항체 군집인 단일클론 항체는, 상기 PSGL-1 폴리펩티드 및 표준 하이브리도마 기술(예, Kohler et al., Nature 256: 495 (1975); Kohler et al., Eur J Immunol 6: 511(1976); Kohler et al., Eur J Immunol 6: 292(1976); Hammerling et al., Monoclonal Antibodies and T Cell Hybridomas, Elsevier, N. Y.(1981))을 이용하여 제조할 수 있다.

특히, 단일클론 항체는 Kohler 등의 Nature 256: 495(1975) 및 미국 특허 제 4,376,110호에 제시된 바와 같은, 연속 배양 세포주에 의한 항체 분자의 생산 기술; 인간 B-세포 하이브리도마 기술(Kosbor et al., Immunology Today 4: 72(1983); Cole et al., Proc Natl Acad Sci USA 80: 2026(1983)), 및 EBV-하이브리도마 기술(Cole et al., Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy, Alan R. Liss, Inc., pp. 77-96(1983))에 의하여 수득할 수 있다. 이러한 항체는 IgG, IgM, IgE, IgA, IgD를 포함하는 임의의 면역글로불린 클래스 및 그의 서브클래스(subclass)의 항체일 수 있다. 본 발명의 mAb를 생산하는 하이브리도마는, 시험관내 또는 생체내에서 배양할 수 있다. 높은 역가의 mAb를 생체내에서 생산하는 능력은 이를 특히 유용한 생산 방법이다.

제조한 후, 다중클론 또는 단일클론 항체는, 예를 들면, Ausubel 등의 상술한 문헌에 제시된 바와 같은 표준 방법에 의한 웨스턴 블롯 또는 면역침전 분석으로 특이적인 PSGL-1 인지력에 대해 테스트한다. PSGL-1을 특이적으로 인지하여 결합하는 항체가 본 발명에 유용하다. T 세포, 예를 들면, CD3+ 세포의 표면에서 PSGL-1 항원에 결합하며, 개체 내에서 T 세포의 고갈 및/또는 세포자살을 유도하는 항-PSGL-1 항체가 특히 유용하다.

항체는 예컨대, 치료 요법(예, 염증성 질환, 자가면역질환, 이식 거부반응, 알레르기 질환 및 T 세포 유래 암과 같은 증상과 관련된 T 세포 매개성 면역 반응 등의 부적절한 면역 반응을 감소 또는 제거하기 위하여)의 한 부분으로써 사용될 수 있다. 또한, 항체는 후보 화합물과 PSGL-1의 결합 능력을 측정하기 위한 스크리닝 분석에도 사용될 수 있다.

그 외에도, 적절한 항원 특이성을 가지는 마우스 항체 분자의 유전자와 함께 적절한 생물학적 활성을 가지는 인간 항체 분자의 유전자를 스플라이싱함으로써 "키메라 항체"를 생산하기 위해 개발된 기술들(Morrison et al., Proc Natl Acad Sci USA 81: 6851(1984); Neuberger et al., Nature 312: 604(1984); Takeda et al., Nature 314: 452(1984))을 역시 사용할 수 있다. 키메라 항체는 뮤라인 단일클론 항체에서 유래된 가변적인 부위 및 인간 면역글로불린의 불변 부위를 가지는 것과 같이, 각각의 부분들이 상이한 동물 종에서 유래된 하나의 분자이다.

대안적으로, 단쇄 항체를 생산하기 위한 기술들은(미국 특허 4,946,778, 4,946,778 및 4,704,692) PSGL-1 폴리펩티드에 대한 단쇄 항체 또는 그것의 단편을 생산하기 위해 개정될 수 있다. 아미노산 결합을 통해 Fv 부위의 중쇄와 경쇄 단편을 연결하여, 하나의 단쇄 폴리펩티드를 제조함으로써 단쇄 항체가 형성된다.

특정 에피토프를 인지하여 결합하는 항체 단편은, 공지 기술로 제조할 수 있다. 예컨대, 이러한 단편들로는 항체 분자의 펩신 절단으로 생산될 수 있는 F(ab')2 단편 및 F(ab')2 단편의 이황화결합을 환원시킴으로써 제조될 수 있는 Fab 단편이 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다. 대안적으로, 원하는 특이성을 가지는 단일클론 Fab 단편을 신속하고 용이하게 동정할 수 있도록 Fab 발현 라이브러리(Huse et al., Science 246: 1275(1989))를 구축할 수 있다.

항체는 당업계에 공지된 방법으로 인간화할 수 있다. 예를 들어, 원하는 결합 특이성을 가지는 단일클론 항체를 상업적으로 인간화시킬 수 있다(Scotgene, Scotland; Oxford Molecular, Palo Alto, Calif.). 또한, 형질전환 동물에서 발현되는 것과 같은 완전한 인간 항체도 본 발명의 특징이다(Green et al., Nature Genetics 7: 13(1994); 미국 특허 5,545,806 및 5,569,825).

다중 화합물

T 세포 또는 NK 세포의 표면에서 복수개의 PSGL-1 단백질에 결합하는 다중 화합물을 사용하여 상기 세포의 세포자살을 유도할 수 있다. 다중 화합물은 적어도 두개의 폴리펩티드 체인을 함유하고 있다. 각각의 폴리펩티드 체인은 (i) PSGL-1에 결합하는 결합성 도메인 및 (ii) 이종의 아미노산 서열을 포함한다.

일반적으로, 다중 화합물은 특정 세포 표면에서 적어도 2개의 상이한 PSGL-1 단백질에 결합한다. 그러나, 다중 화합물은 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12 또는 그 이상의 구분되는 PSGL-1 결합성 도메인을 가져, 특정 세포의 표면에서 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12 또는 그 이상의 다른 PSGL-1 단백질과 다중 화합물의 결합이 이루어지도록, 계획될 수 있다.

결합성 도메인은 PSGL-1에 결합하는 임의의 아미노산 서열(글리코실레이션 및/또는 설페이션과 같이 수정된 임의의 아미노산 서열)을 포함할 수 있다. 결합성 도메인은 자연적으로 형성되거나 비자연적으로 형성된 아미노산 서열중 어느 하나에 해당될 수 있다. 예컨대, 결합성 도메인은 셀렉틴(예, P-셀렉틴, E-셀렉틴 또는 L- 셀렉틴)의 PASL-1 결합성 도메인을 포함할 수 있다. 셀렉틴의 PSGL-1 결합성 도메인을 함유하고 있는 폴리펩티드는 선택적으로 (i) 셀렉틴(예, P-셀렉틴, E- 셀렉틴 또는 L-셀렉틴)의 세포외 도메인; (ii) 셀렉틴(예, P-셀렉틴, E- 셀렉틴 또는 L-셀렉틴)의 칼슘 의존적 렉틴 도메인; 또는 (iii) PSGL-1에 결합을 매개하는 셀렉틴(예, P-셀렉틴, E- 셀렉틴 또는 L-셀렉틴)의 세포외 도메인의 단편을 함유할 수 있다. 이러한 자연적으로 형성된 아미노산 서열 뿐만 아니라, 하나 이상의 아미노산 변화를 자연적으로 형성된 PSGL-1 결합성 도메인에 도입하여, PSGL-1 결합성 기능을 유지하고 있는 비자연적으로 형성된 서열을 제조할 수 있다. 예를 들어, 폴리펩티드는 임의의 (i) 셀렉틴(예, P-셀렉틴, E- 셀렉틴 또는 L-셀렉틴)의 세포외 도메인; (ii) 셀렉틴(예, P-셀렉틴, E- 셀렉틴 또는 L-셀렉틴)의 칼슘 의존적 렉틴 도메인; 또는 (iii) PSGL-1에 결합을 매개하는 셀렉틴(예, P-셀렉틴, E- 셀렉틴 또는 L-셀렉틴)의 세포외 도메인의 단편과 적어도 80%, 85%, 90%, 95% 또는 98% 상동하며, PSGL-1에 결합하는 아미노산 서열을 함유할 수 있다. PSGL-1 결합성 도메인을 코딩하는 핵산 서열에 변형을 도입하는데 표준 분자생물학 돌연변이 유발 기술을 사용할 수 있다. 이후, 수정된 결합성 도메인은 PSGL-1, 예컨대 고정화된 PSGL-1 또는 세포 표면상의 PSGL-1에 대한 이의 결합 능력에 대해 시험할 수 있다. 또한, 결합성 도메인은 항-PSGL-1 항체의 PSGL-1 결합성 도메인 또는 파지 디스플레이 라이브러리로부터 선별된 폴리펩티드, 또는 PSGL-1에 결합하며 항-PSGL-1 항체의 PSGL-1 결합성 도메인 또는 파지 디스플레이 라이브러리로부터 선별된 폴리펩티드와 적어도 80%, 85%, 90%, 95% 또는 98% 상동한 아미노산 서열을 포함할 수 있다.

PSGL-1 결합성 도메인은 P-셀렉틴의 PSGL-1 결합성 단편에 해당되는 아미노산 서열을 포함할 수 있다. 이러한 아미노산 서열을 함유하는 (본원의 다중 화합물의) 폴리펩티드 체인의 예로는, 다음의 성분들을 함유하고 있는 재조합 마우스 P-셀렉틴/Fc 키메라(R&D Systems, Minneapolis, MN)가 있다: (i) CD33 시그널 펩티드(Metl-Alal6); (ii) 마우스 P-셀렉틴(세포외 도메인의 Trp42-Ala709); (iii) IEGRMD(서열번호 1); 및 (iv) 인간 IgGl(ProlO0-Lys330). 이러한 아미노산 서열을 함유하고 있는 폴리펩티드 체인의 두번째 예는, 다음의 성분들을 함유하고 있는 재조합 인간 P-셀렉틴/Fc 키메라(R&D Systems, Minneapolis, MN)가 있다: (i) 인간 P-셀렉틴(Metl- Ala771, 세포외 도메인); (ii) IEGRMD(서열번호 1); 및 (iii) 인간 IgG1(ProlOO-Lys330).

