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Die Erfinaung betrifft ein Verfahren zur Herstellung von L-Threonin,
insbesonaere durch Fermentation. Speziell betrifft die Erfinaung ein Verfahren zur
herstellung von L-Threonin durch Fermentation mit Mikroorganismen in einem Nährmedium,
das Diaminopimelinsäure enthält.
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Es ist bekannt, dass L-Threonin als sogenannte essentielle Aminosaure
für die Ernährung von Mensch und Tier von Bedeutung ist. Serienprotein enthält nur
wenig L-Threonin; @aher ist L-Threonin als Ergänzungsaminosäure zur Verbesserung
des Nährwertes von Serienprotein @usserst brauchbar.
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Zur Herstellung von L-Threonin sind bisher synthetische und proteolytische
Verfahren angewendet worden, @@gleich bereits Versuche zu einer fermentativen Herstellung
von L-Threonin unternommen worden sind, waren diese Verfahren hinsichtlich einer
Anwendung im industriellen Maßstab nicht erfolgreich, insbesondere dann nicht, wenn
ein so kostspieliges Ausgangsmaterial wie L-Homoserin als Ausgangsmaterial verwendet
wurde [vgl. USA-Patentschrift 3 099 064; japanische Patentschrift No. 2986/61; und
Sugawara et al.: "Amino Acid and Nucleic Acid", Bd. 10, S. 68 (1964)], oder wenn
die Ausbeute des angereicherten Produktes in der Fermentationsflüssigkeit gering
war (USA-Patentschriften 2 937 121 und 2 937 122).
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Ziel der Erfindung ist daher ein verbessertes Verfahren zur Herstellung
von L-Threonin, mit dem die Nachteile und Mängel der bisherigen Verfahren ausgeschaltet
werden können.
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Ein weiteres Ziel der Erfindung ist ein Verfahren zur Herstellung
von L-Threonin durch Fermentation, welches auf wirksame und relativ einfache Art
und Weise durchgeführt werden kann.
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Ein weiteres Ziel der Erfindung ist ein Verfahren zur Herstellung
von
L-Threonin durch @ermentation, welches vorteilhaft im industriellen Maßstab bei
niedrigen Kosten und unter Erzielung hoher Produktaus@euten durchgef@hrt werden
kann.
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Ein weiteres Ziel der Erfindung ist die Produktion von L-Threonin.
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Diese und weitere Ziele und Vorteile der vorliegenden Erfindung gehen
für den Fachmann aus der Beschreibung und den Ansprüchen hervor.
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Im Rahmen der vorliegenden Erfindung wurden ausgedehnte Untersuchungen
uber die Produktion von Aminos@uren durch Fermentationen, bei denen L-Aminosäuren
allgemein produziert werden, durchgefuhrt. Als Ergeonis wurde gefunden, dass wesentliche
Mengen an L-Threonin in einer Fermentationsflussigkeit produziert und angereichert
werden können, wenn man die Zuchtung mit speziellen Mikroorganismen in einem Nahrmedium
unter aeroben Bedingungen durchführt, wobei das L-Threonin ein Stoffwechselprodukt
der Mikroorganismen ist.
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Erfindungsgemass werden Mikroorganismen verwendet, die zu den Gattungen
Aerobacter, Serratia, Arthrobacter und Bacillus gehören. Die erfindungsgemass angewendeten
speziellen Mikroorganismenstämme sind solche, die mindestens Diaminopimelinsaure
fur ihr Wachstum @enötigen. Es bestehen zwei Möglichkeiten hinsichtlich dieser Diaminopimelinsäure-Bedurftigkeitseigens@@aft,
d.h. im einen Falle wird @as Bedurfnis nur durch Diaminopimelinsaure befriedigt,
im anderen Falle entweder durch biaminopimelinsäure oder Lysin. Stämme mit solchen
Eigenschaften können vom Fachmann leicht durch Anwendung moderner mikrobiologischer
Arbeitsweisen auf Mikroorganismen der open genannten Gattun@en erhalten werden,
so z.B. durch k@nstliche Mutationen erzeugende behandlungen, wie z.B. UV-@estrah@un@,
Gammapestrahlung, @ehandlung mit
chemischen Mitteln und dgl. oder
durch Penicillin-Selektion.
