CZ96893A3 - Inhibition of adhesive protein cells and their carbohydrates interaction - Google Patents

Description

Oblast techniky

Tento vynález se týká terapeutické interference s interakcemi mezi buněčnými adhezními proteiny a jejich sacharidovými ligandy.

Dosavadní stav techniky

ELAM-1 je integrální membránový adhezní protein. Má extracelulární doménu včetně N-koncového s lektineiti příbuzného segmentu, repetici příbuznou epidermálnímu růstovému faktoru a násobné motify komplentárního regulačního proteinu (Bevilacqua a spol.: Science 243, 1160 ( 1989), Stoolman a spol.: Cell 56., 907 (1989).). ELAM-1 se specificky expresuje na povrchu endotheliálních buněk aktivovaných cytokiny IL-1 a nádorovým nekrotickým faktorem (TNF) (Bevilacqua a spol.: Proč. Nati. Acad. Sci. USA 84 , 9238 (1987).) nebo peptidovým hormonem Substance P (Matis a spol.: J. Invest. Dermatol. 94., 492 (1990).). Zprostředkuje adhezi myeloidních buněk (např. neutrofilních granulocytů) na cytokinem aktivované endotheliální buňky (Bevilacqua a spol.: Proč. Nati. Acad. Sci. USA 84, 9238 (1987).). Bylo navrženo, že ELAM-1 je obsažen v regulaci zánětlivých a imunologických událostí na povrchu mezi krví a stěnou krevních cév (Bevilacqua a spol.: Science 243, 1160 (1989).).

Podstata vynálezu

Obecně je tento vynález charakterizován způsobem inhibování navázání buňky, která nese buněčný adhezní protein, na molekulu nebo buňku, která nese sacharidovou determinantu specifickou pro buněčnou adhezní molekulu. Tento způsob zahrnuje uvedení do kontaktu buňky nesoucí buněčný adhezní protein s molekulou inhibitoru nesoucí- sacharidovou determinantu.

Ve výhodných uspořádáních je buněčným adhezním proteinem selektin, jako je například ELAM-1; sacharidovou determinantou je sialyl-Le*; sialyl-Le* determinanta může být navázána bud na atom dusíku nebo na atom kyslíku. Molekula inhibitoru obsahuje násobné sialyl-Le* determinanty; molekulou inhibitoru je protein, s výhodou glykoprotein «^-kyseliny nebo protilátka, s výhodou IgGl. Molekula inhibotoru obsahuje jedno nebo více adičních míst glykoproteinu «j-kyseliny navázaných na atom dusíku glykanu a molekula inhibitoru je rozpustná.

V příbuzném aspektu je tento vynález charakterizován způsobem snížení zánětu u lidského pacienta, při kterém se pacientovi podává terapeuticky účinné množství organické molekuly, která nese sialyl-Le* determinantu.

Ve výhodných uspořádáních organická molekula obsahuje násobné sialyl-Le* determinanty; sialyl-Le* determinanta jě bud navázána na atom dusíku nebo na atom kyslíku; organická molekula znamená protein, s výhodou glykoprotein «i-kyseliny, nebo protilátku, s výhodou IgGl, a organická molekula je rozpustná.

V jiném příbuzném aspektu je tento vynález charakterizován způsobem identifikace molekuly inhibitoru, která blokuje interakci mezi ELAM-l-nesoucí buňkou a druhou buňkou nebo proteinem. Tento způsob obsahuje uvedeni ELAM-l-nesoucí buňky do kontaktu s kandidátem molekuly inhibitoru a s druhou buňkou nebo proteinem, což umožňuje áfinitnímu komplexu mezi ELAM-l-nesoucí buňkou a druhou buňkou nebo proteinem vytvořit a identifikovat molekulu inhibitoru jako molekulu, která snižuje tvorbu afinitního komplexu. S výhodou druhá buňka nebo protein nese siallyl-Le* determinantu.·

V ještě jiném příbuzném aspektu je tento vynález charakterizován způsobem inhibice navázání prvního člena specifického vázajícího se páru na druhý člen specifického vázajícího se páru, která obsahujé' uvedení prvního člena do kontaktu s protilátkou, která je specifická pro první člen a která je kovalentně navázána na sacharidovou část, která interferuje se schop3 ností protilátky fixovat komplement a vázat F_c receptor.

Ve výhodných uspořádáních první člen znamená protein a druo hý člen také znamená protein; .protilátka je kovalentně navázána na násobné sacharidové části; sacharidová část znamená sialyl-Le* determinantu; sialyl-Le* determinanta jě ňávázáná~'biTd“há atom dusíku nebo na atom kyslíku; a protilátka obsahuje jedno nebo více adičních míst glykoproteinu Cj-kyseliny navázaných přes atom dusíku na glykan.

Podle jiného aspektu je tento vynález charakterizován organickou molekulou neobsahující buňku, na kterou je kovalentně navázána sacharidová determinanta specifická pro buněčný adhezní protein.

X Ve výhodných uspořádáních je buněčným adhezním proteinem selektin, s výhodou ELAM-l, sacharidová složka znamená sialyl-Le*, silalyl-Le* je navázána bud na atom dusíku nebo atom kyslíku, organická molekula znamená protein, s výhodou glykoprotein «j-kyseliny nebo protilátku, s výhodou IgGl, přítomnost sacharidové determinanty na protilátce interferuje se schopností protilátky fixovat komplement a vázat F_c receptor, organická molekula obsahuje jedno nebo více adičních míst glykoproteinu

Ci-kyseliny navázaných atomem dusíku na glykan a organická mo*** » lekula nese násobné sacharidové determinanty.

Tento vynález je dále charakterizován vyčištěnou nukleovou kyselinou kódující protilátku, která obsahuje místa pro připojení sacharidové determinanty, která je specifická pro buněčný adhezní protein, vektorem včetně této nukleové kyseliny a rekombinantní buňkou včetně tohoto vektoru.

A konečně, tento vynález je charakterizován způsobem přípravy molekuly nosiče, ke které je kovalentně navázán sacharid specifický pro buněčný adhezní-protein, zahrnující uvedení molekuly nosiče do kontaktu s enzymem, který je schopen připojit na protein sacharidovou determinantu.

Ve výhodných uspořádáních k uvedení do kontaktu dochází v živých buňkách. Buňkou je eukaryotická a s výhodou savčí buňka. Buňka znamená rekombinantní buňku obsahující DNA, která kóduje enzym. Enzymem je a(1,3)fukosyltransferasa.

Pod pojmem buněčný adhezní protein se rozumí protein, přítomný v některém bodu ve své in vivo existenci na buněčném povrchu, který zprostředkovává specifickou interakci s proteinem (např. proteinem nesoucím sacharidový ligand) na povrchu druhé buňky. Sacharidovou determinantou se rozumí část, která obsahuje jednu nebo více sacharidových skupin, které jsou přítomny na povrchu buňky (v některém okamžiku její in vivo existence) a které interagují specifickým způsobem s proteinem, např. buněčným adhezním proteinem, např. na povrchu druhé buňky. Pod pojmem selektin se míní člen skupiny buněčných adhezních molekul, které jsou strukturně charakterizovány přítomnosti domény podobné lektinu, domény podobné epidermálnímu růstovému faktoru, sérií repetic bohatých na cystein, domény transmembrány a krátkého cytoplasmového okraje. Pojem zánět znamená pathologický proces,- který sestává z cytologických a histologických reakcí, ke kterým dochází v ovlivněných krevních cévách a přilehlých tkáních jako odpověď na poranění nebo abnormální stimulaci způsobenou fyzikálními, chemickými nebo biologickými činidly. Pojem specifický vazebný pár znamená jakýkoliv pár molekul, včetně prvního i druhého členu, který má specifickou afinitu jeden ke druhému. Mezi, příklady specificky vázajících se párů patří receptory,a ligandy, např. buněčné adhezní molekuly a jejich sacharidové ligandy. Pojem vyčištěná nukleová kyselina znamená nukleovou kyselinu, která je oddělena od jiných sekvencí, s nimiž je přirozeně asociována. Pojem N-navázaný nebo navázaný na atom dusíku znamená navázaný na amidový atom dusíku asparaginového zbytku proteinu. Pojem O-navázaný nebo navázaný na atom kyslíku znamená navázaný na atom kyslíku hydroxylové skupiny serinového, threoninového nebo hydroxylysinOVého zbytku proteinu.