PSGL-1-결합성 도메인은 E-셀렉틴의 PSGL-1 결합성 도메인에 해당되는 아미노산 서열을 포함할 수 있다. 이러한 아미노산 서열을 함유하고 있는 (본원의 다중 화합물의) 폴리펩티드 체인의 예로는, 다음의 성분들을 함유하고 있는 재조합 마우스 E-셀렉틴/Fc 키메라(R&D Systems, Minneapolis, MN)가 있다: (i) 마우스 E-셀렉틴(Metl-Pro557, 세포외 도메인); (ii) IEGRMD(서열번호 1); (iii) 인간 IgGl(ProlO0-Lys330); 및 (iv) HHHHHH(서열번호 2). 이러한 아미노산 서열을 함유하고 있는 폴리펩티드 체인의 두번째 예로는, 다음의 성분들을 함유하고 있는 재조합 인간 E-셀렉틴/Fc 키메라(R&D Systems, Minneapolis, MN)가 있다: (i) 인간 E-셀렉틴(Metl-Pro556, 세포외 도메인); (ii) IEGRMD(서열번호 2); (iii) human IgGl(ProlO0-Lys330); 및 (iv) HHHHHH(서열번호 2).

PSGL-1-결합성 도메인은 L-셀렉틴의 PSGL-1 결합성 도메인에 해당되는 아미노산 서열을 포함할 수 있다. 이러한 아미노산 서열을 함유하고 있는 (본원의 다중 화합물의) 폴리펩티드 체인의 예로는 다음의 성분들을 함유하고 있는 재조합 마우스 L-셀렉틴/Fc 키메라(R&D Systems, Minneapolis, MN)가 있다: (i) 마우스 L-셀렉틴(Metl-Asn332, 세포외 도메인); (ii) IEGRMD(서열번호 1); (iii) 인간 IgG1(ProlO0-Lys330); 및 (iv) HHHHHH(서열번호 2). 이러한 아미노산 서열을 함유하고 있는 폴리펩티드 체인의 두번째 예로는, 다음의 성분들을 함유하고 있는 재조합 인간 L-셀렉틴/Fc 키메라(R&D Systems, Minneapolis, MN)가 있다: (i) 인간 L-셀렉틴(Metl-Asn332, 세포외 도메인); (ii) IEGRMD(서열번호 1); (iii) 인간 IgGl(ProlO0-Lys330); 및 (iv) HHHHHH(서열번호 2).

다중 화합물은 동형-다중 화합물 또는 이형-다중 화합물로 계획될 수 있다. 동형-다중 화합물은 단지 동일한 PSGL-1 결합성 도메인들을 가지고 있는 폴리펩티드 체인이다. 예컨대, 동형-다중 화합물은 P-셀렉틴의 동일한 PSGL-1 결합성 단편을 함유하고 있는 폴리펩티드 체인을 포함할 수 있다. 이형-다중 화합물은 여러가지 PSGL-1 결합성 도메인을 가지는 폴리펩티드 체인을 포함한다. 예컨대, 이형-다중 화합물은 P-셀렉틴의 PSGL-1 결합성 도메인을 함유하는 제1 폴리펩티드 체인 및 E-셀렉틴의 PSGL-1 결합성 도메인을 함유하는 제2 폴리펩티드 체인을 포함할 수 있다.

이종의 아미노산 서열은 임의의 아미노산 서열일 수 있다. 그러나, 본원에 기재된 폴리펩티드 체인의 아미노산 서열이 자연적으로 형성된 단백질의 서열과 일치되는 것은 아니다. 이종의 아미노산 서열은 폴리펩티드 체인의 연결을 용인하는 하나 이상의 아미노산을 포함한다. 예를 들어, 하나 이상의 아미노산은 예컨대, 이황화 결합을 통해 공유결합으로 폴리펩티드 체인을 연결할 수 있다. 이종 서열의 예는, 면역글로불린의 중쇄 불변 부위이다. 두개의 폴리펩티드 체인의 Fc 부위 사이의 이황화 결합으로 이량성 화합물이 형성될 수 있다.

또한, 이종의 아미노산 서열은 폴리펩티드 체인의 연결에 기여할 뿐만 아니라 가교-링커(cross-linker) 결합성 부위, 예컨대 세포 표면의 리셉터에 대한 결합성 부위를 포함할 수 있다. 이러한 결합 부위에 물질이 결합하면, 폴리펩티드 체인과 이에 결합되는 세포 표면의 PSGL-1 단백질간의 가교 연결이 형성된다. 면역글로불린의 중쇄 체인 불변 부위는 Fc 리셉터 결합성 부위를 포함한다. 가교-링커는, 예컨대, 이종의 아미노산 서열의 교차-링커 결합성 부위에 특이적으로 결합하는 항체(예, 항-Fc 항체)일 수 있다.

PSGL-1 기능을 조절하는 화합물의 스크리닝 분석

또한, 본 발명은 PSGL-1에 결합하며, T 세포의 고갈 및/또는 T 세포의 세포자살을 유도하는 화합물을 비제한적으로 포함하는, PSGL-1(또는 PSGL-1 도메인)과 상호작용하는 화합물의 동정 방법을 포함한다. 또한, 본 발명은 PSGL-1 활성을 조절하는 막관통, 세포외 또는 세포내 단백질 및 PSGL-1 활성을 조절하는 화합물과 PSGL-1 상호작용을 조절하는 화합물을 포함한다.

본 발명에 따라 스크리닝될 수 있는 화합물은, 펩티드, 항체 및 그의 단편, 및 본원에 기재된 바와 같이 PSGL-1에 결합하여 PSGL-1에 의해 매개된 생물학적 활성을 조절하는 다른 유기 화합물을 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니다.

이러한 화합물은, 예컨대, 가용성 펩티드와 같은 펩티드를 비제한적으로 포함하며, 랜덤 펩티드 라이브러리의 일원(Lam et al., Nature 354: 82(1991); Houghten et al., Nature 354: 84(1991)) 및 D-배위 및/또는 L-배위 아미노산, 포스포펩티드(비제한적으로, 랜덤 또는 일부 변성체, 직접 포스포펩티드 라이브러리의 일원들 포함; Songyang et al., Cell 72: 767 (1993)), 항체(비제한적으로, 다중클론 항체, 단일클론 항체, 인간화 항체, 항-이디오타입 항체, 키메라 항체 또는 단쇄 항체, 및 FAb, F(ab')2 및 FAb 발현 라이브러리 단편, 및 그의 에피토프-결합 단편), 및 작은 유기 또는 무기 분자들을 포함하는 화학적 조합을 통해 얻어지는 분자 라이브러리를 비제한적로 포함한다.

본 발명에 따라 스크리닝될 수 있는 다른 화합물로는, 상술한 바와 같은 PSGL-1 단백질의 활성에 영향을 주는 작은 유기 분자들을 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니다.

컴퓨터 모델링 및 검색 기술은 PSGL-1 발현 또는 활성을 조절할 수 있는 화합물의 동정, 또는 이미 동정된 화합물의 개선을 가능하게 한다. 그러한 화합물 또는 조성물을 동정함으로써, 활성 부위 또는 지역이 동정된다. 그러한 활성 부위는 통상적으로 활성의 천연 모듈레이터에 대한 결합 부위일 것이다. 활성 부위는 예를 들면, 펩티드의 아미노산 서열, 핵산의 뉴클레오타이드 서열, 또는 관련 화합물 또는 조성물 및 천연 리간드의 복합체 연구로부터 당 기술분야에 공지된 방법을 이용하여 동정할 수 있다. 후자의 경우, 인자 상에 모듈레이터(또는 리간드)가 발견되는 장소를 밝혀 활성 부위를 찾기 위하여, 화학적 또는 X-선 크리스탈로그래피법이 사용될 수 있다.

상기에, 결합을 변형시킬 수 있는 화합물의 설계 및 제작을 설명하였으나, 당업자는 PSGL-1 단백질에 결합하여 T 세포의 고갈을 유발하고/유발하거나 T 세포의 세포자살을 유도하는 천연 산물 또는 합성 화학물질을 포함하는 공지된 화합물, 및 단백질을 포함하는 생물학적 활성 물질의 라이브러리를 스크리닝할 수 있을 것이다.

시험관내 시스템은 PSGL-1(또는 PSGL-1의 도메인)과 상호작용할 수 있는 화합물을 동정하도록 설계될 수 있다. 동정된 화합물은 예컨대, 본 명세서에 설명한 바와 같이 T 세포 활성의 조절에 유용할 수 있으므로, 염증, 자가면역, 이식 거부반응, 알레르기 증상 및 T 세포 암과 같은 과도하거나, 불필요한 T 세포 매개성 면역 반응이나 또는 과도하거나 불필요한 T 세포 증식과 관련된 증상 치료에 유용할 수 있다.

PSGL-1에 결합하는 화합물의 동정에 사용되는 분석의 원리는, 두 성분들이 상호작용하여 결합함으로써, 반응 혼합물 내에서 제거될 수 있고/있거나 검출될 수 있는 복합체의 형성이 허용되기에 충분한 조건 및 시간 하에, PSGL-1(또는 그의 도메인)과 테스트 화합물의 반응 혼합물을 준비하는 단계를 포함한다. 사용되는 PSGL-1 종은 스크리닝 분석의 목적에 따라 달라질 수 있다. 일부의 경우에는, 분석 시스템(예, 표지, 얻어진 복합체의 분리 등)에 이점을 제공하는 이형(heterologous) 단백질 또는 폴리펩티드와 융합된 PSGL-1의 도메인에 해당되는 펩티드를 이용하는 것이 바람직하다.

스크리닝 분석은 다양한 방법으로 수행될 수 있다. 예를 들면, PSGL-1 단백질, 폴리펩티드, 펩티드 또는 융합 단백질 또는 테스트 물질을 고체상에 고정시키는 단계, 및 반응 종료 시 고체상에 고정된 PSGL-1/테스트 화합물 복합체를 동정하는 단계를 포함하는 분석 방법을 수행할 수 있다. 그러한 방법의 한 예로, PSGL-1 반응물은 고체 표면에 고정될 수 있으며, 고정되지 않은 테스트 화합물은 직접 또는 간접적으로 표지(labeling)될 수 있다.

실제, 미세적정 플레이트를 고체상으로서 편리하게 이용할 수 있다. 고정된 성분은 비공유 또는 공유 부착에 의하여 고정화될 수 있다. 비공유성 부착은 간단하게 고체 표면을 단백질 용액으로 코팅하고 건조함으로써 이룰수 수 있다. 대안적으로, 고정할 단백질에 대해 특이적인 고정된 항체, 바람직하게는 단일클론 항체를 고체 표면에 단백질을 고정시키는 데 사용할 수 있다. 표면은 미리 제조해 저장할 수 있다.