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In der Technik sind Mikroorganismen bekannt, die imstande sind, Aminosäuren,
wie z.ü. Glutaminsäure, Alanin usw. in einer ermentationsflüssikeit zu produzieren.
Die von solchen Mikroorganismen produzierte Menge an L-Threonin ist jedoch sehr
gering, im allgemeinen liegt sie bei nur 200 µg/ ml oder niedriger. Die Ausbeute
einer speziellen Aminoshure kann jedoch merklich erhöht werden, wenn mutante Mikroorganismen
mit speziellen Nährstoffbedürfnissen verwendet werden. Im Falle der vorliegenden
Erfindung erheilt man mit Mikroorganismen, die für ihr Wachstum nur die @@lichen
Amin@sauren @enötigen, kein zufriedenstellendes Erge@nis, soweit es die Produktion
von L-Threonin anbetrifft. Jedoch können Stämme, die von jeder der open genannten
Gattungen a@stammen, und die für ihr Wachstum Diaminopimelinsäure benötigen, wesentliche
Mengen an L-Threonin in uer Berrnentationsflussigkeit produzieren.
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Es ist selbstverständlich möglich, erfindungsgemäss auch Diaminopimelin-bedurftige
Stämme aus einer der open genannten Gattungen zu verwenden, die neben Diaminopimelinsaure
gleichzeitig weitere Nahrstoffbedurfnisse aufwei@en. Die @iaminopimelinsäure-Bedurftigkeitseigenschaft
wird naturlich durch Diaminopimelinsäure sel@st pefriedigt. In einigen Fällen kann
das Bedürfnis auch durch Lysin befriedigt werden, und jeder dieser Nährstoffe ist
dann erfindungsgemäss zufriedenstellen anzuwenden.
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Entweder ein natürliches oder ein synthetisches Nährmedium ist erfindungsgemass
geeignet, solange es die für das Wachstum des verwendeten Stammes notwendigen N@hrstoffe
enthält.
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Solche Nährstoffe sind in der Technik bekannt und umfassen Substanzen,
wie eine @ohlenstoffquelle, eine Stickstoffquelle anorganische Verbindun@en und
dgl., die von dem verwendeten
@ikroorganismus in geeigneten Mengen
ausgenutzt werden. So @@nnen als Kohlenstoffquelle z.B. Kohlenhydrate, wie Glucose,
Fructose, Maltose, Sucrose, Stärke, Stärkehydrolysate, Melassen, usw., oder jede
andere geeignete Kohlenstoffquelle, wie organische @auren, z.B. Essigsäure oder
@ilchsaure, oder Kohlenwasserstoffe, wie n-Paraffine, Rohöle, Kerosin, und dgl.,
verwendet werden. Diese Substanzen können einzeln oder im Gemisch zweier oder mehrerer
verwendet werden. @ls Stickstoffquelle können verschiedene Arten von anorganischen
oder organischen Salzen oder Verbindungen verwendet werden, z.B.
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Harnstoff, Ammoniak oder Amm@niumsalze, wie z.B. Ammoniumchlorid,
Ammoniumsulfat, Ammoniumnitrat, Ammoniumacetat, @@@oaiumphosphat, usw., oder natürliche
stickstoffhaltige Substanzen, wie Maisquellflüssigkeit, Hefeextrakt, Fleischextrakt,
Pepton, Fischmehl, Bouillon, Caseinhydrolysate, Casaminosaure, Fischpressäfte, Reiskleieextrakt
usw.. Auch diese Stoffe kön@en einzeln oder als Gemisch von zweien oder mehreren
verwendet werden. Anorganische Su@, tanzen, die zu dem Medium @inzugege@en werden
können, sind z.B. Magnesium-Sulfat, Natriumphosphat, Kaliumdihydrogenphosphat, Kaliummono-@@arogenphospnat,
Eisensulfat, Manganchlorid, Calciumchlorid, Natriumchlorid, Zinksulfat, usw. .