V následující části spisu budou stručně popsány přiložené výkresy.

Obrázek 1 ukazuje sekvenci IgGl a mutace navržené pro vytvoření adičních míst navázaných atomem dusíku na glykan.

Obrázek 2 je graf, který ukazuje schopnost α-ELAM-l protilátek vázat se na řadu ELAM-1 subfragmentů a ELAM-1 fúzovaných proteinů.

Obrázek 3 ukazuje strukturu domény fúzovaného proteinu

ELAM-1-IgGl.

Obrázek 4 je graf ukazující stupeň navázání serie savčích buněčných linií na ELAM-1-IgGl fúzovaný protein.

Obrázek 5 je graf, který ukazuje stupeň navázání serie savčích buněčných linií na protilátky proti molekulám buněčného povrchu, CD15, CD63 nebo sialyl-Le*.

Obrázek 6 je graf, který ukazuje navázání neuraminidasou zpracovaných myeloidních buněk na ELAM-1 nebo na a-CDl5 protilátku. ^Λ

Obrázek 7 je graf ukazující inhibici adheze buněk nesoucích ELAM-1 a-silyl-Le* protilátkou.

Obrázek 8 je graf, který ukazuje účinek sialyl-Le* determinanty odvozené od plodové tekutiny na navázání myeloidních buněk na ELAM-1.

Obrázek 9 je graf, který ukazuje schopnost in vitro fukosylovaného glykoproteinu «^-kyseliny vázat ELAM-1.

Obrázek 10 je graf, který ukazuje účinek IL-1 a IL-8 na expresi sialyl-Le* povrchem buněk.

Obrázek 11 je graf, který ukazuje účinek IL-1 a IL-8 na adhezi myeloidních buněk na ELAM-1.

V této části tohoto spisu bude popsána protilátka nesoucí násobné sialyl-Le* determinanty.

V jednom uspořádání je tento vynález charakterizován protilátkou nesoucí jeden nebo více sacharidových postranních řetězců, které maskují CH2 část molekuly imunoglobulinu a tak inhibují fixaci komplementu a navázání F_c receptoru. Takové protilátky jsou užitečné pro narušení nežádoucích interakcí mezi buňkami nebo proteiny nebo, obecně, pro narušení interakce mezi jakýmikoliv dvěma molekulami, z nichž jedna nese determinantu specificky rozpoznávanou protilátkou. Jelikož sacharidové části blokují imunoglobulinovou doménu, která uvádí do pohybu fixaci komplementu a navázání F_c receptoru, tyto protilátky nevykazují nežádoucí vedlejší účinky (tj. ty, které pocházejí z fixace komplementu navazani receptoru) často související s léčeními, které jsou založeny na protilátkách. Sacharidové skupiny s výhodou slouží nejen pro inhibici nežádoucí fixace komplementu a navázání F_c receptoru, ale také pro funkci kompetitivního inhibování interakce sacharidový ligana - buněčný adhezní protein. Tam, kde sacharidové skupiny mají tuto funkci, protilátky obvykle neslouží jako jakákoliv funkce pocházející z jejich specifičnosti, ale slouží pouze jako nosič pro sacharidové skupiny. Dále je popsána taková molekula, v níž sacharidový postranní řetězec obsahuje sialyl-Le* determinantu. Sialyl-Le* působí normálně jako usnadnění interakce mezi buňkami_r které ji nesou (např. neutrofily) a buňkami, které nesou protein ELAM-1 (např. endotheliální buňky, např. ty, které leží na stěnách krevních cév). Přerušení této interakce má terapeutické aplikace, například minimalizování zánětu, -jako jsou například takové, ke kterým dochází po poranění tkáně, např. infarkt myokardu, nebo které jsou charakterizovány onemocněními, jako je například psoriasa (lupénka) nebo reumatická artritida.

Molekula IgGl, v její nascentní formě, nenese žádné sialyl-Le* postranní řetězce. Jelikož -na N-navázaná glykanová adiční místa jsou velmi dobře známa (jsou to: N X S/T (kde N znamená asparagin, S znamená serin, T znamená threonin a X znamená jakoukoliv aminokyselinu vyjma prolinu)), navrhli jsme molekulu obsahující několik takových míst pro připojení sialyl-Le* postranních řetězců. Inspekce IgGl sekvence (obrázek 1) odhalila alespoň pět míst, v nichž lze do molekuly zavést ve výhodných umístěních N-navázaná glykanová adiční místa, v nichž bude tímto procesem poškozena schopnost fixování komplementu a navázání F_c receptoru. Tato mí’šta (tj. počínají na aminokyselinových zbytcích 274, 287, 295, 322 a 355), i když jsou výhodnými místy přidání N-navázaného glykanu, nejsou jedinými kandiΊ dáty. Použitím následujících kriterií (jako vodítka) mohou být identifikována a zavedena do IgGl sekvence jiná užitečná místa:

1) Tato místa jsou s výhodou umístěna v oblasti CH2 imunoglobulinové molekuly, tj. v části molekuly zodpovědné za-fixaci komplementu a navázání F_c receptoru, 2) tato místa jsou umístěna v těch oblastech sekvence, předem dané jejich hydrofilní povahou, která jsou přítomna na vnější straně imunoglobulinové molekuly a jsou tedy přístupna pro enzymy zodpovědné za připojení sacharidových vedlejších řetězců, 3) tato místa jsou umístěna v oblasti, která je minimálně narušená vzhledem k primární aminokyselinové sekvenci a tedy předpověděné sekundární aminokyselinové struktuře. Například přirozeně se vyskytující místo, které se liší od N-napojeného glykanového adičního místa jedinou aminokyselinou, by bylo výhodné vzhledem k místu vyžadujícím dvě změny v sekvenci aminokyselin. Navíc je však výhodné vytvořit N-navázané glykanové adiční místo substituováním aminokyselin podobného náboje nebo polarity (např. substitucí jedné aminokyseliny bez náboje jinou aminokyselinou). Jedna nebo více substitucí N-navázaného glykanového adičního místa může být zavedena do IgGl-kodující sekvence. Takové sekvence (tj. ty, které kódují molekulu protilátky, na níž je sialyl-Le* část napojena) jsou označeny IgGl-sialyl-Le nebo IgGl-Le .