상기 분석을 실시하기 위하여, 비고정화된 성분을 고정된 성분을 함유하고 있는 코팅된 표면에 첨가한다. 반응 종료 후, 미반응 성분들은, 형성된 임의의 복합체들이 고체 표면에 고정된 상태로 유지되는 조건 하에서 (예, 세척에 의하여) 제거한다. 고체 표면 상에 고정된 복합체의 검출은, 다양한 방법으로 달성될 수 있다. 미리 비고정화된 성분이 사전에 표지된 경우, 표면 상에 고정화된 표지의 검출은, 복합체가 형성되었음을 시사한다. 사전에 고정화되지 않은 성분이 미리 표지된 것이 아닌 경우에는, 간접 표지를 이용하여, 예컨대, 사전 비고정화된 성분에 특이적인 표지 항체(표지된 항-Ig 항체로 직접 또는 간접 표지될 수 있는 항체)를 이용하여, 표면에 고정된 복합체를 검출하는 데 사용할 수 있다.

대안적으로, 반응은 미반응 성분들에서 분리한 반응 산물 및 검출된 복합체를, 예를 들면, PSGL-1 단백질, 폴리펩티드, 펩티드 또는 융합 단백질 또는 용액내에서 형성된 임의의 복합체를 고정시키는 테스트 화합물에 대해 특이적인 고정화된 항체, 및 고정된 복합체의 검출을 가능하게 하는 복합체의 다른 성분에 대하여 특이적인 표지 항체를 이용하여, 액체상 내에서 실시할 수 있다.

대안적으로, PSGL-1과 상호작용하는 화합물을 동정하기 위하여 세포 분석을 이용할 수도 있다. 이를 위해, PSGL-1을 발현하는 세포주, 또는 PSGL-1을 발현하도록 유전자 조작된 세포주를 이용할 수 있다. 세포 분석은 본 명세서에서 제시한 스크리닝으로 동정된 화합물의 기능적 효과를 평가하는 데 특히 유용하다. 예를 들면, PSGL-1 단백질에 결합하는 능력을 기준으로 화합물을 동정한 후, 예컨대, 시험관내 또는 생체내에서 T 세포의 세포자살을 유도하거나, 시험관내 또는 생체내에서 T 세포를 고갈시키는 능력에 대해 화합물을 테스트할 수 있다.

제약학적 조성물

본 발명의 목적은 개체의 면역 반응을 변이시키는 것으로, 예를 들면 PSGL-1 폴리펩티드에 특이적으로 결합하는 항체, 다중 화합물, 소분자, 또는 기타 화합물을 함유하는 제약학적 조성물도 본 발명의 일 특징이다. 바람직한 예에서, 상기 화합물은 PSGL-1의 작용제(agonist)로서 작용한다.

본 발명에 따라 사용하기 위한 제약학적 조성물은 생리학적으로 허용가능한 1종 이상의 담체 또는 부형제를 이용하여 통상의 방식으로 제형화될 수 있다. 따라서, 상기 화합물 및 그들의 생리학적으로 허용가능한 염 및 용매물질은 다양한 투여 경로를 통한 투여용으로 제형화될 수 있다.

상기 화합물들은 주사, 예를 들면 환약 주사 또는 연속 주입에 의하여 비경구 투여용으로 제형화될 수 있다. 주사용 제형은 보존제가 첨가된, 예를 들면 앰플과 같은 단일 투약 형태로 존재하거나, 또는 다중-투약 용기 내에 보관될 수 있다. 상기 조성물은 유계 또는 수계 비히클 내의 현탁액, 용액, 또는 에멀젼과 같은 형태를 취할 수 있으며, 현탁제, 안정화제, 및/또는 분산제와 같은 제형화제를 함유할 수 있다. 대안적으로, 상기 활성 성분은 사용 전에 적합한 비히클, 예를 들면 멸균 피로젠 무함유성 수로 구성되는 분말 형태일 수도 있다.

T 세포-매개성 면역 반응의 조절 방법 및 T 세포 군집의 고갈 방법

본 명세서에 제시한 스크리닝 분석에는 예를 들면, PSGL-1 폴리펩티드에 의하여 매개되는 생물학적 기능의 조절 및/또는 과도한 또는 불필요한 면역 반응, 예를 들면, T 세포-매개성 면역 반응과 관련된 질환의 치료용으로, 구체적으로 제시한 화합물이 유용할 수 있다. 이들 화합물은, 비제한적으로 T 세포 표면 상의 PSGL-1에 결합하여 T 세포의 사망을 초래하는 신호 전달 경로를 유도하는 펩티드, 항체 및 그의 단편, 및 기타 유기 화합물을 포함한다. 본 발명의 방법은 세포 표면 상의 PSGL-1의 가교결합을 유도하는 가교결합제의 첨가 단계를 선택적으로 포함한다. 본 명세서에 제시된 화합물들은 T 세포의 활성 고갈 또는 제거가 바람직한 경우에 유용할 수 있다. 본 발명의 화합물을 이용해 치료될 수 있는 특히 유용한 증상으로는 염증 질환, 자가면역성 질환, 이식 거부반응, 알레르기성 질환, 및 T 세포 유래의 암이 포함된다.

본 명세서에 제시된 항-PSGL-1 화합물을 이용해 치료할 수 있는 증상의 예로는 비제한적으로, 당뇨병, 관절염(류머티스성 관절염, 아동 류머티스성 관절염, 골관절염 및 건선성 관절염 포함), 다발성 경화증, 뇌척수염, 중증 근무력증, 전신 낭창성 홍반, 자가면역성 갑상선염, 피부염(아토피성 피부염 및 습진성 피부염), 건선, 조그렌 증후군(Sjogren's Syndrome), 크론 증후군(Crohn's disease), 아프타 궤양, 홍채염, 결막염, 각막 결막염, I형 당뇨병, 염증성 장 질환, 궤양성 대장염, 천식, 알레르기성 천식, 피부 낭창성 홍반, 경피증, 질염, 직장염, 약물 발진, 나병 전도 반응, 나병 결절 홍반, 자가면역성 포도막염, 알레르기성 뇌척수염, 급성 이사 출혈성 척수염, 특발성의 진행성 양측 감각신경난청, 재생불량성 빈혈, 순수 적혈구 세포성 빈혈, 특발성 저혈소판증, 다발연골염, 베게너의 육아종증(Wegener's granulomaltosis), 만성 활성 간염, 스티븐스-존슨 증후군(Stevens-Johnson syndrome), 특발성 스프루, 편평 태선, 그레이브씨병(Graves' disease), 사르코이드증, 초기 담즙 경화, 후부 포도막염, 간질성 폐섬유증, 이식편-대-숙주 질환, 골수 이식, 간 이식, 또는 임의의 기관 또는 조직의 이식과 같은 이식의 병상(동형 또는 이형 조직을 이용한 이식 포함), 아토피성 알레르기와 같은 알레르기, AIDS, 및 백혈병 및/또는 림프종과 같은 T-세포 종양이 포함된다.

본 발명의 방법은 시험관내 또는 생체내에서 세포 군집으로부터 T 세포를 고갈시키는 데 사용될 수 있다. 예를 들면 개체로부터 유래된 생물학적 샘플은 선택적으로 가교결합제와 함께 본 명세서에 제시된 항-PSGL-1 화합물과 샘플을 접촉시켜 시험관내 T 세포를 고갈시킬 수 있다. 이러한 방법은 예를 들면 세포 군집 내의 비-T 세포의 농축(enrichment) 및 세포 군집으로부터 T 세포 활성의 감소 또는 제거에 유용할 수 있다.

도 1은 활성화된 T 세포가 TAB4(항-PSGL-1 단일클론 항체)-매개성 세포자살 신호에 감응하였을때, 조사한 시간 경과에 따른 실험 결과를 나타낸다.

도 2는 TAB4 항체에 의해 인지되는 항원의, 세포 표면의 바이오틴화(biotinylation) 및 면역침전 결과를 나타낸다.

도 3은 비장 CD4⁺ T 세포, CD8⁺ T 세포, CD19⁺ B 세포, 및 NK 세포의 PSGL-1 항원의 발현을 나타낸 도면이다.

도 4는 CD4⁺, CD8⁺, 및 CD4⁺8⁺, 및 CD4^-8^- 흉선세포에서의 PSGL-1 항원 발현을 나타낸 도면이다.

도 5는 반응자로서 TAB4(또는 햄스터 Ig)로 처리된 Balb/c 마우스에서 분리 한 비장 세포를 이용하고, 촉진자로서 H2-미스매치 C3H 비장 세포를 이용하여 혼합 백혈구 배지 내에서 생성된 IL-2의 수준을 나타낸 도면이다.

도 6은 (A) TAB4 항체로 면역 침전되는 단백질이 상업적으로 입수가능한 항-PSGL-1 항체에 의하여 인지될 수 있으며, (B) 항-PSGL-1 항체를 이용한 T 세포 용해물의 사전 세정으로 TAB4에 의해 인지되는 단백질을 고갈시킬 수 있음을 입증하는 웨스턴 블롯 분석이다.

도 7은 Balb/c 마우스 유래의 피부로 이식되고 항-PSGL-1 항체(검은색 다이아몬드) 또는 대조군 항체(흰색 다이아몬드)로 처리된 C57BL/6 마우스에서의 이식편의 생존율(%)을 나타낸 도면이다.

도 8은 항-인간 PSGL-1 항체로 활성화된 말초혈액 단일클론성 세포를 처리한 후의 T 세포의 세포자살율을 나타낸 도면이다.

도 9는 항-PSGL-1 항체(검은색 정사각형) 또는 대조군 항체(흰색 정사각형)로 처리된 자가면역 비-비만 상태의 당뇨병(NOD) 수컷 마우스의 당뇨병 발생률을 나타낸 도면이다.

도 10은 활성화된 마우스 T 세포에 대한, 마우스 P-셀렉틴, E-셀렉틴 및 L-셀렉틴의 결합성을 나타낸 도면이다.

도 11A-11C는 E-셀렉틴(도 llA), P-셀렉틴(도 11B) 및 L-셀렉틴(도 11C)의 다중 형태에 의한, 활성화된 마우스 T 세포의 세포자살 유발을 나타낸 도면이다.

