DE1595862A1

DE1595862A1 - Verfahren zur Herstellung von 5-Fluoruracil-Ribosid und 6-Mercaptopurin-Ribosid

Info

Publication number: DE1595862A1
Application number: DE19661595862
Authority: DE
Inventors: Toshio Komuro; Masanaru Misawa; Kiyoshi Nakayama; Takashi Nara
Original assignee: Kyowa Hakko Kogyo Co Ltd
Current assignee: KH Neochem Co Ltd
Priority date: 1965-07-19
Filing date: 1966-07-19
Publication date: 1970-03-12
Also published as: DE1595862C3; GB1148058A; CA924255A; US3650897A; DE1595862B2

Description

Patentanwälte Patentanmeldung P 15 95 862.0

Dr.-lng. HANS RUSCHKE

Dipl,lng. HEINZ AGULAR^Munc*^en' ^den 2 Ol Juni 1969

B München 80, Pienzenauerstr. 2
Kyowa Hakko Kogyo Co., Ltd_o, Tokyo / Japan

Verfahren zur Herstellung von 5-J!^;liioruracil-Ribosid und 6-MereaptoOurin-Ribosid

Die Eriindung betrifft ein Verfahren, zur HerstelluixP; von b-Pluoruracil-Eibosiu und ö-Mercaptotmrin-Ribosid, insbesondere ein Verfahren ?ur Herstellung vo¹· 5--t'luoruracil-Riuosid und 6-MercaptoOiirin-^ibosid durch Fermentation, bpeziell befaßt sich die Erfindung mit einem Verfahren zur Herstellung von ^-Fluoruracil-RiDosid und 6-Mercaptopurin-Riüosid durch Fermentation in gegenwart bestimmter Microorganismen und Zusätze β

5-])^Aluoruracil-Ribosid und 6-M^rcaptopurin-Ribosid haben die folgenden btrukturformeln:

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Neue Unterlagen (Art Τ\ I Al* 2 Nr. l Satz 3 des Änderung»)»·^ v. 4.9.195Z!

BAD ORIGINAL

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5-i¹luoruracil-RilDOBid

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6-^Tier"cartorurin-Ribosid

Diese Verbindungen sind die üiboside von 5-Fluoruracil und 6-MercaOtOOurin. Di ι let^ter^n Verbindungen fanden Beachtung als Antikrebsmittel (ζ„Β, uSA-Patentschrift 2 721-866 und 2 724 711)» Die erfindungsgemü3 erhältlichen Verbin-^; düngen sind von Bedeutung als Antagonisten des jtfulcleinsäure-StoffWechsels und als Antikrebsmittel„ IZ>B„ k, Lindner et au, Exrerimental U³Il Pesearch, Ergänzun=-sbard 9, S. 485 - 511 (1°63), fiJr 5-Fluoruracil-Kibosid, und britische Patentschrift 936 654; I, Goodman et al., Federation Proceedings, Band 14, S. 219 (1955) für 6-iIercaptopurin-Ribosido)

Ein Ziel der Erfindung ist ein Verfahren zur xiersteilung von 5-Fluoruracil-RiboRid und 6-MercaptOT)urin-Ribosid

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durch Fermentation, das in wirksamer und einfacher Weise durchgeführt werden kann.

Ein weiteres Ziel der Erfindung ist ein Verfahren zur herstellung von 5-Fluoruraeil-Ribosid und 6-Mercaptopur?.n-Ribosid durch Fermentation, das das Produkt in hoher reinheit und guter Ausbeute liefert» Oa s erfindunffsgemäße Verfahren kann in vorteilhafter Weise in technischem Ysßstab bei geringen rosten unter .erzielung hoher Produktausbeuoen durchgeführt werden.

(jemäß der lürfindung wurde gefunden, daß beträchtlich große Mengen 5-P]uoruracil-Riuosid cd^^r> u-L'ercapxoOurin-Ribosid in der FermentationsflüsKigkeit am^Tesa:unelt weraen und aaraus gewonnen v.-erden können, v/eiu. ä?^a ^^rmentaci^r oder Kultivierung mit einem Llicroor, a^isi^us, der dieg^ Veruindungen zu erzeugen vermag, a'^sgef"ii^t '"ird, wie z.B. Bacillus subxjlis, Streptomyces iradise u.dgl., -.vobei ¹^- Pluoruracil oder 6-I.Iercaptorurin je npuh dem gewf'i.soht^^ Produkt zu dem'Kulturmedium zu?;psPt2t "ήτά, ]>iese "u;:aoe kann zu ,ieden: beliebigen Zeit?-ur.iet -/Ehrend der Kultr.vierung vorgenommen werden. AIf '-¹·!*.- ebhiS sft::.:;.⁰"¹1 sich daß i>ukl°^sid ^pm^:i3 aei" pntsirecner.^pn, ä^m Tedium zupes^tzten Base in gr->2en Tleng^r 9n.

