DE2903315A1

DE2903315A1 - Verfahren zur fermentativen herstellung von l-prolin

Info

Publication number: DE2903315A1
Application number: DE19792903315
Authority: DE
Inventors: Hajimu Morioka; Shigeru Nakamori; Fumihiro Yoshinaga
Original assignee: Ajinomoto Co Inc
Current assignee: Ajinomoto Co Inc
Priority date: 1978-02-01
Filing date: 1979-01-29
Publication date: 1979-08-02
Also published as: DE2903315C2; US4224409A; JPS5722319B2; FR2416264A1; NL7900770A; JPS54105293A; FR2416264B1

Description

DEA-13 217 - 3 -

BESCHREIBUNG

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Herstellung von L-Prolin durch Fermentation.

Bisher waren als L-Prolin bildende Mikroorganismen Mutanten mit Isoleucin- oder Arginin-Bedarf des Genus Brevibacterium oder Corynebacterium (JA-AS 11751/1968), eine gegen SuIfaguanidin resistente Mutante mit Isoleuc^n-Bedarf des Genus Brevibacterium oder Corynebacterium (JA-AS 4014/1976) und eine Mutante mit Histidin-und Methionin-Bedarf des Genus Bacillus oder Escherichia bekannt (JA-AS 1198/1969).

Der Erfindung liegt die Aufgabe zugrunde, neue Mutanten zur Verfügung zu stellen, die mit ausgezeichneter Wirksamkeit zur Produktion von L-Prolin befähigt sind. Erfindungsgemäß wurde nun festgestellt, daß diese Aufgabe mit Hilfe von Mutanten des Genus Brevibacterium, Corynebacterium oder Microbacterium gelöst werden kann, die resistent gegen DL-3,4-Dehydroprolin sind.

Gegenstand der Erfindung ist ein Verfahren zur fermentativen Herstellung von L-Prolin durch Züchtung eines L-Prolin bildenden Mikroorganismus in einem Kulturmedium und Gewinnung des angereicherten L-Prolins. Das Verfahren ist dadurch, gekennzeichnet, daß man als Mikroorganismus eine Mutante des Genus Brevibacterium oder Corynebacterium verwendet, die resistent gegen DL-3»4-Dehydroprolin (nachstehend auch als DP bezeichnet) ist.

Zu Beispielen für erfindungsgemäß geeignete Mutanten gehören folgende Mikroorganismen :

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Brevibacterium lactofermentum AJ 11225 (FERM-P 4370)

(NRRL B-11421)

Brevibacterium flavum AJ 11226 (FERM-P 4371)

(KRRL B-11422)

Corynebacterium glutamicum AJ 11227 (FERM-P 4372)

(NRRL B-11423)

Microbacterium ammoniaphilum AJ 11228 (FERM-P 4373)

(NRRL B-11424)

Die FERM-P-Nummern sind die Hinterlegungsnummern des Fermantation Research Institute, Agency of Industrial Science and Technology, Ministry of International Trade and Industry, 2-go, 5-ban, 5-chome, Inagehigashi, Chiba-shi, Japan. Die NRRL-Nummern sind die Hinterlegungsnutnmern der Northern Utilization Research and Development Division des US-Department of Agriculture in Peoria, Illinois.

Die vorstehend erwähnten Mutanten leiten sich von den Elternstämmen des Genus Brevibacterium, Corynebacterium oder Microbacterium ab, die für die Bildung von L-Prolin bekannt sind, oder sind abgeleitet von Wildstämmen des Genus Brevibacterium oder Corynebacterium, wie Brevibacterium lactofermentum ATCC 13869, Brevibacterium flavum ATCC 14067, Brevibacterium divaricatum ATCC 14020, Brevibacterium roseum ATCC 13825, Corynebacterium glutamicum (Micorcoccus glutamicus) ATCC 13032, Corynebacterium acetoacidophilum ATCC 13870 oder Corynebacterium acetoglutamicum ATCC 15806.

Das Wachstum der Elternstämme wird durch DP inhibiert, die Inhibierung wird jedoch teilweise oder vollständig durch L-Prolin unterdrückt.