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Dar@@erhinaus mussen bei Verwendung von mikroorganismenst@mmen mit
speziellen Nahrstoffbedurfnissen Substanzen zu dem Z@@@tungsmedium hinzugegeben
werden, die diese Bedürfnisse befriedigen. Dazu genören z.B. Stoffe wie verschiedene
Aminos@uren, Vitamine, Biotin und dgl..
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Das erfindungsgemä@s verwendete Züchtungsmedium muss im Anfang@stadium
entweder Diaminopimelins ture oder Lysin oder eine Substanz, die diese Stoffe aufweist,
enthalten. Dieser Zus@tzstoff kann jedoch in verschiedenen Konzentrationen angewendet
werden, wobei eine Konzentration von etwa 10 mg/l bis zu etwa 30@ mg/l an entweder
Diaminopimellnsäure oder Lysin im allgemeinen
bevorzugt wird.
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Die Fermentation oder Z@chtung des Mikroorganismus wird unter aeroben
Bedingungen, wie z.B. aeroben Schüttein der Kultur oder durch Rühren und Bel@ften
einer Su@merskultur, bei einer Temperatur von z.B. 20 bis 40°C und einem p@-Wert
von z.B.
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etwa 4,0 bis 9,5 durchgefuhrt.
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Nach etwa 2 bis 4 Tagen der Züchtung unter @iesen @edingungen sind
wesentliche Mengen an L-Threonin in der Fermentationsflussigkeit produziert und
angereichert worden. Nach @oschlu@ der Züchtung kann das L-Threonin aus der kulturflussigkeit
mit Hilfe der üblichen Arbeitsweisen gewonnen werden, z.B.
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durch Behandlung mit einem Ionenaustauscherharz, Extraktion mit Lösungsmitteln,
@dsorption, Ausfällung, Chromatographie oder dgl..
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Die folgenden Beispiele sollen die Erfindung erl@utern, jedoch nicht
begrenzen. Fails nicht anders angege@en, @eziehen sich alle Prozentangaben in den
Beispielen und der gesamten @eschreibung auf das Gewicht pro Liter Wasser. Mikroorganismenstamme,
die @ei der Erfindung mit @esonderm Vorteil anzuwenden sind, werden in den @eispielen
beschrieben.
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Seispiel 1 Bacillus megaterium ATCC 21209 (ein Diaminopimelinsaurebedürftiger
Stamm) wird als Einsaatmikroorganismus verwendet.
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Der Einsaatstamm wird 24 Stunden lang in einem Einsaatkulturmedium
gezuchtet, das 20 g/l Glucose, 10 g/l @epton, 10 g/l Hefeextrakt, 2,5 g/l Na@@ und
50 mg/l Diamino@imelins@ure enthalt. Die erhaltene Eins@atkultur wird in einem von
10 Vol.-% in einen 250 ml-Erlenmeyerkoloen eingeim@@t, der 20 ml eines Fermentationsmediums
der folgenden @usammenetzung (pro @lter Wasser) enthält:
50 g/l
Glucose 14 g/l (NH4)2SO4 1 g/l KH2PO4 0,3 g/l MgSO4.7H2O 5 g/l Maisquellwasser 200
mg/l Diaminopimelinsaure 20 g/l CaCO3 Das Fermentationsmedium wird vor seiner Verwendung
sterilisiert.
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Die Zuchtung wird dann unter aero@em Schuttein der @ultur bei 30°C
96 Stunden lang durchgeführt. Nach Absch@uß der Züchtung petragt die in der Fermentationsflussigkeit
produzierte und angereicherte Menge an L-Threonin 1,8 mg/ml.