Příslušná IgGl molekula nesoucí sialyl-Le* části se připravuje následujícím způsobem. Gen IgGl je obecně dostupný, jeho sekvence je uvedena na obrázku 1 (sekvence identifikační číslo 1). Tento gen se mutagenizuje standardními způsoby in vitro místně-řízené mutagenese, aby se zavedlo jedno nebo více N-navázaných glykanových adičních míst (např. takové, které jsou shora popsány a které jsou shora uvedeny přirozeně se vyskytující sekvencí na obrázku 1, sekvence identifikační číslo

2) . Tento gen se pak vloží do vektoru navrženého pro expresi proteinu v eukaryotické buňce (viz např. takové vektory, které popsali Gillies. a spol.: USA patent č. 4 663 281, uvedený zde jako odkaz ) . Buňkou eukarytického hostitele je obvykle savčí buňka (např. buňka CHO nebo lecll). Expresní vektor obsahující mutovanou IgGl-Le^x-kodující sekvenci se zavede do hostitelské buňky přechodnou nebo stabilní transfekcí standardními technikami. Tyto hostitelské buňky jsou transfektovány také (přechodně nebo stabilně) vektorem·, schopným, expresí poskytovat, a (1, 3 ) fukósyltransf erasu schopnou; připoj it.'sialyí-Le* skupihyš na -molekulu protilátky v místě^glykosylace; íGenXf 1>”3 ) fukosylťransferasy může být expresóyán^z-vektoru jiného než;-je vektor',-kte-; rý kóduje IgGl-Le*,<neboč oba?; gén^mohowbýtš neseny; atexpresová-: ny ze společného vektoru·. Savčí buňky jsou zvláštěužitečnými hostiteli pro syntézu IgGl-Le*, protože poskytují všechny žádoucí prekursory pro získávání sialyl-Le*.

cDNA a(1,3)fukósyltransferasy je popsána Lowem a spol.: Cell 63 , 475 (1990). a(1,3)Fukósyltransferasový enzym, kódovaný touto cDNA, rozpoznává molekulu sialylovaného prekursoru a přidává bud a(l,3)- nebo a(1,4)-navázanou fúkosovou část k N-acetylglukosaminovému postrannímu řetězci. Sialyl-Le* determinanta je charakteristická a( 1,3)-vazbou a a( 1,3)fukósyltransferasový enzym Lowe (viz výše) poskytuje jak obě žádoucí sialyl-Le*-modifikované molekuly tak produkty nesoucí a_(1,4) -navázanou„f ukosu, která, i když není aktivní při navázání na ELAM-1, neinterferuje s působením sialyl-Le*-modifikovaných molekul ani neposkytuje jiné nežádoucí vedlejší efekty. Produkce IgGl-sialyl-Le* by však byla účinnější, kdyby byla použita a(1,3)fukosyltransferasa, která výlučně katalýzu je a( 1,3 ) f úkosové vazby. Takový savčí enzym existuje a jeho cDNA může být isolována následujícím způsobem. Knihovna cDNA, připravená z mRNA, která se isoluje z myeloidní buněčné linie (např. HL-60), se vloží doexpresního vektoru savčí buňky jako vrH3M (viz Simmons a spol.: Nátuře 331, 624 (1988), Aruffo a Seed: Proč. Nati. Acad. Sci. USA 84, 857 3 (1987).) a transfektuje se do savčí buněčné linie, s výhodou do buněk COS7 (jak je to popsáno Seedem a Arruffoem: Proč. Nati. Acad. Sci. USA 84., 3365 ( 1987).). Imunoselekčním postupem popsaným v práci Aruffo a Seed: viz výše, Seed a Arruffo: viz výše a v USA patentové přihlášce č. 379 076, které jsou zde uvedeny-jako odkazy, se isoluje příslušný cDNA klon. Transfektované buňky se isolují a inkubují se s monoklonálními Protilátkami PM-81 (anti-CD!5, Medarex, West Lebanon, NH) ,

FMC13 (anti-CD15, Sera-Lab/Accurate Chemical and Scientific, Westbury, NY) , MC-1 (anti-CDl5, Sera-Lab, Westbury, NY) a VIM8 (anti-CD65). Následuje inkubace (např. 1 hodinu), buňky se oddělí od volných protilátek odstřečfováním polštářem 2% Ficollu v PBS a nechají se usadit v plastikových miskách potažených afinitně vyčištěnými kozími protilátkami na myši IgM (jak ňizě' popsáno). Isolují se adherentní buňky a připraví se Hirt supernatant obsahující episomální DNA. Vyčištěná Hirt supernatantová DNA se transformuje například elektroporací do Esecherichia coli (s výhodou E. coli MC1061/p3) standardními technikami a standardními způsoby se vyberou kolonie resistentní na ampicilin a tetracyklin. Kolonie resistentní na antibiotika se pak spojí a plasmidy se amplifikují (např. následujícím přidáním hydrochloridu spektinomycinu přes noc). Výsledná kultura se převede na sferoplasty a tyto sferoplasty se fuzují s buňkami C0S7 standardními postupy (viz například shora Seed a Aruffo). Buňky se nechají inkubovat (s výhodou dva až tři dny) a vystaví se působení protilátek jak shora popsáno. S výhodou se provedou dvě řady sferoplastové fůze a panning (tj. shora popsaný postup) . Bakteriální buňky, které se získají z posledního kola panning se isolují a připraví se jejich plasmidová DNA. Tato cDNA kóduje enzym, tj. a( 1,3)-fúkosyltransferasu, která řídí výskyt žádaných determinant CD15 a CD65., tj. sialyl-Le* determinant.

Hostitelské buňky, které expresí poskytují α(1,3)fukosyltransferasu a IgGl-Le* (a tedy produkují molekulu IgGl nesoucí sialyl-Le* determinanty), se kultivují standardními způsoby. Protein IgGl-Le* se vyčistí z buněčného lysátu na základě jeho afinity k proteinu A na koloně s proteinem A nebo jinými standardními způsoby isolace a čištění protilátek.

Pro podávání této sloučeniny pacientovi se farmaceuticky čistý LgGl-Le* suspenduje v přijatelném nosiči, např. fysiologickém solném roztoku, a dodává se pacientovi intravenosně v jediné dávce nebo ve více dávkách. V optimálním případě se dostatečného množství IgGl-Le* dosáhne tehdy, jestliže se nasytí všechna ELAM-1 vazebná místa endotheliální buňky. Typicky se tohoto stavu dosáhne dávkami 0,1 mg/kg nebo většími. Výhodné dávky jsou dávky v rozmezí 0,1 až 2,0 mg/kg.

Jiné molekuly nosiče,, například sialyl-Le*-modifikovaný glykóprótéin· <ž£-kýséliňy · (aí-AGP-Le*,'který je popsán níže), by še připravovaly obecně « jak je zde-popsáno a podávaly by se pacientům intravenosně jak shora popsáno (tj. s výhodou v dávkách dostatečných pro nasyceni všech buněčných ELAM-1 vazebných míst, např. v množství 0,1 mg/kg nebo větším).

IgGl-sialyl-Le* nebo c^-AGP-sialyl-Le* se mohou používat například pro léčení pacienta, který trpí srdeční chorobou. Po takovém trauma endotheliální buňky na krevních cévách expresí poskytují na povrchu ELAM-1 a, bez léčení, neutrofily, nesoucí sialyl-Le* na svém povrchu vážou ELAM-1 nesoucí endotheliální buňky, přispívající k zánětu. Léčení molekulou nesoucí sialyl-Le* by zeslabilo zánět kompetitivní inhibicí interakce mezi napadajícími neutrofily a endotheliálními buňkami krevních cév v blízkosti srdce. Sloučeniny, jako jsou například IgGl-sialyl-Ls* nebo Cj-AGP-sialyl-Le*, se mohou používat také, jak shora popsáno, pro léčení onemocnění, které jsou charakterizována chronickými zánětlivými stavy, např. reumatická artritida, psoriasa (lupénka) nebo pemfigus obecný (pemfigus vulgaris).

Příklady provedení vynálezu

Následujícími pokusy bylo ukázáno, že sialyl-Lewis X.(sialyl-Le*) determinanty interagují s ELAM-1 a usnadňují navázání na ELAM-1 nesoucí endotheliální buňky. Tyto příklady jsou zde uvedeny jako ilustrace, nijak neomezující tento vynález.

