HUT64476A - Process for inhibiting interacton between proteins and carbohydrate causing cell-adhesion - Google Patents

Description

A találmány tárgyát a sejt-tapadást okozó fehérjék és a nekik megfelelő szénhidrát ligandumok közötti kölcsönhatások terápiás célú megzavarása képezi.

Az ELAM-1 egy integrális membrán tapadási fehérje.

Egy olyan extracelluláris doménnel rendelkezik, amely egy N-terminális lektinnel rokon szegmentet, egy epidermális növekedési faktorral rokon szegmentet és több komplementer szabályozó fehérje motívumot tartalmaz [Bevilacqua et al., Science, 243, 1160 (1989); Stoolman et al., Cell, 56, 907 (1989)]. Az ELAM-1 specifikusan expresszálódik az IL-1 és a tumor nekrózis faktor (TNF) által aktivált endoteliális sejtek felszínén [Bevilacqua et al., Proceedings of the National Academy of Sciences, USA, 84, 9238 (1987)], illetve a Substance P peptid hormon által aktivált endoteliális sejtek felszínén [Matis et al., J. Invest. Dermatol., 94.

492 (1990)]. Befolyásolja a mieloid sejtek tapadását (például a neutrofil granulocitákét) a citokinnel aktivált endoteliális sejtekhez [Bevilacqua et al., Proceedings of the National Academy of Sciences, USA, 84., 9238 (1987)]. Az a vélemény alakult ki, hogy az ELAM-1 a gyulladásos és immunológiai folyamatok szabályozásában játszik szerepet a vér, és az érfalak határfelületén [Bevilacqua et al., Science, 243. 1160 (1989)].

A találmány tárgyát általánosságban egy olyan módszer képezi, amellyel egy sejt-tapadást okozó fehérjét hordozó sejtnek egy, a sejt-tapadást okozoó molekulára specifikus szénhidrát determinánst hordozó molekulához vagy sejthez való kötődését lehet gátolni. A módszer szerint a sejt-tapadást okozó fehérjét hordozó sejtet olyan inhibitor molekulával hozzuk érintkezésbe, amely a szénhidrát determinánst tartalmazza.

A találmány egy előnyös megvalósítási módja szerint a sejt-tapadási fehérje egy szelektin, azaz például az ELAM1; a szénhidrát determináns a szialil-Le^x; a szialil-Le^x determináns lehet N-kapcsolt vagy O-kapcsolt; az inhibitor molekula több szialil-Le^x determinánst tartalmaz; az inhibitor molekula egy fehérje, előnyösen αχ-savas glikoprotein vagy antitest, előnyös IgGl; az inhibitor molekula az αχ-savas glikoprotein egy vagy több N-kapcsolt glikán kapcsolási helyét tartalmazza; az inhibitor molekula pedig vízben oldódik.

A találmány tárgyát továbbá olyan eljárás képezi, amellyel humán betegben lehet a gyulladást csökkenteni oly módon, hogy a betegnek gyógyászatilag hatásos mennyiséget adunk be egy szialil-Le^x determinánst hordozó szerves molekulából.

Egy előnyös megvalósítási mód szerint a szerves molekula több szialil-Le^x determinánst tartalmaz; a szialilLe^x determináns N-kapcsolt, vagy O-kapcsolt; a szerves molekula egy fehérje, előnyös αχ-savas glikoprotein vagy egy antitest, előnyösen IgGl; a szerves molekula vízben oldódik.

A találmány tárgyát továbbá olyan eljárás képezi, amellyel egy olyan inhibitor molekulát lehet azonosítani, amely gátolja egy ELAM-l-et hordozó sejt és egy második sejt vagy fehérje közötti kölcsönhatást. A módszer abban áll, hogy az ELAM-l-et hordozó sejtet egy feltételezett inhibitor molekulával és a második sejttel vagy fehérjével hozzuk ·*· ·

- 4 érintkezésbe, lehetővé téve ezzel egy affinitás komplex kialakulását az ELAM-l-et hordozó sejt és a második sejt vagy fehérje között, és az inhibitor molekulát azon az alapon lehet azonosítani, hogy gátolja az affinitás-komplex kialakulását. A második sejt vagy fehérje előnyösen egy szialil-Le^x determinánst hordoz.

A találmány tárgyát továbbá olyan eljárás képezi, amellyel egy specifikusan kapcsolódó pár első tagjának a kapcsolódását lehet gátolni a specifikus kapcsolódó pár második tagjához oly módon, hogy az első tagot egy olyan antitesttel hozzuk érintkezésbe, amely specifikus az első tagra, és amely kötődik egy olyan szénhidrát egységhez, amely zavarja az antitestnek azt a képességét, hogy rögzíti a komplementet és egy F_c receptorhoz kötődik.

Egy előnyös megvalósítási mód szerint az első tag egy fehérje, és a második tag is egy fehérje; az antitest kovalensen kötődik több szénhidrát egységhez; a szénhidrát egység egy szialil-Le^x determináns; a szialil-Le^x determináns N-kapcsolt, vagy O-kapcsolt; a szerves molekula egy fehérje, előnyösen αχ-savas glikoprotein vagy egy antitest, előnyösen IgGl; a szénhidrát determináns jelenléte az antitesten zavarja az antitestnek azt a képességét, hogy rögzítse a komplementet és egy F_c receptorhoz kötődjön; a szerves molekula az αχ-savas glikoprotein egy vagy több N-kapcsolt glikán kapcsolási helyet tartalmaz; a szerves molekula több szénhidrát determinánst tartalmaz.

A találmány tárgyát képezi továbbá egy olyan tisztított nukleinsav, amely egy sejt-tapadási fehérjére ···· ; ··*» ♦··- ·· • · « * · · . * * · * r·· ·· * · »··· · « · · * ·· · ·. ... .,·

- 5 specifikus szénhidrát determináns kapcsolódási helyeit tartalmazó antitestet kódol; egy vektor, amely az említett nukleinsavat tartalmazza; és egy rekombináns sejt, amely az említett vektort tartalmazza.

Végezetül, a találmány tárgyát képezi egy eljárás egy olyan hordozó molekula előállítására, amelyhez egy sejt-tapadási fehérjére specifikus szénhidrát kovalensen kapcsolódik oly módon, hogy a hordozó molekulát egy olyan enzimmel hozzuk érintkezésbe, amely képes a fehérjét hozzákötni a szénhidrát determinánshoz.

Egy előnyös megvalósítási mód szerint az érintkeztetés egy élő sejtben játszódik le; a sejt eukarióta sejt, előnyösen egy emlős sejt; a sejt egy rekombináns sejt, amely az enzimet kódoló DNS-t tartalmazza; az enzim pedig egy α(1,3)fukozil-transzferáz.

A sejt-tapadási fehérje kifejezés alatt egy olyan fehérjét értünk, amely in vivő körülmények között való létezése során néhány pontban a sejt felszínén foglal helyet, amely befolyásol egy specifikus kölcsönhatást egy fehérjével (például egy szénhidrát ligandumot hordozó fehérjével) egy második sejt felszínén. A szénhidrát determináns kifejezés alatt egy olyan egységet értünk, amely egy vagy több szénhidrát csoportot tartalmaz, amelyek a sejt felszínén találhatók (az in vivő körülmények között való létezésük néhány pontjában), és amely specifikus módon lép kölcsönhatásba egy fehérjével, például egy sejt-tapadási fehérjével, például egy második sejt felszínén. A szelektin kifejezés alatt egy olyan sejt-tapadási molekula-családnak egy tagját ért ··♦« {·**

jük, amely családot az jellemez, hogy szerkezetileg egy lektin-szerű dómén, egy epidermális növekedési faktor szerű dómén, egy sorozat ciszteinben gazdag ismétlődő szakasz, egy transzmembrán dómén és egy rövid citoplazmás farok található bennük. A gyulladás’’ kifejezés alatt egy olyan kóros folyamatot értünk, amelyben citológiai és hisztológiai reakciók mennek végbe, amelyek az érintett vérerekben és a szomszédos szövetekben lépnek fel, sérülés vagy abnormális serkentés hatására, amelyet egy fizikai, kémiai vagy biológiai ágens okozott. A specifikus kapcsolódási párok kifejezés alatt egy olyan molekulapárt értünk, amelynek van egy első és egy második tagja, és amelyek specifikus affinitással rendelkeznek egymás iránt. A specifikus kapcsolódási párokra példaként megemlíthetjük a receptorokat és a ligandumokat, például a sejt-tapadási molekulákat és a nekik megfelelő szénhidrát ligandumokat. A tisztított nukleinsav kifejezés alatt olyan nukleinsavat értünk, amelyet más, vele természetesen asszociálódó szekvenciáktól elválasztottunk. Az N-kapcsolt alatt az értjük, hogy egy fehérje aszparagin csoportjának amid nitrogénjéhez kapcsolódik. Az O-kapcsolt alatt azt értjük, hogy egy fehérje szerin, treonin vagy hidroxilizin csoportjának hidroxil-oxigénjéhez kapcsolódik.