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BAD ORIGINAL

"Die allgemeinen KuItivierungsbedingungen entsprechen den üblicherweise für Ferinentationsprozesse verwendeten Bedingungen. Entweder ein synthetisches Kulturmedium oder ein natürliches Nährmedium ist für die Erfindung geeignet, sofern es die wesentlichen Nährstoffe für das Wachstum des verwendeten Stammes enthält. Derartige Nährstoffe sind bekannt, und dazu gehören ötoffe wie z.B· eine Kohlenstoffouelle, eine btickstoffnuelle, anorganische Verbindungen und dergleichen, die von dem verwendeten Microorganismus in entsprechenden Mengen verbraucht werden. Als Kohlenstoff quelle können z.B. Kohlehydrate wie Glucose, Fructose, Maltose, Saccharose, Stärke, Stärkehydrolysate usw. verwendet werden. Selbstverständlich können auch andere Kohlenstoffquellen wie z.B, Glycerin, organische Säuren j Glutarinsäure u.dgl. verwendet werden. Es kann eine einzige Kohlenstoffquelle oder ein Gemisch von zwei oder mehreren eingesetzt v/erden. Als otickstofiquelle können verschiedene Arten anorganischer oder organischer Salze oder Verbindungen wie z.B. Harnstoff or'e^ Ammoniumsalze wie Ammoniumchloriu, AH.moniuinsulfat, Ammoniumnitrat, Ammonium-Phosphat usw. oder natürliche stickstoffhaltige Substanzen wie z.B. MaisouellflüsrigKeit, Kefeextrakt, Fleischextrakt, Per,ton, Fischmehl, Kaseinhydrolysat, Oasaminosäure, lös-

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■ liehe Pisehprodukte, Reiskleieextrakt usw. verwendet werden« Die stickstoffhaltigen Substanzen können wiederum entweder einzeln oder in jvombination von zwei oder mehreren verwendet werden» Zu den anorganischen Verbindungen, die dem Kulturmedium zugesetzt werden können, gehören Salze wie ζ„Β» Magnesiumsulfat, Natriumphosphat, Kaliumd.iliydrogenphosphat, Kaliummonohydrogenphosphat, Eisensulfat und andere Eisensalze, Manganchlorid, Calciumchlorid, sowie andere geeignete Salze von iuagnesium, Zink und dergleicheno

Pie .!fermentation wird unter aeroben Bedingungen z„B_e unter aerobem Schütteln der Kultur oder Rühren einer oubmerskultur mit .belüftung bei einer xemperatur von etwa 20 bis 4O⁰CJ und einem pH-Wert von y,0 bis 9,0 durchgeführt. Nach etwa zwei- bis zehntägiger ^Tfulüivierung haben sich beträchtlich große Mengen des eoeziellen gewünschten Fukleosids - entweder S-i'luoruracil-xiibosid oder 6-Mercaptopurin-Ribosid - je nach der speziellen, dem Kulturmedium zugesetzten Base, in der Kulturflüssigkeit sowie in den ZoI!körpern selbst angesammelt.

Liach Beendii^mg der Kultivierung kann das 5-ailuoruraciliiibosi'.d o^sv ö-^e^captopurin-Ki.Dosid aus der u'ermenta**

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tionsflüösigkeit durch üoiiche ί,Λ ttel wie z_oü_o Ionenauöt aus chhar zbehandlung, ülxtraktxon mit Lösungsmitteln, Ausfällung mit ivietallsalzen, Adsorption und dergleichen gewonnen werden,

Die zuzufügende Menge an 5-ii¹luoruracil- oder 6-Yiercaptopurin-Base liegt zwischen etwa ü,1 bis 10 mg/ml des Kulturmediums _o

Die folgenden Beispiele dienen zur Erläuterung der Erfindung, ohne sie zu begrenzen. "^aITs n^cht and^rars angegeben, beziehen sich die ?&-A.ngaberi auf das gewicht pro Litor wasser.

Bacillus subfcilis ATCC 19062 wird als Tiarfbpkteriun verwendet, Jüieser Stamm wird in eimin Kulturmedium, besteh^rd aus 2?έ Glucose, V/o Pepton, V/c Hefe^xtrakt, Q,25t NaGl und 30 11 g/l Biotin bei 30⁰C -vährend ?i Stunden kultiviert, i)er pH-Wert des Kulturmediums wird auf 7,3 eingestellt, Das erhaltene Impfmedium wird in einer Kenge von 1C VoI,-$ in das Fermentationsmedium folgender Zusammensetzung eingeimpft:

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Glucose
\<fo Hefeextrakt

₂SO₄

0,6$ K

0,6?; MgSO₄c7H₂O

2$ OaCO,

Der pH-Wert des Fermentationsmedjums wird mit 5n Natriumhydroxyd vor der Sterilisierung eingestellt. Dann werden 30 ml Anteile des.Gemisches aus Impfkultur und Fermentationsmedium in einzelne 230 ml konische Glasgefäße gegossen, und sterilisiert.

