DE2357100A1 - Verfahren zur biotechnischen herstellung von l-tryptophan - Google Patents

Verfahren zur biotechnischen herstellung von l-tryptophan

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Description

  • "Verfahren zur biotechnischen Herstellung von L-Tryptophan" Priorität: 16. November 1972, Japan, Nr. 114236/72 Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur biotechnischen Herstellung von L-Tryptophan.
  • L-Tryptophan ist eine für-die Ernährung von zahlreichen Tieren notwendige Aminosäure. Deshalb wird sie beispielsweise als Futtermittelzusatz verwendet.
  • Gemäß der US-PS 2 999 051 läßt sich L-Tryptophan durch ZUchtung eines L-Tryptophans bildenden Mikroorganismus in einem Indol oder Anthranilsäure enthaltenden Nährmedium herstellen.
  • Bei diesem Verfahren ist jedoch der Zusatz einer teuren Tryptophanvorstufe, d.h. Indol oder Anthranilsäure, unerläßlich, so daß das Verfahren wegen seiner hohen Kosten nachteilig ist.
  • Außerdem haben diese Tryptophanvorstufen eine Hemmwirkung auf das Wachstum der Mikroorganismen, so daß sie'nicht in großen Mengen dem Nährmedium zugesetzt werden können, da sonst die Menge des gebildeten Endproduktes deutlich abnimmt.
  • Bei anderen bekannten Verfahren wird eine Mikroorganismenmutante mit einem Histidinbedarf (vgl. US-PS 3 594 279), eine MikroQrganismenmutante mit einer Resistenz gegen 5-Methyltryptophan Patentveröffentlichung (FR-Y2 059 715) bzw. eine Mutante von Brevibacterium flavum Nr. 2247, d.h. Brevibacterium flavum 12-555, die einen Nährstoffbedarf an Phenylalanin und Tyrosin und Resistenz gegenüber 5-Methyltryptophan aufweist (vgl. Nihon Nogei Kagakukai annual Meeting for 1971, Abstract of Tectures, S. 153)gezüchtet. In Patentveröffentlichung der vorgenannten FR-#2 059 715 wird auch ausgeführt, daß die L-Tryptophanbildung von Mikroorganismen, die gegenüber 5-Methyl-DL-tryptophan resistent sind, durch Induktion eines Phenylalanin- und/oder Tyrosinbedarfs oder durch Induktion einer Resistenz gegenüber Phenylalanin-oder Tyrosinanalogen gesteigert Patentveröffentlichung werden kann. In dieser FR- # sind jedoch abgesehen von den Beispielen, die auf Mikroorganismen mit einer Resistenz gegenüber 5-MethyS-Dl-tryptophan und einem Phenylalanin- oder Tyrosinbedarf beschränkt sind, keine spezifischen Mutanten oder Verfahren zur Bildung von Mutanten, die eine Resistenz gegen Phenylalanin-oder Tyrosinanaloge aufweisen, angegeben. Außerdem liegen die bei Züchtung der Mutanten der vorgenannten Literaturstellen erhaltenen L-Tryptophanausbeuten bei etwa 500 mg/Liter, wenn die Züchtung in Kolben durchgeführt wird. Auch wenn die Züchtung großtechnisch unter optimalen Bedingungen durchgeführt wird, betragen die Ausbeuten lediglich 1,9 g/Liter (Nihon Nogei kagakukai Annual Meeting for 1971, Abstract of Lectures S. 153).
  • Diese Ausbeuten sind so nietig, daß es praktisch unmöglich ist, diese Verfahren in großtechnischem Maßstab anzuwenden.
  • Auf gabe der Erfindung ist es daher, ein biotechnisches Verfahren zur Herstellung von L-Tryptophan zu schaffen, das sich in guten Ausbeuten in großtechnischem Naß stab durchfiihren läßt.
  • Es wurde erfindungsgemäß festgestellt, daß L-Tryptophan in großen Mengen gebildet wird, wenn man Mutanten von Corynebacberiwn-glutamicum, die von Phenylalanin und Tyrosin abhängig sind und gegen mindestens ein Tryptophananaloges und mindestens ein Phenylalaninanaloges und/oder Tyrosinanäloges resistent sind, in üblichen Nährmedien und unter hierfür üblichen Bedingungen züchtet.