Die Art und Weise, in der die erfindungsgemäßen Mutanten durch

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Induzieren aus den Elternstämmen gebildet werden, ist üblich und bekannt und besteht beispielsweise in der Behandlung der Elternstämme mit N-Methyl-N'-nitro-N-nitrosoguanidin in einer Konzentration von 2000 pg/ml bei 0°C während 20 Minuten.

Wenn die erfindungsgemäßen Mutanten zusätzliche Eigenschaften haben, wie einen zusätzlichen Nährstoffbedarf oder Resistenz gegen andere Wirkstoffe, so bilden sie gewöhnlich höhere Mengen an L-Prolin.

Experimentelle Daten für das relative Wachstum der vorstehend angegebenen Mutanten in einem DP enthaltenden Medium sind in Tabelle 1 gezeigt. (Das relative Wachstum in einem von DP' freien Medium ist als 100 festgelegt).

Das in Tabelle 1 gezeigte relative Wachstum wird in folgender Weise bestimmt : Die Mikroorganismen wurden vorher 24 Stunden lang bei 30⁰C auf Schrägagar mit einem Gehalt an 1,0 g/dl Pepton, 1,0 g/dl Hefeertrakt und 0,5 g/dl NaCl gezüchtet. Jeweils eine Platinöse einer Impfkultur der Zellen auf dem Schrägagar wurde in ein Kulturmedium mit einem pH-Wert von 7,0 übertragen, das 2,0 g/dl Glucose, 1,0 g/dl Ammoniumsulfat, 0,25 g/dl Harnstoff, 0,1 g/dl KH₂PO₄, 0,04 g/dl MgSO₄.7H₂O, 1 mg/dl FeSO₄.7H₂O, 1 mg/dl MnSO₄.7H₉O, 20 pg/dl Thiamin.HCl, 5 pg/dl Biotin und die\ in Tabelle 1 gezeigte Menge an DP enthielt.

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TABELLE 1

Mikroorganismus	relatives Wachstum	0	0,25	0,5	1,0	2,0
Brevibacterium lacto- fermentum 2256 (ATCC 13869) Brevibacterium lacto- fermentum AJ 11225	DP-Konzentration	100 100	47 100	VO VjJ 00 IM	15 88	10 80
Brevibacterium flavum AJ 3416 (FERM-P 1681) Brevibacterium flavum AJ 11226	100 100	42 100	16 73	5 63	5 42
Corynebacterium glu- tamicum ATCC 13032 Corynebacterium glu- tamicum AJ 11227	100 100	53 99	28 99	(X) -A VJI Ul	11 72
Microbacterium ammo- niaphilum ATCC 15354 Microbacterium ammo- niaphilum AJ 11228	100 100	38 99	33 87	13 87	10 75

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Für die Züchtung von Brevibacterium flavum AJ 3416 und AJ 11226, die beide für ihr Wachstum L-Isoleucin benötigen, wurden dem Kulturmedium außerdem 500 ug/ml L-Isoleucin zugesetzt. Nach 24-stündiger Züchtung bei 30⁰C unter Schütteln wurde das Wachstum durch Messung der optischen Dichte des wässrigen Kulturmediums bestimmt. Die dabei erhaltenen Ergebnisse sind in Tabelle 1 gezeigt.

Die erfindungsgemäße Methode, L-Prolin mit Hilfe der vorstehend definierten Mutanten herzustellen, kann nach jeder bekannten, für die fermentative Herstellung von L-Prolin angewendet ten Verfahrensweise durchgeführt werden. Die geeigneten Kulturmedien sind übliche Medien, die Kohlenstoffquellen, Stickstoffquellen, anorganische Salze und erforderlichenfalls andere organische Spurennährstoffe enthalten, wie Vitamine und Aminosäuren.

Als kohlenstoff quelle eignen sich Kohlenhydrate, wie Rübenoder Rohrzuckermelassen, Stärkehydrolysate, organische Säuren, wie Essigsäure, und Alkohole, wie Äthanol. Zu geeigneten Stickstoffquellen gehören beispielsweise gasförmiges Ammoniak, wässriges Ammoniak, Ammoniumsalze und Harnstoff.

Die Züchtung wird unter aeroben Bedingungen bei einer Temperatur im Bereich von 20 bis 40°C durchgeführt. Während der Züchtung wird der pH-Wert des Mediums vorzugsweise bei 6 bis 9 gehalten. Die Züchtung wird während einer Dauer von 20 bis 100 Stunden vorgenommen.