A mellékelt 1. ábrán az IgGl szekvenciája, valamint azok a mutációk láthatók, amelyeket azzal a céllal vittünk be, hogy N-kapcsolt glikán kapcsolási helyeket hozzunk létre.

A 2. ábra egy grafikon, amelyen az α-ELAM-l antitesteknek egy sorozat ELAM-1 szubfragmenshez és ELAM-1 fúziós

.... «...

• ν ··' • ••· 4 • · • 4 • ·4ι 4·

- 7 fehérjéhez való kapcsolódási képességét mutatja be.

A 3. ábra egy ELAM-l-IgG fúziós fehérje doménszerkezetét mutatja be.

A 4. ábra egy grafikon, amely egy sorozat emlős sejtvonalnak egy ELAM-l-IgG fúziós fehérjéhez való kapcsolódása mértékét mutatja.

Az 5. ábra egy grafikon, amely egy sorozat emlős sejtvonalnak a CD15, CD63 vagy szialil-Le^x sejtfelszíni molekulák elleni antitestekhez való kötődése mértékét mutatja.

A 6. ábra egy grafikon, amely neuraminidázzal kezelt mieloid sejteknek az ELAM-l-hez vagy az ot-CD15 antitesthez való kapcsolódását mutatja.

A 7. ábra egy grafikon, amely az ELAM-l-et hordozó sejt tapadásának a-szialil-Le^x antitesttel való gátlását láthatjuk.

A 8. ábra egy grafikon, amely a magzatvízből származó szialil-Le^x determinánsnak a mieloid sejtek és az ELAM-1 közötti kötődésre gyakorolt hatását mutatja.

A 9. ábra egy grafikon, amely az in vitro fukozilezett αχ-savas glikoprotein ELAM-l-hez való kötődési képességét mutatja.

A 10. ábra egy grafikon, amely az IL-1 és az IL-8 hatását mutatja a szialil-Le^x sejtfelszíni expressziójára.

A 11. ábra egy grafikon, amely az IL-1 és IL-8 hatását mutatja a mieloid sejtek és az ELAM-1 közötti tapadásra.

A találmány egyik megvalósítási módja szerint a találmány tárgyát egy olyan antitest képezi, amely egy vagy több olyan szénhidrát oldallánccal rendelkezik, amelyek elfedik az immunoglobulin molekula CH2 részét, és ezáltal gátolják a komplement fixálását és az F_c receptor kötődését. Az ilyen antitestek jól használhatók a sejtek vagy fehérjék közötti nem-kívánatos kölcsönhatások elrontására, vagy, általánosságban bármely két molekula közötti kölcsönhatás elrontására, amelyek közül az egyik egy antitest által specifikusan felismert determinánst hordoz. Mivel a szénhidrát egységek blokkolják azt az immunoglobulin domént, amely a komplement fixálását és az F_c receptor kötődését beindítja, ezek az antitestek nem fejtik ki a nem-kívánatos mellékhatásokat (azaz azokat, amelyek a komplement fixálásából és az F_c receptor kötődéséből származnak), amelyek az antitestet alkalmazó terápiák esetén gyakran fellépnek. A szénhidrát csoportok előnyösen nem csak gátolják a nemkívánatos komplement fixálását és F_c receptor kötődését, hanem az a funkciójuk is megvan, hogy kompetitíven gátolják a szénhidrát ligandum-sejt-tapadási fehérje kölcsönhatást. Ahol a szénhidrát csoportok ellátják ezt a funkciót, ott az antitest általában nem lát el semmilyen ebből a specifitásból származó funkciót, hanem csak a szénhidrát csoportok hordozójaként működik. Az alábbiakban ismertetünk egy ilyen molekulát, amelyben a szénhidrát oldallánc a szialil-Le^x determinánst tartalmazza. A szialil-Le^x általában úgy hat, hogy megkönnyíti azoknak a sejteknek a kölcsönhatását, amelyek hordozzák a szialil-Le^x csoportot (például a neutrofil sej tek) azokkal a sejtekkel, amelyek az ELAM-1 fehérjét hordozzák (például az endoteliális sejtek, amelyek az érfalban találhatók) . Ennek a kölcsönhatásnak az elrontása gyógyászati alkalmazás lehetőségét teremti meg, például minimalizálja a gyulladást, amely szöveti sérülések, például szívinfarktus esetén lép fel, vagy amely betegségekre, például a pszoriázisra vagy a reumatoid artrítiszre jellemző.

Az IgGl molekula természetes alakjában nem hordoz szialil-Le^x olda1láncokat. Mivel az N-kapcsolt glikán kapcsolódási helyek jól ismertek: N X S/T (ahol N jelentése aszparagin, S jelentése szerint, T jelentése treonin és X jelentése bármilyen aminosav prolin kivételével), egy olyan molekulát terveztünk, amely számos ilyen helyet tartalmaz a szialil-Le^x oldalláncok kapcsolódásának céljából. Az IgGl szekvencia vizsgálata (1. ábra) azt mutatja, hogy legalább öt olyan hely van, amelyeknél az N-kapcsolt glikán kapcsolási helyek bevihetők a molekulába előnyös pozíciókban, ahol a komplement fixálását és az F_c receptor kötődéséhez való képességet gátolja az eljárás. Ezek a helyek (azaz a 274-es, 287—es, 295-ös, 322-es és 335-ös aminosavakkal kezdődőek), jóllehet az N-kapcsolt glikán hozzáadására előnyös pozíciók, nem képeznek egyedüli lehetőséget; más hasznos helyek is azonosíthatók és beépíthetők az IgGl szekvenciába, az alábbi kritériumok figyelembevételével:

(1) a helyek előnyösen az immunoglobulin molekula CH2 régiójában találhatók, azaz a molekulának azon a részén, amely a komplement fixálásáért és az F_c receptor kötődéséért felel;

• · * (2) a helyek a szekvencia olyan régióiban találhatók, amelyeket a hidrofil természetük alapján lehet kijelölni, és amelyek az immunoglobulin molekula külső részén találhatók, és ezért hozzáférhetők a szénhidrát oldallánc hozzákapcsolását végző enzimek számára;

(3) a helyek egy olyan régióban találhatók, amely a legkevésbé sem rontja el a primer aminosav szekvenciát és ezáltal a megjósolt szekunder aminosav szerkezetet.

Például egy a természetben előforduló hely, amely egy N-kapcsolt glikán kapcsolási ponttól egyetlen aminosavban tér el, előnyös lehet egy olyan helyként, amely az aminosav szekvenciában két változatot igényel. Továbbá, előnyös úgy készíteni egy N-glikán kapcsolódási helyet, hogy a hasonló töltésű vagy polaritású aminosavakat cseréljük ki (például egy töltetlen aminosavat egy másik töltetlen aminosavra cserélünk). Egy vagy több N-kapcsolt glikán kapcsolódási hely helyettesítést vihetünk be az IgGl-et kódoló szekvenciába; az ilyen szekvenciákat (azaz azokat, amelyek olyan antitest molekulát kódolnak, amelyekhez a szialil-Le^x egységek hozzákapcsolhatók) IgGl-szialil-Le^x vagy IgGl-Le^x jelöléssel látjuk el.

Egy adott, szialil-Le^x egységeket tartalmazó IgGl molekulát az alábbiak szerint állítunk elő. Az IgGl gén szabadon hozzáférhető, szekvenciáját az 1. ábrán mutatjuk be. A gént standard in vitro helyspecifikus mutagenezissel mutagenizáljuk, hogy egy vagy több N-kapcsolt glikán kapcsolási helyet juttassunk be (azaz azokat, amelyeket az előzőekben ismertettünk, és az 1. ábrán látható természetes szék venciában találhatók). A gént azután egy olyan vektorba építjük be, amelyet úgy terveztek, hogy a fehérjét egy eukarióta sejtben expresszálja [lásd például a Gillies és munkatársai által leírt vektorokat, 4 663 281 számú amerikai egyesült államokbeli szabadalmi leírás]. Az eukarióta gazdasejt előnyösen egy emlős sejt (például egy CHO vagy lecll sejt), és a mutált IgGl-Le^x-et kódoló szekvenciát tartalmazó expressziós vektort tranziens vagy stabil transzfekcióval juttatjuk be a gazdasejtbe, standard módszerek alkalmazásával. Az ilyen gazdasejteket transzfektáljuk (tranziensen vagy stabilan) egy olyan vektorral, amely képes az a(l,3)-fukozil-transzferázt expresszálni, amely képes a szialil-Le^x csoportokat a glikozilezési helyeken az antitest molekulához kapcsolni. Az a(l,3)-fukoziltranszferáz gént egy olyan vektorról expresszálhatjuk, amely eltér az IgGl-Le^x-et kódoló géntől, illetve lehet mindkét gén ugyanazon a vektoron, és a közös vektorról expresszálódhatnak. Az emlős sejtek különösen jó gazdasejtek az IgGl-Le^x szintéziséhez, mivel az összes szükséges prekurzort tartalmazzák a szialil-Le^x termeléshez.