Rozpoznávání sialyl-Le* determinanty ELAM-1: ELAM-1 domény nutné pro granulocyty vázající aktivitu byly lokalizovány použitím dvou monoklonálních anti-ELAM-l protilátek: H18/7, které efektivně blokují adhezi leukocytů na aktivované endothelium, a H4/18, které to neprovádějí (Pober a spol.: J. Immunol. 136,

1680 (1986), Bevilacqua a spol.: Proč. Nati. Acad. Sci. USA 84, 9238 (1987).). Celá délka ELAM-1 se expresuje z cDNA nesené plasmidem pEIAM-12 (Bevilacqua a spol.: Science 243, 1160 ( 1989).) . Delece na karboxylovém konci ELAM-1- cDNA se vytvoří PCR reakci (polymerase chain reaction) . Získají se tak proteiny uvedené na obrázku 2. Sekvence primeru pro PCR ďeíece byly navrženy na základě sekvence ELAM-1 o plné délce podle Bevilacqua a spol. (Science 243, 1160 (1989).). Jakmile se jednou získají, potom se ELAM-1 cDNA fragmenty fúzují standardními způsoby na transmembránové a intracelulární kódující části CD7 cDNA (tj. nukleotidy 501 až 1236 cCD7 cDNA popsané.Arrufem a Seedem: EM30

J. <6, 3313 ( 1987 ).). Plasmidy, které nesou výsledné fůze, se transfektují do COS buněk. Reaktivita na monoklonální protilátky se stanoví nepřímou imunofluorescenční mikroskopií fixovaných permeabilizovaných buněk způsobem podle Aruffa a spol.: Cell 61. 1303 ( 1990). Výsledky této analýzy ukazuje obrázek 2. Tyto výsledky jsou representovány transfekcemi tří až šesti nezávislých isolátů uvedených konstrukcí. Obrázek 2 ukazuje, že navázání H18/7 vyžaduje lektinu-příbuzný segment plus domény EGF-repetice, zatímco H4/18 reaktivita dále vyžaduje prvky prvních tří repetic regulačního proteinu komplementu. L označuje segment příbuzný lektinu, EGF označuje segment repetice příbuzné EGF a CR1-CR6 označuje prvky regulačního proteinu komplementu.

Pro další definování vazebného místa pro H18/7 se vymění fragment mezi ELAM-1 cDNA s ekvivalentním fragmentem příbuzné Leu8 (LECCAM-1) cDNA (popsaný Camerinim a spol.: Nátuře 342, 78 (1989).). Leu8 (LECCAM-1)/ELAM-1 chiméry byly vytvořeny záměnou restrikčních fragmentů ze zachovaného BglII místa v lektinové doméně (tj. na nukleotidech 454, případně 475, ELAM-1, případně Leu8 cDNA sekvencí). Jak jeto ukázáno na obrázku 2, H18/7 je navázána na antigenní determinantu umístěnou hlavně v prvních 75 % ELAM-1 lektinové domény. Spolu se shora uvedeným výsledkem (tj. že jak lektinu podobná tak EGF-repetici podobná doména jsou žádoucí pro navázání H18/7 na zkomolenou ELAM-1) naznačuje, že prvek EGF-příbuzné repetice může hrát roli při utváření struktury lektinové‘'domény.

- Pro studium možných lektin-sacharidových interakcí naznačenýcH/mápóváňíiaíepitopú se připraví chiméra rozpustného ELAM-1 proteinul napojením cDNA fragmentu kódujícího ELAM-1 extracelu• lárníyidoinériuTna :gěndmový fragment: kódující :kloub, t j . domény CHj' á-CH^ lidského IgGR (Aruffo a- spol. : Cell? 61-y- 1303 (1990 ) ., obra*zek^!-3 )Vť ELAM-l-IgGl chimera se připraví následujícím postupem. Standardními způsoby se připraví syntetické oligonukleotidy o sekvenci CGGAATTCCAGTACTACTCACCTGGTCCGCCGATGGTCTCCGGGC (sekvence identifikační číslo 3) a o sekvenci

CCAGATATACGCGTTGACATTGATTATTGACTAGTTATT (sekvence identifikační číslo 4), sekvence odpovídající střihu donor/karboxylový konec ELAM-1 a umístění ve vektoru proti směru vlákna vložené cDNA. PCR reakce s těmito oligonukleotidy a ELAM-1 cDNA expresním plasmidem, pELAM-1, jako templátem, poskytla fragment o 1800 párech nukleotidů, který se rozštěpí působením Xhol a EcoRI a subklonuje se do expresního vektoru ΤΓΗ3Μ (Aruffo a Seed; Proč. Nati. Acad. Sci. USA 84, 8573 (1987) .) rozštěpeného působením Xhol/EcoRI. Subklonovaný fragment se uvolní štěpením působením Xhol a Seal a liguje se s IgGl expresním plasmidem rozštěpeným působením Xhol/Scal, který popsali Aruffo a spol.: Cell 61, 1303 (1990). Výsledná konstrukce se transfektuje do COS buněk (jak popsali Seed a Aruffo: Proč. Nati. Acad. Sci. 84., 3365 (1987).). Žádaný fúzovaný protein, označený ELAM-Rg, se isoluje ze supernatantu adsorpci na protein A-agarose a následující elucí z tohoto nosiče, jak popsali Aruffo a špol. (Cell 61, 1303 (1990).). Původní konstrukce a následná verse, v níž byla většina PCR-amplifikovaného segmentu (tj. nukleotidy 1 až 1464 sekvence ELAM-1) nahrazena homologním restrikčním fragmentem (abychom se vyhnuli potenciálním mutacím zavedeným během amplifikace), vykazovala identickou vazebnou aktivitu. Rozpustný protein se objevil ve formě dimerů svázaných disulfidovou vazbou, pravděpodobně zprostředkovanou kloubovou oblastí cysteinových zbytků zodpovědných za vazbu mezi těžkými řetězci aktivních imunoglobulinů.

Pro zjištění, jestli myeloidní buňky navázaly rozpustný ELAM-1, se plastikové misky předem potažené kozími protilidskými IgG protilátkami inkubují se supernatanty, které expresí poskytují ELAM-Rg. Tyto pokusy se prováděly následujícím postupem. Z čerstvě odebrané heparinizované úplné krve se odstředováním (přes Ficoll/diatrizoát sodný; Mono-Poíy Řesoíving Medium, Flow Laboratories, McLean, Va.) po dobu 20 minut při 800 x g isoluji lidské granulocyty. Buněčné linie byly získány z Americké sbírky typů kultur (ATCC) a byly uchovávány v IMDM s 10 % plodového hovězího sera jak popsali Aruffo a Seed (Proč. Nati. Acad. Sci. USA 84., 8573 ( 1987).). Adheze na ELAM-Rg se provede v miskách pro kultivaci bakterií (Falcon 1008, Becton-Dickinson Labware, Lincoln Park, NJ.), na které byla nechána adsorbovat afinitně vyčištěná kozí protilidská IgG protilátka (Organon Teknika/Cappel, Malvern, Pa.) v množství 10 //g/ml v 50mM Tris-HCl, pH 9,5, po dobu alespoň jedné hodiny. Zbývající místa vázající protein byla pak blokována inkubací přes noc s 1 mg/ml hovězího sérového albuminu ve fosforečnanovém pufru (PBS, 137 mM NaCl, 2,7 mM KC1, 4,3 mM Na₂HPO₄.7H₂O, 1,4 ml KH₂PO₄, pH 7,3). Desky se inkubují s ELAM-Rg (přibližně 1 ^g/ml) po dobu 30 minut při 22 °C, promyjí se PBS, převrství se buňkami (10^ buněk) po dobu 10 minut při 22 °C a promyjí se třikrát PBS. Adherentní buňky na jednotku plochy misky se spočtou pomocí vizuální vláknové mřížky a vyhodnotí se následujícím způsobem; >100 buněk: +++++. 100 až 75 buněk: ++++, 75 až 50 buněk: +++, 50 až 25 buněk: ++ a 25 až 10 buněk: +. Všechny hodnoty představují průměr ze trojího stanovení.