도 12는 가용성 P-셀렉틴-Fc 융합 단백질의 가교 결합에 의한, 활성화된 마우스 T 세포의 시험관내 세포자살 유발을 나타낸 도면이다.

이하, 본 발명의 실시를 위한 실시예들이다. 이들 실시예는 어떠한 방식으로든 본 발명의 범위를 제한하지 않는다.

실시예 1: 항-T 세포의 세포자살 유도 단백질("TAIP") 단일클론 항체의 제조

원하는 항체를 분비하는 하이브리도마를 생산하기 위하여, 잘 알려진 Kohler 및 Milstein((1976) European Journal of Immunology 6: 511-519)의 세포 융합 방법을 적용하여 TAIP-특이적 단일클론 항체를 제조하였다. 콘카노발린 A(ConA)-활성화된 Balb/c 비장 T 세포가 주입된 햄스터 유래 항체-생산 세포를 골수종 세포주와 융합시켜, 항체 분비성 하이브리도마를 제조하였다. 두 군집의 세포는 폴리에틸렌 글리콜을 이용하여 융합시켰고, 얻어지는 항체 생산 세포를 클로닝하여 표준 조직 배양 방법으로 증식시켰다. 이러한 방법에 따라 제조한 하나의 하이브리도마는, 시험관내에서 T 세포의 세포자살을 유도할 수 있으며 생체내에서 T 세포를 고갈시킬 수 있는 TAB4로 명명된 단일클론 항체를 분비한다. TAB4에 의해 인지된 단백질을 T 세포의 세포자살 유도성 단백질(TAIP)로 명명하였다.

C57BL/6J(B6) 및 BALB/c 마우스는 잭슨 실험실(Bar Harbor, ME)에서 구입하였다. 시리안 햄스터(Syrian hamster)는 국립 대만 대학교 의과대학의 동물 핵심 시설(Animal Core Facility, National Taiwan University Medical College)에서 구입하였다.

TAB4 하이브리도마의 농축된 배양 상층액은 20,000 xg로 10분간 회전시킨 다음, 상층액을 결합성 완충액(0.1M 소듐 아세테이트, pH5.0)으로 1:1 비율로 희석하 였다. 단백질 G 칼럼(대략 1 ㎖의 충전 부피)을 3 내지 5 ㎖의 상기 결합 완충액으로 3회 세척하였다. 세척한 배양 상청액을 단백질 G 칼럼에 주입하고, 칼럼 통과물(flow-through)을 수집하여 이를 다시 상기 칼럼에 주입하였다. 상기 칼럼을 6 내지 10 ㎖의 결합 완충액으로 세척하고, 결합된 항체를 5 ㎖의 용리 완충액(0.1 M의 글리신-HCl, pH 2.8)으로 용리시켰다. 각 분획은 용리된 항체를 1 ㎖씩 함유하였고, 1 ㎖의 각 분획과 50 ㎕의 1M Tris-HCl(pH 7.5)를 혼합하여, 용리된 분획의 pH를 중성으로 조정하였다. 상기 항체를 함유하는 분획들을 혼합해, 2 ℓ의 PBS, pH 7.4에 대해 매 회의 투석 시간을 3시간씩으로 하여 3회에 걸쳐 투석하였다. Bio-Rad 단백질 분석법(BIO-RAD, Hercules, CA)을 이용하여 Bradford가 제시한 절차에 따라 상기 항체 샘플 내 단백질의 농도를 측정하였다.

실시예 2: 마우스의 비장 세포 현탁액의 제조 및 T 세포의 활성화와 증식

마우스 비장을 8 ㎖의 HBSS(Hank's balanced salt solution)에 침지하고, 멸균 커버 슬립으로 저민 다음 15 ㎖의 원심분리관(Costar)에 옮겨 넣어, 200xg로 5분간 원심분리하였다. 상청액을 버리고, 원심분리관벽을 가볍게 두드려 세포 펠렛을 잔존하는 완충액에 재현탁하였다. 오염시킨 적혈구(RBC)에 1 ㎖의 적혈구 용해 완충액(0.6 M의 NH₄Cl, 0.17 M의 Tris-base, pH 7.65)을 첨가하여 용해시킨 뒤, 실온에서 2분간 배양한 다음, 9 ㎖의 HBSS와 함께 신속하게 담금질(quenching)하였다. 이들 세포를 200 xg로 5분간 펠렛화하고, 2회 세척하여, RPMI 배지에 재현탁하였다. 혈구계(Cambridge Scientific Inc.) 및 트리판 블루 배제법(Trypan blue exclusion)으로, 상기 혼합물 내 세포 농도 및 생존성을 평가하였다.

RPMI 배지에서의 상기 비장 세포의 최종 농도가 3×10⁶/㎖가 되도록 조정하고, 최종 농도가 2 ㎍/㎖가 되도록 콘카노발린 A를 첨가하여 T 세포를 활성화시켰다. 상기 세포 현탁액을 6-웰 배양판(5 ㎖/웰) 또는 10㎝ 배양 디쉬(10 ㎖/디쉬)에 옮기고, 37℃, 5% CO₂ 하에서 48시간 동안 배양하여 수거하였다. 활성화된 T 세포를 포함하는 활성화된 비장 세포들을, 5 ㎖의 HBSS에 재현탁하고, 원심분리관 내 5 ㎖의 55% Percoll 용액의 상층에 조심스럽게 적층하였다. 이 때, 분리층이 붕괴되지 않도록 주의하였다. 상기 세포는 25℃에서 1,900xg로 13분간 연속 원심분리하였다. 증식시킨 T 세포를 두 층의 계면에서 수집하여 HBSS로 2회 세척하여 실험에 준비하였다.

실시예 3: 활성화된 T 세포의 세포자살

활성화된 T 세포(실시예 2)를 최종 농도가 5×10⁵ 셀/㎖이 되도록 5 ng/㎖의 IL-2를 함유하는 RPMI 배지에 재현탁하고, 표 1에 나타낸 조건에 따라 대조군 Ig, TAB4 또는 항-CD3으로 처리하였다.

(표 1)

실험군	처리^*
음성 대조군	3 ㎍/㎖의 햄스터 Ig 5 ng/㎖의 IL-2 3 ㎍/㎖의 가교 항체(항-햄스터 Ig)
TAB4	3 ㎍/㎖의 TAB4 햄스터 mAb 5 ng/㎖의 IL-2 3 ㎍/㎖의 가교 항체(항-햄스터 Ig)
양성 대조군	1 ㎍/㎖의 항-CD3 mAb 5 ng/㎖의 IL-2 1 ㎍/㎖의 가교 항체(항-마우스 Ig)
^*: 배지 내 명기된 반응제의 최종 농도

이를 18 내지 24 시간 배양한 뒤, 7-AAD 세포자살 분석법을 이용하여 각 배양물의 세포자살 정도를 평가하였다. 처리된 세포를 FACS 튜브(Falcon)로 옮기고, 차가운 FACS 용액(PBS 내 1% 소의 태아 혈청, 0.05%의 소듐 아자이드)으로 2회 세척하고, 4℃에서 200xg로 펠렛화하였다. 상기 세포의 최종 농도가 1-2×10⁷ 세포/㎖가 되도록, 차가운 FACS 용액에 재현탁하였다. 이를 염색하기 위하여, 재현탁 세포 0.1 ㎖을 7-AAD와 혼합하여 최종 농도가 2 ㎍/㎖가 되도록 한 다음, 4℃의 암실에서 20분간 배양하였다. 끝으로, 염색된 세포는 차가운 FACS 용액으로 2회 세척하고, 0.5 ㎖의 FACS 용액에 재현탁하여 BD LSR 유세포분석기(Beckton Dickison 제조)로 분석하였다.

도 1은 활성화된 T 세포가 TAB4(항-TAIP)-매개성 세포자살 신호에 감응하였을때의 시간 경과에 따른 실험 결과이다. 마우스의 비장세포를 Con-A로 활성화시키고, IL-2 함유 배지에서 유지시켰다. 활성화된 T 세포를 배수 및 재현탁하고, TAB4 단일클론 항체 또는 가교결합제로서 항-햄스터 IgG 항체의 존재 하에 대조군 햄스터 IgG와 접촉시켰다. 첫째 날에는, 낮은 수준(6.5%)의 세포자살성 세포사를 유도하는 TAIP 가교 능력이 입증되었다. 그러나, TAB4로 유도된 세포자살율은 투여 2일째에 17%로 증가하였고, 4일째에 52%로 정점에 달했다가, 6일째에 44%로 감소하였다. 단지, IL-2만을 처리한 배양물과 비교할 때, 대조군인 상기 햄스터 IgG는 특이적으로 T 세포의 세포자살성 사망을 유도하지 않았다. 항-CD3(양성 대조군)은 활성화 후 48시간 경과시에, T 세포의 세포자살을 38%로 유도하였다(데이터는 나타내지 않음).

실시예 4: 상이한 조직 내에서의 TAIP 항원의 발현

세포를 차가운 FACS 용액(PBS 내 1%의 소의 태아 혈청, 0.05%의 소듐 아자이드)으로 2회 세척하고, FACS 튜브(Falcon)내에서 4℃, 200xg로 펠렛화하였다. 상기 세포는 최종 농도 1×10⁷ 세포/㎖로 차가운 FACS 용액에 재현탁하고, FACS 튜브(Falcon)내 재현탁된 세포 분액 0.1 ㎖을 각 분석에 사용하였다. 표면 염색으로, 최종 농도 2 ㎍/㎖로 TAB4 단일클론 항체 또는 대조군인 햄스터 Ig를 상기 세포에 첨가하고, 이 혼합물을 4℃ 암실에서 30분간 배양하였다. 상기 세포는 차가운 FACS로 1회 세척하고, 이어서 (1) 비장 세포는 차가운 100 ㎕ FACS 용액 내의 사이크롬-접합된 항-CD3 항체(2 ㎍/㎖), FITC-접합된 항-햄스터 Ig, 및 PE-접합된 항-CD8/CD4/CD19/CD11b/pan-NK/I-A/I-E/Mac-3 항체(2 ㎍/㎖)를 이용해 염색하고, (2) 흉선세포는 차가운 100 ㎕의 FACS 용액 내의 FITC-접합된 항-햄스터 Ig, PE-접합된 항-CD8, 및 사이크롬-접합된 항-CD4 항체(2 ㎍/㎖)를 이용하여 염색하였다. 반응 은 4℃의 암실에서 30분간 수행하였다. 끝으로, 염색된 세포들을 차가운 FACS 용액으로 2회 세척하고, 1 ㎖의 FACS 용액에 재현탁하여, BD LSR 유세포분석기(Beckton Dickison 제조)를 이용하여 분석하였다.

