TW201012472A - Modulators of P-selectin glycoprotein ligand 1 - Google Patents

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201012472 六、發明說明： 【發明所屬之技術領域】 本發明係有關於用來調控免疫反應的藥物組合物與方 法。 【先前技術】 在治療如發炎、自體免疫疾病、移植排斥、過敏性疾 • 病與τ細胞衍化癌症等疾病的過程中，控制不需要發生 的免疫反應是主要關鍵。過度侵略性的T細胞活性可藉 由免疫抑制作用或誘發免疫耐受性 tolerance)來加以控制。耐受性（tolerance)係指免疫系統 對抗原不做出任何反應的狀態。可藉著持續使用藥物來 降低免疫系統對抗原發生反應而達到免疫抑制作用。當 進行器官移植時，τ細胞在同種異源抗體（all〇antigens) ❹ 的免疫反應中扮演著必要的角色。現今的免疫抑治療方 法大多使用皮質類固醇（cortic〇ster〇id)、環孢靈素 (cyclosporin)或雷帕黴素(rapamycin)來抑制主要的τ細 胞生長因子「介白素-2 (interleukin-2, IL-2)」的轉錄機 制（transcription)，或抑制介白素依賴型的細胞增生（il_2 dependent proliferation) ° 細胞凋亡（Apoptosis)被認為具有維持適奮免疫系統功 能的生理作用，並且是用來除去無用或缺陷細胞的主要 機制（Kabelitz et a1· Ιιη·η〇1· Today 14:338-340 (1993); 201012472

Raff，Nature:356:397-399 (1992))。來自細胞内或細胞外 的各種訊號會影響細胞存活或死亡。抗體與如Fas (或稱 CD95，分子量 43kD)、TNFR2(分子量 75kD)、CD2(分子 - 量45kD)及CTLA-4(分子量33kD)等T細胞表面上的分子 . 結合可誘使Τ細胞發生細胞调亡反應（Osborne，Curr.

Opin. Immunol. 8:245-248 (1996); Lin et al. J. Immunol. 158:598-603 (1997); Zhang et al. Nature:377:348-350 (1995); Lai et al. Eur. J. Immunol. 25:3243-3248 (1995); φ

Mollereau et al. J. Immunol. 156:3184-3190 (1996); Gribben et al. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 92:811-815 (1995))。但由於Fas與TNFR2並不僅表現在免疫細胞 上’在其他數種重要器官（如肝臟）亦表現此兩種分子， 因此無法達成藉由Fas與TNFR2分子來控制多餘T細胞 的目的。此種表現型態限制了結合Fas與TNPR2分子之 兩種抗體在治療上的應用範圍。 參 選擇素（Selectins)、整合素（integrin)與免疫球蛋白超家 族成貝（immunoglobulin (Ig) superfamily members)這三 類黏附分子（adhesion molecule)對.白血球與血小板之 間’或白血球及血小板與細胞外基質（extracellular matrix) 及血管内皮（vascular end〇thelium)之間的交互作用來說 相當重要（Springer，Nature 346:425 (1990); Osborn，Cell 62:3 (1990); Hynes, Cell 69:11 (1992))。表現在一種細胞 上的黏附分子會與另一種細胞上的他種黏附分子結合而 形成配位體-受.體配對（ligand_recept〇r pair)。 201012472 選擇素家族係由P-選擇素（或稱CD62、CD62P、 GMP140 與 PADGEM)、E-選擇素（或稱 ELAM-1 與 CD62E) 及 L_選擇素（或稱 LECAM-1、Mel-14、LAM-1 與 CD62L) 所組成。上述之選择素具有高度相似性，並皆含有一個 約120個胺基酸的^端凝集素結構區（N_terminal lecUn domain)、一個類内皮生長因子結構區（EGF_Hke d〇main)、以及數個與補體調節.蛋白（complement regulatory pr〇tein)之多重短重複序列（multiple short consensus repeat, SCR)相似的結構區。並且在上述之結 構區的後方接著一個穿膜區（transmenbrane domain)與一 個短的細胞質尾端（Cyt〇plasmic tail) (Siegelman et al.， Science 243:1165-1 172 (1989); Lasky et al., Cell 56:1045-1055 (1989); Tedder et al., J. Exp. Med.

170:123-133 (1989); Johnson et al., Cell 56:1033-1044 (1989); Bevilacqua et al.，Proc. Natl. Acad. Sci. USA 84:9238-9242 (1987) , Bevilacqua et al., Science . ... . 243:1160-1165 (1989), Bevilacqua et al., J. Clin. Invest. 91:379-387 (1993), Camerini et al., Nature 280:496-498 (1989))。關於與細胞受體結合特性，這些選擇素彼此間 有一些重疊但又不甚相同之專一性（Bevilacqua et al.，J. Clin. Invest. 91:379-387 (1993); Feize, Current Opinion in Struct. Biol. 3:701-710 (1993); Berg et al., Biochem. Biophys. Res. Comm. 184:1048-105 5 (1992); Foxall et al., J. Cell Biol. 1 17:895-902 (1992); Larsen et al., J. Biol. 201012472

Chem. 267:11104-11110 (1992); Polley et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88:6224-6228 (1991)) 〇 發炎時’ P-選擇素、E-選擇素與L-選擇素會調節最初 之白血球與内皮細胞、及血小板與白血球之間的黏附作 用（Bevilacqua et al” 1993，supra)。並經證a月這三種選擇 素皆參與白血球與已活化内皮細胞間的初始「滾轉」交 互作用（initial "rolling" interaction) (von Andrian et al.，

Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88:7538-7542 (1991); Ley et ® al., Blood 77:2553-2555 (1991); Abassi et al., J. Clin. Invest. 92:2719-2730 (1993); Dore et al., Blood 82:1308-1316 (1993); Jones et al., Biophys. J. 65:1560-1569 (1993); Mayadas et al., Cell 74:541-554 (1993))。表現在活化血小板與内皮細胞上的5>_選擇素會 與大部分白血球上的細胞表面蛋白結合（McEver et al.，J. Biol. Chem. 250:9799-9804 (1984); Hsu-Lin et al., J. Biol. ❹ Chem· 264:8121-9126 (1.984))。E-選擇素則會表現在細胞 激素活化内皮細胞上’例如受腫瘤壞死因子_a(TNF-a)或 介白素-2等細胞激素刺激6-8小時後，内皮細胞上的E-選擇素便會與大部分的白血.球_結合..（McEver et al.，J. Clin. Invest. 100:485-492 (1997); Bevilacqua et al., 1987, supra; Bevilacqua et al.，1989，supra)。而表現在大部分 白血球上的L-選擇素則會與一些内皮細胞或其他白血球 上的細胞表面蛋白結合（Gallatin et al,，Nature 30.4:30-34 .. · . .... .. (1983); Berg et al., Immunol. Rev. 108:5-18 (1989); Berg 201012472 et al., J. Cell. Biol. 114:343-349 (1991), Hallman et al., Biochem. Biophys. Res. Comm. 174:236-243 (1991);

Smith et al., J. Clin. Invest. 87:609-618 (1991); Spertini et al·，J· Immunol. 147:2565-25.73 (1991))。並且已證實'這· 三種選擇素都能與細胞表面蛋白「P-選擇素醣蛋白配位 體1」結合，並且P-選擇素聽蛋白配位體1幾乎只表現 在白血球及一些特殊T細胞與自然殺手細胞上。P_選擇 素糖蛋白配位體1的轉錄後修飾（Posttranslational ® modification)對於P-選擇素醣蛋白配位鱧1與p_選擇 素、E-選擇素與L-選擇素的結合來說是必要條件（MeEver et al.，J. Clin. Invest” 1997，supra)。 【發明内容】 本發明係有關於利用T細胞表面抗原r p_選擇素聽蛋 白配位體1」之結合作用來耗盡τ細胞’及/或誘使T細 ❹ 胞走向凋亡。耗盡T細胞的方法對於治療那些具有過量 或不需要發生的T細胞調控性免疫反應，或具有過量與 不需要發生的T細胞增生現象的疾病特別有效。舉例來 說，耗盡T細胞可降低或消除伴隨發炎、自體免疫疾病、 移植排斥、過敏性疾病與/或丁細胞衍化癌症而來之的T 細胞活性與增生。本發明包含利用具？_選擇素酶蛋白配 位體1功能的調節因子來預防或降低τ細胞調控性免疫 反應的方法，以及篩選具有卜選擇素醣蛋白配位體1功 201012472 能之調節因子的方法。 本發明一態樣在於提供一種預防或降低患者之τ細 胞調控性免疫反應的方法。此方法包含下列步驟：選 擇一個診斷為患有或可能罹患過度或不需要的τ細胞 調控性免疫反應之病患；使此患者服用一種可與τ細 胞表面上之P_選擇素醣蛋白配位體丨結合的化合物。 其中，此組合物與P_選擇素醣蛋白配位體丨結合會誘 鲁發出一個信號傳遞路徑而造成τ細胞死亡，進而可預 防或降低患者的τ細胞調控性免疫反應。 可用於這類治療方法中的化合物包含抗體或對選 擇素醣蛋白配位體1具有專一性結合力的抗原結合片 段（antigen binding fragment)。在一些較佳實施例中， 化合物可以是能與P_選擇素醣蛋白配位體丨專一性結 合的單株抗體：在一較佳實施例中，本發明方法包含 使用一種能與單株抗體結合之藥劑，並使Τ細胞表面 ❹上的P-選擇素醣蛋白配位體i之間發生交聯反應 (cross-linking) ° 在一些較佳實施例中’本發明方法包含使T細胞表 面上的P-選擇素醣蛋白配位體i發生交聯反應。其中， 此交聯反應會誘發一會導致T細胞死亡的信息傳遞路 徑。 在一些較佳實施例中，本發明方法包含下列步驟：(i) 選擇一個經診斷為具有或可能發生過度或不需要發生 之τ細胞調控性免疫反應的患者;（ii)對該患者施用一 201012472 種能與τ細胞上至少兩個p -選擇素醣蛋白配位體1結 合的多聚複合體化合物’其中’此多聚複合體化合物 含有兩條多胜肽鏈（polypeptide chain)，每條多胜肽鏈含有 (a)—可與p_選擇素醣蛋白配位體丨結合的結合區 (binding domain) ’以及（b) —段異種胺基酸序列 (heterologous amino acid sequence)，其中，該兩條多 胜肽鏈透過異種胺基酸序列的連接而形成該多聚複合 體化合物，且該多聚複合體化合物與T細胞表面上至 ® 少兩個P-選擇素醣蛋白配位體1結合後會誘發出一可 導致T細胞死亡的信息傳遞路徑，以預防或降低該患 者的T細胞調控性免疫反應。 多聚複合體化合物可為一種同多聚複合體化合物 (homo-multimeric compound)或異多聚複合體化合物 (hetero-multimeric compound)。結合區可選擇性的含有 P-選擇素胞外結構區或其中之一 p-選擇素醣蛋白配位 Φ 體1結合片段、E-選擇素胞外結構區或其中之一 ！>_選 擇素醣蛋白配位體1結合片段、L-選擇素胞外結構區 或其中之一 P-選擇素醣蛋白配位體1結合片段、抗p_ 選擇素醣蛋白配位體1抗體或其P-選擇素醣蛋白配位 體1結合片段、選自嗟菌體表現庫（phage display library)中 的一P-選擇素醣蛋白配位體1結合多胜肽或上述片段 之任意組合。 在某些較佳實施例中，多聚複合體化合物不包含抗 p-選擇素醣蛋白配位體1抗體或一可與p_選擇素醣蛋 201012472 白配位體1結合的抗體片段。 異種胺基酸序列可選擇性地包含一段細胞表.面.受體 結合.區域（cell surface receptor binding region)，例如免疫球蛋白 -長鏈怪定區（immunoglobulin heavy chain constant region)。在某此 較佳實施例中’多胜肽鏈可透過異種胺基酸序列的共 價連結’如雙硫鍵連結（disulfide linked)，而形成多聚 複合體化合物。 _ 在某些較佳實施例中’本方法包含一道附加步驟， 係對患者施用一種藥物，該藥物係利用異種胺基酸序 列來與多聚複合體化合物結合並誘使T細胞表面上的 數個P-選擇素醣蛋白配位體1發生交聯反應。 在某些較佳實施例中，本發明方法包含選擇可能罹 患或已罹患自體免疫疾病之病患的步驟。在另一個實 施例中，本方法包含選擇罹患發炎疾病之病患的步 驟。又在另一較佳實施例中，本方法包含選擇接受或 ® 預計接受同種異體（allogeneic)或異種異體（xen〇geneic) 移植之病患的步驟。在另一較佳實施例中，本方法包 含選擇可能患有過敏性疾病之病患的步驟。在另一較 佳實施例中，本方法包含選擇一個診斷為患有τ細胞 衍化癌症之病患的步驟。 在一些較佳實施例中’ T細胞為已活化τ細胞。在 —較佳實施例中，τ細胞是CD4+ Τ細胞。在另一較佳 實施例中，Τ細胞是CD8+ Τ細胞。 在某些較佳實施例中’本方法包括偵測自第一生物 201012472 樣本的τ細胞數量，此第— 生物樣本係取自尚未服用 化合物（如多聚複合體化合物） 切）之患者身上。待同一患者 使用一化合物後（如多聚複人 1硬。體化合物），再自已服甩化 合物之患者身上取得的第-4 &乂 乐—生物樣本，並偵測第二生 物樣本中的Τ細胞數量。比棱 斗从谋士也 牧第一生物樣本與第二生 物樣本的偵測結果。