Egy a(l,3)-fukozil-transzferáz cDNS-t írnak le Lowe és munkatársai [Cell, 63. 475 (1990)]. Az a(l,3)-fukozil-transzferáz enzim, amelyet ez a cDNS kódol, felismeri a szialilezett prekurzor molekulát és vagy egy a(1,3)- vagy egy α(1,4)-kötésű fukóz molekulát ad az N-acetil-glükózamin oldalláncokhoz. A szialil-Le^x determinánst egy a(1,3)-kötés jellemzi, és a Lowe féle [Cell, 63., 475 (1990)] a(l,3)-fukozil-transzferáz enzim mind a kívánt szialil-Le^x módosított molekulákat, mind pedig α(1,4)-kapcsolt fukózt hordozókat termel, amelyek, jóllehet nem aktívak az ELAM-l-hez való kapcsolódásban, nem interferálnak a szialil-Le^x-módosított molekulákkal és más nemkívánatos mellékhatásuk sincs. Az IgGl-szialil-Le^x termelése azonban sokkal hatékonyabb lenne, ha egy olyan a(l,3)-fukozil-transzferázt alkalmaznánk, amely kizárólag az α(1,3)-fukóz kötések keletkezését katalizálja. Ilyen emlős enzim létezik, tehát az azt kódoló cDNS-t izolálni lehet, az alábbiak szerint. Egy cDNS könyvtárat, amelyet egy mieloid sejtvonalból készítettünk (például HL-60 sejtvonalból) egy emlős sejt expressziós vektorba építjük be, ilyen például a πΗ3Μ [lásd Simmons et al., Natúré, 331. 624 (1988); Aruffo and Seed Proceedings of the National Academy of Sciences, USA, 84, 8573 (1987)], majd egy emlős sejtvonalba transzfektáljuk, előnyösen COS7 sejtekbe [Seed and Aruffo, Proceedings of the National Academy of Sciences, USA, 84, 3365 (1987)]. A helyes cDNS kiónt az Aruffo és Seed által közölt immunszelekciós módszerrel izoláljuk [Proceedings of the National Academy of Sciences, USA, 84. 8573 (1987); Proceedings of the National Academy of Sciences, USA, 84., 3365 (1987), valamint a 379,076 számú amerikai egyesült államokbeli szabadalmi bejelentés]. A transzfektált sejteket összegyűjtjük, és a PM-81 (anti-CD15; Medarex, West Lebanon, NH), FMC13 (anti-CD15; Sera-LAb/Accurate Chemical and Scientific, Westburt, NY) és VIM8 (anti-CD65) monoklonális antitestekkel inkubáljuk. Az inkubálást követően (például 1 órás inkubálás) a sejteket PBS-ben készített 2%-os Ficoll párnán való átcentrifugálás• · · · • · • · · · · • · · · · · · • ·«···· · · · ·· · ·· · · ·

- 13 sál elválasztjuk a szabad antitestektől, majd hagyjuk ülepedni affinitás-kromatográfiásan tisztított egér IgM elleni kecske antitestekkel borított műanyag csészékben (az alábbiakban ismertetettek szerint). A tapadó sejteket kinyerjük, majd az episzomális DNS-t tartalmazó Hirt felülúszőt készítünk. A tisztított Hirt felülúszó DNS-t standard módszerekkel transzforrnáÍjuk (például elektroporációval) Escherichia coli-ba (előnyösen Escherichia coli MC1061/p3-ba), majd ampicillin- és tetraciklin-rezisztens telepeket izolálunk. Az antibiotikum-rezisztens telepeket azután egyesítjük, és a plazmidokat amplifikáljuk (például oly módon, hogy egy éjszakán át spektinomicin-hidrokloridot adunk hozzá). A kapott tenyészetet szferoplasztokká alakítjuk, majd a szferoplasztokat standard módszerekkel COS7 sejtekkel fúzionáltatjuk [lásd például Seed and Aruffo, Proceedings of the National Academy of Sciences, USA, 84. 3365 (1987)]. A sejteket tovább inkubáljuk (előnyösen 2-3 napig), majd antitestekkel hozzuk érintkezésbe, az előzőekben leírt módon. Előnyösen két menetben végezzük a szferoplaszt fúziót és az aranymosást (azaz azt az eljárást, amit az előzőekben ismertettünk), majd az eljárás utolsó menetéből származó baktérium sejteket összegyűjtjük, plazmid DNS-üket izoláljuk. Ez a cDNS egy enzimet kódol, azaz egy a(1,3)-fukozil-transzferázt, amely a keresett CD15 és CD65 determinánsok megjelenését szabályozza, azaz a szialil-Le^x determinánsét.

Az α(1,3)-fukozil-transzferázt és az IgGl-Le^x-et expresszáló gazdasejteket (amelyek ennek következtében • · • · · · · · ♦ • ·*···· · « •· · ·· ···

- 14 szialil-Le^x determinánsokat hordozó IgGl molekulákat termelnek) standard módszerekkel növesztjük, és az IgGl-Le^x fehérjét a sejtlizátumból tisztítjuk, a Protein A oszlophoz való affinitása alapján, illetve az antitest izolálás és tisztítás bármely más ismert módszerével.

Ahhoz, hogy egy ilyen vegyületet egy betegnek beadjunk, a gyógyászatilag tiszta IgGl-Le^x-et megfelelő hordozóban, például fiziológiás sóoldatban szuszpendáljuk, majd intravénásán beadjuk, egyszeri vagy többszöri dózisban. Optimális esetben megfelelő mennyiségű IgGl-Le^x-et juttatunk be ahhoz, hogy az egy endoteliális sejten található összes ELAM-1 kötési helyet telítsük. Tipikus esetben ezt 0,1 mg/kg vagy magasabb dózisokkal érhetjük el. Az előnyös dózis a 0,1-2 mg/kg tartományban található.

Más hordozó molekulákat, például a szialil-Le^x-vel módosított a^-savas glikoproteint (ai~AGP-Le^x, melyet az alábbiakban ismertetünk) általában az itt leírtak alapján állíthatunk elő, és a betegeknek az előzőekben leírt módon intravénásán adhatjuk be (azaz előnyösen olyan dózisban, hogy az összes sejtes ELAM-1 kötési helyet telítsük, például 0,1 mg/kg vagy magasabb dózisban).

Az IgGl-szialil-Le^x vagy az ai-AGP-szialil-Le^x használható például szívrohamban szenvedő betegek kezelésére. Egy ilyen traumát követően a vérerekben sorakozó endoteliális sejtek ELAM-l-et expresszálnak a felszínükön, és kezelés nélkül a neutrofilek, amelyek a felszínükön szialil-Le^x-t hordoznak, kötődnek az ilyen ELAM-l-et hordozó endo ···· · ···· ···· ·· • · · · · · • · · · ··· ·· • ·*···· · · · « •· · · · ··· ·· teliális sejtekhez, és ezzel hozzájárulnak a gyulladáshoz. Egy szialil-Le^x-t hordozó molekulával végzett kezelés gyengíti a gyulladást oly módon, hogy kompétitíven gátolja a betörő neutrofilek és az érfal endoteliális sejtjei közötti kölcsönhatást a szív közelében. Az IgGl-szialil-Le^x vagy az ax-AGP-szialil-Le⁵* is használható, a fentiekben leírt módon olyan betegségek kezelésére, amelyeket krónikus gyulladásos állapotok jellemeznek, például a reumatoid artrítisz, pszoriázis vagy penthigus vulgáris.

Az alábbi kísérletekkel a szialil-Lewis X (szialilLe^x) determinánsokról kimutattuk, hogy kölcsönhatásba lépnek az ELAM-l-gyel, és megkönnyítik az ELAM-l-et hordozó endoteliális sejtekhez való kötődést. Ezeket a példákat azzal a céllal mutatjuk be, hogy illusztrálják a találmányt, de nem korlátozzák oltalmi körét.