도 3 및 도 4는 다양한 하위 군집의 비장세포 및 흉선세포에서의 TAIP 항원의 분포를 FACS 분석으로 나타낸 것이다. 도 3에 나타낸 바와 같이, CD19⁺ B 세포는 표면에 TAIP 단백질을 검출가능한 수준으로 소량 발현하였다. CD3⁺ T 세포 및 NK 세포 분획에서는 다량의 TAIP 단백질이 검출되었다. CD4⁺, CD8⁺ 및 CD4⁺8⁺ 흉선 T 세포의 대부분에서는 다량의 TAIP 단백질이 발현되었다. 반면, TAIP 단백질은 CD4^-8^- 흉선 T 세포의 소군집에서만 발현되었다(도 4).

뇌, 흉선, 심장, 폐, 간, 위, 신장, 비장 및 피부를 포함한, B6 및 BALB/c 마우스에서 얻은 조직을 수집하여, 10% 포름알데하이드로 실온에서 하룻밤 동안 고정하고, 파라핀 블록으로 포매하였다. Leica RM 2135 마이크로톰을 이용하여 상기 파라핀 블록으로부터 4 ㎛ 두께의 조직 절편을 준비하고, 45℃ 물에 분산시킨 뒤, 코팅된 슬라이드 위에 두었다. 이 슬라이드를 37℃에서 건조시켜 다음 실험을 위해 준비해 두었다.

상기 조직의 파라핀 절편을 함유하는 슬라이드의 왁스를 제거하고, 표준 프로토콜에 따라 자일렌-100% 에탄올을 차례로 통과시켜 건조하고, 끝으로 100% 에탄올 내에 보관하였다. 상기 절편들을 표준 프로토콜에 따라 100% 에탄올-90% 에탄 올-85% 에탄올-70% 에탄올-PBS로 차례로 통과시키고 최종 PBS 용액에서 재수화하였다. 이하의 반응은 모두 습한 상자안에서 수행하였다. 상기 조질 절편은차단 완충액(1%의 일반 염소 혈청)에서 실온에서 1시간(또는 4℃에서 하룻밤 동안) 배양하여, 비특이적 결합을 차단하였다. 상기 차단 완충액을 제거하고, 상기 조직에 TAB4 또는 정상 햄스터 Ig(1:200로 희석)를 첨가하여, 실온에서 1시간 동안(또는 4℃에서 하룻밤 동안) 계속 배양하였다. 상기 절편은 PBS로 매회 5분간 2회 세척하여 1차 항체를 제거하고, 1:250의 비로 희석한 알칼리성 포스파타아제-접합된 염소의 항-햄스터 Ig와 반응시켜, 실온에서 1시간 동안 배양하였다. 다시, 상기 절편들을 PBS로 매회 5분간 2회 세척하여, 항체-효소 접합체를 제거하고, BCIP/NBT 기질 용액을 이용하여 실온의 암실 내에서 30분간 발색시켰다. 상기 절편들을 다시 PBS로 세척하여 과잉의 효소 기질을 제거하고, PBS-에탄올-자일렌으로 차례로 통과시켜 탈수한 뒤, 현미경 상에 탑재시켰다.

그 결과, TAIP 단백질이 실험에 이용된 조직들 중 골수 유래의 조직에서만 발현된 것으로 나타났다.

실시예 5: 세포 표면의 바이오틴화 및 TAIP 항체의 면역침전

5×10⁷ RL♂1 또는 NIH-3T3 세포를 0.5 ㎎/㎖ 설포-NHS-바이오틴(Pierce)을 포함하는 1 ㎖의 PBS내에서, 얼음위에서 30분간 두어 표면을 바이오틴화하였다. 상기 세포를 0.5 ㎖의 DMEM(Dulbecco's modified Eagle's medium, Life Technologies, Inc.)과 함께 얼음위에 10분 동안 두어, 반응을 종료하였다. 세포 는 1 ㎖의 DMEM으로 1회 세척한 다음, 1 ㎖의 PBS(phosphate-buffered saline)로 2회 세척하였다.

표지된 세포는 완전 단백질분해효소 저해제 칵테일(Roche)을 함유하는 차가운 용해 완충액(1% Triton X-100, 20 mM의 Tris-HCl, pH 8.0, 160 mM NaCl, 1 mM의 CaCl₂)을 이용하여 15분간, 5.0×10⁷ 세포/㎖의 밀도로 용해(lysis)시키고, 불용성 물질은 10,000xg로 10분간 펠렛화하였다. 상기 및 하기 모든 단계들은 4℃에서 수행하였다. 면역침전 시, 용해물(lysate)은 50 ㎕의 충전된 단백질 G-세파로스(Amersham Pharmacia Biotech)와 함께 30분간 미리 두어, 비특이적으로 결합하는 단백질을 제거하였다. 비드는 펠렛화하고, 상청액의 분액(통상적으로 5.0×10⁷ 개의 세포에 해당함)은 햄스터의 정상 혈청에서 얻은 10 ㎍의 mAb TAB4 또는 IgG가 미리 주입된 20 ㎕의 단백질 G-세파로스와 함께 두었다. 이를 4℃에서 4 시간 동안 둔 다음, 수지를 세척 완충액(0.05%의 Triton X-100, 50 mM의 Tris-HCl, pH 8.5, 400 mM의 NaCl, 1 mM의 CaCl₂, 1 ㎎/㎖의 오발부민)으로 4회 세척하고, 상기 400 mM NaCl 대신 250 mM NaCl을 함유하는 유사 세척 완충액으로 2회 세척하였다. TAB4에 특이적으로 결합한 단백질은 50 ㎕의 1×SDS 샘플 완충액으로 용리시켰다. 용리된 단백질은 8%의 SDS-PAGE로 분리하여, 니트로셀룰로스막(Millipore)으로 이동시켰다. 막으로부터, 퍼옥시다아제-접합된 아비딘(Avidin)(PharMingen)을 이용하여 바이오틴화된 단백질을 분석하고, 화학발광제(Chemiluminescence reagent, NEN^TM Life Science Products)로 발색시켰다.

도 2에 나타낸 바와 같이, TAB4에 의해 RL.1 세포(TAIP⁺ T 세포)에서 약 120 kD 분자량의 바이오틴화된 표면 단백질이 확인되었으나, 3T3 세포(TAIP^- 세포)에서는 확인되지 않았다. 반면, 햄스터의 정상 혈청으로 코팅된 단백질 G 세파로스에서는 상기 120 kDa의 단백질이 검출되지 않았다. 이러한 결과는 120 kDa의 단백질이 T 세포의 표면에서 단일클론 항체 TAB4에 의해 항원으로 인지됨을 시사한다.

실시예 6: 생체내 T 세포의 고갈

T 세포 및 기타 세포 군집에 대한 TAB4의 생체내 효과를 조사하기 위하여, 300 ㎍의 TAB4 또는 대조군 햄스터 Ig를 마우스의 복강내에 주사하고, 4일째에 전체 세포의 수 및 FACS에 의한 세포 표면 마커를 분석하기 위하여, 비장 세포, 흉선세포 및 말초혈액 단핵 세포를 수거하였다.

FACS 분석을 위하여, 상기 세포를 4℃에서 20분간 2%의 파라포름알데하이드로 고정하고, 2회 세척하여, 차가운 FACS 용액에 최종 농도 1×10⁷ 셀/㎖로 재현탁하였다. 각각의 분석에는 FACS 튜브(Falcon) 내 재현탁 세포 분액 100 ㎕를 사용하였다. 최종 농도 2 ㎕/㎎로 TAB4 또는 대조군인 햄스터 Ig를 상기 세포에 첨가하고, 그 혼합물을 4℃의 암실에서 30분간 두었다. 상기 세포는 차가운 FACS로 1회 세척하고, (1) 비장 세포는 차가운 FACS 용액 100 ㎕내의 사이크롬-접합된 항-CD3 항체(2 ㎍/㎖), FITC-접합된 항-햄스터 Ig, 및 PE-접합된 항- CD8/CD4/CD19/CD11b/pan-NK/I-A/I-E/Mac-3 항체(2 ㎍/㎖)와 반응시키고, (2) 흉선세포는 차가운 FACS 용액 100 ㎕내의 FITC-접합된 항-햄스터 Ig, PE-접합된 항-CD8, 및 사이크롬-접합된 항-CD4(2 ㎍/㎖)와 반응시켰다. 상기 반응은 4℃의 암실에서 30분간 수행하였다. 끝으로, 염색된 세포를 차가운 FACS 용액으로 2회 세척하고, 1,000 ㎕의 FACS 용액에 재현탁하여, BD LSR 유세포분석기(Beckton Dickison 제조)를 이용하여 분석하였다.

주사 4일 후, 말초혈액 백혈구(PBL)내 CD3⁺T 세포의 백분율은, 대조군 마우스에서의 36.7%로부터 TAB4로 처리한 마우스에서의 4.1%까지 감소하였다(표 2). TAB4 처리시, 비장세포의 총 수는 다소 감소하였다. 그러나, TAB4로 처리한 마우스에서의 CD3⁺ T 세포수는 62%, NK 세포수는 50%로 감소하였고, CD19+B 세포의 총 수는 약간 증가하였다. TAB4-처리된 마우스에서 회수된 전체 흉선세포 수는 대조군에서 나타난 수준의 48%에 불과하였다(52% 감소). 또한, CD4+T 세포를 제외한, 모든 CD8+, CD4+CD8+ 및 CD4-CD8-T 세포가 감소하였으며, CD4+CD8+ 하위 군집이 크게 영향을 받았다(64.7% 감소),.