在某些較佳實施例中’本方法包含偵測第一生物樣 本中的Τ細胞生物活性的步驟。第一生物樣本係取自 於尚未服用化合物（如多聚複合體化合物）之患者身 上。並將測得結果與第二生物槎〇 ώ认τ Α 王初揉。口中的Τ細胞活性相 比較。第二生物樣本係取自已服 J π « G服用化合物（如多聚複合 體化合物）之該患者身上。 在某些較佳實施例中，用藥後可使患者的已活化τ 細胞至少減少10%V在某些較佳實施例中，用藥後可 使患者的已活化Τ細胞至少減少1〇%、20%、3〇%、 40%、50%或更多。 在某些較佳實施例中，當已活化τ細胞與抗體、抗 體上的抗原結合片段或多聚複合體化合物接觸後，抗 體、抗體上的抗原結合片段或多聚複合體化合物可使 患者身體中至少10%的已活化τ細胞死亡。在某些較 佳實施例中，該用藥可誘使患者身體中至少10%、 20%、30%、40%、50%或更多的已活化丁細胞死亡。 並可在任何時間债測Τ細胞死亡現象，例如可在使用 抗體、抗體上的抗原結合片段或多聚複合體化合物後 11 201012472 的一、二、三、四、五、六、七或更多天來偵測τ細 胞的死亡現象。 另一方面’本發明之特點在於引起τ細胞或自然殺 • 手細胞死亡的方法。此方法包含下列步驟:提供一種 會在細胞表面上表現Ρ-選擇素醣蛋白配位體1的Τ細 胞或自然殺手細胞；使Τ細胞與自然殺手細胞與一種 會與其細胞表面上之Ρ_選擇素醣蛋白配位體1結合的 _ 化合物接觸；其中該化合物與Τ細胞或自然殺手細胞 表面上之Ρ-選擇素醣蛋白配位體1的結合反應會誘發 出一可造成τ細胞或自然殺手細胞死亡的訊息傳遞路 徑。 本方法使用的化合物可包含抗體或該抗體中可與ρ_ 選擇素醣蛋白配位體i結合的抗原結合片段。在一較 佳實施例中’化合物是與p_選擇素醣蛋白配位體1專 一性結合的單株抗體。在一較佳實施例中，本方法包 鲁 含使單株抗體與一藥劑接觸的步驟，此藥劑會與單株 抗體結合’並使τ細胞或自然殺手細胞表面上的數個 - P-選擇素酿蛋白配位體丨發生交聯反應。 .在一較佳實施例中，本發明包含下列步驟：⑴提供 一種會在細胞表面上表現p_選擇素醣蛋白配位體〗的 T細胞或自然殺手細胞；（ii)使該τ細胞或自然殺手細 胞與一種能在細胞表面與至少兩個卜選擇素醣蛋白配 位體1分子結合的多聚複合體化合物接解：其中，該 多聚複合體化合物含有兩條多胜肽鏈，每條多胜肽鏈 12 201012472 含有（a) —可與P-選擇素醣蛋白配位體丨結合的結合 區，以及（b) —異種胺基酸序列，其中，該兩條多胜肽 鏈透過異種胺基酸序列的連結而形成該多聚複合體化 合物，其中當該多聚複合體化合物與τ細胞或自然殺 手細胞表面上的兩個Ρ-選擇素醣蛋白配位體1相結合 時，會誘發出一可使Τ細胞或自然殺手細胞死亡的訊 息傳導路徑。

該多複合體化合物可為同多聚複合體化合物或異多 聚複合體化合物。結合區可選擇性的包含卜選擇素胞 外結構區或其中之一 ρ_選擇素醣蛋白配位體丨結合片 段、Ε-選擇素胞外結構區或其中之一 ρ_選擇素醣蛋白 配位體1結合片段、L-選擇素胞外結構區或其中之一 Ρ-選擇素醣蛋白配位體"吉合片m選擇素醣蛋 白配位體！抗體或其P_選擇素酿蛋白配…結合片 段、選自㈣體表現庫相P_選擇素酶蛋白配位體」 結合多胜肽或上述片段之任意組合。 異種胺基酸序列可選擇性地含有一段細胞表面受體 結合區域’例如免疫球蛋白長鏈恆定區。在某些較佳 實施例中，多胜肽鏈透過異種胺基酸列 結，如雙韻連結™ w驗物 在-些較佳實施例中，本方法包含—道使多聚複合 體化合物與-藥劑接觸的附加步驟。此藥劑透過里種 胺基酸序列與多聚複合體化合物連結，並使τ細胞表 面上數個 ρ_選擇素醣蛋白 配位體1發生交聯反應。 13 201012472 在些較佳實施例中，本方法包括促使τ細胞或自 然殺手細胞表面上數個Ρ-選擇素醣蛋白配位體1抗原 發生父聯反應的步驟。其中，此交聯反應會引發一個 導致Τ、.、田胞或自然殺手細胞死亡的訊息傳導路徑。 本發明方法之部分較佳實施例中，Τ細胞是已活化Τ 細胞。在一實施例中，Τ細胞是CD4 + T細胞。在另一 實施例中’ T細胞是cD8+T細胞。

在本方法之„卩分較佳實施例中本方法包含評估T 細胞或自然殺手細胞與化合物（如，多聚複合體化合物） 接觸後之細胞存活率的步驟。

在本方法之部分較佳實施例中，本方法包含評估T 細胞或自然殺手細胞與化合物（如，多聚複合體化合物） 接觸後之生物活性的步驟。 在一些較佳實施射，本方法包括弓丨起已活化τ細 胞的死亡〇 Ρ-選擇素醣蛋 本發明另一態樣之特點在於一種筛選 白配位體1之調節因子的方法。 此方法包括步驟：提 供一種在細胞表面上表現ρ_選擇去 俾京醣蛋白配位體1的 細胞；使此細胞與一種測試物質垃 月供觸；以及測量細胞 與測試物質接觸後的細胞·存话.率 質是否為Ρ -選擇素聽蛋白.配位體 在一實施例中，本方法包含〜 物質引起的細胞死亡.現象，藉此 為Ρ-選擇素聰蛋白配位體1的調 ’藉此決定該測試物 】的調節因子。 #驟用來偵測由測試 列斷該測試物質是否 節因子。 14 201012472 在—實施例中，測試物質可為抗體或該抗體之p_選 擇素醣蛋白配位體1的抗原結合片段。在-較佳實施 例中’測試物質是—種與P_選擇素醣蛋白配位體1專 一性結合的單株抗體。在一較佳實施例中，本方法包 含使單株抗體與一種會與單株抗體結合的藥劑接觸， 並使細胞表面上數個P_選擇素醣蛋白配位體i發生交 聯反應。 在實施例中，本方法包含使細胞表面上數個p-選 擇素酷蛋白配位體1抗原發生交聯反應的步驟。其中， 交聯反應會引發一個導致細胞死亡的訊息傳導路徑。 在一較佳實施例中’ τ細胞是已活化T細胞。在一 實施例中’ T細胞是一種CD4 + T細胞》在另一實施例 中，T細胞是一種CD8 + T細胞。 在一較佳實施例中，本方法包含製造大量測試物 質’並將測试物質與藥學上可接受.之載體（phajjjjaceuticaUy acceptable carrier)配方成一藥劑的步驟。 本發明另一態樣之特點在於提供一種藥劑套組，其 含有：一種可與T細胞表面之p_選擇素醣蛋白配位體 1結合的化合物’以及使用說明書；其中，該化合物與 T細胞表面之P-選擇素醣蛋白配位體1結合會引發一 個使T細胞死亡的訊息傳導路徑；使用說明書則用來 說明該化合物的使用方法，解釋此化合物可用來洽療 具有過度或不需要的T細胞調控性免疫反應，或治療 過度或不需要的τ細胞增生現象，如發炎、自體免疫 15 201012472 疾病、移植排斥、過敏狀況或τ細胞癌。 在一實施例中，此藥劑套組含有⑴一多聚複合趙化 合物’其可與τ細胞表面上至少兩個Ρ-選擇素醣蛋白 配位體1結合，其中此多聚複合體化合物具有兩條多 胜肽鏈’每條多胜肽鏈含有（a)一段能與ρ-選擇素_蛋 白配位體1結合的結合區，以及（b) —段異種胺基酸序 列。其中，多胜肽鏈係透過異種胺基酸序列的連結而 形成多聚複合體化合物，並且此多聚複合體化合物與τ 一 細胞表面上至少兩個ρ_選擇素醣蛋白配位體1的結合 反應會引起使Τ細胞死亡的訊息傳導路徑。此外此藥 劑套組亦含有（ii)一使用說明書，用來說明該化合物的 使用方法’以及說明此藥劑套組可用來治療具有過度 或不需要的T細胞調控性免疫反應，或用來治療過度 或不需要的T細胞增生現象，如發炎、自體免疫疾病、 移植排斥、過敏狀況或τ細胞癌❶ φ 本發明之優點在於能引發T細胞耗盡或τ細胞调亡 的現象’卻不會產生不需要或傷害性的免疫反應。例 如，在某些較佳實施例中，患者使用本發明之一種抗 P -選擇素餹蛋.白配位.體1抗體或一種多聚複合體化合 物並不會使如介白素-2或腫瘤壞死因子_α等發炎細胞 激素（inflammatory cytokine)的量發生不正常的升高情 況。 本發明之另一.優點在於使用一種可引起T細胞〉周亡 的協同性（agonistic)組合物來耗盡T細胞。因此，本發 16 201012472 明提供一種異於被動性免疫抑制之主動性免疫抑制方 法，來引發主動性免疫抑制作用；該被動性免疫抑制 係肇因於使用拮抗性組合物（antag〇nistic composition)(例如，拮抗性抗p_選擇素醣蛋白配位體ι 抗體或拮抗性可溶選擇素片段）利用與免疫受體結合來 防止受該些受體調控的免疫活化反應。 本發明之另一優點在於僅對幾乎只表現在白血球（特 .別疋T細胞或自然殺手細胞）細胞表面上的p_選擇素醣 蛋白配位體1發生作用。因此，本發明之化合物不會 使他種細胞（例如肝細胞）發生明顯的細胞凋亡現象。在 不引起致命的細胞激素反應與傷害其他器官的情況 下針對τ細胞或自然殺手細胞（特別是參與移植排斥 反應的CD3細胞）進行選擇性耗盡作用是免疫抑制藥 劑所渴望的特性。 除非特別定義’本發明中使用之所有專業與科學性 ❹用語之意義與習知技藝者所熟悉之意義相同。同時， 尚有其他方法或材料與本發明中所敘述之方法與材料 似或均等’並可作為本發明之實施或測試示範，並 在下列内容中敘述之。文中所提到之所有發表文獻、 丨2明案件、專利以及其他參考資料均完整併入參 田使用術a吾具爭議時，以本發明之說明書為基準。 此外’說明書中所敘述之方法與材料僅作為說明示範 之用，並不能用來限制本發明之範圍。 其他特徵與優點將藉由下列詳細敘述與申 17 201012472 請專利範圍來加以說明。 【實施方式】 本發明係有關於利用調控τ細胞表面之卜選擇素醣 ' 蛋白配位體1的功能來調控τ細胞活性的方法。本發 明内容所敘述之P_選擇素醣蛋白配位體丨與協同性組 合物的結合，能造成τ細胞耗盡與/或使τ細胞走向細 參 胞凋亡。因此協同性組合物可作為控制免疫相關症狀 的治療藥劑，例如發炎、自體免疫疾病、移植排斥、 過敏性疾病與/或τ細胞衍化癌症。協同性組合物亦可 用來引起任何具有過量τ細胞數量或活性之生物樣本 的Τ細胞耗盡作用。 Ρ·選擇素餹蛋白配位體l(PSGL-l) P-選擇素醣蛋白配位體1係為一種細胞表面黏附分 ❹ 子，其表現在中性白血球（neutrophils)、T淋巴細胞與b 淋巴細胞（T and B-lymphocyte)、自然殺手細胞、單核 球（monocyte)、樹突細胞（dendritic cell)與原始人類CD34 . . .. 造血前.驅，細胞（primitive human... CD34 hematopoietic progenitor cell) 上。透過P-選擇素醣蛋白配位體1與選擇素的結合， 使得P-選擇素膽蛋白配位體1能調控白血球在内皮組 織（endothelium)的滾轉運動，以及調控白血球穿透血管而 . . ... ... 進入發炎組織的行為。由P-選擇素醣蛋白配位體1媒 18 201012472 介之了細胞與E_選擇素及p_選擇素的結合或是τ細胞 的遷.移均受到差異性的調控。例如，...當Τ鈿胞從.原始 狀態轉變成記憶性Τ細胞時，τ細胞表面上會表現出 皮膚淋巴細·胞抗原（cut；ane〇us.lymph〇eyte antigen，CLA) 之抗原決定表位（epit〇pe)。並且，只有已活化的第一型 辅助性Τ細胞能表現出有功能的ρ_選擇素醣蛋白配位 體丨，並能移動到皮膚上的發炎區域。而第二型輔助性 Τ細胞則不具有此種功能。 Ρ-選擇素醣蛋白配位體1為一種唾液酸化黏蛋白 (sialomucin) ’其需經過特殊的唾液酸化（siaiy.iated)、海 藻醣化（fbcosylated)與硫酸化（sulfated)後才能與P-選擇素 結合。P-選擇素醣蛋白配位體1會因其筆白鏈N_端上 之聽化程度的不同及硫化位置不同而產生數種異構物 (isoformh靜止周邊血液T細胞與B細胞、淋巴細胞 株與體外活化周邊血液T細胞之P-選擇素醣蛋白配位 ❺ 體1的蛋白表現量大至相等。並且只有已活化的T細 胞會表現有功能的P -選擇素酷蛋白配位體1，並與p_ 選擇素具高親合性之結合。活化依賴性結合活性 (activation-dependent binding activity)是不同程度之轉譯後修飾 (pos.t-translational modification)造成的結果，例如可藉 著提高已活化T細胞内的α (1，3 )-海藻膽基轉移酶（aipha (l，3)fbcosyltransferases)活性來改變醣化的程度。P-選擇素醣 蛋白配位體1的異構物對L-選擇素與E-選擇素亦會展 現不同的親和性。例如，呈現皮膚淋巴細胞抗原（CLA) ... ... .. 1 19 201012472 陽性的人類T細胞會黏附E-選擇素與P-選擇素並進行 滚轉。而表現p-選擇素醣蛋白配位體1，但不具有皮 膚淋巴細胞抗原決定表位的T細胞則僅會與Ρ·選擇素 結合。此外，p_選擇素醣蛋白配位體丨與p —選擇素的 、结合係決定在末端十個胺基酸胜肽（terminal deeapeptide) 上’其中包含三個硫化的酷胺酸（tyrosine)，以及一個 醣化的息寧胺酸（threonine)。 可利用重組技術（recombinant method)與/或從生物組織中 分離出天然的P -選擇素醣蛋白配位體1以獲取p_選擇 素醣蛋白配位體1。並且，不論是以體内“” Wv〇)或體 外（ζ·« Wiro)的方法，均可在原核或真核細胞中製造p_ 選擇素醣蛋白配位體1之重組蛋白。係利用具有p_選 擇素醣蛋白配位體1基因序列的核酸序列來進行重組 蛋白製造。P -選擇素糖蛋白配位體1之核酸序列請參 考 GenBank Accession ΝΜ_00300ό。同時，用來辨識 p_ 選擇 鲁 素醣蛋白配位體1的抗體已為專業領域者所熟悉，並 且該抗體可用.來純化抗原.以及/或作為文中所敘_述之甩 途（Herron et al. (2000) Science Jun 2;288(5471)： 1653-56; WO 00/25808)。亦可在Sako等人或其他文獻中查詢到有關 P-選擇素醣蛋白配位體1更進一步的詳細敘述（1993，Cell 75:1179; Vachino et al. (1995) J. Biol. Chem. 270:21966; and Veldman et al. (1995) J. Biol- Chem. 270:16470) ° 在P-選擇素醣蛋白配位體1之重組蛋白的製造過程 中，P-選擇素醣蛋白配位體1的表現，以及〇： (1,3)-海 201012472 藻醣基轉移酶（Fuc-TVII)對Ρ·選擇素醣蛋白配位體1的 修飾作用需同時進行，才能表現出具有功能的Ρ-選擇 素糖蛋白配位體1。並且在Ρ -還擇素酷蛋白配位體1 重組蛋白的製造過程中，可選擇共轉染（cotransfaction) 一段PACE核酸序_列用來移除原胜_肽（propeptide)，與/ 或共轉染一段酪胺酸硫槔移酶（tyrosine sulfotransferase)的核酸序列。 抗P-選擇素醣蛋白配位體1抗體可用來分離盥純化 m β 生體組織中的P-選擇素醣蛋白配位體1 »任何表現P_ 選擇素醣蛋白配位體1的細胞株，如從患者身上或τ 細胞株中得到的T細胞均為P-選擇素醣蛋白配位體1 的來源。純化後的P-選擇素醣蛋白配位體1可用來進 行本發明中欽述的各種實驗。例如，純化的p_選擇素 醣蛋白配位體1可用來進行T細胞之P-選擇素糖蛋白 配位體1功能調控因子的體外篩選試驗，或作為製備 _ 辨識P-選擇素醣蛋白配位體1之抗體的免疫原 (immunogen) ° 抗P-選擇素醣蛋白配位體1抗體 P-選擇素酷蛋白配位體1(或免疫原片段或其類似物） 可用來產生本發明方法中的抗體。如上述方法，可利 用基因.重組技術或.固相合成法.（solid, phase, synthesis method)來製造P-選擇素醣蛋白配位體丨或其胜肽片 段。Ρ -選擇素醣蛋白配位體1之重組多胜肽或盆胜肽 201012472 片段可作為免疫原來製造出抗p-選擇素醣蛋白配位體 1抗體。此外，抗p_選擇素醣蛋白配位體丨抗體，如 TAB4單株抗體，又可用來純化P-選擇素醣蛋白配位體 - 1。例如可使用抗P-選擇素醣蛋白配位體1抗體來純化 . 天然結構的P-選擇素醣蛋白配位體1，而純化後的P_ 選擇素醣蛋白配位體1又可作為產生他種抗Ρ·選擇素 醣蛋白配位體1抗體的免疫原。 本發明之抗體可以是單株抗體、多株抗體（polyclonal) ® 或對P-選擇素醣蛋白配位體1具有專一性結合力的人 工抗體（engineeredantibody)。對特定抗原（如P-選擇素膽蛋 白配位體1)具有「專一性結合力」的抗體不會辨識測 試樣品中的其他分子，亦不與之結合。因此本發明之 特點在於提供數種辨識方法，用來找出可與本發明之 多胜肽結合的測試化合物（如抗體）。本發明之方法係使 測試化合物與本發明之多胜肽接觸，並藉著直接測定 φ 結合力、或加入競爭分子來阻礙測試化合物與多胜肽 結合’或利用細胞凋亡活性試驗來偵測分子結合力等 , 方法來判斷測試化合物是否能與此多胜肽結合。 . p-選擇素醣蛋白配位體1可配合如血氰蛋白（keyhole limpet hemoCyanin，KLH)等載體蛋白，並與佐劑混合 後，注射至哺乳動物宿主體内。隨後，此哺乳動物體 内所產生的抗體可利用抗原親和層析法(peptjde antigen affinity chromatography)来.加以純化。 如有需要’可將P-選擇素醣蛋白配位體丨或其抗原 22 201012472 片段注射到各種動物體内來引起免疫反應。常用動物 包括兔子、小鼠（mice)、天竺鼠（guineapig)與大鼠（rats)。 用來增加免疫反應的佐劑需配合所使用之動物種系來 - 選擇，其包括弗氏佐劑（完全佐劑與不完全佐劑）、礦物 ，膠（mineral gel)如氫氧化銘（aluminum, hydroxide)、界面 活性劑（surface active substance)如溶血卵磷脂（或稱脫 脂酸卵磷脂lysolecithin)、普羅尼克多元醇（pluronic polyols)、聚陰離子（p〇lyani〇ns)、胜肽、油乳劑（〇ii emulsions)、血氰蛋白與二硝基酚（dinitrophenol)。可 能有用的人類佐劑包括 卡介疫苗：（bacille Calmette-Guerin, BCG)與短小棒狀桿菌菌苗 (Corynebacterium parvum)。多株抗體係指存在於免疫 動物血清中的異種株（heterogeneous ’population)抗趙。 本發明中的抗體包含多株抗體、單株抗體、擬人化 或嵌合抗體（humanized or chimeric antibodie)、單鏈抗體（single ❹ chain antiody)、Fab 片段、F(ab’）2 片段與利用 Fab 表 現庫所製造出來的產物。 單株抗體係指能辨識特定抗原的同種株抗體 (homogeneous polulation)，其可利用上述之P-選擇素 蛋白配位體 1 _多胜散與融'合瘤，技術（standard hybridoma technology)來製備（Kohler et al.，Nature 256:495 [1975]; Kohler et al., Eur J Immunol 6:511 [1976]; Kohler et al., Eur J Immunol 6:292 [1976]; Hammerling et al·，Monoclonal Antibodies and T Cell 23 201012472