Tie ivultivierung wird dann unter aerobem Schütteln bei 30⁰C durchgeführt. Nach 68-stündiger Kultivierung wiri 5-Fluoruracil zu der Kulturflüssigkeit zugegeben, um eine Konzentration von 2 mg/ml zu erha] uen. Nach 1 20-sxi;ndiger Kultivierung matten sich 2,5 mg/ml 5-Fluoruracil-liibos id in der Fern-entß.tionsilüssigkf-it angesammelt. Das erhaltene S-Flucruracil-Ejbosid wird durch Chromatographie an ijowex 1 (Handelsname eine? stenc r. 'ar.ionischen Pclystyrol-Austauschiiarzes der ^ow Chemical ^empany (Formie.ttyr)) gewonnen .

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Beispiel 2

Es werden der gleiche Impfstamm, das gleiche Impfmedium und das gleiche lermentationsmedium, wie in Beispiel 1 beschrieben, verwendet, Nach 68-stündiger Kultivierung wird 6-Mercaptopurin anstelle von 5—Fluoruracil zu dem Medium zugefügt, so daß eine Konzentration von 2,0 mg/ml erhalten wird. Nach 120-stündiger Kultivierung haben sich 0,89 mg/ml 6-Mercaptopurin-Ribosid in der Fermentationsflüssigkeit angesammelt. Das erhaltene 6-Mercaptopurin-Ribosid wird aus der Fermentationsflr'ssigkeit durch eine Kombination einer Chromatographie an üowex 1 (Handelsname für das stark anionische Polystyrol-Austauschharz der now Chemical Company (Formiattyp)) und einer Kohleadsorptions-Desorptions-Kethode gewonnen.

Beispiel 5

Als Impfbakterium wird Streptomyces fradiae ATCC 19063 verwendet. Es werden das gleiche Kultur- und ü'ermentationsmedium wie in Beispiel 1 beschrieben verwendet. Nach 68-stündiger Kultivierung wird 6-Mercaptopurin zu der Kulturflüssigkeit in einer solchen kenge zugegeben, daß eine Konzentration von 2,0 mg/ml erhalten wird. Nach 120-stündiger Kultivierung naben sich 0,42 mg/ml 6-Fercaptopurin-Ribosid in der iermentatiorsflüssigkeit angesammelt·

- Patentansprüche 0098 1 1 / 1644 äq^

Claims

. - 9 Patentansprüche

To Permentat ionsverfahren zur .aer st ellung von 5-I¹IuO ruracil-Ribosid oder.6-Mercaptopurin-Ribosid durch Kultivierung eines Mikroorganismus, der diese Verbindung erzeugen kann in einem wässrigen Mahrmedium unter aeroben Bedingungen, dadurch gekennzeichnet> daß man als Base 5-3?luoruracil im Falle der Verstellung von 5-3?luoruraeil-Ribosid und 6-Mercaptopurin im Ji'all der Herstellung von o-Mercaptopurin-Ribosid, dem Nährmedium zusetzte

2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß man die Base dem Medium vor jtüinleitung der Kultivierung zusetzte

3ο verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß man die üase zu dem Medium während der Kultivierung zusetzt.

ο Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß man als mikroorganismus Bacillus subtilis verwendet.

ο Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß

-TO-

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Neue Unterlagen (Art ? & I Abe. 2 Nr. 1 Satz 3 des Anderungsees· v· 4.9.19621

- ίο -

man als Mikroorganismus Streptomyces fradiae verwendet,

β Verfahren zur tieratellung von 5-Fluoruracil-.tiibosia oder ö-Tüercaptopurin-Hibosid, dadurch gekennzeichnet, daß man einen Mikroorganismus, der diese Verbindung erzeugen kann, in einem wässrigen iiährmedium unter aeroben Bedingungen in Gegenwart einer Base, 5-Fluoruracil im Fall der Herstellung von 5-Fluoruracil-Ribosid oder 6—Mercaptopurin im Falle der Herstellung von 6-Mercaptopurin-Ribosid, kultiviert und das erhaltene Produkt aus der lermentationsflüssigkeit abtrennt.

7. Verfahren nach Anscruch 6, dadurch gekennzeichnet, daß man die Kultivierung bei einer Temperatur von etwa 20 bis 40⁰C und einem pH-Wert von etwa 5,0 bis 9,0 durchführt ·

8. Verfahren nach AnsOruch 7, dadurch gekennzeichnet, daß man als Mikroorganismus Bacillus subtilis ATCC 19062 oder Streptomyces fradiae ATCC 19063 verwendet.

9. Verfahren nach Anspruch 8, dadurch gekennzeichnet _t däi man zur Herstellung von 5-Fluoruracil-Ribosid als Base 5-Fluoruracil verwendet·

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10. Verfahren nach Anspruch 8, dadurch gekennzeichnet, daß man zur Herstellung von 6-Mercaptopurin-Ribosid als Base 6-Mercaptopurin verwendet.

11· Verfahren nach Anspruch 7, dadurch gekennzeichnet, daß man die Base in einer !'enge von etwa 0,1 bis 10 mg/ml des Kulturmediums verwendet.

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