Tyto zpracované plastikové misky získaly schopnost specificky vázat granulocyty stejně jako myeloidní buněčné linie HL60 a THP1 (obr. 4). Bylo zjištěno, že se na ELAM-1 potažené plastikové misky vážou také další buněčné linie jak krvetvorného (tj. U937 a HSB-2) tak nekrvetvorného původu (tj. WIDR) (obr. 4). Misky,- které byly potaženy CD8 fúzovaným proteinem (Aruffo a spol. : Cell 61, 130 3 ( 1990).), vykazovaly zanedbatelnou afinitu (pro granulocyty nebo jakékoliv jiné testované buněčné linie (Bevilacqua a spol.: Proč. Nati. Acad. Sci. USA 84,

9238 (1987).)).

’Pro korelaci vazebné aktivity s povrchem fenotypu byly testóvánýřrůzné^mmóhoklonálňí- protilátky/ rozpoznávané* zňámýmiugra- nulocytóvými- sacharidovými^ antigeny-na/reaktivitu; se shora uvedenými _ř typy,* buňěk-Λ* S~následú j fclmil protilátkami^ (j akoí ascitěs; ve zředění- 1' ;u 250/nebo& jako* vyčištěná?protilátkáúvlmnožství /íg/ml) 'bylo inkubováno 5.10^ buněk: · PM-81 (áňti-CDl5; Medarex, W. Lebanon, NH; Balí a spol.: J. Immunol. 130, 2937 (1983).), CSLEX-1 (anti-sialyl-Le^x; Fukushima a spol.: Cancer Res. 44, 5279 (1984).) nebo VIM2 (anti-CD65; Macher a spol.:

J. Biol. Chem. 263, 10186 ( 1988).) a s fluoresceinem konjugovanou kozí protimyši IgG+IgA+IgM protilátkou (Organon TeknikaZCappel, Malverne, Pa.).

Výsledky jsou uvedeny na obrázku 5. Řídké tečky znamenají negativní kontrolu (žádná primární protilátka) . Husté tečky znamenají anti-CDl5 mAb, pevná čára znamená anti-CD63 mAb a čárkovaná čára znamená anti-sialyl-Le^x mAb. Zde použité.. linii_U9 37 chyběly sialyl=Le^x determinanty na rozdíl od příbuzné buněčné linie U937 testované Terasakim a spolupracovníky (Fukushima a spol.: Cancer Res. 44., 5279 (1984).). Počáteční přehled ukazoval, že ELAM-1 adhezní potenciál odpovídal přítomnosti CD15 determinanty (tj. Le^x nebo lakto-N-fukopentose III; Gooi a spol.: Nátuře 192, 156 (1981); Huang a spol.: Blood 61, 1020 (1983); Magnan a spol.: Arch. Biochem. Biophys. 233, 501 (1984); Gooi a spol.: Eur. J. Immunol. .13, 306 (1983); Tetteroo a spol.: Eur. J. Immunol. 14, 1089 (1984).), ale nikoliv s determinantami asociovanými s CD17 (laktosylceramid; Symington a spol.: J. Biol. Chem. 259,; 6006 (1984).), CD65 (VI^NeuAcIII^FucnorLcnOsegCer; Macher a spol.: J. Biol. Chem. 263, 10186 (1988).) nebo sulfatidy (Fredman a spol.: Biochem. J. 251, 17 (1988).).

Pro další testování korelace mezi ELAM-1 adhezním potenciálem a přítomností CD15, byly buňky, které nesou CD15, zpracovány s neuraminidasou, enzymem, o němž je známo, že štěpí ter15 minální sialylové skupiny. Buňky HL60 se inkubují (106/_na desku) v 50 μΐ 0,15M NaCl, 4mM CaCl2, pH 5,5, 1 hodinu při 37 °C v přítomnosti nebo v nepřítomnosti 41,5 milijednotek neuraminidasy (z Vibrio cholerae, typ II, Sigma, St. Louis, Mo. ) . Buňky

...se .pr.omy. jí . třikrát ..PBS. .a. .adh.er.en.ee .bud. .na ..ELAM-.lR.g-. ..nebo. _P.M- 8.1-potažené misky se vyhodnotí jak shora uvedeno. Misky se potáhnou ELAM-Rg jak shora uvedeno a vyčištěnou PM-81 protilátkou v množství 10 /xg/ml v 50mM Tris-HCl, pH 9,5. Testy adherence se provádějí jak shora uvedeno. Výsledky uvedené na obrázku 6 jsou vyjádřeny jako % kontroly a byly vypočteny jako střed* ± standardní odchylka z průměru trojího stanovení ve třech nezávislých pokusech.

Obrázek 6 ukazuje, že korelace ELAM-1 adhezního potenciálu s přítomností CD15 byla nedokonalá, protože štěpení buněk neuraminidasou odstraňuje vázaní na ELAM-1, ale zvyšuje vázání na imobilizované anti-CDl5 protilátky.

Asociace s CD15 a citlivost na neuraminidasu naznačuje, že sialylovaná forma CD15 sacharidového antigenu může představovat fysiologický ELAM-1 ligand. Pro testování této myšlenky se CSLEXl monoklonální protilátka testuje na schopnost inhibovat adhezi buněk HL60 na ELAM-Rg. ΙΟ** buněk HL-60 se inkubuje s CSLEXl (ve zředění 1 : 50 v PBS) 30 minut v ledu, potom se zesíťuje s afinitně vyčištěnou kozí proti-myší IgM protilátkou (Organon Teknika/Cappel, Malverne, Pa.) v množství 20 /xg/ml v PBS během 30 minut a fixuje se 2% formaldehydem v PBS 20 minut při 22 °C. Buňky se promyjí třikrát PBS/1 % glycinu a inkubují se s ELÁM- 1-Rg-potaženými miskami jak shora uvedeno. Data (uvedená jako procenta ke kontrole) na obrázku 7 představuji střed ± standardní odchylku z trojího stanovení ve třech nezávislých pokusech.

Obrázek 7 naznačuje, že. existuje velmi dobrá korelace mezi povrchovou hustotou sialyl-Le^x a pořadím počtu buněk navázaných na jednotku plochy plastikových misek potažených ELAM-Rg. Dále, ^an'^t:-i-sialyl-Le^x protilátka úplně inhibuje adhezi myeloidních buněk na ELAM-1, zatímco anti-CD65 a anti-CD15 protilátky nemají za stejných podmínek žádnou aktivitu.

- ^-/Sacharidový epitop_Arozeznávaný protilátkouJ2SLEXÍ/byl 'po-, psáns? jako,,NeuNAca2-3GalBl-4 (Fucal-3 )GlcNAcBl-3Gal,je .založen ria.\ motif ech< obvyklých; pro? strukturně/ charakterizované? glykolipidy ,ý s / nimiž/protilátka/reaguje/ (Fukušhima^ a' . spol. : ^Cancer Res. 44, 5279 (1984).)7 Chemická analýza fúkosylovaných laktosaminoglykanů neutrofilních granulocytů ukázala, že jak Le^x (CD15) tak sialyl-Le^x determinanty jsou převážně representovány na tetraanténových asparaginu podobných glykanech, jejichž jednotlivá vlákna jsou vystavěna z póly(N-acetyllaktosamin)ových řetězců nesoucích různé a( 1,3)-napojené fúkosové substituce (Fukuda a spol.: J. Biol. Chem. 259. 10925 (1984); Spooncer a spol.: J. Biol. Chem. 259, 4792 (1984).). Serologický důkaz rovněž podporuje existenci sialyl dimerní Le^x determinanty na granulocytech (Fukushi a spol.: J. Biol. Chem. 259, 10511 (1984); Fukushi a spol.: Cancer Res. 45, 3711 (1985).). Jako například _zby.tek.na.redukuj.ící-stran.ě_sial.y-l-Le2Lskupiny~znamená galaktosu ve všech dosud identifikovaných granulocytových strukturách. I když protilátka CSLEX1 blokuje navázání, struktura rozeznávaná ELAM-1 může být složitější než struktura rozeznávaná CSLEX1. Pro stanovení minimální glykanové struktury pro navázání ELAM-1 se chemicky charakterizované glykany nesoucí sialyl-Le^x determinanty vyhodnotí na rozpoznávání ELAM-1.