Hybridomas，Elsevier, Ν.Υ· [1981])。 在某些情況下’可利用培養永生性細胞株 (continuous cell line)的製造抗體方法來獲得單株抗 ' 體，..例如· Kohler 等人在期刊'Nature. 256:495 (1975).及 • 美國專利編號4,376，110之案件中所敘述的人類b細胞 融合·瘤技術（Kosbor et al·，Immunology Today 4:72 [1983]; Cole et al., Proc Natl Acad Sci USA 80:2026 [1983])’ 及 EBV 融合瘤技術（Cole et al.，Monoclonal 擊

Antibodies and Cancer Therapy, Alan R. Liss, Inc., pp. 77-96 [1983])。此類抗體可以是任意的免疫球蛋白種 類’包括IgG、IgE、IgM、IgA、IgD與任何免疫球蛋 白的次種類（subclass)。本發明之製造單株抗體的融合 瘤可採用體内或體外方式培養。而體内方式是更有效 的高濃度單株抗體製造方法。 所得到的單株抗體或多株抗體需利用西方墨點法 ❹ （western blot)或免疫沈澱.分.析法（immun〇p.recip.itation analysis)來測定其對p_選擇素醣蛋白配位體1的特異 辨識力，檢測方法可參考如Ausubel等人之論文。 對P-選擇素醣蛋白配位體1具有專一性辨識力與結 合力的抗體’特別是能與T細胞（如CD3+細胞）表面上 的P-選擇素醣蛋白配位體i抗原結合，並能引起患者 體内的T細胞耗盡或凋亡的抗p_選擇素醣蛋白配位體 1抗體方可為本發明使用。 上述之抗體具多種用途，例如，可用來配製醫療組 24 201012472 〇物以降低或消除不希望發生的免疫反應，如伴隨 發炎、自體免疫疾病、移植排斥、過敏性疾病與τ細 胞折化癌症τ細胞而來的τ細胞調控性免疫反應。亦 -可在篩選試驗中，使用上述抗體來測試待測化合物對 . Ρ-選擇素醣蛋白配位體1的結合能力。 此外’可利用剪切具有適當抗原專一性之單株抗體 基因與具有適當生物活性的人類抗體基因，並將兩者 _ 結〇的技術來製造出礙合抗體（M〇rris〇n. .et ai.，pr〇e Natl Acad Sci USA 81:685 1 [1984]; Neuberger et al., Nature 312:604 [1984]; Takeda et al., Nature 314:452 [1984])。嵌合抗體係指一種分子各部分來自不同動物 種系的分子。例如一個分子中同時具有小鼠單株抗體 之可變區與人類免疫球蛋白的恆定區。 單鍵抗體製造技術（U.S. Pat. Nos. 4,946,778,乇 and 4’704,692)亦可用來製備抗P_選擇素醣蛋白配位體i的單 Ο 鏈抗體，或其單鏈抗體片段。單鏈抗體係利用胺基酸 來橋接抗體Fv區中的長鏈(heavy chain)與短鏈(light chain)片段以形成單鏈多胜肽。 习辨識特定抗原決定表位之抗體片段的製備技術廣為 習知技藝者所熟悉。舉例來說，可利用胃蛋白酶 來分解抗體而得到F(ab，)2片段。亦可還原F(ab，)2片 段上的雙硫鍊而得到Fab片段v或是利用建構Fab表 現庫來達到簡便並快速地辨識出具有特定親和性之單 株Fab片段的目的。 25 201012472 可利用習知技術來使抗體擬人化。例如具有專一性 結合力的單株抗體便可進行商業規模的擬人化修飾 (Scotgene, Scotland; Oxford Molecular, Palo Alto, Calif.)。完全擬人化抗體（例如在基因轉殖動物體内表 現的抗體）亦為本發明的特色之一（Green et al.，Nature Genetics 7:13 [1994]; and U.S. Pat. Nos. 5,545,806 and 5,569,825) ° 多聚複合體化合物 能與T細胞或自然殺手細胞表面上之P-選擇素醣蛋 白配位體1蛋白結合的多聚複合體化合物可用來引發 細胞凋亡現象。多聚複合體化合物至少包含兩條多胜 肽鏈。每條多胜肽鏈包含⑴一段能與P-選擇素糖蛋白 配位體1結合的結合區，以及（ii)一異種胺基酸序列。 概括而言，多聚複合體化合物能與特定細胞表面上 至少兩個不同的P-選擇素醋蛋配位.體白，1·蛋白.結合.。 不過，多聚複合體化合物亦可經過設計’而使其具有 3、4、5、6、7、8、9、10、11、12 或更多傭不同的 P-選擇素醣蛋白配位體1結合區，而使得此多聚複合 體化合物能與特定細胞表面上3、4、5、6、7、8、9、 10、11、1 2個或更多個p-選擇素醣蛋白配位體1結合。 結合區包含能與P-選擇素醣蛋白配位體1結合的任 何胺基酸序列，或是任何經過修飾的胺基酸序列，例 如經過醣化或硫化修飾反應。結合區可與自然產生的 26 201012472 胺基酸序列或非自然產生的胺基酸序列一致。例如， 、° σ區了包含選擇素(如P-選擇素、E-選擇素或L-選擇 素）的Ρ-選擇素醣蛋白配位體1結合區。包含選擇素之 ρ-選擇素畴蛋白配位體丨結合區的多胜肽鏈可選擇性 • 地包含：（i)一段選擇素膜外區（如ρ_選擇素、Ε_選擇素 或L-選擇素之膜外區）；(ii)一段選擇素（如ρ·選擇素、 E-選擇素或L-選擇素）上的鈣離子依賴性凝集素結構 鲁 區（calcium dependent lectin domain);或是（出）選擇素 (如P-選擇素、E_選擇素或L-選擇素）上用來調控選擇 素對P-選擇素醣蛋白配位體1之結合能力的膜外區片 段。此外’在自然產生的胺基酸序列方面，可改變自 然的P-選擇素醣蛋白配位體1結合區内一個或一個以 上的胺基酸來得到非自然序列，並且該非自然胺基酸 序列保留其與P-選擇素醣蛋白配位體1結合的功能。 舉例來說’一多胜肽鏈含有一段能與P-選擇素醣蛋白 ❼ 配位體1結合的胺基酸序列，並且此胺基酸序列與下 列任一片段具有至少80〇/ί 、85% 、90% 、95%或98% 的相似度。這些任意片段包括：（i)一選擇素（如ρ_選擇 ，素、選擇素或L-選擇素）的膜外區；（ii)一選擇素（如 P-選擇素、E-選擇素或L-選擇素）的鈣依韻性凝集素結 構區；或是（iii)一選擇素（如P-選擇素、E-選擇素或L-選擇素）上用來調控選擇素對P-選擇素醣蛋白配位體! 之結合能力的膜外區片._段。_ 一般分子生_物突變技術 (molecular biology mutagenesis techniques)可用來改變 P-選擇素 27 201012472 醣蛋白配位體1結合區的核酸序列4修飾後的結合區 隨後可利用如固定化的P_選擇素醣蛋白配位體i或是 細胞表面上的P-選擇素醣蛋白配位體丨來測試其對p_ 選擇素醣蛋白配位體1的結合能力\結合區亦可包含 抗P-選擇素醣蛋白配位體丨抗體，或選自噬菌體表現 庫之多胜狀上的P-選擇素醣蛋白配位體1結合區，又 或是一段能與P-選擇素醣蛋白配位體1結合之胺基酸 序列的P-選擇素醣蛋白配位體J結合區。其中，此胺 基酸序列需與一抗P-選擇素醣蛋白配位體i抗趙或一 段選自噬菌體表現庫之多胜肽的p_選擇素醣蛋白配位 想1結合區有至少80% 、85% 、90% 、95%或98%的 相似度。 P-選擇素聽蛋白配位體1結合區可包含一段胺基酸 序列’此胺基酸序列與p_選擇素上的p_選擇素醣蛋白 配位體1結合片段相同。以文中所敘述之多聚複合體 ❷ 化合物的多胜肽鏈為例，此多胜肽鏈包，含一段小鼠P_ 選擇素 /Fc 重組嵌合體（r&d Systems，Minneapolis, MN)。此段小鼠P-選擇素/Fc嵌合體包含下列結構： (i)CD33訊息胜肽片段（曱硫胺酸b丙胺酸16， Metl-Alal6) ; (ii)小鼠p_選擇素（胞膜外區之色胺酸42 至丙胺酸 709 之片段，Trp42-Ala709 of extracellular domain) ; (iii)IEGRMD(SEQ ID N0:1);以及（iv)人類免 疫球蛋白 G1(脯胺酸 100-離胺酸 330 ，