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Beispiel 2 Die Diaminopimeiinsäure-bedurftigen Stämme der in Tabelle
1 @ezei@ten Bakterien werden als Einsaatstämme ver@endet. Die Einsa@tstamme werden
jeweils in einem Einsaatmedium gezüchtet, we@caes 20 g/l Glucose, 10 g/l Pepton,
10 g/l @efeextrakt, 2,5 g/l NaCl und 50 mg/l Diaminopimelinsäure enthalt. Die Eins@atmedien
werden jeweils in einem Ver@ lt@is von 10 @@@. -% in gr@@@e Reagensgi@ser eingeimpft,
die je 10 ml eines Fermentationsmediums mit der folgenden Zusammensetzung enthalten:
50
g/l Glucose 14 g/l (NH4)2SO4 1 g/l KH2PO4 0,3 g/l MgSO4.7H2O 5 g/l Maisquellwasser
100 mg/l Diaminopimelinsäure 20 g/l CaCO3 Das Fermentationsmedium wird vor seiner
Verwendung sterilisiert.
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Die Züchtung jedes der Stämme wird dann unter aerobem Schutte@n uei
280C 96 Stunden lang durchgeführt. Nach der Züchtungsdauer von 96 Stunden sind die
in Tabelle 1 gezeigten @engen an L-Threonin von den verschieaenen verwendeten Stämmen
in den jeweiligen Kulturflüssigkeiten angereichert worden.
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Tabelle 1 verwendeter Stamm erhaltene Menge an L-Threonin Aerobacter
aerogenes KY 7064 2,1 mg/ml ATCC 21321 Serratia marcescens ATCC 21212 3,1 Beispiel
3 Arthrobacter paraffineus 43-4 ATCC 21322 (ein Diaminopimelinsäure-bedürftiger
Stamm) wird als Einsaatmikroorganismas verwendet. Dieser Einsaatstamm wird in ein
Einsaatkuiturmedium eingeimpft, das @ % Sorbit, 1 % Fleischextrakt, 1 % Pepton,
0,5 % Hefeextrakt, und 0,3 % NaCL enthält. Die Züchtung wird
24
Stunden lang bei 30°C durchgefuhrt, um eine Einsaatkultur zu erhalten.
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2 ml der erhaltenen Einsaatkultur werden in einen 250 ml-Erlenmeyerkolben
eingeimpft, der 20 ml eines sterilisierten Fermentationsmediums mit der folgenden
Zusammensetzung enthalt: 5 % n-Paraffingemisch (C11-C18) 2 % (NH4)2SO4 0,2 % KH2PO4
0,2 % K2HPO4 0,1 % MgSO4.7H2O 0,001% FeSO4.7H2O 0,001% MnSO4.7H2O 0,001% ZnSO4 5
mg/l Thiamin 0,3 % Hefeextrakt 2 % CaCO3 100 mg/l meso-Diaminopimelinsäure Die Zuchtung
wird dann unter aerobem Schütte@n der kultur bei 30°C 96 Stunden lang durchgeführt.
Als Ergebnis sind in der erhaltenen Fermentationsbruhe 1,3 mg/ml L-Threonin angereichert
worden.
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@eispiel 4 Die Zuchtung wird in dersel@en Weise und unter densel@en
Bedingungen wie in Beispiel 4 dur@ngeführt, mit der A@wandlung, da@@ 5 % @or@it
anstelle des n-Paraffingemisches in dem Fermentationsmedium
angewendet
werden. Nach A@schluß der Zuchtung beträgt die in der Fermentationsflüssigkeit angereicherte
Menge an L-Threonin 0,75 mg/ml.
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Aus dieser Beschreibung der Erfindung geht hervor, dass dieseloe in
vielfacher hinsicht variiert werden karni. Solche Variationen sind keine Abweichungen
vom Grun@gedanken und Geltungsoereich der Erfindung und sollen in den Bereich der
folgenden Patentanspruche fallen.
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-Patentansprac@e-