Plodová tekutina je jedním ze zdrojů dobře definované sialyl-Le^x determinanty, která se nachází ve velice rozdílných souvislostech než granulocytový buněčný povrch. Silal-Le^x-nesoucí sacharid plodových mucinů je napojen Bl-6 k 3-substituovanému N-acetylgalaktosaminu, který je dále napojen přímo na polypeptidový základní řetězec 0-vazbou na serin nebo threonin (Hanisch a spol.: Carbohydr. Res. 178, 29 ( 1988).). Sialyl-Le^x determinanty odvozené od plodové tekutiny byly testovány na svoji schopnost blokovat navázání myeloidních buněk na imobilizováný ELAM-1. Lidská plodová tekutina (HAF) byla použita bud bez čištění, frakcionovaná ultrafiltraci odstředováním (jméno17 vitá frakce o mol. hmotě 100 000; Centricon 1000, Amicon, Danvers, Ma.) nebo frakcionována, po extrakci fenolem, chromatograf ií na gelu (Sephacryl S-300 HR) ve 4M guanidiniumchloridu (způsobem podle ^!Hanische a spol.: Carbohydr. Res. 178, 29 (1988).). Získají se tak vyčištěné muciny. Tyto muciny byly použity pro zkoncentrování proteinu na přibližně 150 /zg/ml. Navázání na ELAM-Rg potažené plastikové misky se provádí jak bylo shora popsáno. Výsledky (vyjádřené jako procento ke kontrole) uvedené na obrázku 8 jsou průměrem ze trojího stanovování ve. dvou nezávislých pokusech. .....

Obrázek 8 ukazuje, navzdory nepodobnosti mezi granulocytovými glykany a muciny plodové tekutiny, že vyčištěné muciny plodové tekutiny stejně jako nefrakcionovaná plodová tekutina (která vypadá, jako by obsahovala všechnu svoji aktivitu ve vysokomolekulární frakci bohaté na muciny) účinně blokuje navázání myeloidních buněk na imobilizovaný ELAM-1.

Jiným zdrojem, sialyl-Le^x determinant je fukosylovaný glykoprotein a^-kyseliny (<Z|-AGP) (Biou a spol.: Biochim. Biophys. Acta 913, 308 (1988); Wieruszewski a spol. : FEBS Lett. 238, 390 ( 1988).). Chemická analýza lidského <Z|-AGP ukázala, že fukosa je přítomna na menší frakci N-navázaných glykanů (Schmid a spol.: Biochim. Biophys. Acta 492, 291 (1977); Fournet a spol.: Biochemistry 17, 5206 (1978).), ale že asialo-protein alespoň částečně blokuje navázání anti-CD15 protilátek (Gooi a spol.: Eur·. J. Immunol. 13, 306 (1983); Tetterro a spol.: Eur. J. Immunol. 14 , 1089 (1984) .). Mírného (35 ± 9 %) snížení navázání HL60 buněk na ELAM-1 (adsorbovaných na plastikových miskách) se dosáhne s 200 /zg/ml proteinu.

In vitro produkce sialyl-Le^x molekuly: Abychom rozšířili tyto výsledky, byly připraveny in vitro enzymaticky fukosylované a^-AGP. Biosyntéza sialyl-Le^x determinanty je kontrolována specifickou a(1,3)fukosylťransferasou (Campbell a spol.: Cell 35, 303 ( 1983); Campbell a spol.: J. Biol. Chem. 259, 11208 (1984).), která přidává fukosu na N-acetylglukosaminovou část koncového N-acetyllaktosaminu nebo jeho 3-sialylového produktu; o geneticky a biochemicky odlišné a( 1,3)fukosyltransferase je známo, že pouze přidává fukosu k asialylovému prekursoru (Prieelsjja spol. Eur. J. Biochem. 130, · 347 (1983);. Muramatsu a spol. :- J. ?Eur ;· Biochem; 157, 71 (1986).). O třetí fukósyltrarisférásě'Kjé3^?zhámd, žéř tvoří j jak <x( 1,3)' tak a(l,4) vazby, zřejmě knésialylovaným¹ substrátům (Prieels a spol.: J. Biol. Chem. 256,'10456 (1981); Lowe a spol.: viz výše.). Biosyntéza sialyl-Le^x determinanty probíhá postupně sialylací následovanou fukosylací, protože a(2,3)siaiyltransferasa nemůže rozeznávat fukosylovaný koncový N-acetyllaktosamin, který je CD125 (Holmes a spol.: J. Biol. Chem. 261, 3737 (1986).). Glykoprotein «^-kyseliny je dobrým substrátem pro α( 1,3)fukosyltransferasu plodové tekutiny (např. Hanish a spol.: Carbohydr. Res. 178, 23 (1988).), enzym, který tvoří sialyl-Le^x ze sialylovaných a nesialylovaných prekursorů.

Fukosyltransferasa plodové tekutiny byla isolována afinitní chromatografií a vyhodocena na _ schopnost .převádět. a .j- AGP. .na. ELAM-1 ligand následujícím postupem, a(1,3)Fukosyltransferasa se isoluje z koncentrované plodové tekutiny chromatografií na fetuin-agarose jak to bylo dříve popsáno (Hanish a spol.: Carbohydr. Res. 178, 23 (1988) a Mitsakos a spol.: Biol. Chem. Hoppe-Seyler 369, 661 (1988).). 0,8 /xCi GDP¹⁴C-fúkosy (225 Ci/mol) a 100 /xg hovězího α^-AGP (Sigma, St. Louis, Mo. ) se přidá k reakční směsi obsahující 25mM Tris-HCl, pH 7,0, 35 mM MgCl2 a lmM ATP v konečném objemu 120 μΐ. Reakce se nechá probíhat 24 hodin při 37 °C, potom se do TCA-nerozpustného materiálu zahrne přibližně 10 % ^⁴C-značené fukosy. Neinkorporovaný markér se odstraní ultrafiltrací odstředěním (Centricon 10, Amicon, Danvers, Ma.). 20 μΐ ředění 1 : 5 označeného materiálu nebo 10 μΐ ředění 1 : 5 podobně sestavené reakční směsi, které chybí značená GDP-fukosa, se adsorbuje na plastikových miskách (jak shora popsáno) nebo na mikrotitrovacích destičkách s 96 jamkami (Falcon 3911, Becton Dickinson, Oxnard, Ka.). Jamky se inkubují při 22 °C s ELAM-Rg nebo CĎ8-Rg v množství 1 /xg/ml 1 hodinu, promyjí se PBS a inkubují se s radioaktivním jodem o19 značenou kozí proti-lidskou IgG protilátkou (DuPont/NEN, Boston, Ma.) další 1 hodinu. Po promytí se navázání značené protilátky změří počítačem gamaimpulsů. Výsledky, které jsou uvedeny na obrázku 9,jsou vyjádřeny jako^ střední hodnota ± standardní odchylka čtvero stanovení představujících dva nezávislé pokusy.

Obrázek 9 ukazuje, že ú^-AGP inkubovaný s fukosyltransferasou v přítomnosti GDP-fukosy navázal významně více ELAM-Rg než <2-j_-AGP samotný nebo «j-AGP inkubovaný s enzymem v nepřítomnosti GDP-fukosy..