Prol00-Lys3 30)。另一較佳範例之多胜散鏈則可含有人 28 201012472 類 P-選擇素./Fc 重組喪合體（r&d Systems，Minneapolis， MN)。此段人類P-選擇素/Fc重組嵌合體含有下列結 構：⑴人類P-選擇素（胞膜外區之曱硫胺酸1至丙胺酸

- 771 之片段，Metl-Ala771) ; (ii) IEGRMD (SEQ ID - ΝΟ:1);以及（iii)人類免疫球蛋白Gl(脯胺酸100-離胺 酸 330)。 P-選擇素醣蛋白配位體1結合區可包含一段胺基酸 序列，此胺基酸序列與E-選擇素上的P-選擇素醣蛋白 ❹ 配位體1結合片段相同。以文中所敘述之多聚複合體 化合物的多胜肽鏈為例，此多胜肽鏈包含一段小鼠E-選擇素 /Fc 重組欲合體（R&D Systems，Minneapolis， MN)。此段小鼠E-選擇素/Fc嵌合體包含下列結構：（i) 小鼠Ε·選擇素（胞膜外區之曱硫胺酸1至脯胺酸557之 片段，Metl-Pro557); (ii)募肽 IEGRMD(SEQ ID ΝΟ:1); (iii)人類免疫球蛋白Gl(脯胺酸100-離胺睃330， ❹ Pr〇100-Lys330);以及（iv)寡肽 HHHHHH(SEQ ID NO : 2)。另一較佳範例之多胜肽鏈則可含有人類E-選擇素 /Fc 重組嵌合體（R&D Systems，Minneapolis，MN)。此段 人類E-選擇素/Fc重組嵌合體含有下列結構：（i)人類 E-選擇素（胞膜外區之甲硫胺酸1至脯胺酸556之片 段，Metl-Pro55 6) ; (ii)寡肽 IEGRMD (SEQ ID ΝΟ:1); (iii) 人類免疫球蛋白Gl(脯胺酸100-離胺酸330);以及 (iv) 募肽 HHHHHH(SEQ ID NO : 2)。 P-選擇素St蛋白配位體1結合區可包含一段胺基酸 . . . .... ' .. . . ' . . . 29 201012472 序列’此胺基酸序列與L-選擇素上的p_選择素醣蛋白 配位體1結合片段相同。以文中所敘述之多聚複合體 化合物的多胜肽鏈為例’此多胜肽鏈包含一段小鼠L_ 選擇素 /Fc 重組欲合體（r&d Sy.stems;，. ..Minneapolis， MN) »此段小鼠L-選擇素/Fc嵌合體包含下列結構：⑴ 小鼠L -選擇素（胞膜外區之甲硫胺酸1至天門冬醯酸

332 之片段，Metl-Asn332) ; (ii)募肽 ieGRMD(SEQ ID _ NO:l); (in)人類免疫球蛋白G1(脯胺酸1〇〇離胺酸

330 ’ Prol00-Lys330);以及（iv)寡肽 HHHHHH(SEQ ID NO : 2)。另一較佳範例之多胜肽鏈則可含有人類^選 擇素 /Fc 重組喪合體（r&d .Systems，Minneapolis, MN) °此段人類L-選擇素/Fc重組嵌合體含有下列結 構·（1)人類L-選擇素（胞膜外區之曱硫胺酸1至天門冬 醯酸 332 之片段 ’ Metl-Asn3 3 2); (ii)寡肽 IEGRMD (SEQ ID NO:l) ; (iii)人類免疫球蛋白脯胺酸1()〇_離胺酸 ❹ 330);以及（iv)寡肽 HHHHHH(SEQ ID NO : 2)。 多聚複合體化合物可製備成同多聚複合體化合物或 是異多聚複合體化合物。同多聚複合體化合物之多胜 狀鍵上僅具有相同的p_選擇素醣蛋白配位體丨結合 區。舉例來說’同多聚複合體化合物可含有一段與P-選擇素之P-選擇素醣蛋白配位體丨結合區之序列相同 的多胜肽鏈。異多聚複合體化合物之多胜肽鏈上則具 有不同的P-選擇素醣蛋白配位體丨結合區。例如，異 多聚複合體化合物之第一條多胜肽鏈具有p_選擇素之 201012472 P-選擇素聽蛋白配位體1結合區，而第二條多胜肽鏈 上則具有E-選擇素之P-選擇素膽蛋白配位體1結合區。 異種（heterogeneous)胺基酸序列可以是任意胺基酸 序列。然而’文中所敘述之多胜肽鏈上的此段胺基酸 序列不可與任何自然產生之蛋白質的序列相似。異種 胺基酸序列含有一個或一個以上的胺基酸用來作為多 胜肽鏈之間的連結。例如，一個或一個以上的胺基酸 _ 可透過如雙硫鍵之方式來與多胜肽鏈做共價性鍵結。 例如免疫球蛋白長鏈恆定區便可作為此異種胺基酸序 列。而恆定區（Fc)内的雙硫鍵可連結兩條多胜肽鏈而形 成二聚體化合物（dimeric compound)。 異種胺基酸序列除了具有連結多胜肽鏈的功能以 外，其序列上更可包含一段交聯分子結合區 (c^oss-linker bind regi〇n)，如細胞表面受體結合區域。 當此段交聯分子結合區與一藥劑結合後，可使多胜肽 ❹ 鏈與細胞表面上的P-選擇素醣蛋白配位體」蛋白因發 生交聯反應而結合。免疫球蛋白長鏈恆定區包含Fc受 體結合區域。而交聯分子可以是抗體，例如抗Fc抗體， 其對異種胺基酸序列上的交聯分子結合區具有特異結 可調節P-選擇素51蛋自配位體i功能之化合㈣選試驗 本發明亦包含具有p_選擇素醣蛋白配位體1 (或卜 選擇素畴蛋白配位體1之結構區)結合能力之化合物的 31 201012472 辨識方法。上述化合物至少 v已栝斯•透過與p-選擇素醣 :白配位體合而引發τ細胞耗盡與τ細胞调亡現 象的化合物、.Ρ_選擇素餹蛋白配位體」與控制ρ_ 選擇素醣蛋白配位體i活性 旺之穿膜蛋白、細胞間蛋白 或細胞内蛋白之結合反應的从 馮的化合物，以及調控P-選擇 素醣蛋白配位體1活性的化合物。 根據本發明方法所篩選出來的化合物可包括胜肽、 抗體或抗體之部分片段以及其他有機化合物，並且如 文中所述，此類有機化合物能與p_選擇素_蛋白配位 體1結合’並能調控那些受到p_選擇素醣蛋白配位體 1調節的生物功能。 具有上述功能之化合物可包括胜肽，例如可溶性胜 肽，其包括隨機胜肽庫中的各種胜肽分子（Lam et ai.， Nature 354:82 [1991]； Houghten et al., Nature 354:84 [1991])。並且該化合物亦包括由d與/或[型之胺基 © 酸所構成之組合化學衍生分子庫、磷酸化胜肽、抗體 與有機或無機小分子（small organic 〇r in〇rganic molecules)。其中磷酸化胜肽包括來自鱗酸化胜肽庫中 的隨機或部分退化分子（s〇ngyang et al·，Cen 72:767 [1993])。而抗體則包括多株抗體、單株抗體、擬人化 抗體、抗獨特型抗體、敌合體抗體或單鏈抗體、FAb、 F(ab )2、FAb表現庫片段，以及上述各類抗體之抗原 決定表位結合片段。 根據本發明方法所篩選出之其他化合物更包含有機 32 201012472 小分子’該些有機小分子會料P_選擇素酷蛋白配位 體1蛋白的活性。 電腦模擬與資料搜尋技術可用來鑑定化合物，或是 • 針對那些已鑑定為可調控P-選擇素醣蛋白配位體i之 . 表現量或活性的化合物進行改善。當化合物或組合物 經過鑑定後，便可辨識出其上的活性位置或區域。活 性位置一般多為調控因子的結合區。可利用習知方 ❹法，如從胜肽的胺基酸序列或從核酸上的核酸序 列，又或研究該化合物之配位體與該化合物之類似化 合物或組合物所形成之複合體來辨識出活性位置。後 續内容中，利用化學方法或X光晶體繞射法（X ray crystallographic meth〇d)，並藉著尋找調節因子或配位 體與分子的結合位置來找出化合物的活性位置。 雖然可參考上述内容來設計並製造出具有結合能力 的化合物是一種方法。另一種方法是可從已知的化合 〇 物中，包括自然產物、合成化學物與包括蛋白質之生 物活性物質中篩選出能與p_選擇素醣蛋白配位體i結 合，益產生τ細胞減少之現象，或引發τ細胞之細胞 凋亡現象。 . . ... . ...... 可設計一種體外試驗方法來鑑定化合物是否能與p_ 選擇素醋蛋白配位體1(或p_選擇素醋蛋白配位體丨蛋 白上的結構區)結合。經辨識的化合物可能具有調控τ 細胞活性的功能因此亦可能適合用來治療伴隨過度 或不需要發生的T細胞調控性免疫反應或τ細胞過度 33 201012472 增生的症狀，例如發炎、自體免疫疾病、移植排斥、 過敗性疾病或τ細胞癌。 ❹ ❹ 本發明之鑑定可與P_選擇素醣蛋白配位體！結合之 化合物的試驗方法包括：準備一含有p_選擇素醣蛋白 配位體1(或其結構區片段）與待測化合物的混合物並 將該混合物置於適當反應條件下反應足夠時間，以使 混合物中的兩種組成物能相互作用並結合。隨後在混 σ物中會產生可被移除與/或偵測到的複合體。在實驗 中所使用t Ρ_選擇素酶蛋白配位體i的種類可依昭筛 選試驗的目的而改變。纟某些情況下，可使用一段與 P-選擇素醣蛋白配位體]夕4 之結構區序列相同的胜狀， 並且此段胜肽可與另一種蛋 但贫白或多胜肽融合以達到方 便實驗進行的目的，你丨1 >认 作為標定記號（labeling).，或 是用來將產生的複合艚白、θ人， 自尾合物中分離出來等目的。 此外，可採用不同方沐办 卜u々忐來進行篩選試驗，例如可將 P-選擇素醣蛋白配位體丨 1蛋白、多胜肽、短胜肽、融

合蛋白或是帶測化合物固A 固疋在固體表面（solid phase) 上’並在反應結束後，伯，、日丨κ 谓冽留在固體表面上Ρ-選擇素 畴蛋白配位體1/待測化入t $物複合體的量。在本方法之 一較佳實施例中，係將p 各 〃、選擇素醣蛋白配位體1固定 在固體表面上，而待測 *化合物則不固定於固體表面 上。並且該待測化合物 1 ..利用直接或間接方法來加以 •#3& -A ^ ί示S己。 在較佳實施例中，开 _使用微貧滴定盤（microtiter· 34 201012472 plates)來作為固體表面。並且可利用非共償性連結或共 價性連結的方法來使欲固定之成分固定在固體表面 上。可藉著在固體表面上塗佈一層含有欲固定的蛋白 質分液待乾燥後即可達成非共價性連結的目的。或 * 者’使用可辨識欲固定之蛋白的固定化抗體來使該蛋 白固疋在固體表面上。其中所使用的固定化抗體以單 株抗體為佳體表面可如上述方法先行處理後儲 存備用。 隨後將非E1定：的成分加人具有@定成分的固體表面 上。待反應完全後，在反應後所產生之複合體仍可固 定在固體表面的條件下，藉著如沖洗的方式來移除未 反應的成刀。之後可以多種方法來偵測留在固體表面 上的複合體。其中非固定之成分可預先加以標記待 反應後，若在固體表面上偵測到標記訊號即表示有複 合體生成。若非固定之成分無預先進行標記處理，則 © 可使用間接標記的方法來偵測留在固體表面上的複合 物，例如使用具有標記的抗體，此標記抗體對非固1 成分有專一性結合力。並且此標記抗體又可利用直接 標記方法，或利用已標記之抗免疫球蛋白抗體來對該 抗體做間接標記。 ^ 上述之反應亦可在液相中進行，再將反應後的產物 自未反應的成分中分離出來並測定複合物的生成量。 例如可使用一種對Ρ_選擇素醣蛋白配位體】具有專— 性的固定化抗體、多胜肽、短胜肽片段、融合蛋白或 35 201012472 待測化合物來抓住反應液體中產生的複合體。並且使 用一種對複合體中的其他成分具有專一性結合力的標 記抗體來偵測複合體的量。 * 又或者利用細胞活性師選法（cell-based, ass.ay)來篩 _ 選出能與P-選擇素聽蛋白配位體1結合的化合物。係 使用會表現P-選擇素醣蛋白配位體1的細胞株，或使 用經過基因改造後可表現出選擇素醣蛋白配位體1 _ 的細胞株來進行篩選試驗。細胞活性筛選試驗對於評 估利用文中所敘述之篩選方法所得到之化合物是否具 有功能性的效果特別有效。例如，根據對p-選擇素聽 蛋白配位體1之結合能力而篩選出一種化合物後，可 對該化合物進行細胞活性筛選試驗來測試其功效，例 如是否能在體内或體外試驗中引起τ細胞凋亡或下細 胞的數量耗盡。 • 藥學組合物 本發明之另一特色在於提供一藥學組合物來達到改 變患者免疫反應的目的。此藥學組合物包含如抗體、 多聚複合體化合物、小分子或對ρ_選擇素醣蛋白配位 體1具有特異結合力之他種化合物等組成。在一較佳 實施例中’此化合物具有ρ_選擇素醣蛋白配位體【作 用劑之功效。 本發明之藥學組合物可如傳統方法使用一或一種以 上之生理可接受之载體或辅劑來配製。因此’可依不 36 201012472 同用藥方式的需要來製備該化合物及其生理可接受之 鹽類與溶劑化物（solvate)。： _ 本發明之化合物可製備成非胃腸性用藥的藥劑型 態，例如，以快速注射或連續滴注的方式來用藥。注 射用之藥劑配方可製備成如小玻璃藥水瓶之單劑型， 或添加保存劑的多劑型包裝。本發明之組合物可製成 懸序溶液、油性或水性溶劑之乳劑（emulsion)。並且組 合物中可含有配方劑，如懸浮劑、安定劑或分散劑。 此外’活性成分可製備成粉末狀’並在使用前以適當 溶劑（如滅菌水，sterile pyrogen-free water)來回溶使 用0 控制T細胞調控性免疫反應舆耗盡τ細胞數量的方月 ❹ 在上述篩選試驗中的化合物可用來調節受ρ_選擇^ 酷蛋白配位體1調控的生物功能，或是用來治療因封 度或不需要發生之免疫反應的疾病，如Τ細胞調控七 免疫反應。這些化合物包含胜肽、抗體或抗體部分》 段與其他能和細胞表面之Ρ-選擇素醣蛋白配位體i矣 合並誘發出可使T細胞死亡之訊息傳導路徑的有機… 合物。本發明方法可選擇性地添加交聯劑，此交㈣ 可使細胞表面上的P_選擇素醣蛋白配位體」發生交用 反應。文中敘述之化合物可用於各種希望降低或消除' 細胞活性的任何癥狀。本發明化、 人 丨口物對於治療如辱 炎、自體免疫疾病、移植排斥、 ❿敏性疾病與T細饰 37 201012472 衍化癌症等疾病之治療效果卓越。