  • Gegenstand cier Erfindung ist somit: ein Verfahren zur biotechnischen Herstellung von L-Tryptophan in üblichen Nahrmedien unter hierfür üblichen Züchtungsbedingungen, das dadurch gi ennzeichnet ist, daß man als Mikroorganismus Corynebacterium glutamicum ATCC 21842, ATCC 21843, ATCC 21844, ATCC 21845, ATCC 21846, ATCC 21847, ATCC 21848, ATCC 21849, ATCC 21850 und ATCC 21851, verwendet und das in der Gärmaische angereicherte Tryptophan isoliert.
  • Die erfindungsgemäß verwendeten Mutanten leiten sich vom Stamm Corynebacterium glutamicum KY 9456 ATCC 21854 ab.
  • Corynebacterium glutamicum ist ein Synonym für Micrococcus glutamicus (vgl. US-PS 3 00-3 925).
  • Beim erfindungsgemäßen Verfahren wird extracellulares L-Trxpto- phan in großen und bisher nicht erreichten Mengen gebildet.
  • Corynebacterium glutamicum gehört zur Gattung Corynebacterium und wird im allgemeinen durch £olgende Merkmale charakterisiert: gerade bis leicht gekrümmte Stäbchen mit unregelmäßig gefärbten, manchmai körnchenartigen Segmenten; die Zellen zeigen häufig keulenförmige Verdickungen; durch das "Schnappen" der Zellen während der Teilung entstehen gewinkelte oder palisadenförmige Anordnungen von Zellen; unbeweglich mit Ausnahmen unter den pflanzenpathogenen Arten; grampositiv, wobei manchmal junge und manchmal alte Zellen den Farbstoff schnell verlieren; körnchenartige Körper sind gram positiv; im allgemeinen aerob, es existieren jedoch auch mikroaerophile und anaerobe Arten; Katalase-positiv; manche Arten verflüssigen Gelatine, während andere dazu nicht in der Lage sind; manche Arten reduzieren Nitrat zu Nitrit, während andere dazu nicht in der Lage sind; manche Arten bauen Zucker ab, während andere dazu nicht in der Lage sind; beim Abbau von Zuckern tritt sehr selten eine starke Säurebildung auf; manche Arten oxidieren Glucose vollständig zu Co und Wasser, wobei keine sichtbaren Gasmengen auftreten.
  • Corynebacterium glutamicum KY 9456 ATCC 21854 bildet L-Tryptophan und ist von Phenylalanin und von Tyrosin abhängig. Dieser Stamm ist zum Wachstum in einem Minimalmedium mit den nachstehenden Bestandteilen, das mit Phenylalanin und Tyrosin versetzt ist, fähig: 1 Prozent Glucose, 0,1 Prozent (NH4)112P04, 0,02 Prozent KC1, 0,02 Prozent MgS04-7H20, 30 µg/Liter Biotin, 10 mg/Liter Vitamin Bl -hydro- chlorid, 1 Liter einer Lösung von Spurenmetallsalzen (wäßrige Lösung mit 88 mg Na2B407.10H20, 37 mg (NH4)6.Mo7O24.4H2O, 72 mg MnC12.4H20, 970 mg FeCl3.6H-20, 8,8 mg ZnSO4.7H20 und 2b mg CuS04.5H20 pro 1 Liter) und 2 Prozent Agar.
  • Jedoch wird das Wachstum dieses Stammes gehemmt, wenn dem Nährmedium zusätzlich ein Tryptophan-, Phenylalanin- oder Tyrosinanaloges zugegeben wird.
  • Die im erfindungsgemäßen Verfahren verwendeten Mutanten können in einem Phenylalanin und Tyrosin enthaltenden Nährmedium wachsen, wenn dieses mindestens ein Tryptophananaloges und mindestens eine Phenylalanin- oder Tyrosinanaloges enthält. Beispiele für Tryptophananaloge sind 4-Methyltryptophan, 5-Methyltryptophan, 6-Methyltryptophan, 7-Azatryptophan, 5-Fluortryptophan, 6-Fluortryptophan,-Tryptophanhydroxamat, α-Methyltrpytophan und Indolacrylessigsäure. Beispiele für Phenylalanin- oder Tyrosinanaloge sind 2-Fluorphenylalanin, 3-Fluorphenylalanin, 4-Fluorphenylalanin, 2-Methylphenylalanin, 3-Methylphenylalanin, 4-Methylphenylalanin, 2-Hydroxyphenylalanin, 3-Hydroxyphenylalanin, 2-Aminophenylalanin, 3-Aminophenylalanin, 4-Aminophenylalanin, 2-Nitrophenylalanin, 4-Nitrophenylalanin, ß-2-Thienylalanin, ß-3-Thienylalanin, 2-Indolalanin, 1-Naphthalinalanin, 2-Naphthalinalanin, 2-Pyridinalanin, 2-Thiazolalanin, 3-Thiazolalanin, Phenylalaninhydroxamat, 3-Aminotyrosin, 3-Fluortyrosin, 3-Hydroxytyrosin, 3-Nitrotyrosin, 5-Hydroxy-2-pyridinalanin, und Tyrosinhydroxamat.