(표 2)

비장
×10⁶	비처리	정상 햄스터 Ig	TA-B4 처리	고갈율(%)
전체 비장 세포	123	93.3	105	14.6
CD3⁺ T 세포	32.8	28.4	12.4	62.2
CD3^-CD19⁺	72.2	53.4	72.9	-0.8
CD3^-NK⁺	3.6	5.4	1.80	50

말초혈액 백혈구
	비처리	정상 햄스터 Ig	TA-B4 처리	고갈율(%)
CD3⁺ T 세포	36.7%	36%	4.1%	88.8%

흉선
×10⁶	비처리	정상 햄스터 Ig	TA-B4 처리	고갈율(%)
전체 흉선세포	94	229	45	52.1
CD4⁺	9.3	28.4	10.9	-16.6
CD8⁺	5.2	7.7	3.6	30.3
CD4⁺CD8⁺	73.8	182	26	64.7
CD4^- CD8^-	5.6	10.5	4.5	19.3

(3번의 실험에서 얻은 데이터)

실시예 7: 항-TAIP 항체는 IL-2 또는 TNF-α의 분비를 유도하지 않음

Balb/c 마우스(H-2d)에 300 ㎍의 TAB4 또는 대조군 햄스터 Ig를 복강 내에 주사하였다. 주사한 지 7일 후, 비장세포를 분리하고 미토마이신 C로 처리된 C3H(H-2K) 비장세포(자극제로서)와 함께, 배양시 반응자로 사용하였다. 3일 뒤, 배양 상청액을 수거하고, ELISA 세트(PharMingen)로 IL-2 함량을 측정하였다. 도 5에 나타낸 바와 같이, IL-2의 생성은, 대조군 마우스에 비해 TAB4로 처리된 마우스에서 유래된 반응자 세포에서 더 억제되었다. 또한, IL-2 및 TNF-a의 혈장 수준을 분석한 결과, 대조군 및 TAB4로 처리된 마우스의 혈청에서는 유의할만한 IL-2(또는 TNF-a)의 수준 차이는 관찰되지 않았다. IL-2의 생성은 T 세포 활성에 중추적이기 때문에, 상기 결과를 통해, TAB4와 같은 TAIP-특이성 항체가 생체내에서 자가면역 질환 및 이식 거부반응과 관련된 T 세포 및 대조군의 불필요한 T-세포 매개의 면역 반응을 조절하는데 사용될 수 있음을 확인할 수 있다.

실시예 8: 이식 거부반응을 예방하기 위한 항-TAIP 항체의 용도

8주령 내지 12주령의 마우스(Jackson Laboratory에서 입수함)를 아세프로마진 말레이트(Acepromazin maleate, Fermenta Animal Health Co., Kansas City, MO)로 마취시켰다. 상기 마우스에 피부 이식을 수행하기 7일 전에, 흉선을 절제하지 않은 수령체 C57BL/6 마우스(H-2^b)에 500 ㎍의 TAB4 또는 아이소타입의 대조군 항체를 복강 내 투여하였다. 투여 7일 뒤, 항체가 사전 처리된 C57BL/6 마우스의 외측 옆구리에, 완전한 이형인 미스매치 Balb/cj 마우스(H-2^d)의 외측 옆구리 피부를 이식하였다. 이식 7일 후, 상기 마우스에 다시 500 ㎍의 TAB4 또는 아이소타입의 대조군 항체를 주사하였다. 이식 후, 상기 마우스들을 매일 관찰하였다. 공여체 피부의 50%가 괴사한 경우, 상기 이식이 거부된 것으로 간주하였다. 도 7은 이식 생존률을 나타낸다(n=8). 그 결과는, TAB4 항체 처리가 동종이형 피부 이식편의 생존을 연장시킴을 보여준다.

실시예 9: PSGL-1로서의 TAIP 동정

CD162라고도 명명된 P-셀렉틴 당단백질 리간드-1(PSGL-1)은 T 세포를 포함하는 백혈구 상에서 발현되는 주요 P-셀렉틴 리간드이다(Sako et al.(1993) Cell 75:1179; Vachino et al.(1995) J. Biol. Chem. 270:21966; Veldman et al.(1995) J. Biol. Chem. 270:16470). TAIP의 분자량 및 이량화 경향과 같은 생화학적 특성은, TAB4가 PSGL-1과 유사할 수 있음을 제시한다. 이들 두 항원간의 관계를 조사하기 위하여, 1) TAB4에 의해 침전된 항원이 상업적으로 입수가능한 항-PSGL1 항체에 의해 인지될 수 있는지, 및 2) 항-PSGL-1 항체가 세포 융해물로부터 TAB4를 고 갈시킬 수 있는지의 여부를 테스트하였다.

RL♂1 T 세포를 1.0×10⁸ 세포/㎖의 밀도로 완전한 단백질분해효소 저해제 칵테일을 함유하는 용해 완충액(1%의 Triton X-100, 20 mM의 Tris-HCl, pH 8.0, 160 mM의 NaCl, 1 mM의 CaCl₂)을 이용하여 1시간 동안 용해시키고, 불용성 물질을 10,000xg에서 10분간 펠렛화하였다. 상기 및 후속의 단계들은 모두 4℃에서 수행하였다. 5.0×10⁷ 개의 세포에 해당되는 융해물을 10 ㎍의 항-PSGL-1 mAb(클론 2PH1, PharMingen, San Diego, CA), 항-TAIP mAb, TAB4, 또는 정상 햄스터의 혈청에서 얻은 IgG가 미리 주입된 20 ㎕의 단백질 G-세파로스와 함께 두었다. 이를 4℃에서 4시간 둔 다음, 세척 완충액(0.05%의 Triton X-100, 50 mM의 Tris-HCl, pH 8.5, 400 mM의 NaCl, 1 mM의 CaCl₂, 1 ㎎/㎖의 오발부민)으로 상기 비드를 5회 세척하고, 상기 400 mM NaCl 대신 250 mM NaCl을 함유하는 동일한 세척 완충액으로 다시 2회 세척하였다. 결합된 단백질은 40 ㎕의 1×SDS 샘플 완충액으로 용리시켰다. 용리된 단백질은 6%의 SDS-PAGE로 분리하고, 니트로셀룰로스막으로 이동시켰다. 상기 막을 항-PSGL-1 mAb으로 면역블롯하고, 퍼옥시다아제-접합된 염소 항-랫 IgG(H+L) 및 이후 화학발광제(Renaissance, NEN)로 가시화하였다.

표면이 바이오틴화된 RL♂1 T 세포를 1.0×10⁸ 세포/㎖의 밀도로 용해 완충액으로 용해하였다. 상기 세포 추출물은 40㎕의 단백질 G-세파로스에 결합된 20 ㎍의 항체와 함께 4℃에서 하룻밤 동안 배양하였다. 고갈은 항-PSGL-1 mAb(2PH1) 또는 대조군 랫의 IgG와, TAB4 또는 대조용 햄스터의 정상 혈청을 이용하여 실시하였다. 고갈된 용해물은 각각 TAB4 또는 항-PSGL-1-mAb를 이용하여 추가로 면역침전을 수행하였다. 면역침전물은 6%의 SDS-폴리아크릴아미드 겔상에 분리시키고, 형광법(fluorography)으로 검출하였다. 도 6에 나타낸 바와 같이, 항-PSGL-1 항체는 T 세포 용해물로부터 TAIP 단백질을 고갈시킬 수 있다. 아울러, 항-TAIP 항체(TAB4)로 면역침전된 단백질은, 웨스턴 분석의 항-PSGL-1 항체에 의해 인지될 수 있다.

실시예 10: 항-PSGL-1 항체에 의한 인간 T 세포의 세포자살 유도

인간 T 세포의 세포자살에서 PSGL-1의 역할을 확인하기 위하여, 활성화된 인간 T 세포가 PSGL-1-매개의 세포자살 신호에 감응하였을때의 시간에 따른 실험을 수행하였다. 인간 T 세포를 식물적혈구 응집소(PHA: phytohemagglutinin) 미토겐으로 자극하고, IL-2를 함유하는 배지에서 증식시켰다. 활성화된 T 세포를 수집한 뒤, IL-2 및 가교 항체의 존재 하에 항-PSGL-1를 투여하였다.

건강한 성인의 말초혈액을 채취하여 헤파린을 첨가한 다음, Ficoll-Paque Plus(Pharmacia Biotech)를 이용하여 차별적인 밀도를 기준으로 말초혈액의 단핵 세포(PBMC)를 보강하였다. 상기 PBMC를 1%의 PHA(Life Technologies, GibcoBRL)로 48시간 동안 활성화시키고, 이어서 분석기간 동안 인간 재조합 IL-2(5 ng/㎖) 내에 유지시켰다. 항-인간 PSGL-1 항체의 세포자살 유도 능력을 평가하기 위하여, 활성화된 세포를 (1) 1 ㎍의 항-PSGL-1 항체 클론 KPL-1(BD PharMingen)과 가교결합제인 토끼의 항-마우스 Ig(0.5 ㎍/㎖)(Jackson ImmunoResearch Laboratories); (2) 아이소타입의 대조군인 정제 마우스 Ig와 가교결합제인 토끼 항-마우스 Ig; 또는 (3) 가교결합제인 토끼의 항-마우스 Ig 단독으로 처리하였다. 처리 6시간 후, 항-아넥신 V(Annexin V, BD PharMingen) 및 PI(Sigma)로 염색하는 FACS에 따라 초기 세포자살 세포의 백분율을 측정하였다.

도 8에 나타낸 바와 같이, 항-PSGL-1 항체와 가교결합제를 이용하여 PSGL-1에 의해 유발되는 시그널링은, PHA-활성화된 인간 PBMC(대개 T 세포)에서 유의한 수준의 세포자살을 유발하였다. 항-PSGL-1 처리된 배지 내에서의 세포자살성 세포의 백분율은 3일째에 8.5%에서 8일째에 24%로 증가하였다. 아이소타입의 매치된 대조군 및 단독 가교 항체 모두 이들 세포들에 아무런 영향을 주지 않았다.

실시예 11: 자가면역성 질환을 치료하기 위한 항-PSGL-1 작용제 항체의 용도

자가면역성 당뇨병에 잘 걸리는 동물인 NOD-비만 마우스를 표준 조건 하에서 사육하였다. 약 20주령의 NOD 마우스에서 자발성 당뇨병이 발병되었다. 실험군으로서, 항-PSGL-1 항체(TAB4)를 14, 15 및 17주령의 마우스 당 300 ㎍으로 3회에 걸쳐 마우스의 복강 내에 투여하였다. 24주령 및 26주령의 마우스에 동량을 2회 더 추가 주사하였다. 대조군에도 상기와 동량의 햄스터 Ig를 투여하였다. 이 마우스들이 15주령이 된 이후에, 메디-테스트 글루코스 스트립(Macherey-Nagel, 독일)에 의해 당뇨(glucose uria)를 매주 2회 모니터링하였다. 비단식성 뇨내 당 농도가 2회 연속 측정값으로 300 ㎎/l 이상인 경우는 당뇨병으로 간주하였다.