Ο 本發明所敘述之抗ρ-選擇素醣蛋白配位體1化合物 還可用來治療包括糖尿病(diabetes mellitus)、關節炎 (arthritis)(其中包括類風濕:性關.節...炎.（rheumatoid arthritis)、幼年型類風.濕性關節炎（juvenile rheumatoid arthritis)、骨關節炎（osteoarthritis)與乾癖性關節炎 (psoriatic arthritis)) ' 多發性硬化症（multiple sclerosis)、脊趙炎（encephalomyelitis)、.重症肌無力症 (myasthenia gravis)、紅斑性狼瘡（systemic lupus erythematosis)、自體免疫性甲狀腺炎（autoimmune thyroiditis)、皮膚炎（dermatitis)(包括異位性皮膚炎 (atopic dermatitis)與濕瘆性皮膚炎（eczematous dermatitis))、乾癣（psoriasis)、修格連氏综合症 (Sj6gren's Syndrome)、克隆氏症（Crohn’s disease)、口 瘡性潰瘍(aphthousulcer)、虹膜炎（iritis)、結膜炎 (conjunctivitis)、角膜炎（keratoconjunctivitis)、第一型 糖尿病（type I diabetes)、發炎性腸道疾病（inflammatory bowel diseases)、潰瘍性大腸炎（ulcerative colitis)、氣 喘（asthma)、過敏性氣:喘（allergic asthma)、.急性紅斑性 狼瘡（cutaneous lupus .. erythematosus) .、/硬..皮...症 (scleroderma)、陰道炎（vaginitis)、直腸炎（proctitis)、 藥療（drug eruptions)、逆轉性麻瘋病（leprosy reversal reactions)、痲’瘋結' 節性紅，斑(erythema nodosum leprosum) '自體免疫性葡萄膜炎（autoimmune 38 201012472 uveitis)、過敏性脊趙炎（allergic encephalomyelitis)、 急性壞死出血性腦病變（acute necrotizing, hemorrhagic encephalopathy)、特發性雙邊漸進式感音神經性聽障 - (idiopathic bilateral progressive sensorineural hearing loss)、再生不良性貧血（aplastic anemia) '純粹紅血球 性貧血（pure red cell anemia)、特發性血小板過少症 (idiopathic thrombocytopenia) 、 軟骨炎 (polychondritis)、偉格那氏肉牙腫（Wegener's β w granulomatosis)、慢性活動性肝炎（chr〇nic active hepatitis)、史蒂文森-強生症候群（Stevens_Johns〇n syndrome)、特發性脂肪下痢（idi〇pathic sprue)、扁平苔 癖（lichen planus)、葛瑞芙氏症（Graves，disease)、類肉 瘤症（sarcoidosis)、原發性膽汁姓肝硬化（primary biliary cirrhosis)、後段葡萄膜炎（uveitis p〇steri〇r)、 間質性肺硬化（interstitial lung fibrosis)、移植物抗宿 ❹ 主疾病（graft-versus-host disease)、器官移植（包括使用 異種異體組織或同種異體組織，如骨髓移植肝臟移植 或其他組織或器官移植）、過敏（如異位性過敏）、愛滋 病與T細胞惡性腫瘤（T_cell ne〇piasms)如白血病 (leukemias)與 /或淋巴癌（lymphomas)。 不論是體内或體外試驗，本發明方法可耗盡細胞群 中的Τ細胞數量。例如，在體外試驗中，將取自患者 身上的生物樣品與本發明之抗ρ_選擇素醣蛋白配位體 1化合物接觸’並選擇性地搭配交聯劑來使用，可使樣 39 201012472 品中的τ細 胞群中的非 胞數目減少。本發明方法介+ +贫月乃忐亦可有效提高細 Τ細胞數量而達到降低或消除細胞群之τ 細胞活性的效果。 下述為本發明之較佳實施例。其僅作為示範之用 不足以用來限制本發明之範圍。 較佳實施例 魯第1較佳實施例：製備抗Τ細胞凋亡誘發蛋白（ΤΑΙΡ) 之單株抗體 可採用習知技藝者所熟悉的Kohler與Milstein之細 胞融合方法（1976，European Journal 〇f immunology 6:5 11-5 19)來製造出會分泌指定抗體的融合瘤細胞，以 製造出T細胞凋亡誘發蛋白專一性之單株抗體。操作 方式係將以刀豆球蛋白A活化的Balb/c脾臟T細胞 (Con A-activated Balb/c spleen T cells)注射到倉鼠體 ® 内後可獲得抗體產生細胞。將獲得的抗體產生細胞與 骨髓瘤細胞株（myeloma cell line)進行細胞融合後可得 到抗體分泌融合瘤（antibody secreting hybridoma)。融 合方法係先以聚己_二醇（polyethylene glycol)使兩種細 胞株融合後得到抗體產生細胞，並以常用的組織培養 法來增殖之。根據上述方法所製造出來的融合瘤細胞 可分泌出一單株抗體「TAB4」。TAB4單株抗體可引起 體外的T細胞凋亡，並能耗盡體内的T細胞數量。而 ' ' .国·… 可被TAB4抗體辨識的蛋白質即為T細胞凋亡誘發蛋白 201012472 (TAIP)。 實驗中使用的C57BL/6J (Β6)與BALB/c小鼠可購自 .Jackson lab (Bar Harbor, ME)。Syrian 倉氣可購自國立 台灣大學_醫學院動物中心.(Animal，Core Facility， National Taiwan University Medical College)。 將 TAB4融合瘤細胞的濃縮培養上清液（culture supernatant)以20,000xg的轉速離心1〇分鐘後，再以 結合緩衝液（binding buffer, 0.1 Μ醋酸鈉，pH 5.0)將 ® 上清液以1:1的比例稀釋。準備填充容積（bed volume) 約lml的G-蛋白管柱，並以3·5 ml的結合缓衝液清洗 G-蛋白管柱三次後，將澄清的培養上清液注入G-蛋白 管柱中，使上清液通過管柱後流出。收集流出管柱的 上清液’並將流出液再次注入管柱中。待上清液通過 G -蛋白管柱後，以6-10ml的結合緩衝液清洗管柱，再 以5 πϋ的洗出緩衝液（elution buffer, 0.1 Μ甘胺酸-鹽 φ 酸（giycine-HCl)，pH 2·8)將結合在管柱上的抗體沖 脫’並將含有抗體的洗脫液以每管1 ml的方式收集。 分別於每管1 ml之抗體诜脫液中加入50〆1之1M Tris-HCl(pH7_5)溶液，使抗體之酸鹼值到達中性❹將中 和後的抗體液集中後’以2公升之p η 7.4的碟酸缓衝 液（phosphate-buffered saline，PBS)透析該抗體液三 次’每次3小時。完成透析步驟後，以Bi〇_Rad蛋白 質分析法（Bio-Rad Protein Assay，BIO-RAD，Hercules， CA)來測定獲得之抗體樣品的蛋白質濃度。 201012472 第2較佳實施例：製備小鼠脾臟細胞懸浮液與τ細胞 之活化及增生 將小鼠脾臟浸泡在8 ml的漢克平衡鹽溶液（Hank’s balanced salt solution, HBSS)，並以滅菌蓋玻片溫和地 將小鼠脾臟切碎。隨後將小鼠脾臟碎片置入15 ml離心 管中（Costar)，以20〇xg的轉速離心5分鐘。離心後， 丟棄上清液’以輕敲管壁的方式將沈澱下來的細胞重 新懸浮在沈殿物緩衝液（residual buffer)中。於細胞懸 浮液中加入1 ml的紅血球溶胞緩衝液（rbc lysis buffer, 0.6M 氣化銨（NH4C1)、0.17MTris-base，pH7.65)，以溶 解換雜在細胞中的紅血球。隨後將細胞懸浮液置於室 溫下靜置2分鐘後，加入9 ml的漢克平衡鹽溶液快速 冷卻之。以200xg的轉速離心5分鐘來沈澱胞沈後， 以RPMI培養液沖洗沈殿細胞兩次，再將細胞重新懸浮 在RPMI培養液中。最後以血球計數器（hemoCyt〇meter， ❹ Cambridge ScientiHc Inc.)與錐藍排除法（Trypan blue exclusion)來測定懸浮液中的細胞濃度與細胞存活率。 將獲得的脾臟細胞以RPMI培養液調整至3χ106 cell/ml的細胞濃度’並在細胞懸浮液中加入刀豆球蛋 白A，使刀豆球蛋白A在細胞懸浮液中的濃度成為2 pg/ ml以活化T細胞。將細胞懸浮液以5 mi/孔的用量 注入6孔培養盤（6-well culture plate)中，或以1〇 ml/ 盤的用量注入10公分培養皿〇 〇_cm culture dish)後， 置於37 C、5%C〇2的環境下培養48小時後收取細胞。 42 201012472 將含有T細胞的已活化脾臟細胞重新懸浮在5 ml的漢 克平衡鹽溶液後，置於離心管中，並小心地在懸浮竣 面上浮蓋5. ml之55%細胞·分離液（Percoll solution)。保 • 持不擾動兩種分離液層的狀況’在25 °C下，將細胞懸 • 浮液以l，9〇〇xg的轉速連續離心13分鐘。離心後，可 在兩種分層液體的界面間收集到T細胞。將收集到的τ 細胞以漢克平衡鹽溶液清洗兩次後，待後續實驗中使 用。 參 第3較佳實施例：活化後Τ細胞的細胞凋亡反應 將已活化的Τ細胞(請見第二較佳實施例）重新懸浮 於含有5 ng/ml介白素-2的RPMI培養液中，並將細 胞濃度調整成5xl05 cell/ml。隨後參照表一所示之條 件’在已活化T細胞懸浮液中分別加入對照用免疫球 蛋白（control Ig)、TAB4抗體或抗CD3抗體。 魯 實驗組 ----— 負對照組 表一 處理方法* 3 ug/ml倉鼠免疫球蛋白 5 ng/ml介白素-2 3 ug/ml交連用抗體(抗倉鼠免疫 3 ug/ml TAB4倉鼠單株抗體 5 ng/ml介白素-2 3 ug/ml交連用抗體(抗倉鼠免疫球蛋白） 43 201012472 正對照組 1 ug/ml抗CD3單株抗體 ~ 5ng/ml介白素-2 1 ug/ml交連用抗體(抗小鼠免疫球蛋白） 培養液中指定藥劑之最終濃逐 一 ——~~~— 使表一中的各組細胞混合液反應18_24小時以後，利 用7-AAD細胞凋亡分析法來測定每組細胞混合液中的 胞凋亡程度。7-ADD細胞凋亡分析法係將處理過的細 胞移入FACS管（Falcon)中。隨後在磷酸緩衝溶液中加 藝 入1。/。小牛血清（fetal bovine serum)與0.05%疊氮化鈉 (sodium azide)配製出溶液，再以冰冷的FACS溶液清 洗細胞兩次後，以200xg的轉速’於4°C下將細胞沈澱 下來。獲得的細胞重新懸浮在冰冷的FACS溶液中，並 將細胞濃度調整為1〜2χ 107 cells/ml。將0.1 ml的細胞 懸浮液與7-ADD試劑混合’使細胞懸浮液中的7-ADD 試劑濃度成為2 ug/m卜隨後令細胞與7-ADD試劑的混 參 合液在黑暗中與4°C的環境下靜置20分鐘以進行細胞 染色反應。最後，使用冰冷的FACS溶液清洗染色後細 胞兩次。再將染色後細胞重新懸浮在〇 5 ml FACS溶液 中’並以 / B D L S R 流式細.胞儀（B D L S R f 1 〇 w c y to m e t e r， Beckton Dickison)來分析細胞。. .弟1圖為.時程實驗的結果（time-cours.e experiment)， 係顯示已活化T細胞對TAB4(抗T細胞凋亡誘發蛋白） 調控性細胞凋亡訊號的敏感性。此實驗係以刀豆素球 蛋白A (Con-Α)來活化小鼠脾臟細胞，並以含有介白 44 201012472 素-2的培養液來維持其活化狀態。收取已活化τ細胞， 並重新懸浮已活化Τ細胞後，在Τ細胞懸浮液中加入 ΤΑΒ4單株抗體或對照用倉鼠免疫球蛋白G，並加入抗 倉鼠免疫球蛋白G抗體以作為交聯分子來進行反應。 於實驗第一天測得T細胞凋亡誘發蛋白交聯反應會引 起一低程度（6.5%)之細胞凋亡的結果。然而，ΤΑΒ4誘 發細胞调亡的程度會在第二天上升至17%，第四天上 升至52%，而在第六天下降至44%。與僅接受介白素_2 ® 處理的細胞比較下，對照用倉鼠免疫球蛋白G無法引 起T細胞凋亡。而加入抗CD3抗體（正對照組）則可在 48小時後’引起38%的已活化τ細胞凋亡（未顯示數 據）。 第4較佳實施例：各種組織之τ細胞凋亡誘發蛋白的 表現 ❹ 以冰冷的FACS溶液（含1%小牛血清與〇·〇5%疊氮 化鈉之鱗酸緩衝液）來清洗細胞兩次，並置於FACs管 (Falcon)中’在4°C下’以200xg的轉速離心後獲得細 胞。獲得的細胞重新懸浮在冰冷的FACS溶液中，讓細 胞濃度成為1 X 1 〇7 cell/ml。在FACS管中分裝0.1 ml 的細胞懸浮液後，備用。 進行細胞表面染色係將.濃..度調整成2· pg/ml的TAB.4 單株抗體或對照用倉鼠免疫球蛋白加入上述分裝的細 胞懸浮液中，並將此混合物置於4下，在黑暗中反應 45 201012472 30分鐘。將反應後的細胞以冰冷的facS溶液清洗一 次後，將細胞進行下列處理：（1)在1〇〇 μ1冰冷的FACS 溶液中加入cychrome標記之抗CD3抗體（2 pg/ml)、 • FITC標§己之抗倉鼠免疫球蛋白與pE標記之抗 - CD8/CD4/CD19/CDllb/ Pan-NK/I-A/I-E/Mac-3 抗體（2 pg/ml)來進行脾臟細胞染色；（2)在1〇〇μ1冰冷的facs 溶液中加入FITC標記之抗倉鼠免疫球蛋白、pE標記 ® 之抗CD8抗體與cychrome標記之抗CD4抗體（2 Ug/ml) 來進行胸線細胞（thymus cell)染色。並將上述反應置於 4 C下’於黑暗中反應30分鐘。最後，以冰冷的facS 溶液清洗染色後細胞兩次’在將染色後細胞重新懸浮 於1 ml的FACS溶液中以BD LSR流式細胞儀（Beckt〇n Dickison)進行結果分析》 第3與第4圖係顯示以FACS法來分析脾臟細胞與胸 線細胞之不同次群細胞上的T細胞凋亡诱發蛋白抗原 © 分佈。在第3圖中，CD19+B細胞表面上的τ細胞凋亡 誘發蛋白含量很低，但仍可偵測到。而在自然殺手細 胞與CD3 + T細胞的細胞表面上則可偵測到較高含量的 Τ細胞凋亡誘發蛋白。並且多數的cD4+、CD8^ CD4 8脚線τ細胞能表現大量的τ細胞凋亡誘發蛋 白。相較於第3圖之結果，第4圖則顯示τ細胞凋亡 誘發蛋白僅表現在少部分的CD4-8-胸線T細胞上。 採集B6與βALB/c小鼠之腦、胸腺、心臟、肺臟、 肝臟、胃、腎臟、脾臟與皮膚等各處組織 '並在室溫 46 201012472 下’將組織樣品以1 〇%的曱酸（f〇rmaldehyde)處理一個 晚上以固定組織。再以石蠟將組織包埋後，置於45〇c 下’以切片機（Leica RM2135 microtome, spread)將組織 切成厚度4 μιη的薄片。將組織薄片置於處理過之玻片 上’隨後將玻片置於37°C之環境下乾燥後備用。 依標準步驟依序使用二甲苯（Xylenes)來除去玻片上 組織石壞切片的石躐’再以1 〇 〇 %的乙醇來乾燥組織切 片後，將含有組織的玻片保存在10%的乙醇中。 m 參考標準步驟’將組織切片依序浸泡在1 00%乙醇與 含有90%乙醇- 85%乙醇- 70%乙醇的麟酸緩衝液中，最 後使用填酸緩衝液來使組織切片進行水相置換 (rehydrate)。後續實驗均在潮濕容器中進行。係在室溫 下，將組織切片以阻隔緩衝液（blocking buffer，含1% 正常山羊血清）浸泡一小時（或在4 °C下浸泡一個晚 上）’以避免發生非專一性結合。移除阻隔緩衝液後， ❺ 將TAB4抗體或正常倉鼠免疫球蛋白以1:2〇〇的比例稀 釋後，加入組織切片中繼續在室溫下反應一小時（或在 4°C下反應一個晚上）。以磷酸緩衝液清洗組織切片兩 次、每次5分鐘以移除初級抗體。再將具有鹼性磷酸 酶標記之山羊抗倉鼠免疫球蛋白抗體（alkaline phosphatase-conjugated goat anti-hamster Ig)以 1:2.50.. 之比例稀釋後與組織切片在室溫下反應1小時。再以 磷酸緩衝液清洗組織切片兩次，每次5分鐘以移除具 有酵素標記之抗體。最後，使用BCIP/NBT試劑溶液與 47 201012472 組織切片在室溫下之黑暗環境中反應30分鐘後完成組 織切片的呈色反應。以填酸缓衝液洗去切面上過量的 酵素反應試劑’在依序使用磷酸緩衝液、乙醇、二甲 苯來除去組織切片的水分後置於顯微鏡上觀察。 、”°果顯不僅能在，骨趙衍化組織（bone marrow derived-tissues)中偵測到T細胞凋亡誘發蛋白的表 現。而在其他組織中則無法偵測到Τ細胞凋亡誘發蛋 白。 第5較佳實施例：細胞表面生物素標記舆τ細胞凋亡 誘發蛋白之免疫沈澱分析 在冰上，使5xl07個RLdl細胞或ΝΙΗ-3Τ3細胞與 lml之含有 0.5 mg/ml硫化-玻珀硫亞胺生物素 (Sulfo-NHS-biotin，Pierce)的麟酸緩衝液反應30分 鐘，以使細胞表面進行生物素.修_ (biotinylated)。.在冰 上讓細胞與 〇、5 ml的 DMEM.培養液（Dulbec.co's modified.Eagle's .medium，.Life Technologies,.Inc)反應 10分鐘以終止生物素修飾反應。使用1 ml的DMEM 培養液清洗細胞一次’再以1 ml的破酸缓衝液清洗細 胞兩次。

