DE1442258B - Verfahren zur Herstellung von L-Glutaminsäure - Google Patents
Verfahren zur Herstellung von L-GlutaminsäureInfo
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Description
Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Herstellung von L-Glutaminsäure durch Züchten eines Glutaminsäure
bildenden Mikroorganismus der Art Micrococcus glutamicus.
In letzter Zeit sind in starkem Maße Verfahren zur Herstellung von L-Glutaminsäure durch Fermentation
entwickelt worden. Weiterhin sind diese Verfahren wegen einer starken Zunahme im Verbrauch und den
Anwendungsmöglichkeiten von L-Glutaminsäure in immer größerem Maße industriell durchgeführtworden.
Aus der schweizerischen Patentschrift 36 68 25 ist ein Verfahren zur biotechnischen Herstellung von
L-Glutaminsäure unter Verwendung von Brevibacterium lactofermentus als Mikroorganismus bekannt.
Aus der französischen Patentschrift 1 335 693 ist ein weiteres Verfahren zur biotechnischen Herstellung von
L-Glutaminsäure bekannt, bei dem Microbacterium ammoniaphilum als Mikroorganismus verwendet wird.
Zahlreiche Faktoren, die bei der Herstellung von L-Glutaminsäure durch Fermentation von Bedeutung
sind, sind jedoch zur Zeit noch unbekannt. Im Hinblick auf die Fermentationsbedingungen bei derartigen
Verfahren existieren daher noch zahlreiche Probleme. Die Untersuchung und Auswertung dieser
Faktoren ist daher von großer Bedeutung, wenn man die optimalen Bedingungen bestimmen will, unter
denen sich die L-Glutaminsäure in industriellem Maßstab in hoher Ausbeute herstellen läßt.
Es ist bekannt, daß es bei der Herstellung von L-Glutaminsäure durch Züchten von L-Glutaminsäure
bildenden Mikroorganismen erforderlich ist, dem Kulturmedium die für das Wachstum der Mikroorganismen
wesentlichen bzw. unentbehrlichen und spezifischen Nährstoffe, wie z. B. Vitamine, Aminosäuren
usw., in geringen Mengen zuzusetzen oder ein diese Substanzen enthaltendes Rohmaterial zu dem
eine Kohlenstoffquelle, eine Stickstoffquelle, anorganische Verbindungen u. dgl. enthaltenden Nährmedium
zu geben. Weiterhin ist es bekannt, daß derartige Zusätze die Ausbeute an L-Glutaminsäure bei
der fermentativen Herstellung erhöhen können.
Aus der französischen Patentschrift 1 335 176 ist z. B. ein Verfahren zur biotechnischen Herstellung von
Glutaminsäure bekannt, bei dem Microbacterium ammoniaphilum in einem Nährmedium gezüchtet
wird, das Fettsäureester des Sorbitans enthält, und aus der französischen Patentschrift 1 342 365 ist ein
weiteres Verfahren zur biotechnischen Herstellung von L-Glutaminsäure bekannt, bei dem ein L-Glutaminsäure
erzeugender Mikroorganismus in einem Kulturmedium gezüchtet wird, das eine grenzflächenaktive
Substanz enthält.
Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist ein neues verbessertes Verfahren zur biotechnischen Herstellung
von L-Glutaminsäure.
Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist ein Verfahren zur Herstellung von L-Glutaminsäure
durch Züchten eines Glutaminsäure bildenden Mikroorganismus der Art Micrococcus glutamicus in einem
eine Kohlenstoffquelle, eine Stickstoffquelle, anorganische Salze und zum Wachstum des Mikroorganismus
notwendige Nährstoffe enthaltenden wäßrigen Nährmedium unter aeroben Bedingungen, dadurch
gekennzeichnet, daß man die Fermentation in Gegenwart von 0,01 bis 1,0 Gewichtsprozent eines oder
mehrerer Ester von Propyl-, Isopropyl-, Butyl-, Isobutyl-, Amyl-, fsoamyl-, Hexyl-, Heptyl-, Octyl-,
Nonyl- oder Decylalkohol mit Citronensäure, Bernsteinsäure, Äpfelsäure, Malonsäure, Adipinsäure,
Gluconsäure, Acetylcitronensäure oder Acetyläpfelsäure ausführt.
Bei der Untersuchung der verschiedenen Faktoren, die bei der fermentativen Herstellung von L-Glutaminsäure
mit Hilfe von Mikroorganismen der Art Micrococcus glutamicus von Bedeutung sind, wurde gefunden,
daß in einem Kulturmedium eine größere Menge an L-Glutaminsäure angesammelt wird, wenn man
dem Kulturmedium, das für die das Wachstum der Mikroorganismen wesentlichen bzw. unentbehrlichen
Nährstoffe, wie z. B. eine Kohlenstoffquelle, eine Stickstoffquelle, anorganische Verbindungen u. dgl.
enthält, einen oder mehrere der obengenannten Ester zusetzt.