A szialil-Le^x determináns felismerése ELAM-l-gyel

A granulocita-kötő aktivitáshoz szükséges ELAM-1 doméneket a következő két monoklonális anti-ELAM-1 antitest alkalmazásával lokalizáltuk: H18/7, amely hatásosan blokkolja a leukocitáknak az aktivált endotéliumhoz való kötődését, és H4/18, amely ezt nem teszi [Pober et al., J. Immunoi., 136. 1680 (1986); Bevilacgua et al., Proceedings of the National Academy of Sciences, USA, 84, 9238 (1987)]. A teljes hosszúságú ELAM-l-et a pELAM-1 plazmidon található cDNS-ről expresszáltuk [Bevilacqua et al., Science, 243. 1160 (1989)]. Az ELAM-1 cDNS C-terminális delécióit polime···· 4 ···· ···· ·· • · 4 4 4 4 • · · 4 4 ·» 44 • ·»···· « « · · ·< · · 4 44· ··

- 16 ráz láncreakcióval készítettük, és így kaptuk a 2. ábrán látható fehérjéket. A PCR-hez szükséges indító molekulákat a Bevilacqua és munkatársai által leírt teljes hosszúságú ELAM-1 szekvencia [Science, 243. 1160 (1989)] alapján terveztük. Miután előállítottuk, az ELAM-1 cDNS fragmenseket standard módszerek alkalmazásával fúzionáltattuk a CD7 cDNS transzmembrán és intracelluláris kódoló részéhez [azaz a CD7 cDNS 501-1237-os nukleotidjaihoz, amelyet Aruffo és Seed írtak le, EMBO J., 6, 3313 (1987)]. A kapott fúziós termékeket hordozó plazmidokat COS sejtekbe transzfektáltuk.

A monoklonális antitestekre való reaktivitást a fixált, permeabilizált sejtek indirekt immunfluoreszcenciás mikroszkopizálásával határoztuk meg, Aruffo és munkatársai módszerével [Cell, 61, 1303 (1990)]. Ennek az elemzésnek az eredményeit a 2. ábrán mutatjuk be, amelyek a bemutatott konstrukciók három-hat független izolátumával végzett transzfekciókból származnak. A 2. ábrán látható, hogy a H18/7 kötődéshez a lektin-szerű szegmensre, plusz az EGF ismétlődő doménekre volt szükség, míg a H4/18 reaktivitáshoz emellett az első három komplement szabályozó fehérje ismétlődő elem szükséges. Az L mutatja a lektinnel rokon szegmenst; az EGF mutatja az EGF-fel rokon szegmenst; a CR1-CR6 mutatja a komplement szabályozó fehérje elemeket.

A H18/7 kötési helyének további meghatározásához egy fragmenst kicseréltünk az ELAM-1 cDNS és a rokon Leu8 (LECCAM-1) cDNS között [Camerini et al., Natúré, 342. 78 (1989)]. A Leu8(LECCAM-1)/ELAM-1 kimérákat restrikciós fragmens cserével hoztuk létre, a lektin doménben található • · · 4 * « • ·· ·

konzervált BglII helynél (azaz az ELAM-1 és a Leu8 cDNS szekvencia 454-es és 474-es nukleotidjainál). Amint az a 2. ábrán látható, az egy antigén determinánshoz kötődő H18/7 az ELAM-1 lektin doménnek főleg az első 75%-ában található. A fenti eredményekkel együtt (azaz, hogy mind a lektin-szerű, mind az EGF-ismétlődés-szerű doménekre szükség van ahhoz, hogy a H18/7 kötődjön a csonkított ELAM-l-hez) arra a következtetésre juthatunk, hogy az EGF-hez kapcsolódó ismétlődő elem szerepet játszhat a lektin dómén szerkezetének meghatározásában.

Az epitop térképezés alapján javasolt lehetséges lektin-szénhidrát kölcsönhatások vizsgálatára egy oldható ELAM-1 fehérje kimérát állítottunk elő egy, az ELAM-1 extracelluláris dóménjét kódoló cDNS fragmenst fúzionáltatva a humán IgGl csukló-részét, azaz a CH2 és CH3 doméneket kódoló genomiális fragmenshez [Aruffo et al., Cell, 61, 1303 (1990); 3. ábra]. Az ELAM-1 kimérát az alábbiak szerint készítettük. Az alábbi szekvenciákkal rendelkező szintetikus oligonukleotidokat:

CGGAATTCCAGTACTACTCACCTGGTCCGCCGATGGTCTCCGGGC és CCAGATATACGCGTTGACATTGATTATTGACTAGTTATT amelyek megfelelnek az ELAM-1, illesztés donor/karboxil teminálisának és a beépített cDNS előtti vektor szakasznak, standard módszerekkel állítottuk elő. Az ezekkel a nukleotidokkal és az ELAM-1 cDNS expressziós plazmiddal (pELAM-1) mint templáttal végzett polimeráz láncreakció egy 1800 bp méretű fragmenst eredményez, amelyet Xhol és EcoRI restrikciós enzimekkel emésztettünk, és az Xhol/EcoRI restrikciós ·«·« « ···· ···· ·« • · a * · · • «a · ··· ·· •a a ·« ··· · · enzimekkel emésztett πΗ3Μ expressziós vektorba klónoztunk [Aruffo and Seed, Proceedings of the National Academy of Sciences, USA, 84., 8573 (1987)]. A szubklónozott fragmenst Xhol és Scal restrikciós enzimekkel végzett emésztéssel felszabadítottuk, és az Xhol/Scal restrikciós enzimekkel emésztett IgGl expressziós plazmidba ligáltuk [Aruffo et al., Cell, 61, 1303 (1990)]. A kapott konstrukciót COS sejtekbe transzfektáltuk [Seed és Aruffo leírása szerint, Proceedings of the National Academy of Sciences, USA, 84, 3365 (1987)], majd a kívánt fúziós fehérjét, amelynek a jelzése ELAM-Rg, adszorpcióval és Protein A agarózról végzett elúcióval kinyertük a felülúszóból [Aruffo et al., Cell, 61, 1303 (1990)]. A kiindulási konstrukció, majd annak egy következő verziója, amelyben a PCR-rel amplifikált szegmens legnagyobb részét (azaz az ELAM-1 szekvencia 1-1464-es nukleotidjait) egy homológ restrikciós fragment kicserélésével helyettesíttük (hogy elkerüljük az amplifikálás során esetleg bekerülő mutációkat) azonos kötési aktivitást mutatott. Az oldható fehérje diszulfiddal kapcsolt dimerek formájában jött létre, feltehetőleg a csukló-régió cisztein-csoportjain keresztül, amelyek az aktív immunoglobulinok nehéz-láncok közötti kapcsolódásáért felelősek.

Annak meghatározására, hogy az oldható ELAM-l-et kötik-e a mieloid sejtek, kecske-anti-humán IgG-vel előre borított műanyag csészéket inkubáltunk az ELAM-Rg-t expresszáló sejtek felülúszójával. Ezeket a kísérleteket az alábbiak szerint hajtottuk végre. Humán granulocitákat izoláltunk frissen vett, heparinizált teljes vérből,

Ficoll/nátrium-diatrizoáton keresztül 20 percig 800 x g-vel végzett centrifugálással (Mono-Poly Resolving Médium, Flow Laboratories, McLean, VA). A sejtvonalakat az American Type Culture Collection-től (ATCC) szereztük be, és 10% borjúmagzat szérummal kiegészített IMDM-ben tartottuk fenn, Aruffo és Seed leírása szerint [Proceedings of the National Academy of Sciences, USA, 84., 8573 (1987)]. Az ELAM-Rg tapadását baktérium tenyésztő csészékben hajtottuk végre (Falcon 1008, Becton-Dickinson Labware, Lincoln Park, NJ), amelyekre affinitás-tisztított kecske anti-humán IgG antitestet (Organon Teknika/Cappel, Maiverne PA) adszorbeáltattunk 10 Mg/ml koncentrációban, 50 mmol/1 TRIS-HC1 pH=9,5 pufferben, legalább egy óra hosszat. A megmaradó fehérje kötődési helyeket ezután blokkoltuk oly módon, hogy egy éjszakán át 1 mg/ml borjúszérum albuminnal inkubáltuk foszfáttal pufferolt sóoldatban (PBS; 137 mmol/1 NaCl, 2,7 mmol/1 KC1, 4,3 mmol/1 Na₂HPO₄ x 7H₂0, 1,4 mmol/1 KH₂PO₄, pH=7,3). A lemezeket ELAM-Rg-vel inkubáltuk (kb. 1 gg/ml) 30 percig 22°C-on, majd háromszor mostuk PBS-sel. A csésze egységnyi felületére tapadó sejteket egy speciális nagyító segítségével megszámláltuk, és a következő eredményeket kaptuk: >100 sejt: +++++; 100-75 sejt: ++++; 75-50 sejt: +++; 50-25 sejt: ++ és 25-10 sejt:+. Mindegyik eredmény három független meghatározásból származik.