Fukosylované glykany asialo-<z-AGP nesou koncovou strukturu GalB (1-4 ) - (Fuca-(1-3 ) ) GlcNAcB (1-4 ) Man, zatímco nefukosylované. konce asialoproteinu sestávají z N-acetyllaktosaminové skupiny připojené na manosu buď β(1-4), β(1-2) nebo 0:(1-6) (Fournet a spol.: Biochemistry 17 , 5206 ( 1978).). Na galaktosu tedy nemohou být napojeny ani předem existující sialyl-Le^x determinanty o^-AGP ani žádné potenciální fukosylové adukty na N-acetyglukosaminu. Tyto výsledky spolu s inhibicí vázání ELAM-1 glykany s O-navázaným mucinem ukazují, že samotné sialyl-Le^x seskupení má významnou afinitu na ELAM-1. Zbývá stanovit, jestli kvantitativně silnější ELAM-1 navázání může být podpořeno zbytky sousedícími se sialyl-Le^x determinantami na granulocytech nebo sférickými faktory ovlivňujícími jejich přístupnost.

IL-8 blokuje adhezi myeloidní buňky na ELAM-1: Bylo popsáno, že uvolnění IL-8 z IL-l-^-zpracovaných endotheliálních buněk způsobuje, že granulocyty ztrácejí schopnost vázat se na IL-1 indukované endothelium (Gimbrone a spol.: Science 246, 1601 (1989).). Vliv IL-1 a IL-8 na expresi sialyl-Le^x povrchového antigenu byl stanoven následujícím způsobem. Granulocyty byly inkubovaný s IL-Ιβ (10 ng/ml; Pepro Tech, Rock Hill, NJ. ) nebo IL-8 (25 ng/ml; Pepro Tech, Rock Hill, NJ. ) 20 minut při 37 °C, třikrát promyty a inkubovaný s monoklonální protilátkou na buď CD15 (PM-81), CD65 (VIM2) nebo sialyl-Le^x (CSLEX1) (shora popsaných) v ledu. Výsledky na obrázku 10 jsou uvedeny jako relativní střední intensita fluorescence (MFI) stanovená průtokovou cytometrií, jako procento MFI granulocytů inkubovaných paralelně bez cytokinů. Výsledky představují čtyři pokusy.

X Obrázek 10 ukazuje, že ani IL-12 ani IL-8 nezpůsobuje podstatné snížení exprese sialyl-Le^x buněčného povrchu.

' Při testování schopnosti supernatantů isolovaných z granulocytů vystavených působení IL-8 pro blokování navázání na ELAM-1 se granulocyty (5.10^/ml) inkubují s IL-1 nebo IL-8 (ve shora uvedených koncentracích) i n při 37 ’C. Po odstřeďování se isolují supernatanty. Supernatanty se inkubují s ELAM-Rg potaženými miskami. Po 30 minutách se přidají buňky a navázání se stanoví jak shora uvedeno. Imunoadsorpce se provede se 40 ,«1 Protein-A agarosových kuliček (Sigma, St. Louis, Mo.), na nichž bylo adsorbováno 10 /xg afinitně vyčištěné králičí protimyší IgM, následuje přidání 5 μ! CSLEXl ascites. Kontrolní perličky byly připraveny podobným způsobem, ale nebyly inkubovány s CSLEXl. Tyto perličky byly promyty PBS a inkubovány se supernatanty 1 h při 4 ⁸C. Výsledky j sou._uvedenv__na .obrázku___ll__a- jsou vyjádřeny jako procento buněk navázaných vzhledem k počtu navázaných v přítomnosti supernatantů granulocytů inkubovaných bez cytokinů za stejných podmínek. Uvedená data znamenají střední hodnotu ± standardní odchylku z trojího stanovení ve třech nezávislých pokusech.

Obrázek 11 ukazuje, že supernatanty isolované z kultur granulocytů zpracovaných s IL-8, ale nikoliv s IL-1, blokovaly adhezi buněk HL-60 na imóbilizovaný ELAM-1. Inhibice navázání by mohla být specificky převrácena adsorpci supenatantů s CSLEXl na pevné fázi, nikoliv však s imunoadsorpční matricí samotnou.

Do rozsahu tohoto vynálezu spadají i další uspořádání. Například tento vynález zahrnuje jakoukoliv protilátku se sníženou schopností fixovat komplement a vázat F_c receptor jako důsledek napojených sacharidových postranních řetězců. Jak je shora popsáno, patří sem protilátky užitečné pro jejich imunologickou specifičnost (např. protilátky, např. MY9O4, Todd a spol.: USA patent č. 4 840 793), které kompetitivně inhibují interakci buňka-buňka a také protilátky, které jsou užitečné pouze jako nosiče pro terapeutické sacharidové skupiny. Protože N-navázaná glykanová adični místa jsou dobře známa, =jsou jimi:

asparaqin (N) , X,__serin (S) nebo threonin (T), kde X znamená jakoukoliv skupinu vyjma prolinu, odborník může navrhnout molekulu, která má jakýkoliv počet takových míst a tedy jakýkoliv počet sacharidových postranních řetězců. V sekvenci protilátky jsou zahrnuta glykosylační místa, například in vitro místně řízenou mutagenesí.

Pro jiné účely než je léčení zánětu by se používaly protilátky fixující ne-komplement a vázající ne-F_c receptor. Například protilátka proti GPII^III_a se může použít pro inhibici srážení destiček a je tedy užitečná při léčení infarktu myokardu. Protilátky proteinů, jako je například fibrin nebo jeden z kaskády srážecích proteinů, by byly užitečné pro inhibici tvorby trombů. Obecně může být jakákoliv protilátka (včetně, bez omezení, anti-Mo-1 a anti-CDl4) navržená pro terapeutický účinek nebo taková, o níž je prokázáno, že má terapeutický účinek, zlepšena přidáním sacharidových částí, které maskuji schopnost protilátky fixovat komplement a vázat F_c receptor. Tato vlastnost bude zvláště důležitá například u imunoglobulinových fúzovaných proteinů (například <Z|-AGP-IgGl fúzovaný protein). V tomto případě protein, o který se jedná, je fúzován (například geneticky) na molekulu imunoglobulinu. Zvýší se tak životnost proteinového sera. Jelikož tyto fúzované proteiny mají v pacientovi prodlouženou životnost, je pravděpodobnější, že budou rozpoznávány jako cizí antigeny. To je zvláště užitečné, protože takové proteiny unikají systémům pacienta, které vážou F_c receptor a fixují komplement..

Pro blokování interakcí mezi buňkami nebo proteiny se může využít jakákoliv příslušná molekula nosiče. Obecně jsou výhodnými proteiny, protože mají relativně dlouhou životnost v seru. Jednou skupinou nosných proteinů jsou sérové proteiny, jako je například albumin (např. hovězí sérový albumin nebo lidský šero22 vý albumin), transferin nebo a-2 makroglobulin. Nosné proteiny mohou obsahovat endogenní glykanová adiční místa nebo. místa mohou- býtJ zavedena do· DNA·, sekvence nosného? proteinu * (jak. shora popsáno)? například? místně řízěnow mutagenesÍT* Méně výhodné·: je, jestliže;-nosná molekůlaíznamená/ lipidity? jednom příkladu/se?lipid; -_s'-jednou! nebb'více napojenými sacharidovými/částmi: (napřr ? sialyl-Le^xdeterminanty)' dodává do?cílové-buněčné stěny-(např. stěny endotheliální buňky) jako liposom. Tento liposom může blokovat buněčnou nebo proteinovou interakci nebo může být použit

3ako dodavatel léčiva do příslušného místa působení.