도 9에 나타낸 바와 같이, TAB4(항-PSGL-1) 항체 처리군은 대조군 항체 처리 군에 비해, 유의할만한 보호효과를 나타내었다. 따라서, 항-PSGL-1 항체 처리로 자가면역성 T 세포를 억제할 수 있고, I형 당뇨병의 발병을 지연시킬 수 있다.

실시예 12: 활성화된 T 세포에 대한 P-셀렉틴, E-셀렉틴 및 L-셀렉틴의 결합성

활성화된 T 세포에 대한 셀렉틴(P-셀렉틴, E-셀렉틴 및 L-셀렉틴)의 결합 능력을 결정하기 위해, C57BL/6 마우스로부터 신선하게 준비한 비장세포를 활성화시키고, 2, 4 및 6일에 회수하였다. 비활성화된 T 세포(즉, 0일날 신선하게 준비한 비장세포)를 또한 분석하였다. 2일째 샘플은 2일간 DMEM + 10% FBS에 용해된 콘카나발린 A(ConA) 2 ug/ml로 활성화시킨 비장세포 3 x 10⁶ cells/ml로 구성된다. 살아있는 세포는 피콜 농도구배 분리에 의해 분리하였다. 4일째 샘플은 3일간 Con A로 활성화시키고 다음날 IL-2 5 ng/ml을 함유하고 있는 배지에서 유지시킨 세포로부터 수득하였다. 6일째 샘플은 3일간 Con A로 활성화시킨 다음 3일간 IL-2 5 ng/ml을 함유하고 있는 배지에서 유지시킨 세포로부터 수득하였다.

샘플을 FACS 분석으로 검증하기 위해, 웰당 2 x 10⁵의 0일, 2일, 4일 및 6일 세포를, 20 ug/ml에서 0.156 ug/ml까지의 2배수 연속 희석 농도의 인간 IgG1의 Fc 부분과 융합된 마우스 P-셀렉틴, E- 셀렉틴 또는 L-셀렉틴(R&D Systems, Minneapolis, MN)과 40 ul/웰로 함께 4 ℃에서 30시간 두었다. 배양한 다음, 세포를 lx FACScan 완충액(베를린의 Biochrom AG 사의, 칼슘 및 마그네슘 이온 무함유성 1 x PBS 및 2% FBS). 샘플은 항-Thy1.2 95 ul/웰 및 3.25 ug/ml의 이차 반응시 약(FITC-anti human IgG, which is specific to Fc fragment, purchased from Jackson hnmunoResearch Laboratories, Inc., West Grove, PA)을 30분간 4 ℃에서 추가적으로 두었고, 이후 1X FACS 완충액으로 세척하였다.

FACSCalibur 분석 결과는 도 10에 나타나 있다. 20 ug/ml 농도에서, 활성화된 마우스 T 세포에 대한 P-셀렉틴의 결합이 점차적으로 증가하여 4일에 피크를 이루었으며, 6일에 조금 감소하였다. E-셀렉틴의 결합은 2일에서 4일사이에 현저하게 증가하여 6일에 피크를 유지하였다. 활성화된 마우스 T 세포에 대한 L-셀렉틴 결합이 관찰되지 않았으며, 활성화 기간, 즉 0일에서 6일 사이에 변화가 관찰되지 않았다. L-셀렉틴의 결과는, L-셀렉틴의 그의 리간드에 대한 낮은 결합 친화성 때문일 수 있다. 또한 3종의 셀렉틴을 저 농도로 실험에서 사용한 경우에서도, 유사한 결과를 얻을 수 있었다.

실시예 13: E-셀렉틴 및 P-셀렉틴의 다중 형태는 활성화된 T 세포의 세포자살을 유발한다

96-웰 플레이트(NUNC)를 1x PBS에 용해된 20 ug/ml 농도의 인간 항-Fc Ig 50 ul로 4 ℃에서 하룻밤동안 코팅하고, 1% BSA를 사용하여 2시간동안 37 ℃에서 블록킹하였고, 상온에서 2시간동안 셀렉틴-인간 Fc 융합체(0.063 - 5 ug/ml) 50 ul과 두었다. 모든 실험 단계들에서, 각 웰은 1X PBS로 5회 완전하게 세정하였다. 미리 4일간 ConA를 사용하여 활성화시킨 T 세포 2 x 10⁵를 각 웰에 첨가하여 37 ℃에서 5시간 배양한 다음 200 xg로 4 ℃에서 5분간 원심분리하였다. 활성화된 T 세포 를 함유하고 있는 수득한 펠렛을 아넥신 V-바이오틴 접합체와 함께 상온에서 15분간 배양하고, 이후 아비딘 접합체(SA-beta-gal, 1: 5000 희석)와 37 ℃에서 30분간 배양하였다. 각 반응마다, 각 웰을 아넥신 V 결합 완충액으로 3회 세척하였다. Z-완충 혼합액(Z-완충액 20ml 내의 2-머캅토에탄올 54 ul) 110 ul 및 ONPG(0.04 g/ml) 30 ul과 함께 4 ℃에서 하룻밤 두어 발색시켰다. 420 nm에서 광학적 밀도를 측정 및 기록하였다.

ConA로 활성화된 T 세포의 셀렉틴 유도성 세포자살 수준은, 인간 IgG1의 Fc와 융합된 P-셀렉틴(도 11A) 또는 E-셀렉틴(도 11B)의 농도 증가(0.063 ug/ml - 5 ug/ml)에 따라 증가하였다. 햄스터 항체 TAB4는 활성화된 T 세포의 세포자살을 유발하였으며(실시예 1), 본 실험에 양성 대조군으로 사용되었다. 음성대조군인 항-인간 Fc, 인간 IgG(HIg) 및 BSA는 세포자살을 유발하지 않았다. L-셀렉틴 인간 Fc 융합 단백질(도 11c)의 존재시, 활성화된 T 세포에 L-셀렉틴의 결합 실패와 일관되게, 활성화된 T 세포에 L-셀렉틴은 잘 결합하지 못하였다(실시예 12)

종합하여, P-셀렉틴 또는 E-셀렉틴의 결합성 단편 및 인간 Fc 단편을 함유하고 있는 플레이트에 결합되어 있는 융합 단백질은 활성화된 T 세포의 세포자살을 유도하였다.

실시예 14: 가용성 P-셀렉틴-Fc 융합 단백질의 가교 결합은 활성화된 T 세포의 세포자살을 유도한다.

전술한 바와 같이, 마우스의 셀렉틴(P-셀렉틴, E-셀렉틴 및 L-셀렉틴)을 인간 IgG1의 Fc 부위에 융합시켜 가용가능한 이량성 융합 단백질을 형성하였다. 상 기 가용성 셀렉틴이 활성화된 T 세포의 세포자살을 유도할 수 있는지를 평가하기 위해, 플레이트에 결합된 항-인간 Fc Ig를 생략한 점을 제외하고는 실시예 13과 동일한 실험을 수행하였다. P-셀렉틴 융합 단백질(이량체)의 가용성 형태가 단독으로 존재하는 경우에는, 거의 미량 또는 소량의 활성화된 T 세포의 세포자살이 이루어졌다(도 12). 그러나 가교-링커(항-인간 Fc)를 첨가하면, 세포자살 활성은 대략 플레이트에 결합된 항체의 존재시 유발되는 세포자살 수준으로 실질적으로 증가되었다. 항-인간 Fc, 인간 Ig(HIg) 또는 BSA 어느 것도 세포자살을 유도하지 않는다.

P-셀렉틴-Fc 융합 단백질에서 수득된 바와 같은 유사한 결과를 E-셀렉틴-Fc 융합 단백질에서 얻을 수 있었다. 또한, 플레이트에 결합된 (다중 형태)의 L-셀렉틴의 결과와 일관되게, L-셀렉틴 융합 단배질의 가용성 형태는 활성화된 T 세포의 세포자살을 유도하지 않았다.

기타 실시예들

본 발명은 상세한 설명과 함께 개시되지만, 상술한 설명은 본 발명을 상세하게 설명하기 위한 것으로 본 발명의 범위를 제한하지 않는다. 본 발명의 다른 측면, 장점 및 변형은 다음에 첨부된 청구의 범위에 포함된다.

Claims

개체의 T 세포 매개성 면역반응을 방지 또는 감소시키는 방법으로서, 상기 방법은

과도하거나 또는 불필요한 T 세포 매개성 면역반응을 특징으로 하는 증상을 가지거나, 상기 증상을 가질 위험이 있을 것으로 진단된 개체를 선별하는 단계; 및

T 세포 표면에서 적어도 2개의 P-셀렉틴(Selectin) 당단백질 리간드(PSGL-1)에 결합하는 다중 화합물(multimeric compound)을, 상기 개체에게 투여하는 단계를 포함하며,

상기 다중 화합물은, 각각 (i) PSGL-1에 결합하는 결합성 도메인과 (ii) 이종의 아미노산 서열을 포함하는 두개의 폴리펩티드 체인을 포함하며,