A kezelt műanyag specifikusan kötötte a granulocitákat, valamint a HL60 és THP1 mieloid sejtvonalakat (4. ábra). Más hematopoietikus (például U937 és HSB-2) és nem-hematopoietikus eredetű (például WIDR) sejtvonalakról is kiderült, hogy kötődnek az ELAM-l-gyel borított műanyaghoz (4. ábra). A CD8 fúziós fehérjével borított csészék [Aruffo et al., Cell, 61, 1303 (1990)] elhanyagolható affinitást mutatnak a granulocitákhoz illetve bármely vizsgált sejtvonalhoz [Bevilacqua et al., Proceedings of the National Academy of Sciences, USA, 84, 9238 (1987)].

Ahhoz, hogy a kötési aktivitás és a felszín fenotípusa között korrelációt állapítsunk meg, különböző monoklonális antitesteknek, amelyek ismert granulocita szénhidrát antigéneket ismernek fel, vizsgáltuk a reaktivitását a fenti sejttípusokkal. 5 x 10⁵ sejtet inkubáltunk az alábbi antitestekkel (aszciteszként 1:250 hígításban, tisztított antitestként 4 Mg/ml koncentrációban): PM-81 [anti-CD15; Medarex, W.Lebanon, NH; Ball et al., J. Immunoi., 130. 2937 (1983)], CSLEX-l [anti-szialil-Le^x; Fukushima et al., Cancer Research, 44, 5279 (1984)]; vagy VIM2 [anti-CD65; Macher et al., Journal of Biological Chemistry, 263, 10186 (1988)]; majd ezt követően fluoreszceinnel konjugált kecske anti-egér IgG+IgA+IgM antitest (Organon Teknika/Cappel, Maiverne, PA).

Az eredmények az 5. ábrán láthatók. A pontokkal rajzolt görbe jelenti a negatív kontrollt (nincs primer antitest) ; a pont-vonallal rajzolt görbe jelenti az anti-CD15 mAB-ot; a folytonos vonallal rajzolt görbe jelenti az anti-CD63 mAB-ot; és a szaggatott vonallal rajzolt görbe jelenti az anti-szialil-Le^x mAB-ot. Az használt U937 sejtvonal nem tartalmazza a szialil-Le^x determinánsokat, ellentétben a Terasaki és munkatársai által vizsgált rokon U937 sejtvonallal [Fukushima et al., Cancer Research, 44., 5279 (1984)].

···· « ···· 4··· ·· • · * · 4 · • · · ···· 44 • ······ · · a ·

Egy kezdeti vizsgálat kimutatta, hogy az ELAM-1 tapadási potenciálja korrelál a CD15 determináns jelenlétével [azaz a Le^x vagy a lakto-N-fukopentaóz III jelenlétével; Gooi et al., Natúré, 292, 156 (1981); Huang et al., Blood, 61, 1020 (1983); Magnan et al., Arch. Biochem. Biophys., 233, 501 (1984); Gooi et al., Eur. J. Immunoi., 13, 306 (1983); Tetteroo et al., Eur. J. Immunoi., 14/ 1089 (1984)], de nem korrelál a CD17 jelenlétével [azaz a laktozil-ceramid jelenlétével; Symington et al., Journal of Biological Chemistry, 259, 6008 (1984)], és a CD65 jelenlétével [azaz a VI³NeuAcIII³-FucnorLcnOse6Cer jelenlétével; Macher et al., Journal of Biological Chemistry, 263, 10186 (1988)] vagy a szulfatidok jelenlétével [Fredman et al., Biochem. J., 251, 17 (1988)].

Abból a célból, hogy tovább vizsgáljuk a korrelációt az ELAM-1 tapadási potenciálja és a CD15 jelenléte között, a CD15-öt hordozó sejteket neuraminidázzal kezeltük, egy olyan enzimmel, amelyről ismert, hogy lehasítja a terminális szialil csoportokat. A HL60 sejteket (10⁶/lemez) 50 μΐ 0,15 mol/1 NaCl, 4 mmol/1 CaC12, pH=5,5 összetételű pufferben inkubáltuk 1 óra hosszat 41,5·10~³ egység neuraminidáz jelenlétében (Vibrio cholerae-ből, ΙΙ-es típus, Sigma, St. Louis, MO). A sejteket háromszor mostuk PBS-sel, majd a fentiekben leírt módon kiértékeltük, hogy mennyire tapadnak ELAM-Rg-vel vagy ΡΜ-81-gyel borított csészékhez. A csészéket a fentiekben leírt módon ELAM-Rg-vel és tisztított PM-81 antitesttel tisztítottuk 10 μg/Inl koncentrációban 50 mmol/1 TRIS-HC1 pH=9,5 összetételű pufferben. A tapadási vizsgála • · · ·*·· φ φ • ······ φ · · φ ·· · ·· ··· φφ tokát a fentiekben leírt módon hajtjuk végre. A 6. ábrán látható eredményeket a kontroll százalékában fejeztük ki, és három független kísérlet háromszor ismételt meghatározásának átlag ± standard deviáció értékéből számítottuk ki.

A 6. ábrán látható, hogy az ELAM-1 tapadási potenciáljának nem tökéletes a korrelációja a CD15 jelenlétével, mivel a sejt neuraminidázzal való emésztése eltüntette az ELAM-l-hez való tapadást, de növelte az immobilizált anti-CD15 antitestekhez való kötődését.

A CD15-tel való asszociáció és a neuraminidáz érzékenység azt sugallja, hogy a CD15 szénhidrát antigén szialilezett formája jelentheti a fiziológiás ELAM-1 ligandumot. Ennek az elképzelésnek a vizsgálatára a CSLEX1 monoklonális antitestet megvizsgáltuk, hogy képes-e gátolni a HL60 sejtek tapadását az ELAM-Rg-hez. 10⁶ HL60 sejtet 30 percig jégen inkubáltunk CSLEXl-gyel (1:50 PBS-ben), majd affinitás-tisztított kecske anti-egér IgM antitesttel (Organon Teknika/Cappel, Maiverne, PA) térhálósítóttűk, 20 Aig/ml koncentrációban PBS-ben 20 percig 22°C-on. A sejteket háromszor mostuk PBS/1% glicin pufferben, majd ELAM-1-Rg-vel borított lemezeken inkubáltuk a fentiekben leírt módon. A 7. ábrán látható adatokat három független kísérlet háromszor ismételt meghatározásának átlag ± standard deviáció értékéből számítottuk ki.

A 7. ábrán az látható, hogy nagyon jó az összefüggés a szialil-Le^x felszíni sűrűsége és az ELAM-Rg-vel borított műanyag egységnyi felületére tapadó sejtek számának nagyságrendje között. Emellett, az anti-szialil-Le^x antitest telje • ·· · *·· ·· • ······ · ·· · ·· · ·· ··· ·· sen gátolja a mieloid sejtek ELAM-l-hez való tapadását, míg az anti-CD65 és anti-CD15 antitesteknek azonos körülmények között nincs aktivitásuk.

A CSLEX1 antitest által felismert szénhidrát epitopot az antitesttel reagáló, szerkezetileg jellemzett glikolipidekben azonos motívumok alapján NeuNAcaa2-3GallB-4(Fucal-3)GlcNacBl-3Gal jellel jelölték [Fukushima et al., Cancer Research, 44. 5279 (1984)]. A neutrofil granulociták fukozilezett laktózaminoglikánjainak a kémiai elemzése azt mutatja, hogy mind az Le^x (CD15), mind a szialil-Le^x determinánsok túlnyomó részben a négyágú, aszparaginhoz kapcsolt glikánokon vannak jelen, amelyeknek az egyes szálaik poli(N-acetil-laktózamin) láncokból épülnek fel, és amelyek variábilis a(l,3)-kapcsolt fukóz helyettesítéseket tartalmaznak [Fukuda et al., Journal of Biological Chemistry, 259, 10925 (1984); Spoocer et al., Journal of Biological Chemistry, 259, 4792 (1984)]. A szerológiai bizonyítékok alátámasztják a dimer szialil-Le^x determinánsok létezését granulocitákon is [Fukushi et al., Journal of Biological Chemistry, 259, 10511 (1984); Fukushi et al., Cancer Research, 45, 3711 (1985)]. A szialil-Le^x csoport redukáló oldalán található csoport minden, eddig azonosított granulocita struktúrában galaktóz. Jóllehet a CSLEX1 antitest gátolja a kötődést, az ELAM-1 által felismert struktúra sokkal komplexebb lehet mint a CSLEX1 által felismert struktúra. Az ELAM-1 kötődéshez szükséges minimális glikán struktúra meghatározásához kémiailag jellemzett, szialil-Le^x determinánsokat hordozó glikánokat fejlesztettünk ki az ELAM-1 felis···· · • ·

- 24 mérés céljára.