  • Mutanten mit den vorgenannten Eigenschaften (analog-resistente Mutanten) lassen sich nach folgendem Verfahren herstellen: Corynebacterium glutamicum ATCC 13032 wird einer Mutationsbehandlung unterzogen. Dazu können übliche Verfahren zur Induktion von Mutanten verwendet werden, beispielsweise Bestrahlung mit UV-, Röntgen- oder Co60 γ-Strahlen oder Behandlung mit Mutanten induzierenden Chemikalien. Die behandelten Zellen werden aufgrund ihrer Nährstoffbedürfnisse nach einem üblichen Testverfahren ausgewählt. Dazu werden die Zellen auf ein Vollmedium überimpft und gezüchtet. Die gewachsenen Kolonien werden dann sowohl auf das vorgenannte Minimalmedium als auch auf ein durch Zusatz von jeweils 10 mg/Liter Tyrosin und Phenylalanin zu diesem Minimalmedium hergestelltes Medium überimpft und weiter gezüchtet. Anschließend werden die Mutanten sowie der Ausgangsstamm, die zum Wachstum auf dem letztgenannten Medium fähig sind, aber auf dem erstgenannten Medium nicht wachsen können, ausgewählt.
  • Es sei darauf hingewiesen, daß von Tyrosin und Phenylalanin abhängige Mutanten nicht nur durch das vorgenannte Mutationsverfahren, sondern auch durch ein zweistufiges Mutationsverfahren erhalten werden können Dabei wird während der ersten Stufe eine durch eine Mutationsbehandlung induzierte Mutante, die entweder einen Tyrosin- oder Phenylalaninbedarf aufweist, ausgewählt. Bei der zweiten Stufe wird diese ausgewählte Mutante einer weiteren Mutationsbehandlung unterzogen, um Mutanten herzustellen, die einen gleichzeitigen Tyrosin- und Phenylalaninbedarf aufweisen. Bei diesem zweistufigen Mutationsverfahren wird in der ersten Stufe eine Mutante mit einem Tyrosin- oder Phenylalaninbedarf nach dem vorgenannten Replikationsverfahren unter Verwendung des vorgenannten Minimalmediums und eines durch Zusatz von Tyrosin-oder Phenylalanin zum Minimalmedium hergestellten Mediums ausgewählt.
  • Nach diesem Verfahren wird der genannte Mutantenstamm Corynebacterium glutamicum KY 9456 ATCC 21854 erhalten. Das-Wachstum diesen Mutante wird in einem Nährmedium, das ein Tryptophananaes logvist, in relati-v geringer Konzentratnon, zusammen mit einem Tyrosinanalogen und/oder einem Phenylanalinanalogen in einer Konzentration von mindestens den nachstehend genannten Konzentrationen gehemmt. Die minimale Hemmkonzentration dieser wachstumshemmenden Verbindungen ist von Verbindung-zu Verbindung stark unterschiedlich. Außerdem hängt die minimale Hemmkonzentration einiger dieser Analogenverbindungen von der Art des Mikroorganismus ab. In Tabelle I ist die minimale Hemmkonzentration für typische Tryptophan-, Tyrosin- -und Phenylalaninanaloge für den Stamm Corynebacterium glutamicum KY 9456 ATCC 21854 angegeben.