使用 含.有.1 % Triton X-100 20 mM

Tris-HCl(pH8.0)、160 mM 氯化鈉（160 mM NaCl)與 1 mM氯化妈（1 mM CaCl2)的冰冷溶胞缓衝液（lysis -buffer).，將細.胞調整成·5.0χ107 cell/ml.的細.胞濃度，… 並加人蛋白酶混合抑制劑後靜置1 5分鐘以使細胞溶 48 201012472 解。將溶胞液（lysate)# 10,000xg的轉速離心分鐘 以沈殿出溶胞液中的不溶物。上述步驟與後續步驟均 在4°C下進行。

• 為了進行免疫沈澱分析，係先將溶胞液與50 μ1的G > 蛋白瓊脂糖凝膠粒（protein G-Sephar〇se，Amersham

Pharmacia Biotech)反應30分鐘以移除非專一性結合蛋 白。隨後離心以移除G蛋白瓊脂糖凝膠粒。並將獲得 之上清液分成數份’每份之蛋白含量相當於5.〇xl〇7個 細胞的蛋白量。將已加入10 pg之TAB4單株抗體或正 常倉鼠血清之免疫球蛋白的20 μΐ G -蛋白填脂糖凝勝 粒與上清液在4 °C下反應4小時。反應後，使用含有 0.05% Triton X-100、50 mM Tris-HCl(pH 8.5)、400 應 氣化鈉、1 mM氣化鈣與1 mg/ml即白蛋白（ovalbumin) 的清洗缓衝液（washing buffer)來清洗膠粒四次後，再 以氣化鈉濃度改為250 mM的上述清洗緩衝液來清洗 @ 膠粒兩次。以50 μΐ之 1 xSDS樣品緩衝液（1 xjsdS sample buffer)來洗脫膠粒上與TAB4抗體結合的蛋白 質。脫除下來的蛋白質以8%的SDS電泳膠進行解析 後，再將電泳膠上的蛋白質轉移至硝化纖維薄膜上 (nitrocellulose membrane，Millipore)。隨後.以過氧化酶\ 標記之抗生物素蛋白（peroxidase-conjugated Avidin, PharMingen)與化學發光試劑（Chemiluminescence reagent, .N.ENTM Life .Science Products)來·分析硝’化纖 .... ... .. .. .... . . ..... 維薄膜上的生物素化蛋白。 49 201012472 第2圖係顯示’丁入34辨識出在1^$1細胞（1'細胞 凋亡誘發蛋白表現型T細胞）具有一分子量約為12〇 kD 的生物素化表面蛋白。而3 T3細胞（τ細胞凋亡誘發蛋 白不表現型細胞）則無。且經正常倉鼠金清處理過的G 蛋白瓊脂糖凝膠粒無法抓到此分子量為12〇 kD的蛋 白。所得結果暗示出該120 kD大小的蛋白質為τ細胞 表面上能被TAB 4單株抗體所辨識的抗原。 第6較佳實施例··耗盡體内T細胞 以腹腔注射的方式來提供小鼠3 〇〇 的TAB4抗體或 對照用倉鼠免疫球蛋白，並在注射抗體後的第四天取 出該小鼠的脾臟細胞、胸線細胞與周邊血液單核細 胞，計算其總細胞數量，並以FACS分析法來分析細胞 表面上的標記蛋白（marker) ’以測驗TAB4抗體在τ細 胞或其他細胞群種中的作.用.。 FACS分析法係在4°C下，將細胞以2%的多聚甲醛 參 （Paraformaldehyde)處理20分鐘來固定細胞。隨後以冰 冷的FACS溶液清洗細胞兩次，並重新懸浮細胞並調整 成IxlO7 cells/ml的細胞濃度。將懸浮細胞以每管1〇〇 μΐ之體積分裝.後，備用。在每管.1 〇〇μ之細胞中加入濃 度為2 pg/ml之ΤΑΒ4抗體或對照用倉鼠免疫球蛋白， 使抗體與細胞混合後置於黑暗中於4°C下反應3〇分 鐘。反應後’以冰冷的FACS溶液清洗細胞一次後，將 細胞進行下列處理：（丨）在丨〇〇 μ1冰冷的FACs溶液中 加入cychrome標記之抗^⑴抗體乂之叫〜丨卜打代標 50 201012472 記之抗倉鼠免疫球蛋白與 PE 標記之抗 CD8/CD4/CD19/CD1 lb/pan-NK/I-A/I-E/Mac-3 抗體（2 pg/ml)來對脾臟細胞進行染色；（2)在 100 μΐ冰冷的 • _FACS溶液中加入FITC標記之抗倉鼠免疫球蛋白抗 體、PE標記之抗CD8抗體與cychrome標記之抗CD4 抗體（2 ug/ml)來對胸線細胞進行染色。並將上述反應 置於4°C下，於黑暗中反應30分鐘。最後，以冰冷的 FACS溶液清洗已染色的細胞兩次，再將已染色的細胞 ® 重新懸浮於1 ml的FACS溶液中以BD LSR流式細胞 儀（BecktonDickison)進行結果分析。 注射抗體四天後，TAB4抗體處理小鼠之周邊血液白 血球（PBL)中的 CD3 + T細胞的百分比，從正常小鼠的 36.7%下降至4.1 %(請參考表二）。TAB4抗體的處理僅 使造成總脾臟細胞數量輕微下降。然而，在TAB4抗體 處理的小鼠體内，CD3 + T細胞的數量減少了 62%，自 _ 然殺手細胞的數量減少了 50%，並且造成CD19 + B細胞 總數的輕微上升。而TAB4抗體處理小鼠體内的胸線細 胞總數則僅為對照組小鼠的 48%(即表示減少了 52%)。此外，除了 CD4 + T 細胞，其他 CD8+、CD4 + CD8 + 與CD4XD8 — T細胞的數量均下降。其中以CD8 + CD4 + 之次種群作用效果最明顯（下降了 64·7%)。 表二 脾臟 51 201012472 xlO6 無處理 正常倉鼠免 TA-B4-處 耗盡量 疫球蛋白 理後 (%) 脾臟細胞 123 93.3 105 14.6 總數 CD3+T cells 32.8 28.4 12.4 62.2 CD3' CD19+ 72.2 53.4 72.9 -0.8 CD3NK+ 3.6 2.4 1.80 50 周邊血液白血球 無處理 正常倉鼠免 TA-B4-處 耗盡量 疫球蛋白 理後 (%) CD3+T cells 36.7 % 36% 4.1% 88.8% 胸線 xlO6 無處理 正常倉鼠免 疫球蛋白 TA-B4·處 理後 耗盡S (%) 胸線細胞 總數 94 229 45 52.1 CD4+ 9.3 28.4 10.9 -16.6 CD8+ 5.2 7.7 3.6 30.3 CD4+ CD8+ 73.8 182 26 64.7 CD4' CD8' 5.6 10.5 4.5 19.3 (以上數據係由三次實驗所得到之代表數據） 52 201012472 第7較佳實施例：抗Τ細胞凋亡誘發蛋白之單株抗體 無法誘發分泌出介白素_2或腫瘤壞死因子；^ 將300 mg之ΤΑΒ4抗體或對照用倉鼠免疫球蛋白注 . 射到Balb/c小鼠（H-2d)的腹腔中。於注射7天後，分 • 離出該小鼠的脾臟細胞以作為反應細胞，並與用來作 為刺激細胞的絲裂黴素處理過之C3H(H_2k)脾臟細胞 (mit〇mydnC-treatedC3H(H-2k)spienocytes)共同培養。經培養三 天後，收取培養上清液，並利用ELIS A試劑組（pharMingen) 來測量培養上清液中的介白素_2含量β 第5圖係顯示’相較於對照組小鼠，由ταΒ4處理小 鼠身上取得之反應細胞的介白素_2表現量受到抑制。 分析血漿中介白素-2與腫瘤壞死因子…含量，可發現 對照組小鼠與ΤΑΒ4處理小鼠之血清中的介白素_2(或 腫瘤壞死因子-α)含量沒有明顯差異。 由於製造介白素-2是Τ細胞的活性指標。，'因:此，結 ❹ 果顯示出τ細胞凋亡誘發蛋白專一性抗體（如ΤΑβ4)可 用來控制體内的Τ細胞’並可控制不需要發生的τ細 胞調控性免疫反應例如伴隨自體免疫疾病與移植，排 斥而來的免疫反應。 第8較佳實施例：科用抗τ細胞凋亡誘發蛋白抗體來 預防移植排斥 以乙醯丙嗓馬來酸鹽（Acepromazin maleate)(Fermenta