Das in der gebildeten Kulturflüssigkeit angereicherte L-Prolin kann nach Jeder üblichen bekannten Methode gewonnen werden, wie beispielsweise durch Verwendung eines Ionenaustauscherharzes.

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Beispiel 1

20 ml-Anteile eines Kulturmediums mit einem pH-Wert von 7,0, das 10 g/dl Glucose, 0,1 g/dl KH₂PO₄, 0,08 g/dl MgSO₄.7H₃O, 100 ug/dl Thiamin.HCl, 0,1 ml/dl Sojabohnenprotein-Hydrolysat, 6,0 g/dl (NH₄)₂SO₄, 1 mg/dl FeSO₄.7H₂O, 1 mg/dl MnSO₄.4H₂O, 450 ug/1 Biotin und 5,0 g/dl CaCO₃ enthielt, wurden in 500 ml-Schüttelkolben gegeben und durch Erhitzen sterilisiert· Jeder Anteil des Mediums wurde mit Brevibacterium lactofermentum AJ 11225 angeimpft und 72 Stunden lang bei 30°C geschüttelt. In der erhaltenen Kulturflüssigkeit war L-Prolin in einer Menge von 22,5 g/l angereichert.

Beispiel 2

Brevibacterium flavum AJ 3416 (eine L-Isoleucin benötigende Mutante), das nicht resistent gegen DP ist, und Brevibacterium flavum AJ 11226, das resistent gegen DP ist und von AJ 3416 abgeleitet ist, wurden in der in Beispiel· 1 beschriebenen ¥eise in dem Medium gemäß Beispiel 1 gezüchtet, welches zusätzlich 150 mg/1 L-Isoleucin enthielt. Der Stamm AJ 11226 bildete 36,2 g/l L-Prolin, während AJ 3416 32,3 g/l L-Prolin bildete.

Beispiel 3

Corynebacterium glutamicum AJ 11227 wurde in der in Beispiel 1 erläuterten Weise gezüchtet. Dabei wurden 12,0 g/l L-Prolin gebildet.

Beispiel 4

Microbacterium ananoniaphilum AJ 11228 wurde in der in Beispiel 1 beschriebenen Weise gezüchtet, wobei 3,3 g/l L-Prolin gebildet wurden.

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Claims

PAT&NTAN WmLTK SCHIFF ν. FÜNER STREHL SCH ÜBEL-HOPF EBBINGHAUS FINCK MARIAHILFPLATZ 2 & 3, MÖNCHEN 9O POSTADRESSE: POSTFACH 95 O1 6O, D-800O MÜNCHEN 93 29Q3315 PROFESSIONAL REPRESENTATIVES ALSO BEFORE THE EUROPEAN PATENT OFFICE KARL LUDWIG SCHIFF DIPL. CHEM. DR. ALEXANDER V. FÜNER DIPL. ING. PETSR STREHL DIPL. CHEM. DR. URSULA SCHÜBEL-HOPF DIPL. ING. DIETER EBBINGHAUS DR. ING. DIETER FINCK TELEFON CO89) 48 2O 54 TELEX S-23 56S AURO D TELEGRAMME AUROMARCPAT MÜNCHEN AJINOMOTO CO., INC. DEA-13 217 29. Januar 1979 Verfahren zur fermentativen Herstellung von L-Prolin PATENTANSPRÜCHE

1. Verfahren zur fermentativen Herstellung von L-Prolin durch Züchtung eines L-Prolin bildenden Mikroorganismus in einem Kulturmedium und Gewinnung des angereicherten Prolins, dadurch gekennzeichnet , daß man als Mikroorganismus eine gegen DL-3,4-Dehydroprolin resistente Mutante des Genus Brevibacterium, Corynebacterium oder Microbacterium verwendet.

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2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß man als Mikroorganismus eine Mutante von Brevibacterium lactofermentum, Brevibacterium flavum, Corynebac-, terium glutamicum oder Microbacterium ammoniaphilum verwendet,

3. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß man eine Mutante verwendet, die für ihr Wachstum L-Isoleucin benötigt.

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