  • Tabelle I Analoge Verbindungen Minimale Hemmkonzentration, DL-4-Methyltryptophan 500 DL- 5-Methyltryptophan 500 DL-5-Fluortryptophan 500 DL-6-Flubrtryptophan 3000 L-Tryptophan-hydroxamat 500 DL-4-Flourphenylalanin 25 DL-3-Fluorphenylalüanin 50 DL-2-Fluorphenylalanin 50 DL-ß-2-Thienylalanin 600 DL-Phenylalanin-hydroxamat 400 L-3-Aminotyrosin 4000 DL-Tyrosin-hydroxamat 600 DL-4-Aminophenylalanin 3000 Die minimalen, Hemmkonzentrationen der vorgenannten analogen Verbindungen werden folgendermaßen hestimmt. Corvnebacterium glutamicum KY 9456, ATCC 21854 wird über Nacht auf einem Bouillon-Agar-Schrägröhrchen gezüchtet. Die dahei erhaltenen Zellen werden in einer isotonischen Natriumchloridlösung suspendiert. Ein Teil der erhaltenen Suspension mit 106 bis 107 Zellen wird gleichmässig über eine mit einem der vorgenannten analogen Verbindungen und jeweils 10 Xg/ml L-Tyrosin und L-Phenylalanin angereicherten Minimal-Agar-Nährboden, der sich in einer Petrischale von 85 mm Durchmesser befindet, gesprüht und 3 bis 4 Tage bei 300C gezüchtet. Der Hemmgrad wird auf Grund der Beobachtungen des Wachstums auf dem Nährmedium bestimmt.
  • Gegen analoge Verbindungen resistente mutanten werden folgendermassen festgestellt. Die mutierten Zellen von Corynebacterium glutamicum KY 9456 ATCC 21854 werden auf einem minimal-Agar-Nährboden ausgebreitet, der die vorgenannten analogen Verbindungen in Konzentrationen enthält, die mindestens den vorgenannten.
  • minimalen Hemmkonzentrationen entsprechen. Die darauf gewachsenen Zellen werden ausgewählt. Zur Gewinnung der gegen analoge Verbindungen resistenten Mutanten dient eine spontane Mutation oder das vorgenannte künstliche Mutationsverfahren.
  • Als Medium zum Testen der gegen die genannten analogen Verbindungen resistenten Mutanten wird im allgemeinen ein festes Agarnährmedium verwendet, das:die analogen Verbindungen, eine Kohlenstoff- und Stickstoffquelle, .anorganische Salze, Tyrosin, Phenylalanin, Biotin Vitamin B1 und Spurenmengen von anderen Nährstoffen, die für das Wachstum des Ausgansbakteriums not- wendig sind, enthält. Anstelle von Spurenmengen der Wachstumsfaktoren können auch natürliche Materialien verwendet werden, die diese Nährstoffe bereits enthalten.
  • Die so ausgewählten Mutanten mit einem Bedarf an Tyrosin und Phenylalanin und den Resistenzeigenschaften gegen die genannten analogen Verbindungen werden in einem flfissigen Nährmedium gezüchtet das eine Kohlenstoff- und Stickstoffquelle, anorganische Verbindungen und gegehenenfalls für die Mutanten notwendige Spurenmaterialien enthält. Anschliessend werden die gewünschten Bakterien mit guter Fähigkeit zur Bildung von L-Tryptophan nach einem üblichen Verfahren ausgewählt. Auf diese Weise werden die Stämme Corynebacterium glutamicum ATCC 21842, 21843, 21844, 21845, 21846, 21847, 21848, 21849, 21850 und 21851 erhalten. Diese Mutanten haben die nachstehenden Eigenschaften.
  • Tabelle II Mutante Eigenschaften Corynebacterium glutamicum Trp-1 Phe, tyr, 5MTr, 6FTr, 4FPr ATCC 21842 Trp-2 Phe , tyr-, 5MTr, 6FTr, 4APr ATCC 21843 Trp-3 Phe-, tyr-, 5MTr, 6FTr, ATCC 21844 Tyrhxr Trp-4 Phe , tyr , 4MTr, 6FTr, ATCC 21845 Phehxr Trp-5 Phe-, tyr-, 4MTr, 6FTr, 3ATr ATCC 21846 Trp-6 Phe-, tyr-, 5MTr, 6FTr, ATCC 21847 4AP4, 4FPr Trp-7 Phe-, tyr-, Trphxr, 6FTr, ATCC 21848 4APr, 3FPr Trp-8 Phe-, tyr-, 6FTr, 4APr, 2FPr ATCC 21849 Trp-9 Phe-, tyr-, 5MTr, 6FTr, 4AP4, ATCC 21850 4FPr, Tyrhxr Trp-10 Phe-, tyr-, 4MTr, 6FTr, 4APr ATCC 21851 4FPr, Tyrhxr, Phehxr (*) phe- von Phenylalanin abhängig tyr - ... von Tyrosin abhängig 5MTr : resistent gegen 5-Methyltryptophan 6FTr resistent gegen 6-Fluor-tryptophan 4MTr :: resistent gegen 4-Methyltryptophan Trphxr .-- resistent gegen Tryptophanhydroxamat 4APr : resistent gegen Aminophenylalanin Tyrhxr : resistent gegen Tyrosinhydroxamat Phehexr: resistent gegen Phenylalaninhyroxamat 3ATr : resistent gegen 3-Aminotyrosin 4FPr . resistent gegen 4-Fluorphenylalanin 3Fpr : resistent gegen 3-Fluorphenylalanin 2FPr : resistent gegen 2-Fluorphenylalanin Die Mutanten wurden bei der American Type Culture Collection, Rockville, Maryland, V.St.A., hinterlegt.