상기 폴리펩티드 체인들은 이종의 아미노산 서열을 통해 연결되어 다중 화합물(multimeric compound)을 형성하며,

상기 T 세포 표면에서 상기 다중 화합물이 적어도 2개의 PSGL-1 단백질에 결합함으로써, T 세포의 사멸을 초래하는 신호 전달 경로가 유도되고, 그에 따라 개체의 T 세포 매개성 면역반응이 방지 또는 감소되는 것을 특징으로 하는, 개체의 T 세포 매개성 면역반응을 방지 또는 감소시키는 방법.
제 1항에 있어서, 상기 다중 화합물은 동형-다중 화합물(homo- multimeric compound)인 것을 특징으로 하는, 개체의 T 세포 매개성 면역반응을 방지 또는 감 소시키는 방법.
제 1항에 있어서, 상기 다중 화합물은 이형-다중 화합물(hetero-multimeric compound)인 것을 특징으로 하는, 개체의 T 세포 매개성 면역반응을 방지 또는 감소시키는 방법.
제 1항에 있어서, 상기 이종의 아미노산 서열은 세포의 표면 리셉터에 대한 결합 부위를 포함하는 것을 특징으로 하는, 개체의 T 세포 매개성 면역반응을 방지 또는 감소시키는 방법.
제 1항에 있어서, 상기 결합성 도메인은 P-셀렉틴의 세포외 도메인 또는 그것의 PSGL-1-결합 단편을 포함하는 것을 특징으로 하는, 개체의 T 세포 매개성 면역반응을 방지 또는 감소시키는 방법.
제 1항에 있어서, 상기 결합성 도메인은 E-셀렉틴의 세포외 도메인 또는 그것의 PSGL-1-결합 단편을 포함하는 것을 특징으로 하는, 개체의 T 세포 매개성 면역반응을 방지 또는 감소시키는 방법.
제 1항에 있어서, 상기 결합성 도메인은 L-셀렉틴의 세포외 도메인 또는 그것의 PSGL-1-결합 단편을 포함하는 것을 특징으로 하는, 개체의 T 세포 매개성 면 역반응을 방지 또는 감소시키는 방법.
제 1항에 있어서, 상기 결합성 도메인은 항-PSGL-1 항체의 항원 결합성 도메인 또는 그것의 단편을 포함하는 것을 특징으로 하는, 개체의 T 세포 매개성 면역반응을 방지 또는 감소시키는 방법.
제 1항에 있어서, 상기 결합성 도메인은 파지 디스플레이 라이브러리(phage display library)로부터 선택된 PSGL-1 결합성 폴리펩티드를 포함하는 것을 특징으로 하는, 개체의 T 세포 매개성 면역반응을 방지 또는 감소시키는 방법.
제 1항에 있어서, 상기 폴리펩티드 체인들은 이종의 아미노산 서열을 통해 공유결합으로 연결되어 다중 화합물을 형성하는 것을 특징으로 하는, 개체의 T 세포 매개성 면역반응을 방지 또는 감소시키는 방법.
제 10항에 있어서, 상기 공유결합은 이황화 결합인 것을 특징으로 하는, 개체의 T 세포 매개성 면역반응을 방지 또는 감소시키는 방법.
제 1항에 있어서, 상기 이종의 아미노산 서열은 면역글로불린의 중쇄 불변 부위(immunoglobulin heavy chain constant region)를 포함하는 것을 특징으로 하는, 개체의 T 세포 매개성 면역반응을 방지 또는 감소시키는 방법.
제 1항에 있어서, 이종의 아미노산 서열을 통해 다중 화합물에 결합하며 T 세포 표면에서 복수개의 PSGL-1 항원의 가교 결합을 유도하는 물질을 개체에게 투여하는 단계를 더 포함하는 것을 특징으로 하는, 개체의 T 세포 매개성 면역반응을 방지 또는 감소시키는 방법.
제 1항에 있어서, 염증성 질환을 가지는 것으로 진단된 개체를 선별하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는, 개체의 T 세포 매개성 면역반응을 방지 또는 감소시키는 방법.
제 1항에 있어서, 자가면역 질환을 가지는 것으로 진단된 개체를 선별하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는, 개체의 T 세포 매개성 면역반응을 방지 또는 감소시키는 방법.
제 1항에 있어서, 동종 이식(allogeneic transplant) 또는 이종 이식(xenogeneic transplant)을 받았거나 받게될 개체를 선별하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는, 개체의 T 세포 매개성 면역반응을 방지 또는 감소시키는 방법.
제 1항에 있어서, 알레르기 질환을 가지는 것으로 진단된 개체를 선별하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는, 개체의 T 세포 매개성 면역반응을 방지 또는 감소시키는 방법.
제 1항에 있어서, T 세포 암을 가지는 것으로 진단된 개체를 선별하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는, 개체의 T 세포 매개성 면역반응을 방지 또는 감소시키는 방법.
제 1항에 있어서, 상기 T 세포는 활성화된 T 세포인 것을 특징으로 하는, 개체의 T 세포 매개성 면역반응을 방지 또는 감소시키는 방법.
제 1항에 있어서, 상기 방법은 다중 화합물을 투여하기 전에 개체로부터 채취한 제1 생물학적 샘플에서 T 세포의 수를 검출하는 단계 및 다중 화합물을 투여한 후 개체로부터 채취한 제2 생물학적 샘플의 T 세포 수와 비교하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는, 개체의 T 세포 매개성 면역반응을 방지 또는 감소시키는 방법.
제 1항에 있어서, 상기 방법은 다중 화합물을 투여하기 전에 개체로부터 채취한 제1 생물학적 샘플에서 T 세포의 생물학적 활성을 검출하는 단계, 및 다중 화합물을 투여한 후 개체로부터 채취한 제2 생물학적 샘플내 T 세포의 생물학적 활성과 비교하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는, 개체의 T 세포 매개성 면역반응을 방지 또는 감소시키는 방법.
제 1항에 있어서, 상기 투여로 개체내 활성화된 T 세포가 적어도 10% 고갈되는 것을 특징으로 하는, 개체의 T 세포 매개성 면역반응을 방지 또는 감소시키는 방법.
세포 표면에 PSGL-1을 발현하는 T 세포 또는 NK(natural killer) 세포를 제공하는 단계; 및

상기 T 세포 또는 NK 세포의 표면에서 적어도 2개의 PSGL-1 단백질에 결합하는 다중 화합물을 상기 T 세포 또는 NK 세포에 접촉시키는 단계를 포함하며,

상기 다중 화합물은, 각각 (i) PSGL-1에 결합하는 결합성 도메인과 (ii) 이종의 아미노산 서열을 포함하는 두개의 폴리펩티드 체인을 포함하며,

상기 폴리펩티드 체인들은 이종의 아미노산 서열을 통해 연결되어 다중 화합물을 형성하며,

상기 T 세포 또는 NK 세포 표면에서 상기 다중 화합물이 적어도 2개의 PSGL-1 단백질에 결합함으로써, T 세포 또는 NK 세포 사멸을 초래하는 신호 전달 경로가 유도되는 것을 특징으로 하는, T 세포 또는 NK 세포의 사멸을 유발하는 방법.
제 23항에 있어서, 상기 다중 화합물은 동형-다중 화합물인 것을 특징으로 하는, T 세포 또는 NK 세포의 사멸을 유발하는 방법.
제 23항에 있어서, 상기 다중 화합물은 이형-다중 화합물인 것을 특징으로 하는, T 세포 또는 NK 세포의 사멸을 유발하는 방법.
제 23항에 있어서, 상기 이종의 아미노산 서열은 세포의 표면 리셉터에 대한 결합 부위를 포함하는 것을 특징으로 하는, T 세포 또는 NK 세포의 사멸을 유발하는 방법.
제 23항에 있어서, 상기 결합성 도메인은 P-셀렉틴의 세포외 도메인 또는 그것의 PSGL-1-결합 단편을 포함하는 것을 특징으로 하는, T 세포 또는 NK 세포의 사멸을 유발하는 방법.
제 23항에 있어서, 상기 결합성 도메인은 E-셀렉틴의 세포외 도메인 또는 그것의 PSGL-1-결합 단편을 포함하는 것을 특징으로 하는, T 세포 또는 NK 세포의 사멸을 유발하는 방법.
제 23항에 있어서, 상기 결합성 도메인은 L-셀렉틴의 세포외 도메인 또는 그것의 PSGL-1-결합 단편을 포함하는 것을 특징으로 하는, T 세포 또는 NK 세포의 사멸을 유발하는 방법.
제 23항에 있어서, 상기 결합성 도메인은 항-PSGL-1 항체의 항원 결합성 도 메인 또는 그것의 단편을 포함하는 것을 특징으로 하는, T 세포 또는 NK 세포의 사멸을 유발하는 방법.
제 23항에 있어서, 상기 결합성 도메인은 파지 디스플레이 라이브러리로부터 선택된 PSGL-1 결합성 폴리펩티드를 포함하는 것을 특징으로 하는, T 세포 또는 NK 세포의 사멸을 유발하는 방법.
제 23항에 있어서, 상기 폴리펩티드 체인들은 이종의 아미노산 서열을 통해 공유결합으로 연결되어 다중 화합물을 형성하는 것을 특징으로 하는, T 세포 또는 NK 세포의 사멸을 유발하는 방법.
제 32항에 있어서, 상기 공유결합은 이황화결합인 것을 특징으로 하는, T 세포 또는 NK 세포의 사멸을 유발하는 방법.
제 23항에 있어서, 상기 이종의 아미노산 서열은 면역글로불린의 중쇄 불변 부위(immunoglobulin heavy chain constant region)를 포함하는 것을 특징으로 하는, T 세포 또는 NK 세포의 사멸을 유발하는 방법.
제 23항에 있어서, 이종의 아미노산 서열을 통해 다중 화합물에 결합하며 T 세포 표면에서 복수개의 PSGL-1 항원과 가교 결합을 유도하는 물질을, 개체에게 투 여하는 단계를 더 포함하는 것을 특징으로 하는, T 세포 또는 NK 세포의 사멸을 유발하는 방법.
제 23항에 있어서, 활성화된 T 세포의 사멸을 유도하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는, T 세포 또는 NK 세포의 사멸을 유발하는 방법.
제 23항에 있어서, 상기 방법은 다중 화합물과 접촉시킨 다음 T 세포 또는 NK 세포의 생존성을 평가하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는, T 세포 또는 NK 세포의 사멸을 유발하는 방법.
제 23항에 있어서, 상기 방법은 다중 화합물과 접촉시킨 다음 T 세포 또는 NK 세포의 생물학적 활성을 평가하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는, T 세포 또는 NK 세포의 사멸을 유발하는 방법.
T 세포의 표면에서 적어도 2개의 PSGL-1 단백질에 결합하는 다중 화합물로서, 상기 다중 화합물은 각각 (i) PSGL-1에 결합하는 결합성 도메인과 (ii) 이종의 아미노산 서열을 포함하는 두개의 폴리펩티드 체인을 포함하며, 상기 폴리펩티드 체인들은 이종의 아미노산 서열을 통해 연결되어 다중 화합물을 형성하며, 상기 T 세포 표면에서 상기 다중 화합물이 적어도 2개의 PSGL-1 단백질에 결합함으로써 T 세포의 사멸을 초래하는 신호 전달 경로를 유도하는, 다중 화합물; 및

염증, 자가면역, 이식 거부반응, 알레르기 증상 또는 T 세포 암의 치료를 위한 상기 다중 화합물의 사용 설명서를 포함하는 키트.