Animal Health Co.，Kansas City，MO)麻醉鼠齡約 8 〜1.2 .週的小鼠 (得自JackscmLabomtoiy)。進行植皮手術7天前，尚未切除 53 201012472 胸腺的C57BL/6小軋（H-2b)先以腹腔注射方式供給500 叫之TAB4抗體或同型（is〇type)的.對照組抗體.β注射抗. 體7天後，將完全異種異體配對不吻合之Balb/cj小鼠 (H-2 )的侧腹皮膚取出，並移植到注射過抗體之 C5 7BL/6小鼠的側腹上。皮膚移植7天後，該些C57bl/6 小氣再次注射500 μ§之tab4抗艘或同型的對照組抗 體。每日觀察該些接受皮膚移植的小鼠。若5〇%的植 _ 皮膚發生壞死情形時，則表示移植皮膚受到排斥。第7 圖係顯示移植皮膚存活的百分比（η=8)。圖中的數據顯 示出ΤΑΒ4抗體的治療能延長異種異體移植組織的存 活時間。 第9較佳實施例：ΤΑΙΡ經鑑定為ρ選擇素醣蛋白配位 艎1 別稱CD 162的Ρ-選擇素醣蛋白配位體丨是一種表現 在白血球（包括T細胞）之細胞表面上的p_選擇素配位 © 體（Sako et ah (1993) Cel1 75:1179; Vachino et al. (1995) J. Biol. Chem. 270:21966; Veldman et al. (1995) j. Biol

Chem· 270:16470)。T細胞凋亡誘發蛋白由於其分子量 與傾向形成二聚體等生化特性，均暗示出TAB4可能是 p-選擇素醣蛋白配位體1的類似物。為了研究兩種抗 原之間的關係，係以下列步驟來進行試驗：丨)測試被 ΤΑΒ4抗體沈澱下來的抗原是否能被市售的抗選擇 素醣蛋白配位體1抗體所辨識；2)測試抗ρ選擇素醣 蛋白配位體1抗體是否能消粍掉細胞溶胞液中的ταβ4 54 201012472 抗體。 下列步驟均在4°C下進行，係以加入蛋白酶混合抑制 劑的溶胞溶解液（1% Triton X-100, 20 mM Tris-HCl, pIi * 8.0, 160 mM氯化納，1 mM氯化妈）將RL<^ 1 T細胞調 -整成1 ·0 x 1 08 cells/ml之細胞密度後，靜置1小時以使 細胞溶解。隨後以10,OOOxg轉速將溶胞液離心10分 鐘，以去除溶胞液中的不溶物質。將每20μ1的G蛋白 _ 瓊脂糖凝膠粒中分別預先加入1 0 eg抗Ρ-選擇素醣蛋 β 白配位體 1 單株抗體（clone 2ΡΗ1，PharMingen，San Diego，CA)、抗T細胞凋亡誘發蛋白單株抗體、TAB4 抗體或正常倉鼠血清中的免疫球蛋白G後，再將相當 於5.OxlO7個細胞之蛋白量的溶胞液加入上述含有抗 體之G蛋白瓊脂糖凝膠粒中。使溶胞液與含有抗體之 G蛋白瓊脂糖凝膠粒在4°C下反應4小時後，以清洗緩 衝液（0.05% Triton X-100, 50 mM Tris-HCl, pH 8··5, 400 ® mM氯化納，1 mM氯化約，1 mg/ml卵白蛋白.)洗滌G 蛋白瓊脂糖凝膠粒五次。將清洗缓衝液中的氣化納調 整成25 0 mM的濃..度後’再清.洗G蛋白遭脂糖凝膠粒 兩次後 以40 μΐ之 1 xSDS樣.品緩衝液來洗脫.g蛋白 瓊脂糖凝膠粒上的蛋白質。隨後以6°/。的SDS電泳膠來 分離洗出來的蛋白質’並將電泳膠上的蛋白質轉潰到 硝化纖維薄膜上。以抗P-選擇素醣蛋白配位體丨單株 抗體對薄膜上的蛋白質進行免疫墨點分析 (immunoblotted)，並以過氧化酶標記之山羊抗小鼠免 55 201012472 疫球蛋白G(H+L)配合化學發光試劑（Renajssance,视冲來 使薄膜上的蛋白質顯影..。 將細胞表面生物素化的RLdi τ細胞以溶胞溶解液 * 調整成l.OxlO8 cell/ml的密度，並使細胞溶解。獲得 - 的細胞萃取物（cell extract)與結合在40 μίθ蛋白瓊脂 糖凝膠粒上的20 pg抗體混合，並在4°c下反應一個晚 上。上述反應所使用之抗體可為抗p_選擇素醣蛋白配 $ 位體1單株抗體（2PH1)或對照用小鼠免疫球蛋白G，亦 可使用TAB4抗體或對照用正常倉鼠血清。經上述處理 後的細胞萃取物再分別以TAB4抗體或抗P-選擇素醣 蛋白配位體1單株抗體來進行免疫沈澱反應。以6%的 SDS聚丙稀酿胺凝膠（sj)S-p〇lyacrylamide gel)來分離獲得的 免疫沈殿物’並以螢光攝影（fluorogj^aphy)來檢視結果。第 6圖係顯示抗P-選擇素醣蛋白配位體1單株抗體可去 除T細胞萃取物中的τ細胞凋亡誘發蛋白。此外，利 ® 用西方墨點法可發現，與抗Τ細胞凋亡誘發蛋白單株 抗體（ΤΑΒ4)共同免疫沈澱下來的蛋白質能被抗ρ_選擇 素酷蛋白配位體1單妹抗體所辨識。 第10較佳實施例：利用抗Ρ_選擇素糖蛋白配位體1抗 髏來誘發出人類Τ細胞之細胞凋亡反應 為瞭解Ρ-選擇素醣蛋白配位體I在人類Τ細胞的細 胞调亡機轉中扮演何種角色，因此進行一時程實驗用 來研究已活化人類Τ細胞對Ρ-選擇素醣蛋白配位體i 調控性的細胞凋亡訊號的敏感度。係在含有介白素_2 56 201012472 的培養..液-中加入植物也凝素分裂原（phytohemagglutinin mitogen，PHA)以刺激人類T細胞。收取已活化的T細胞， 並以含有介白素-2與交聯抗體的抗P-選擇素醣蛋白配 位體1抗體來處理該些已活化的人類T細胞。 自健康成人體内取得人類周邊血液，將周邊血液以 肝制凝素處理後，根據細胞比重不同，利用 Ficoll-Paque 試劑（Pharmacia Biotech)來收集周邊血液 單核球（peripheral blood mononuclear cells, PBMC)。使 用濃度 1%的植物 jk 凝素（Life Technologies，GibcoBRL) 來處理周邊血液單核球48小時後，並在整個實驗過程 中’均將已活化的周邊血液單核球保存在含有重組人 類介白素-2(5 ng/ml)的狀況下中。為了評估抗人類p_ 選擇素醣蛋白配位體1抗體之細胞凋亡誇發能力，以 下述各種物質來處理已活化周邊血液單核球。所使用 之材料為：（l)lpg/ml之抗p_選擇素醣蛋白配位體丄 © 「KPL-1」（BD PharMingen)加交聯用兔子抗小鼠免疫 球蛋白（0.5fXg/ml)(Jackson ImmunoResearch

Laboratories); (2)純化的同型對照用小鼠免疫球蛋白加 上父聯用兔子抗小鼠旁t涛綠名A , # t

57 201012472 加上交聯分子來使p-選擇素醣蛋白配位體1產生訊號 而誘使PHA活化的人類周邊血液單核球（主要為τ細胞） 發生顯著的細胞调亡現象。在經過抗Ρ _選擇素酷蛋白 * 配位體.1抗體處理的細胞中，调.亡細胞的.比率從第二 .天的8.5%到第8天則升高至24%。而不論是同型對照 用抗體’還是僅使用交聯用抗體均不會對細胞造成任 何影響。 ❼第11較佳實施例：使用抗Ρ-選擇素醣蛋白配位艎1協 同性抗髖來治療自體免疫疾病 以一般方式來飼養非肥胖型糖尿病（N〇D)小鼠（即自 體免疫糖尿病動物）。大約在鼠齡20週時，非肥胖型糖 尿病小鼠會自發性地罹患糖尿病。在實驗組中，小氣 为別在鼠齡14週、15週與17週時，以總共三次，每 次300叫之用量，以腹腔注射方式對每隻小鼠施打 3〇〇μ§的抗P-選擇素醣蛋白配位體1抗體（TAB4抗 〇 體）。又分別在鼠齡24與26週的時候，再給予小鼠注 射相同劑量的TAB4抗體。而以相同劑量與相同的方式 對小鼠注射倉鼠免疫球蛋白來作為對照組。並且於鼠 ^ 5週以後’母週兩次’以Medi-Test葡萄糖試紙 (Macherey-Nage丨，Germany)來追縱小鼠尿液中的葡萄 糖含量。連續兩次測得非禁食之尿中葡萄糖含量高於 300 mg/刖時，則判定該小鼠患有糖尿病。第9圖係顯 示，相較於使用對照用抗體，使用TAB4抗體能產生明 顯的保護效果。因此，使用抗p_選擇素酶蛋白配位體 58 201012472 1抗體能抑制自體免疫T細胞的活性，並延緩第I型糖 尿病的發生。 第12較佳實施例·· p_選擇素、E-選擇素與^選擇素對 * 活化τ細胞的結合力 . 為了測定選擇素（Ρ-選擇素、Ε-選擇素與L_選擇素） 對已活化T細胞的結合能力，係從C57BL/6小鼠體内 獲得新鮮的脾臟細胞並活化之’並收取活化過程中第 2、第4與第6天及尚未被活化的τ細胞（剛製備好脾 臟細胞時為第〇天）來進行分析試驗。。使用含有2μ§/ιη1 之刀豆球蛋白Α與10%小牛血清的DMEM培養液來培 養脾臟細胞兩天後’所收取的細胞為第2天之細胞樣 品’並存活的以Ficoll比重梯度分離法來分離出肝臟 細胞。細胞以刀豆球蛋白A活化三天，再置於含有5 ng/ml之介白素_2的培養液中培養一天後便可獲得第* 天之細胞樣品。而第六天之細胞樣品係將細胞以刀豆 ❹ 球蛋白A活化三天，再置於含有5 ng/nl卜之介白素_2 的培養液中培養3天後而得。 接著以FAC S分析法來檢測上述細胞樣品，係將第 〇、第2、第4與第6天之細胞樣品分別取出2x1 〇5個 細胞置於不同之盤孔，隨後於每盤孔中加入體積為 40W、濃度為從20pg/ml連續2倍稀释至〇.156pg/ml 之小鼠P-選擇素、E_選擇素或L-選择素融合蛋白(R&D Systems，Minneapolis，MN)。這些選擇素融合蛋白是小 鼠選擇素與人類免疫球蛋白G1之Fc ^定區融合而形 59 201012472 成的。小鼠選擇素融合蛋白與細胞混合後，置於4 °C下 反應30分鐘。反應後，以IxFACScan緩衝液（去除鈣 離子與鎂離子的l x磷酸缓衝液（Biochr〇m AG)加上2%小 * 牛血清）來清洗細胞。隨後再於各孔盤中分別加入濃度 - 為3.25pg/m卜體積95μ1的抗-Thyl.2及第二試劑（FITC_ 抗人類免疫球蛋白G之恆定區片段’ Jackson Immun〇Research

Laboratories, Inc.，West Grove，PA)與樣品細胞混合，並置於 4。〇 • 下反應30分鐘後，以1 xFACScan緩衝液清洗細胞。 第10圖係顯示FACSCalibur分析法的結果。當使用 濃度20pg/ml之p_選擇素與已活化τ細胞反應時，p_ 選擇素對已活化細胞的結合力會隨著天數増加而漸漸 上升’第四天的結合力最高，而到第六天時，結合力 則些微下降。E_選擇素的結合力在第2至第4天大幅 上升後’保持不變至第六天。L-選擇素對小鼠已活化τ 細胞的結合力則不明顯，並且在整個活化過程中均無 Θ 變化，例如從第〇天到第6天均無結合力的變化。^ 結果可能是因為L-選擇素對其配位體具有極低的親和 力的緣故。當三種選擇素使用較低濃度來進行實驗 時’所得到的實驗結果與使用較高濃度之結果類似。 第13較佳實施例-選择素、E-選擇素與選择素: 多聚複合體可引起活化後T細胞的細胞瑪亡反應 β在、4 C下，以濃度20吨/m卜體積50μ1的抗人類怪） 品免疫球蛋白抗體來處理96-孔盤（NUNC)—個晚上 60 201012472 隨後在37°C下，以1 %小牛血清蛋白（Bs A)來對處理過 的96-孔盤進行阻隔處理（blocking)。完成阻隔處理後， 在孔盤中加入50μ1的人類Fc_選擇素融合蛋白（濃度介 * 於0.063〜5Kg/ml之間），置於室溫下反應2小時。在上 -述所有實驗步驟中，每個盤孔均以丨倍的磷酸緩衝液 清洗五次。隨後’在每個盤孔中加入2 x丨〇5個已經過刀 豆球蛋白A活化四天後的細胞，並置於37«c下培養5 小時。隨後在4°C下將此96-孔盤以200xg的轉速離心 5分鐘以獲得細胞沈澱。將生物素_膜聯蛋白_v結合物 (Annexin V-biotin conjugate)加入含有已活化細胞的沈澱物 中’置於至/JBL下反應15分鐘後’再加入印白，素結合物 (avidin conjugate)(Beta —半乳糖苷酶（S A_beta-gal)以 1:5000之倍數稀釋後使用）後置於37°c下繼續反應3〇 分鐘。每個反應步驟完成後，係以膜聯蛋白_v結合緩 衝液清洗各個盤孔三次。最後在各盤孔中加入u 〇μ1 〇 的ζ-緩衝液混合物（係在20 ml Ζ-緩衝液中加入54 ul 的乙硫醇（2-mercaptoethanol)配製而成）與3〇μ1的 ONPG(0.04g/10ml)後在4°C下放置一個晚上即可完成 呈色反應。隨後紀錄波長42Onm的光源來讀取結果。 已活化T細胞的選擇素調控性細胞凋亡程度會隨著 具有人類免疫球蛋白G1之Fc區域的P -選擇素（第11A 圖）或E-還擇素（第11B圖）之濃度提高而上升。其中選 擇素的濃度使甩範圍從0.063 ug/ml到5 ug/mi。而在 第一較佳實施例中’亦證明倉鼠抗體TAB4可引發已活 61 201012472 化τ細胞的細胞凋亡現象，並可用來做為其他較佳實 施例中的正對照組。而無法引發已活化τ細胞之細胞 凋亡現象的抗人類Fc抗體、人類免疫球蛋白與小牛血 ‘ 清蛋白則可用來作為其他實驗中的負對照組。人類