  • Die im erfindungsgemäßen Verfahren verwendeten Mutanten von Corynebacterium glutamicum bilden L-Tryptophan in höheren Ausbeuten als andere Stämme von Corynebacterium glutamicum, die in bekannten Verfahren zur Herstellung von L-Tryptophan gezüchtet werden. Insbesondere zeigt ein Vergleich der erfindungsgemäß verwendeten Stämme mit dem in der japanischen Patentveröffentlichung Nr. 14395/63 genannten, von Tyrosin und Phenylalanin abhängigen Stamm von Corynebacterium glutamicum und dem in der US-PS 3 594 279 genannten, von Histidin abhängigen Stamm von Corynebacterium glutamicum, daß die erfindungsgemäß verwendeten Stämme L- Tryptophan in etwa 15- bis 20-fachen Ausbeuten der genannten Kontrollstämme bilden (vgl. Beispiel 1). Aus der Patentveröffentlichung FR-# @ 059 715 geht hervor, daß die durch Züchtung von Corynebacterium acetoglutamicum AJ-3293 (von Phenylalanin und Tyrosin abhängig und gegen 5-Methyltryptophan resistent) erhaltene Ausbeute 0,186 mg/ml und die durch Züchtung von Micrococcus glutamicus AJ-3295 (gegen 5-Methyltryptophan resistent) erhaltene L-Tryptophanausbeute 0,0235 mg/ml beträgt. Aus Nihon Nogei Kagakukai Annual Meeting for 1971, Abstract of Lectures, S. 153, geht hervor, daß die durch Züchtung von Brevibacterium flavum 12 - 555 (von Phenylalanin und Tyrosin abhängig und gegen 5-Methyltryptophan resistent) erreichte L-Tryptophanausbeute 1,9 g/Liter betrags, wenn die Züchtung großtechnisch unter optimalen Bedingungen durchgeführt wird. Demgegenüber erhält man bei Züchtung der er2indungsgemäß venvendeten Stämme von Corynebacterium gwu cumS die von Phenylalanin und Tyrosin abhängig und gs nüber zumindest einem Tryptophananalogen und zumindest einet Tyrosinanalogen und/oder Phenylalaninanalogen L n resistent sind, überraschenderweise höhere L-Tryptophanausbeuten als bei den bekannten Verfahren. Deshalb eignet sich das erfindungsgemäße Verfahren in hervorragender Weise zur-Herstellung von L-Tryptophan in großtechnischem Maßstab.
  • Als Nährmedien zur Züchtung der Mutantenstämme können im- erfindungsgemäßen Verfahren synthetische oder natürliche Nährmedien verwendet werden, die geeignete Kohlenstoff- und Stickstoffquellen, anorganische Salze und Spurenmengen von für die spezifische Mutante notwendigen Nährstoffen enthalten.
  • Alle Kohlenstoff- und Stickstoffquellen, die vom jeweiligen Mikroorganismus verwertet werden können, können verwendet werden. Beispiele für Kohlenstoffquellen sind Kohlenhydrate, wie Glucose, Fructose, Saccharose, Maltose und Mannose, Zuckeralkohole, wie Sorbit und Mannit, Glycerin, Stärke, Stärkehydrolysate und Melassen. Außerdem können verschiedene organische Säuren, wie- Brenztraubensäure, Milchsäure, Essigsäure, Fumarsäure und Gluconsäure, sowie niedere Alkohole, wie Äthanol, verwendet werden. Beispiele für Stickstoffquellen sind Ammoniak, anorganische oder organische Ammoniumverbindungen, wie Ammoniumchlorid, Ammoniumsulfat, Ammoniumcarbonat und Ammoniumacetat, Harnstoff, und stickstoffhaltige organische Verbindungen, wie Pepton, enzymatisch abgebautes Casein, Fleischextrakt, Hefeextrakt, Maisquellwasser, Caseinhydrolysat, Fischmehl oder abgebautes Fischmehl und Schmetterlingspuppenhydrolysat, Beispiele für anorganische Salze sind Kaliumdihydrogenphosphat, Dikaliumhydrogenphosphat, Magnesiumsulfat, Natriumchlorid, Eisen(II ) -sulfat, Mangansulfat und Calciumcarbonat.