Buněčné adhezní molekuly mohou být vedle ELAM-1 inhibovány připojením příslušné sacharidové rozpoznávací části k molekule nosiče jak je to shora popsáno. Mezi takové buněčné adhezní molekuly mohou patřit, bez omezení, LFA-1, LFA-3, ICAM-1, PADGEM, Mel™ 14, LAM-1 a kadherin, buněčný-CAM nebo N-CAM. Mohou být připojeny další glykany včetně, bez omezení, jakéhokoliv N-navázaného glykanu, O-navázaného glykanu, GMP-140, Leu8 a fosfatidyl-inositol-fosfát-qlykanů. V případech.—kdy—je—znám— g-i-y-ka-nový, adiční signál, může být zaveden do DNA sekvence molekuly organického nosiče jak shora popsáno. V případě, že přesné místo není známo, ale obecná oblast takového adičního místa v některé přirozeně se vyskytující molekule je definována, DNA fragment (ze sekvence kódující přirozeně se vyskytující molekulu), který obsahuje tuto oblast, může být klonován do DNA sekvence žádané molekuly nosiče (např. IgGl- nebo α^-AGP-kodující sekvence).

Příprava molekul nosiče nesoucích sacharidové části se může provádět v buňce, s výhodou v eukaryotické buňce jiné než kvasinka. Zvláště výhodnými hostiteli jsou savčí buňky, například savčí buněčné linie. Tyto buňky obvykle syntetizují molekuly nutného prekursoru a poskytují, nebo mohou být uspořádány tak, aby poskytovaly, enzymy zodpovědné za připojení sacharidu. Pro napojení sialyl-Le^x determinant jsou zvláště vhodnými savčí buněčné linie, jako jsou například CHO a lecll. Sacharidové části se mohou na molekulu nosiče připojit také in vitro, tj. extracelulárně. V jednom z příkladů se <x-(1,3)fukosyltransfera23 sa naváže na pevný nosič (např. na koloně) a molekula žádaného nosiče se nechá projít přes navázaný fukosyltransferasový enzym za podmínek, které usnadňují připojení sialyl-Le^x skuprn na jejich patřičné místo na molekule nosiče.

Claims (33)

1. PATENTOVÉ NÁROKY

   1» Způsob identifikování molekuly, inhibitoru/ která blokuje interakci mezi buňkou nesoucí ELAM-1 a druhou buňkou nebo proteinem, v y z n a č uj. £ cíše tím , že buňka nesoucí ELAM-1 se uvede do kontaktu s molekulou kandidáta inhibitoru a s druhou buňkou nebo proteinem, nechá se vytvořit afinitní komplex mezi buňkou nesoucí ELAM-1 a druhou buňkou nebo proteinem a identifikuje se molekula inhibitoru jako molekula, která snižuje tvorbu uvedeného afinitniho komplexu.
2. 2. Způsob podle bodu 1, vyznačující se tím , že druhá buňka nebo protein nese sialyl-Le^x determinantu.
3. 3 · _ Protilátka pro použit i _při_léč.en£_onemocněn-í,---v—y——značujicí se tím,že se první člen specifického vázajícího se páru naváže na druhý člen specifického vázajícího se páru v pacientovi, uvedená protilátka je specifická na uvedený prvni člen a je kovalentně navázána na sacharidovou část, která interferuje se schopnosti protilátky fixovat komplement a vázat F_c receptor.
4. 4. Protilátka podle bodu 3, vyznačující se tím , že se jako první člen používá protein.
5. 5. Protilátka podle bodu 3, vyznačující se tím , že se jako druhý člen používá protein.
6. 6. Protilátka podle bodu 3, vyznačující se tím , že protilátka je kovalentně navázána na násobné sacharidové části.
7. 7· Protilátka podle bodu 3, vyznačující tím , že se jako sacharidová část používá sialyl-Lex determinanta.
8. 8. Protilátka podle bodu 7, vyznačující se ___________t.._í__m_____r. že sialyl-Le^x determinanta je navázána na atom dusíku.

   í .·
9. 9. Protilátka podle bodu 7, vyznačující se tím , že sialyl-Le^x determinanta je navázána na atom kyslíku.
10. 10. Protilátka podle bodu 3, vyznačující se tím , že protilátka obsahuje jedno nebo více adičních míst glykoproteinu α^-kyseliny N-navázaného glykanu.
11. 11. Organická molekula neobsahující buňky, vyznačující se tím , že je na ni kovalentně navázána sacharidová determinanta specifická pro buněčný adhezní protein.
12. 12. ' Organická molekula neobsahující buňky podle bodu 11, vyznačující se tím , že se jako buněčný adhezní protein používá selektin.
13. 13. Organická molekula neobsahující buňky podle bodu 12, vyznačující se tím , že se jako selektin používá ELAM-1,
14. 14. Organická molekula neobsahující buňky podle bodu 11, vyznačující se tím , že se jako sacharidová determinanta používá sialyl-Le^x.
15. 15. Organická molekula neobsahující buňky podle bodu 14, v y z nač ující se tím , že sialyl-Le^x je navázaný na atom dusíku’.
16. 16. Organická molekula neobsahující buňky podle bodu 14, vyznačující se tím , že sialyl-Lex j_e navázaný na atom kyslíku.
17. 17. Organická molekula neobsahující buňky podle bodu 11, vyznačující se tím , že se jako organická molekula používá protein.
18. 18. Organická molekula neobsahující buňky podle bodu 17, vyznačující se tím , že se jako protein používá glykoprotein «-^-kyseliny.
19. 19. Organická molekula neobsahující buňky podle bodu 11, vyznačující se tím , že obsahuje jedno nebo více adičních míst glykoproteinu α^-kyseliny N-navázaného glykanu.
20. 20. Organická molekula neobsahující buňky podle bodu 17, vyznačující se tím , že se jako protein ___pou.žívá_prot ilátka.---------------------—————- —-----——· — ———-
21. 21. Organická molekula neobsahující buňky podle bodu 20, vyznačující se tím , že se jako protilátka používá IgGl.
22. 22. Organická molekula neobsahující buňky podle bodu 20, vyznačující se tím , že přítomnost sacharidové determinanty interferuje se schopností protilátky fixovat komplement a vázat F_c receptor.
23. 23. Organická molekula neobsahující buňky podle bodu 11, vyznačující se tím , že uvedená organická molekula nese násobné sacharidové determinanty.
24. 24. Farmaceutický prostředek, vyznačující se tím , že obsahuje molekulu podle bodu 11.
25. 25. Vyčištěná nukleová kyselina kódující protilátku, vy27 značující se tím , že obsahuje místa pro připojení sacharidové determinanty, která je specifická pro buněčný adhezní protein.
26. 26. Vektor, vyznačující se tím , že obsahuje nukleovou kyselinu podle bodu 25.
27. 27. Rekombinantní buňka, vyznačující se tím , že obsahuje vektor podle bodu 26.
28. 28.. Způsob přípravy molekuly nosiče, na níž je kovalentně navázán sacharid specifický pro buněčný adhezní protein, vyznačující se tím , že molekula nosiče, se uvede do kontaktu s enzymem umožňujícím napojení na protein sacharidové determinanty.
29. 29. Způsob podle bodu 28, vyznačující se tím , že ke kontaktu dochází v živé buňce.
30. 30. Způsob podle bodu 29, vyznačující se tím , že živou buňkou je eukaryotická buňka.
31. 31. Způsob podle bodu 30, vyznačující se tím , že živou buňkou je savčí buňka.
32. 32. Způsob podle bodu 29, vyznačující se tím , že živóu buňkou je rekombinantní buňka, která obsahuje DNA kódující uvedený enzym.
33. 33. Způsob podle bodu 32, vyznačující se tím, že se jako enzym používá a (1,3)fukosyltransferasa.