A magzatvíz az egyik forrása a jól jellemzett szialil-Le^x determinánsnak, amelyet a granulocita sejtfelszíntől nagyon eltérő környezetben találhatunk meg. A magzatvíz mucinjainak szialil-Le^x-et hordozó szénhidrátjait Bl-6 vagy egy 3-helyettesített-N-acetil-galaktózamin köti össze, amelyek viszont közvetlenül a polipeptid gerinchez kapcsolódnak, a szerin vagy treonin oxigénjén keresztül [Hanisch et al., Carbohydr. Rés., 178, 29 (1988)]. A magzatvíz eredetű szialil-Le^x determinánsoknak megvizsgáltuk azt a képességét, hogy mennyire blokkolják a mieloid sejtek immobilizált ELAM-l-hez való kötődését. A humán magzatfolyadékot (HAF) tisztítás nélkül, centrifugán ultraszűréssel frakcionáltuk (100 kDa nominális elválasztási érték; Centricon 100, Amicon, Danvers, MA) vagy fenolos extrakciót követően molekulaszűréses kromatográfiával frakcionáltuk (Sephacryl S-300 HR;, 4 mol/1 guanídium kloridban) [Hanisch és munkatársai módszerével, Carbohydr. Rés., 178, 29 (1988)], így tisztított mucinokat kaptunk. Ezeket a mucinokat körülbelül 150 gg/ml fehérje koncentrációban alkalmaztuk. Az ELAM-Rg-vel borított műanyaghoz való kötést a fentiekben leírt módon hajtottuk végre. A 8. ábrán látható eredmények (a kontroll százalékában kifejezve) két független kísérletben végzett három-három ismételt meghatározás átlaga.

A 8. ábra azt mutatja, hogy a granulocita glikánok és a magzatvíz mucinok közötti eltérés ellenére a tisztított magzatvíz mucinok, valamint a frakcionálatlan magzatvíz (amelyről úgy tűnik, hogy az összes aktivitása a mucinban • •·4 * *··« «··«*· • · · · · · . · · *···· • · ··:· * · · · ·· · ·· ···>· gazdag nagymolekulatömegű frakcióban található) hatásosan blokkolja a mieloid sejteknek az immobilizált ELAM-l-hez való kapcsolódását.

A szialil-Le^x determinánsok egy másik forrása a fukozilezett a^-savas glikoprotein (α^-ΑβΡ) [Biou et al., Biochim. Biophys. Acta, 913. 308 (1987); Wieruszeski et al., FEBS Letters, 238. 390 (1988)]. A humán αχ-AGP kémiai elemzése igazolta, hogy a fukóz az N-kapcsolt glikánoknak csak egy töredékében található meg [Schmid et al., Biochim. Biophys. Acta, 492. 291 (1977); Fournet et al., Biochemistry, 17, 5206 (1978)], de az aszialo fehérje legalább részlegesen blokkolja az anti-CD15 antitestek kötődését [Gooi et al., Eur. J. Immunoi., 13, 306 (1983); Tetteroo et al., Eur. J. Immunoi., 14, 1089 (1984)]. A HL60 sejteknek az ELAM-l-hez (műanyagra adszorbeált) való kötődésében közepes (35 ± 9%) csökkenést a fehérje 200 /ig/ml koncentrációjával lehetett elérni.

A szialil-Le^ molekula in vitro előállítása

Ezeknek az eredményeknek a kiterjesztéséhez, enzimatikusan fukozilezett cti-AGP-t állítottunk elő in vitro. A szialil-Le^x determináns bioszintézisét egy specifikus α(1,3)-fukozil-transzferáz szabályozza [Campbell et al., Cell, 35, 303 (1983); Campbell et al., Journal of Biological Chemistry, 259. 11208 (1984)], amely fukózt ad a terminális N-acetil-laktózaminhoz, illetve 3-szialil adduktjához; egy genetikailag és biokémiailag eltérő specifikus a(l,3)-fukozil-transzferázról annyi ismert, hogy az aszialil prekurzor• •·· · • · ···« ···« ·· • · · « • ··« ·· • · « · <

·< ··· ««

- 26 hoz csak fukózt ad hozzá [Priels et al., European Journal of Biochemistry, 130, 347 (1983); Muramatsu et al., European Journal of Biochemistry, 157, 71 (1986)]. Egy harmadik fukozil-transzferáz is ismert, erről ismeretes, hogy a(l,3)- és α(1,4)-kötéseket hoz létre, láthatólag nem-szialilezett szubsztrátokon [Prieels et al., Journal of Biological Chemistry, 256 10456 (1981); Lowe et al., Cell, 63, 475 (1990)]. A szialil-Le^x determináns bioszintézise lépésenkénti szialilezéssel játszódik le, amit fukozilezés követ, mivel az a(2,3)-szialil-transzferáz nem képes felismerni a fukozilezett terminális N-acetil-laktózamint, azaz a CD15-öt [Holmes et al., Journal of Biological Chemistry, 261, 3737 (1986)]. Az αχ-savas glikoprotein jó szubsztrátja a magzatvíz eredetű a(1,3)-fukozil-transzferáznak [lásd például Hanisch et al., Carbohydr. Rés., 178, 23 (1988)], azaz egy olyan enzimnek, amely szialil-Le^x-t képez a szialilezett, illetve nem-szialilezett prekurzorokból.

A magzatvíz fukozil-transzferázát affinitáskromatográfiával izoláltuk, és azt a tulajdonságát, hogy mennyire képes az αχ-AGP-t egy ELAM-1 ligandummá konvertálni, az alábbiak szerint értékeltük ki. Az α(1,3)-fukozil-transzferázt töményített magzatvízből izoláltuk fetuin-agarózos kromatográfiával, amint azt korábban Hanisch és munkatársai [Carbohydr. Rés., 173, 23 (1988)], valamint Mistsakos és munkatársai leírták [Bioi. Chem. Hoppe-Seyler, 369, 661 (1988)]. 0,8 gCi GDP¹⁴C-fukózt (225 Ci/mol) és 100 gg szarvasmarha αχ-AGP-t (Sigma, St Louis, MO) adtunk egy olyan reakcióelegyhez, amely 25 mmol/1 TRIS-HC1 pH=7,0 puffért, mmol/1 MgC12~t és 1 mmol/1 ATP-t tartalmazott 120 pl végtérfogatban. Az elegyet 24 óra hosszat 37°C-on reagáltattuk, amely idő alatt a ¹⁴C-jelzett fukóznak körülbelül 10%-a TCAban oldhatatlan anyagba épült be. A be nem épült anyagot centrifugális ultraszűréssel eltávolítottuk (Centricon 10, Amicon, Danvers, MA). A jelzett anyag 1:5-ös hígításából 20 pl-t, illetve egy hasonlóan összeállított, de jelzett GDP-fukózt nem tartalmazó reakcióelegy 1:5-ös hígításából 10 pl-t adszorbeáltattunk műanyag csészékre (az előzőkben leírt módon), illetve 96 mélyedéses mikrotitráló lemezekre (Falcon 3911, Becton Dickinson, Oxnard, CA). A lemezeket 22°C-on 1 óra hosszat inkubáltuk 1 pg/ml koncentrációjú ELAM-Rg-vel, illetve CD8-Rg-vel, PBS-sel mostuk, majd radioaktív jóddal jelzett kecske anti-humán-IgG antitesttel inkubáltuk (DuPont/NEN, Boston, MA) további egy óra hosszat. A mosást követően a jelzett antitest mennyiségét egy gamma-számlálóban határoztuk meg. A 9. ábrán látható eredmények két független kísérletben végzett négy ismétlés átlag ± standard deviáció értékében vannak megadva.

A 9. ábrán látható, hogy a GDP-fukóz jelenlétében fukozil-transzferázzal kezelt a^-AGP lényegesen jobban köti az ELAM-Rg-t, mint ahogy azt az αχ-AGP egyedül tette, illetve az enzimmel GDP-fukóz nélkül inkubált ai-AGP.