  • Selbstverständlich werden dem Nährmedium die für das Wachstum der Mutanten nötigen Vitamine und Aminosäuren zugesetzt. Es ist jedoch nicht nötig, diese Wuchsstoffe dem Nährmedium getrennt zuzusetzen, wenn sie bereits zusammen mit anderen vorgenannten Komponenten in das Nährmedium gelangen. Das heißt, daß bestimmte natürliche Bestandteile bereits die spezifischen Wachstumsfakto--ren in genügendem Maße enthalten.
  • Die Züchtung wird unter aeroben Bedingungen durchgeführt, beispielsweise unter Schütteln oder unter Belüftung und Rühren.
  • Vorzugsweise beträgt die Züchtungstemperatur 20 bis 400C. Der pH-Wert des Nährmediums wird vorzugsweise während der ganzen Züchtung um den Neutralpunkt gehalten, um hohe Ausbeuten zu erreichen. Die vorgenannten Temperatur- und pH-Bedingungen sind jedoch nicht wesentlich, d.h. die Züchtung kann auch unter anderen Bedingungen durchgeführt werden. Im allgemeinen dauert die Züchtung 2 bis 5 Tage, wobei sich eine beträchtliche Menge an L-Tryptophan im Nährmedium anreichert.
  • Nach beendeter Züchtung werden die Zellen entfernt, und L-Tryptophan wird nach bekannten Verfahren, wie Behandlung mit Aktivkohle oder mit einem Ionenaustauscherharz, aus der Gärmaische isoliert.
  • Die Beispiele erläutren die Erfindung.
  • B e i s p i e l 1 In diesem Beispiel wird Corynebacterium glutamicum Trp-1 ATCC 21842 verwendet. Die Mutante wird bei 30°C 24 Stunden in einem Anzuchtnährmedium gezüchtet, das 2 Prozent Glucose, 1 Prozent Pepton, 1 Prozent Hefeextrakt und 0,3 Prozent NaCl enthält. 1 ml der erhaltenen Anzuchtkultur wird als Inoculum für 10 ml eines in einem 250 ml fassenden Erlenmeyerkolben befindlichen Nährmediums der folgenden Zusammensetzung verwendet: Glucose 10 Prozent KH2PO4 0,05 Prozent K2HPO4 0,05 Prozent MgSO4. 7H20 0,025 Prozent (NH4)2S04 2 Prozent enzymatisch abgebautes Casein 0,5 Prozent Biotin 30 pg/Liter CaC03 2 Prozent pH-Wert 7,2 Nach 4-tägigem Züchten bei 300C unter Schütteln erhält man eine L-Tryptophanausbeute von 3,6 mg/ml.
  • 2 Liter dieser Gärmaische werden zur Abtrennung der Mikroorganismenzellen und von CaC03 zentrifugiert. Der erhaltene Uberstand wird der Ionenaustauschchromatographie an einem stark sauren Kationenaustauscherharz (Diaion SK-104, H+-Form, der Firma Mitsubishi Kasei Kogyo K.K.,) unterzogen, um das L-Tryptophan zu adsorbieren. Nach dem Waschen mit Wasser wird -das Harz mit 0,5 n wäßrigem Ammoniak eluiert. Das erhaltene Eluat wird eingedampft. Dabei erhält man rohe.L-Tryptophankristalle. Die rohen Kristalle werden in einer kleinen Menge heißem 50prozentigem wäßrigem Äthanol gelöst. Die erhaltene.
  • Lösung wird mit Aktiv kohle entfärbt und abgekühlt. Man erhält 3,5 g kristallines L-Tryptophan.