Die im folgenden beschriebenen Versuche, bei denen L-Glutaminsäure durch Fermentation unter Verwendung
von Micrococcus glutamicus hergestellt wurde, zeigen die Wirkung, die durch den Zusatz der erfindungsgemäß
verwendeten Ester erzielt wird.
Wenn nicht anders angegeben, sind die angegebenen Prozentzahlen Gewichtsprozente.
Versuch 1
Die Versuchsreihe zeigt die Abhängigkeit der erhaltenen Ausbeute an L-Glutaminsäure von der Art und
der Menge von dem Kulturmedium zugesetzten Estern der Bernsteinsäure.
Als Fermentationsbehälter wurde bei sämtlichen Fermentationsversuchen ein 5-Liter-Kolben verwendet.
270 ecm einer Impfflüssigkeit, die Micrococcus glutamicus ATCC Nr. 13032 als L-Glutaminsäure
bildenden Bakterienstamm enthielt, wurden zum Beimpfen eines Kulturmediums verwendet, das 13°/„
eines durch Säurehydrolyse hergestellten Stärkehydrolysats (berechnet als Glucose), 0,1 % Ammoniumhydrogenphosphat,
0,1 °/0 Diammoniumhydrogenphosphat, 0,05 % Magnesiumsulfat, 0,004 °/0 Mangansulfat,
0,002 % Eisen(II)-sulf at, 0,3 °/0 Kaliumsulfat,
0,5 0/0 Harnstoff und 3 μ g/Liter Biotin enthielt. Das auf
diese Weise beimpfte Kulturmedium wird 48 Stunden unter den folgenden Bedingungen gehalten:
Umdrehungsgeschwindigkeit... 600 Umdrehungen
pro Minute
Temperatur 34°C
Belüftungsgeschwindigkeit 3 Liter/Minute
Während des Züchtens wird der pH-Wert mit Hilfe einer 30°/0igen Harnstofflösung bei 7,0 gehalten.
Es werden die folgenden Ergebnisse erhalten:
Es werden die folgenden Ergebnisse erhalten:
| Menge an zugesetztem Ester |
Menge an gebildeter L-Glutamin säure |
|
| (%) | (mg/cem) | |
| (1) Di-n-butylsuccinat | 0,10 | 63,3 |
| Di-n-butylsuccinat | 0,15 | 65,0 |
| Di-n-butylsuccinat | 0,20 | 68,1 |
| kein Zusatz | — | 55,5 |
| (2) Di-n-octylsuccinat | 0,10 | 60,0 |
| Di-n-octylsuccinat | 0,15 | 65,3 |
| Di-n-octylsuccinat | 0,20 | 66,0 |
| kein Zusatz | — | 55,6 |
| (3) Di-n-hexylsuccinat | 0,10 | 68,1 |
| Di-n-hexylsuccinat | 0,15 | 66,6 |
| Di-n-hexylsuccinat | 0,20 | 58,8 |
| kein Zusatz | — | 55,2 |
Versuch 2
Diese Versuchsreihe zeigt den Einfluß von n-Propylestern
verschiedener genannter Säuren.
Die Fermentationsversuche wurden wie bei Versuch 1 durchgeführt. Es wurden die folgenden Ergebnisse
erhalten:
| Zugegebene Estermenge |
Gebildete Menge an L-Glutamin- säure |
|
| (%) | (mg/ccm) | |
| Di-n-propylsuccinat ... | 0,1 0,2 |
61,2 67,0 |
| Di-n-propylmalat ..... | 0,1 0,2 |
60,4 64,4 |
| Di-n-propylmalonat ... | 0,1 0,2 |
63,1 66,9 |
| Di-n-propyladipat | 0,1 0,2 |
62,0 66,8 |
| J Mono-n-propylgluconat | 0,1 0,2 |
64,0 67,1 |
| kein Zusatz | — | 55,5 |
Versuch 3
Die Fermentationsversuche wurden in einem 5-Liter-Kolben durchgeführt.