Az aszialo-a-AGP fukozilezett glikánjai a GalB(l-4)(Fuca(l-3))GlcNacB(l-4)Man terminális struktúrát hordozzák, míg az aszialoprotein nem-fukozilezett végei N-acetil-laktózamin csoportokat tartalmaznak β(1-4), β(1-2) vagy a(1-6) kötéssel mannózhoz kapcsolva [Fournet et al., Biochemistry, • ·

- 28 17, 5206 (1978)]. Ennélfogva sem az αχ-AGP már előzőleg létrejött szialil-Le^x determinánsa, sem az N-acetil-glükózamin semmilyen potenciális fukozil adduktja nem kapcsolható galaktózhoz. Ezek az eredmények azzal együtt, hogy gátolják az ELAM-1 kötődését mucin O-kapcsolt glikánokkal, azt mutatják, hogy a szialil-Le^x csoport önmagában elfogadható affinitással rendelkezik az ELAM-l-hez. Azt azonban még meg kell határozni, hogy vajon mennyiségileg erősebb ELAM-1 kapcsolódás elősegíthető-e olyan csoportokkal, amelyek a granulocitákon szomszédosak a szialil-Le^x determinánsokkal, illetve a hozzáférésüket befolyásoló szférikus faktorokkal.

Az IL-8 gátolja a mieloid sejtek tapadását az ELAM- l-hez

Azt már leírták, hogy az IL-8 felszabadulása IL-1gyel kezelt endoteliális sejtekből azt okozza, hogy a granulociták elvesztik azt a képességüket, hogy kötődjenek az IL-l-gyel indukált endotéliumhoz [Gimbrone et al., Science, 246. 1601 (1989)]. Az IL-1 és IL-8 hatását a szialil-Le^x felszíni antigén expressziójára az alábbiak szerint határoztuk meg. A granulocitákat IL-lB-val (10 ng/ml; Prepro Tech, Rock Hill, NJ) vagy IL- 8-cal inkubáltuk (25 ng/ml; Prepro Tech, Rock Hill, NJ) 20 percig 37 °C-on, majd háromszor mostuk, és CD15 (PM-81), CD65 (VIM2) vagy szialil-Le^x (CSLEX1) elleni monoklonális antitesttel inkubáltuk (az előzőkben leírt módon) jégen. A

10. ábrán megadott eredmények áramlási citometriával meghatározott relatív átlagos fluoreszcencia intenzitás értékek (MFI), a párhuzamosan, citokinek nélkül inkubált granulociták MFI értékének százalékában kifejezve, és négy kísérlet adatait mutatják be.

A 10. ábráról látható, hogy sem az IL-1, sem az IL-8 nem okozza a sejtfelszíni szialil-Le^x expressziójának lényeges csökkenését.

Annak ellenőrzésére, hogy az IL-8 hatásának kitett granulociták felülúszója gátolja-e az ELAM-1 kötődését, 5xl0⁷/ml granulocitát inkubáltunk IL-l-gyel vagy IL-8-cal (az előzőkben leírt koncentrációban), 1 óra hosszat 37°C-on. A felülúszókat centrifugálással kinyertük, és ELAM-Rg-vel borított csészékkel inkubáltuk. A sejteket 30 perc múlva adtuk hozzá, és a kötődést az előzőkben leírt módon határoztuk meg. Az immunadszorpciót 40 μΐ Protein-A agaróz gyöngyökkel végeztük (Sigma, St. Louis, MO) , amelyekre 10 gg affinitás-tisztított nyúl anti-egér IgM-et adszorbeáltunk, majd 5 μΐ CSLEX1 aszciteszt adtunk hozzá. A kontroll gyöngyöket hasonlóképpen állítottuk elő, de nem inkubáltuk CSLEXl-gyel. A gyöngyöket PBS-sel mostuk, majd a felülúszóval inkubáltuk 1 óra hosszat 4°C-on. Az eredmények a 11. ábrán láthatók, és a megkötött sejtek százalékában fejeztük ki, az azonos körülmények között, citokin nélkül inkubált granulociták felülúszójának jelenlétében megkötött sejtek számához viszonyítva. A bemutatott adatok három független kísérletben végzett három-három párhuzamos mérésből kapott átlag ± standard deviáció értékét jelzik.

A 11. ábráról látható, hogy az IL-8-cal kezelt granulociták tenyészetéből kinyert felülúszók gátolják a HL60 sejtek tapadását az ELAM-1 sejtekhez, míg az IL-1 • · ·

- 30 kezelés esetében ez nem mondható el, és a kötődés gátlását specifikusan visszafordíthatjuk a felülúszókat adszorbeáltatva szilárd fázisú CSLEXl-re, de csak az immunadszorpciós hordozó alkalmazásával ez nem érhető el.

Más megvalósítási módok

A többi megvalósítási mód is az igénypontok által biztosított oltalmi körön belül vannak. Például, a találmány tárgyát képezi bármely antitest, amely csökkent képességgel tudja fixálni a komplementet és az F_c receptort megkötni, a hozzákapcsolt szénhidrát oldalláncok következtében; a fentiekben leírt módon ezek közé olyan antitestek tartoznak, amelyek az immunológiai specifitásuk miatt jól használhatók [például antitestek, úgymint az MY904, Todd et al.,

840 793 számú amerikai egyesült államokbeli szabadalmi leírás], amely kompetitíven gátolja a sejt-sejt kölcsönhatásokat, valamint olyan antitestek, amelyeket csak a terápiás hatású szénhidrát csoportok hordozóiként használunk. Mivel az N-kapcsolt glikánok kapcsolódási helyéről jól ismert, hogy az aszparagin (N), X, szerin (S), vagy treonin (T), ahol X jelentése bármely, a prolintól eltérő aminosavmaradék, a szakterületen jártas szakember ezen az alapon megtervezhet egy olyan molekulát, amely bármely számú ilyen hellyel rendelkezik, azaz bármely számú szénhidrát oldallánccal rendelkezhet. A glikozilezési helyek helyspecifikus mutagenezissei beépíthetők az antitest szekvenciába.

A komplementet nem fixáló és nem-F_c receptor kötő antitesteket nemcsak gyulladásos folyamatok kezelésében • · ····· ·♦······ • · · · « • » · * ··· • ······ · · * ·· · ·· ···

- 31 lehet használni. Például, egy ilyen, a GPIIbIII_a elleni antitest használható arra is, hogy a vérlemezke aggregációt gátoljuk vele, ennélfogva használható szívinfarktus kezelésére is. A fehérjék elleni antitestek, úgymint a fibrin vagy a véralvadási kaszkád egyik fehérjéje elleni antitest hasznos lehet a trombotikus folyamatok gátlásában. Általában bármely antitest tulajdonságai (beleértve, anélkül hogy erre korlátoznánk magunkat, az anti-MO-l-et és az anti-CD14-et) , amelyről elképzelhető vagy igazolt, hogy a gyógyászatban használható lehet, javíthatók azáltal, ha olyan szénhidrát csoportokat adunk hozzá, amelyek elfedik az antitest komplement fixálási és F_c receptor kötési képességét. Ez a jellemző különösen fontos lehet például az immunoglobulin fúziós fehérjék esetében (például egy αι-AGP-IgGl fúziós fehérje esetében). Ebben az esetben egy számunkra érdekes fehérjét fúzionáltatunk (például genetikailag) egy immunoglobulin molekulához, hogy növeljük a szérum felezési idejét a szérumban. Mivel ezeknek a fúziós fehérjéknek megnövekszik az élettartama a betegben, ezekről sokkal valószínűbb, hogy idegen antigénekként ismerik fel őket, ennélfogva az ilyen fehérjék esetében különösen fontos, hogy elárasszák a beteg F_c receptor kötési helyeit és komplement fixáló rendszereit.

Arra a célra, hogy sejtek és fehérjék közötti kölcsönhatásokat blokkoljunk, bármely alkalmas hordozó molekula használható. A fehérjék általában azért előnyösek, mert felezési idejük viszonylag hosszú a szérumban. A hordozó fehérjék egyik csoportja szérum fehérje, például albumin (például szarvasmarha szérum-albumin vagy humán szérum-albumin), • · ·

- 32 transzferrin vagy α-2-makroglobulin. A hordozó fehérjék tartalmazhatnak endogén glikán kapcsolódási helyeket, illetve az ilyen helyeket a hordozó fehérje DNS szekvenciájába be lehet építeni (a fentiekben leírt módon), például helyspecifikus mutagenezissei. A hordozó molekula lehet egy lipid, habár ez kevésbé előnyös. Egy példában a lipidet egy vagy több hozzákapcsolt szénhidrát egységgel (például szialil-Le^x determinánsokkal) egy liposzóma formájában juttatjuk át egy megcélzott sejt falán (például egy endoteliális sejt falán). A liposzóma blokkolhat egy sejtet vagy fehérje kölcsönhatást, illetve használható egy hatóanyag megfelelő helyre való juttatására.