  • Bei Züchtung des Ausgangsstammes Corynebacterium glutamicum KY 9456, ATCC 21854, der von Tyrosin und Phenylalanin abhängig ist>und bei Züchtung von Corynebacterium glutamicum KY 9104, ATCC 21334, der von Histidin abhängig ist (vgl. US-PS 3 594 279), unter den gleichen Bedingungen betragen die L-Tryptophanausbeuten 0,2 mg/ml bzw. 0,5 mg/ml.
  • Beispiel 2 In diesem Beispiel werden L-tryptophanbildende Mutanten von Corynebacterium glutamicum mit den in TabelleIII angegebenen Eigenschaften verwendet. Die Stämme werden 24 Stunden in dem in Beispiel 1 angegebenen Anzuchtnährmedium gezüchtet. Jeweils 1 ml dieser Anzuchtkulturen wird als Inoculum für 10 ml eines in einem 250 ml fassenden Erlenmeyerkolben befindlichen Nährmediums der folgenden Zusammensetzung verwendet: Rohrzuckermelasse 10 Prozent (als Glucose angegeben) KH2PO4 0,05 Prozent K2HPO4 0,05 Prozent MgSO4.7H2O 0,025 Prozent (NH4) 2S04 2 Prozent Maisquellwasser 1 Prozent CaCO3 2 Prozent pH-Wert 7,2 Man züchtet 4 Tage bei 30°C unter Schütteln. Die Ergebnisse sind in Tabelle iir zusammengestellt.
  • Tabelle III Menge des gebilde-Stamm ten L-Tryptophans, mg/ml C. glutamicum Trp-2 3,4 (ATCC 21843) Trp-3 392 (ATCC 21844) Trp-4 3.3 (ATCC 21845) Trp-5 3,7 (ATCC 21846) Trp-6 7,0 (ATCC 21847) Trp-7 6,2 (ATCC 21848.) Trp-8 6,0 (ATCC 21849) Trp-9 (ATCC 21850) (FERM-P No. 1675) 10,0 Trp-10 (ATCC 21851) (FERM-P No. 1675) 11,5 Beispiel 3 Corynebacterium glutamicum Trp-I0, ATCC 21851 wird 24 Stunden in einem Anzuchtnährmedium gezüchtet. Dieses Anzuchtnährmedium enthält 7 Prozent Rohrzuckermelasse (angegeben als Glucose), 0,3 Prozent Maisquellwasser, 0,1 Prozent KH2P04, 0,1 Prozent K2HP04, 0,05 Prozent MgS04.7H20 und 0,9 Prozent Sojabohnenpreßkuchenhydrolysat (erhalten durch Zersetzung von Sojabohnenpreßkuchen mit 6 n Schwefelsäure und Neutralisation des Zersetzungsproduktes mit wäßrigem Ammoniak; angegeben als Sojabohnenpreßkuchen). 300 ml der Anzuchtkultur werden dann als Inoculum für 3 Liter eines in einem 5 Liter fassenden Glasfermenter befindlichen Nährmediums der folgenden Zusammensetzung verwendet: Rohrzuckermelasse (angegeben als Glucose) 15 Prozent Maisquellwasser 0,1 Prozent KH2P04 O,1 Prozent K2HP0Z; 0,1 Prozent MgS04.7H20 0,05 Prozent Sojabohnenpreßkuchenhydrolysat (flussig; angegeben als Sojabohnenpreßkuchen) 0,9 Prozent pH-Wert 7,2 Die Züchtung wird 72 Stunden bei 300C und einer Belüftungsge-(600 U/Min.) schwindigkeit von 3 Liter/Minute unter Rühren/durchgeführt. Es werden 16,8 mg/ml L-Tryptophan gebildet.

Claims (1)

  1. P a t e n t a n s p r u c h
    Verfahren zur biotechnischen Herstellung von L-Tryptophan in üblichen Nährmedien unter hierfür üblichen Züchtungsbedingungen, d a d u r c h g e k e n n z e i c h n e t , daß man als Mikro-Organismus Corynebacterium glutamicum ATCC 21842, ATCC 21843, ATCC 21844, ATCC 21845, ATCC 21846, ATCC 21847, ATCC 21848, ATCC 21849, ATCC 21850 und ATCC 21851 verwendet und das in der Gärmaische angereicherte Tryptophan isoliert.
DE19732357100 1972-11-16 1973-11-15 Verfahren zur biotechnischen Herstellung von L-Tryptophan Expired DE2357100C3 (de)

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