Fc-L-選擇素融合蛋白無法引起顯著之細胞凋亡的結果 (第11C圖），則與第12較佳實施例中L_選擇素無法與 已活化T細胞結合的結果相呼應。 而在此較佳實施例中的結論是，固定在孔盤上且具 有P-選擇素或E-選擇素之p_選擇素醣蛋白配位體i結 合片段與人類Fc片段的融合蛋白可引發已活化τ細胞 的細胞凋亡現象。 第14較佳實施例：可溶性p_選擇素_Fc恆定區融合蛋 白的交聯反應會引起已活化τ細胞的細胞凋亡反應 依照上述方法將小鼠選擇素（Ρ-選擇素、Ε-選擇素與 φ L-選擇素）與人類免疫球蛋白⑴之Fc區域融合以形成 可溶性二聚性融合蛋白（soluble dimeric fusion protein)，進行實驗評估此可溶性選擇素是否能引起已 活化τ細胞的細胞洞亡反應，實驗設計細節參考第13 較佳實施例中所敘述之方法，但是略去加入固定在孔 盤上之抗人類Fc免疫球蛋白的步驟，。如第12圖所 示’若僅加入可溶性P-選擇素融合蛋白（二聚體），則 已活化T細胞發生細胞凋亡的程度極低，甚至低到可 w略的情況。然而’若添加如抗人類Fc之交聯分子， 62 201012472 則已活化τ細胞發生細胞亡 ^ ^的現象則大幅提昇，其 引起細胞凋亡程度接近内含有 3有固定之抗體後所引發的 細胞凋亡程度。而抗人類Fc、 入類免疫球蛋白（HIg)或 小牛血清蛋白均不能引起已活 T細胞的細胞凋亡反 應。 同理’ E-選擇素-Fe融合|白t 1 蛋白亦可得到與P-選擇素-Fc 融合蛋白相同的結果。此外，·^ 卜可溶性L-選擇素融合蛋 白亦無法引發已活& T細胞的调亡反應，且此結果虚 對已活化τ細胞使用固定在盤孔上(多聚體)之l選擇 素的結果一致。 其他較佳實施例 需瞭解到以上有關本發明之詳細敘述僅作為說明本 發明之用，並不非用來限定本發明範圍。本發明之其 他目的、優點及改良均應仍屬下述申請專利範圍所涵 蓋之範圍。 ❹ 【圖式簡單說明】 第1圖係顯示一時程實驗的結果，用來研究已活化τ 細胞對TAB4抗體（抗P-選擇素醣蛋白配位體丨單株抗體） 調控性細胞凋亡訊號的敏感性。 第2圖係顯示對細胞表面進行生物素標記反靡，並 利用TAB4抗體對抗原進行免疫沈殺的結果。 第3圖係顯示脾臟之CD4 + T細胞、CD8+ 了細胞 63 201012472 CD19 Β細胞與自块組主&也， 目…、殺手細胞上的ρ·選擇素醣蛋白配 位體1表現情況〇 第4圖係顯示 胞上的Ρ-選擇素 CD4+、CD8+、CD4 + 8 +與 CD4_8_胸線細 聰蛋白配位體1表現情況。

φ 第5圖係' 顯示混和細胞培養中介白素-2 #表現量， 其中使用經TAB4抗體（或倉鼠免疫球蛋白）處理之 Balb/c小鼠的脾臟細胞來作為反應細胞，並以H2非配 對之C3H脾臟細胞來作為刺激細胞。 第6圖係顯示西方墨點分析結果，用來說明：（A)利 用TAB4抗髏免疫沈搬下來的蛋自質能被市售的抗p_ 選擇素醣蛋白配位體i抗體辨認，以及（B)T細胞溶胞 抗體前置清除處理 液經過抗P-選擇素醣蛋白配位體 後’溶胞液中能被TAB4抗體所辨識的蛋白量減少。 第7圖係顯示分別接受抗p_選擇素醣蛋白配位體1 抗體（實心菱形）或對照組抗體(空心方形）處理過之 C5 7BL/6小鼠在接受Balb/c小鼠之移植皮膚後的移植 存活率。 第8圖係為一時程實驗，係顯示以抗人類p_選擇素 醣蛋白配位體1抗體來處理已活化人類周邊血液單梭 球後的T細胞凋亡百分率。 第_ 9圖係顯示自_體免疫性糖尿病（或_稱非肥胖性糖_尿 病NOD)雄鼠的糖尿病發生率，該些雄鼠經過施打 TAB4抗體（實心方塊）或對照組抗體（空心方塊）的處 理。 64 201012472 第ίο圖係_示小& 乳之P選擇素、E-選擇素與^選擇 素對小鼠已活仆T / t 化T細胞的結合情況。 第11圖係颟示刹 ^ 〜”小V π 丄丄Λ _ ;、 (苐11Β圖）與l_選渡去， 遊擇素（弟11C圖）之多聚複合 用Ρ_選擇素（第11Α圖）、Ε-遞擇素 體進行小 ;11 R nn 鱼 r 一 鼠已活化T細胎沾4从 胞的細胞凋亡誘發反應。 第12圖係顯示利用可溶性P-選擇素-Fc恆定區融合蛋 白來進行小鼠已活化T細胞的體外細胞凋亡誘發反應。 ® 【主要元件符號說明】 無 ❹ 65

Claims (1)

1. 201012472 七、申請專利範圍： 1 · 一種防止或降低患者之τ細胞調控性免疫反應的方 法，該方法至少包括： . 選擇一病患’該病患係經診斷為患有或可能患有過 - 度τ細胞調控性免疫反應或不需要的T細胞調控性免疫 反應；以及 對該患者施用一多聚複合體化合物，該多聚複合體 鲁 化合物會與Τ細胞表面上至少兩個Ρ_選擇素醣蛋白配位 體1結合，其中該多聚複合體化合物至少包括二條多胜 肽鏈，該些多胜肽鏈至少包括（i)一結合區與（ii)一異種 胺基酸序列，其中，該結合區可與p_選擇素醣蛋白配位 體1結合，且該些多胜肽鏈透過該異種胺基酸序列的連 接來形成該多聚複合體化合物， 其中該多聚複合體化合物與τ細胞表面上至少兩個 Ρ-選擇素醣蛋白配位體1的結合會誘發出一可造成τ細 © 胞死亡的訊息傳導路徑，藉以防止或降低該患者的Τ細 胞調節性免疫反應。 . 2.如申請專利範圍第1項所述之方法，其中該多聚複合 體化合物為一同多聚複合體化合物。 3，如申請專利範圍第1項所述之方法，其令該多聚複合 體化合物為一異多聚複合體化合物。 66 201012472 4.如申請專利範圍第丨項所述 甘；—田 <〈方法，其中該異種胺基 酸序列至少包括一細胞表面受體結合區域。 5.如申請專利範圍第i項所述之方法，其中該結合區至 少包括-P·選擇㈣外區或該擇素胞外區之p_選擇 素糖蛋白配位體1結合片段。 6.如申請專利範圍第！項所述之方法，其中該結合區至 籲 少包括-E_選擇素胞外區或該^選擇素胞外區之^選 擇素醣蛋白配位體1結合片段。 7.如申請專利範圍第丨項所述之方法，其中該結合區至 少包括一 L-選擇素胞外區或該L·選擇素胞外區之卜選 擇素醋蛋白配位體1結合片段。 ❹ 8·如申請專利範圍第1項所述之方法，其中該結合區至 少包括一抗P-選擇素醣蛋白配位體丨抗體的抗原結合區 或該抗P-選擇素醣蛋白配位體丨抗體之抗原結合區的片 段。 9.如申請專利範圍第1項所述之方法，其中該結合區至 少包括一可以結合P-選擇素醣蛋白配位體丨之多胜肽 鍵’ δ亥多胜狀鍵選自一嗟菌體表現庫中。 67 201012472 10.如申請專利範圍f 1項所述之方法，其中該些多胜 狀鍵係藉著該異種胺基酸序列之共價連結來形is多聚 複合體化合物。 其中該共價連 11·如申請專利範圍第10項所述之方法 結為一雙硫鍵連結。

   12.如申請專利範圍第1項所述之方法， 基酸序列至少包括一免疫球蛋白長鏈怪定 其中該異種胺 區〇 13.如申請專利範圍第1項所述之的方法，更至少包括 對該患者施用一藥劑，該藥劑可透過該異種胺基酸來與 該多聚複合體化合物結合，並引起T 、 匙τ細胞表面上複數個 P -選擇素酶蛋白配位體1抗原的交聯反應_。 ❿ 如申請專利範圍帛1JS所述之方法其至少 择一經診斷為患有一發炎疾病的患者的步驟。 15. 如申請專利範圍第1項所述之方法，其至少包含 擇-經診斷為患有—自體免疫疾病之患者的步驟。3、 16. 如申請專利範圍第厂項所述之方法，其至少包含選 擇一接受或預定揍受一同種異體显胁 之患者的步驟。異種異體移植 68 201012472 ’其至少包含選 的步驟。 17·如申請專利範圍第1項所述之方法 擇一經診斷為患有一過敏性疾病之患者 18.如申請專利範圍第 擇一經診斷為患有一 T 1項所述之方法，其至少包含選 細胞癌症之患者的步驟。

   19.如中請專利範圍第！項所述之方法，其中該7細胞 為^一已活化T細胞。 20.如申請專利範圍第i項所述之方法，其至少包括偵 測一第一生物樣本之T細胞數量’該第一生物樣本係取 自尚未使用該多聚複合體化合物之患者，並將該結果與 一第二生物樣本之T細胞數量比較，該第二生物樣本係 取自已使用該多聚複合體化合物之患者。 21 ·如申請專利範圍第1項所述之方法，其至少包括偵 測一第一生物樣本之T細胞生物活性，該第一生物樣本 係取自未使用該多聚複合體化合物之患者，並將該結果 與一第二生物樣本之T細胞生物活性比較，該第二生物 樣本係取自已使用該多聚複合體化合物之患者。 22.如申請專利範圍第1項所述之方法，其中該施用藥 劑的步驟會使該患者體内已活化的T細胞數目減少至少 69 201012472 10% 〇 23· 一種引起τ細胞或自然殺手細胞死亡的方法，該方 .法至少包括： 提供在細胞表面上表現Ρ-選擇素醣蛋白配位體1的 i 一 τ細胞或一自然殺手細胞；以及 使該T細胞或該自然殺手細胞與一多聚複合體化合 物接觸，該多聚複合體化合物會與該τ細胞或該自然殺 瘳 手細胞表面上與至少兩個P-選擇素醣蛋白配位體1結 合，其中該多聚複合體化合物至少包含二條多胜肽鏈， 該些多胜肽鏈至少包括⑴一結合區，與（ii)一異種胺基酸 序列’其中，該結合區會與P-選擇素醣蛋白配位體1結 合’並且該些多胜肽鏈透過該異種胺基酸序列的連接來 形成該多聚複合體化合物， 其中該多聚複合體化合物與該τ細胞或該自然殺手 φ 細胞表面上之該至少兩個P-選擇素醣蛋白配位體1結合 會誘發出一可造成該τ細胞或該自然殺手細胞死亡的訊 息傳遞路徑。 24. 如申請專利範圍第23項所述之方法，其中該多聚複 合體化合物為一同多聚複合體化合物。 25. 如申請專利範圍第23項所述之方法，其中該多聚複 合體化合物為一異多聚複合體化合物。 201012472 26.如申請專利範圍第23項所述之方法，其中該異種胺 基酸序列至少包括一細胞表面受體結合區域。 ‘ 27.如申請專利範圍第23項所述之方法，其中該結合區 至少包括一 P-選擇素胞外區或該p_選擇素胞外區之一 p_ 選擇素醣蛋白配位體1結合片段。 ❹ 28.如申請專利範圍第23項所述之方法，其中該結合區 至少包括一 E-選擇素胞外區或該E-選擇素胞外區之一 P-選擇素醣蛋白配位艎1結合片段。 29.如申請專利範圍第23項所述之方法，其中該結合區 至少包括一 L-選擇素胞外區或該L-選擇素胞外區之一 P-選擇素醣蛋白配位體1結合片段。 _ 30.如申請專利範圍第23項所述之方法，其中該結合區 至少包括一 P-選擇素醣蛋白配位體1抗體的抗原結合區 或該抗P-選擇素醣蛋白配位體1抗體之抗原結合區的片 段。 31.如申請專利範圍第23項所述之方法，其中該結合區 至少包括一可以結合P-選擇素醣蛋白配位體1之多胜肽 鏈，該多胜肽鏈選自於一噬菌體表現庫中。 η 201012472 32. 如申請專利範圍第23項所述之方法，其中該些多胜 肽鏈透過該異種胺基酸序列而共價連結以形成該多聚複 合體化合物。 33. 如申請專利範圍第32項所述之方法，其中該共價連 結為一雙硫鍵連結。 i 34.如申請專利範圍第23項所述之方法，其中該異種胺 基酸序列至少包括一免疫球蛋白長鍵恒定區。 35.如申請專利範圍第23項所述之方法，更至少包括使 該多聚複合體化合物與一藥劑接觸，該藥劑會透過該異 種胺基酸序列來與該多聚複合體化合物連接，並引起τ 細胞表面上之複數個p_選擇素醋蛋白配位體i抗原的交 _ 聯反應。. φ 36·如申請專利範圍第23項所述之方法，該方法至少包 括引起該已活化T細胞的死亡。 37·如申請專利範圍第23項所述之方法，其中該方法至 少包括§平估該T細胞或該自然殺手細胞與該多聚複合體 化合物接觸後的存活率。. . . .... .. ... .... ' 72 201012472 38.如申請專利範圍第23項所述之方法，其中該方法至 少包括評估該Τ細胞或該自然殺手細胞與該多聚複合體 化合物接觸後的生物活性。 39. —種藥劑套組，其至少包括. 一多聚複合體化合物，其係能與_ T細胞表面上至 少兩個P-選擇素醣蛋白配位體1結合’其中該多聚複合 體化合物至少包括二條多胜肽鏈’每一條該些多胜狀鏈 _ 至少包括⑴一結合區，與（ii)一異種胺基酸序列，其中該 結合區會與P-選擇素醣蛋白配位體1結合，該些多胜肽 鏈透過該異種胺基酸序列的連結而形成該多聚複合體化 合物’其中該多聚複合體化合物與該T細胞表面上至少 兩個P-選擇素醣蛋白配位體1的結合會誘發出一可造成 該T細胞死亡的訊息傳導路徑；以及 說明書’用來說明該多聚複合體化合物可洽療發 _ 炎、自體免疫疾病、移植排斥、過敏性症狀或一 τ細胞 癌0 73