Az ELAM-1 melletti sejt-tapadási molekulák gátolhatok a megfelelő szénhidrát felismerő egységeknek egy hordozó molekulához való kapcsolásával, a fentiekben leírt módon. Az ilyen sejt-tapadási molekulák közé tartozik, anélkül, hogy ezekre korlátoznánk magunkat, az LFA-1, az LFA-3, az ICAM-1, a PADGEM, a Mel-14, a LAM-1, egy cadherin, a sejt-CAM vagy egy N-CAM. Más glikánok is hozzákapcsolhatók, beleértve, anélkül, hogy ezekre korlátoznánk magunkat bármely N-kapcsolt glikánt, O-kapcsolt glikánt, a GMP-140-et, a Leu8-at és a foszfatidil-inozit-foszfát-glikánokat. Azokban az esetekben, amikor a glikánaddíciós szignál ismert, akkor az bejuttatható egy szerves hordozó molekula DNS szekvenciájába, a fentiekben leírt módon. Egy másik eljárás szerint, ha a pontos hely nem ismert, de egy ilyen addíciós hely általános régióját néhány, a természetben előforduló molekulában azonosították, akkor egy DNS fragmenst (a természetben meg• · · · ·

- 33 található molekulát kódoló szekvenciából), amely tartalmazza ezt a régiót, a kívánt hordozó molekula DNS szekvenciájába klónozhatjuk (például egy IgGl- vagy αχ-AGP-kódoló szekvencia) .

Szénhidrát egységeket hordozó molekulákat előállíthatunk egy sejtben, előnyösen egy eukarióta sejtben, és nem élesztőben. Az emlős sejtek, például az emlős sejtvonalak különösen alkalmas gazdaszervezetek. Ezek a sejtek általában felismerik a szükséges prekurzor molekulákat és előállítják, illetve megváltoztathatók úgy, hogy előállítsák a szénhidrát kapcsolódásáért felelős enzimeket. A szialil-Le^x determinánsok kapcsolásához az emlős sejtvonalak, például a CHO és a lecll különösen alkalmasak. Egy másik eljárás szerint a szénhidrát egységeket in vitro, azaz extracellulárisan hozzákapcsolhatjuk egy hordozó molekulához. Az egyik példában az α-(1,3)-fukozil-transzferáz egy szilárd hordozóhoz köthető (például egy oszlophoz), és a keresett hordozó molekulát áteresztjük a megkötött fukozil-transzferáz enzimen, olyan körülmények között, amelyek megkönnyítik a szialil-Le^x csoportok kapcsolódását a megfelelő helyhez, illetve a hordozó molekulához.

Claims (33)

1. SZABADALMI IGÉNYPONTOK

   1. Eljárás egy olyan inhibitor molekula azonosítására, amely blokkolja egy ELAM-l-et hordozó sejt és egy második sejt vagy fehérje kölcsönhatását, azzal jellemezve, hogy az említett ELAM-l-et hordozó sejtet egy feltételezett inhibitor molekulával és az említett második sejttel vagy fehérjével hozzuk érintkezésbe, hagyjuk, hogy kialakuljon egy affinitás komplex az említett ELAM-l-et hordozó sejt és az említett második sejt vagy fehérje között, és azonosítjuk az inhibitor molekulát, amely csökkenti az említett affinitás komplex képződését.
2. 2. Az 1. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy második sejtként vagy fehérjeként egy szialil-Le^x determinánst hordozó sejtet vagy fehérjét alkalmazunk.
3. 3. Egy betegség kezelésére használható antitest, azzal jellemezve, hogy egy specifikus kapcsolódási pár egy első tagját az említett specifikus kapcsolódási pár második tagjához képes kötni egy betegben, és az említett antitest specifikus az említett első tagra és kovalensen hozzá van kötve egy szénhidrát egységhez, amely zavarja az említett antitestnek azon képességét, hogy fixálja a komplementet és egy ^Fc receptorhoz kötődik.
4. 4. A 3. igénypont szerinti antitest, azzal jellemezve, hogy az említett első tag egy fehérje.
5. 5. A 3. igénypont szerinti antitest, azzal jellemez- ve, hogy az említett második tag egy fehérje.

   • ··
6. 6. A 3. igénypont szerinti antitest, azzal jellemezve, hogy az említett antitest kovalensen kötődik több emlí·’ tett szénhidrát egységhez.
7. 7. A 3. igénypont szerinti antitest, azzal jellemezve, hogy az említett szénhidrát egység egy szialil-Le^x determináns.
8. 8. A 7. igénypont szerinti antitest, azzal jellemezve, hogy az említett szialil-Le^x determináns N-kapcsolt.
9. 9. A 7. igénypont szerinti antitest, azzal jellemezve, hogy az említett szialil-Le^x determináns O-kapcsolt.
10. 10. A 3. igénypont szerinti antitest, azzal jellemezve, hogy az említett antitest az αχ-savas glikoprotein egy vagy több N-kapcsolt glikán addíciós helyét tartalmazza.
11. 11. Egy sejtmentes szerves molekula, azzal jellemezve, hogy ehhez egy sejt tapadási fehérjére specifikus szénhidrát van hozzákapcsolva.
12. 12. A 11. igénypont szerinti sejtmentes szerves molekula, azzal jellemezve, hogy az említett sejt-tapadási fehérje egy szelektin.
13. 13. A 12. igénypont szerinti sejtmentes szerves molekula, azzal jellemezve, hogy az említett szelektin az ELAM-1.
14. 14. A 11. igénypont szerinti sejtmentes szerves molekula, azzal jellemezve, hogy az említett szénhidrát determináns a szialil-Le^x.
15. 15. A 14. igénypont szerinti sejtmentes szerves molekula, azzal jellemezve, hogy az említett szialil-Le^x Nkapcsolt.

    • · · · · • « « « ····
16. 16. A 14. igénypont szerinti sejtmentes szerves molekula, azzal jellemezve, hogy az említett szialil-Le^x 0kapcsolt.
17. 17. A 11. igénypont szerinti sejtmentes szerves molekula, azzal jellemezve, hogy az említett szerves molekula egy fehérje.
18. 18. A 17. igénypont szerinti sejtmentes szerves molekula, azzal jellemezve, hogy az említett fehérje az αχsavas glikoprotein.
19. 19. A 11. igénypont szerinti sejtmentes szerves molekula, azzal jellemezve, hogy az aj-savas glikoprotein egy vagy több N-kapcsolt glikán addíciós helyét tartalmazza.
20. 20. A 17. igénypont szerinti sejtmentes szerves molekula, azzal jellemezve, hogy az említett fehérje egy antitest.
21. 21. A 20. igénypont szerinti sejtmentes szerves molekula, azzal jellemezve, hogy az említett antitest az IgGl.
22. 22. A 20. igénypont szerinti sejtmentes szerves molekula, azzal jellemezve, hogy az említett szénhidrát determináns jelenléte zavarja az említett antitest azon képességét, hogy fixálja a komplementet és egy F_c receptorhoz kötődik.
23. 23. A 11. igénypont szerinti sejtmentes szerves molekula, azzal jellemezve, hogy az említett szerves molekula többet hordoz az említett szénhidrát determinánsokból.

    ··*· · ···· ·»·· ·« • ♦ 9 9 9 9

    9 9» Λ 9 99 · • ······ · ·· · • · · · · 9 99 9 9
24. 24. A 11. igénypont szerinti molekulát hordozó gyógyászati készítmény.
25. 25. Egy antitestet kódoló tisztított nukleinsav, azzal jellemezve, hogy egy sejt adhéziós fehérjére specifikus szénhidrát determináns kötődéséhez szükséges helyeket kódol.
26. 26. Vektor, azzal jellemezve, hogy a 25. igénypont szerinti nukleinsavat tartalmazza.
27. 27. Rekombináns sejt, azzal jellemezve, hogy a 26. igénypont szerinti vektort tartalmazza.
28. 28. Eljárás olyan hordozó molekula előállítására, amelyhez egy sejt-adhéziós fehérjére specifikus szénhidrát van kovalensen hozzákapcsolva, azzal jellemezve, hogy az említett hordozó molekulát egy olyan enzimmel hozzuk érintkezésbe, amely képes az említett fehérjéhez hozzákapcsolni az említett szénhidrát determinánst.
29. 29. A 28. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy az említett érintkeztetést egy élő sejtben játszatjuk le.
30. 30. A 29. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy említett sejtként eukarióta sejtet alkalmazunk.
31. 31. A 31. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy említett sejtként emlős sejtet alkalmazunk.
32. 32. A 29. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy említett sejtként egy rekombináns, az említett enzimet tartalmazó sejtet alkalmazunk.
33. 33. A 32. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy említett enzimként egy a(l,3)-fukozil-transzferázt alkalmazunk.