2730 ecm eines Kulturmediums, das 13 % eines durch Säurehydrolyse hergestellten Stärkehydrolysats
(berechnet als Glucose), 0,1 % Ammoniumhydrogenphosphat, 0,1 °/0 Diammoniumhydrogenphosphat,
0,05 °/0 Magnesiumsulfat, 0,004 % Mangansulfat,
ίο 0,002% Eisen(II)-sulfat, 0,3% Kaliumsulfat, 0,5 %
Harnstoff und 3 μ g/Liter Biotin enthielt, wurde mit 270 ecm einer Impfflüssigkeit beimpft, die Micrococcus
glutamicus ATCC Nr. 13032 als L-Glutaminsäure bildenden Bakterienstamm enthielt. Das Medium wurde
48 Stunden unter den folgenden Bedingungen gehalten:
Drehgeschwindigkeit 600 Umdrehungen
pro Minute
ao Temperatur 34° C
Belüftungsgeschwindigkeit 3 Liter/Minute
Während des Züchtens wurde der pH-Wert mit Hilfe einer 30%igen wäßrigen Harnstofflösung bei
7,0 gehalten.
Es wurden die folgenden Ergebnisse erhalten:
| Zugegebene Estermenge |
Gebilde Menge an L-Glutamin säure |
|
| (%) | (mg/ccm) | |
| (1) Tri-n-butylcitrat ... | 0,05 | 68,2 |
| Tri-n-butylcitrat ... | 0,10 | 68,2 |
| Tri-n-butylcitrat ... | 0,15 | 71,4 |
| Tri-n-butylcitrat ... | 0,20 | 70,0 |
| kein Zusatz | — | 56,0 |
| (2) Di-n-butylcilral | 0,05 | 57,6 |
| Di-n-butylcitrat | 0,10 | 60,0 |
| Di-n-butylcitrat.... | 0,15 | 63,5 |
| Di-n-butylcitrat.... | 0,20 | 63,0 |
| kein Zusatz | — | 55,0 |
| (3) Mono-n-butylcitrat | 0,05 | 61,8 |
| Mono-n-butylcitrat | 0,10 | 62,1 |
| Mono-b-nutylcitrat | 0,15 | 65,0 |
| Mono-n-butylcitrat | 0,20 | 65,2 |
| kein Zusatz | — | 55,6 |
| (4) Tri-n-amylcitrat ... | 0,05 | 56,9 |
| Tri-n-amylcitrat ... | 0,10 | . 58,9 |
| Tri-n-amylcitrat ... | 0,15 | 62,2 |
| Tri-n-amylcitrat ... | 0,20 | 64,3 |
| kein Zusatz | — | 54,8 |
| (5) Tri-n-hexylcitrat ... | 0,05 | 57,8 |
| Tri-n-hexylcitrat ... | 0,10 | 67,3 |
| Tri-n-hexylcitrat ... | 0,15 | 66,4 |
| Tri-n-hexylcitrat ... | 0,20 | 56,9 |
| kein Zusatz | — | 55,0 |
Die Versuche 1, 2 und 3 zeigen, daß die gebildete Menge an L-Glutaminsäure in allen Fällen, in denen
die Fermentation in Gegenwart eines der genannten Ester durchgeführt wurde, bedeutend höher war.
Die' genannten Ester werden dem Fermentationsmedium in geeigneter Weise in Mengen von etwa
0,01 bis 1,0 Gewichtsprozent zugegeben, obgleich dieser Bereich etwas mit der Art des verwendeten
L-Glutaminsäure bildenden Bakterienstammes, der Zusammensetzung des Kulturmediums, der Zuckerkonzentration
und insbesondere der Art des als Zusatz verwendeten Esters variiert. Es liegt auf der Hand,
daß zur Erzielung einer größtmöglichen Bildung an L-Glutaminsäure die Zugabe von optimalen Mengen
5 6
der Ester erforderlich ist, nachdem einmal über die hydrogenphosphat, Magnesiumsulfat, Calciumcarbo-
verschiedenen anzuwendenden Züchtungsbedingungen nat, Mangansulfat usw.
entschieden worden ist. Die im folgenden beschriebenen Vergleichsversuche,
Die bakteriologischen Eigenschaften von Mikro- in denen Micrococcus glutamicus ATCC 13058 sowohl
Organismen der Art Micrococcus glutamicus, wie sie 5 ohne Zusatz als auch unter Zusatz der erfmdungs-
bei den obigen Versuchen verwendet wurden, sind in gemäß verwendeten Ester in den gleichen Nährmedien
der japanischen Patentschrift 243 382 beschrieben unter gleichen Fermentationsbedingungen mit dem
worden. beim Verfahren nach der schweizerischen Patentschrift
Was die Zusammensetzung des Kulturmediums Nr. 36 68 25 verwendeten Brevibacterium lactofermen-
anbetrifft, so kann entweder ein künstliches Kultur- io tus verglichen wird, zeigen die Überlegenheit des er-
medium oder ein Kulturmedium verwendet werden, findungsgemäßen Verfahrens.
das auf natürlichen organischen Substanzen beruht, Das verwendete Kulturmedium hatte die folgende
solange nur das Kulturmedium die für das Wachstum Zusammensetzung:
der verwendeten Mikroorganismen wesentlichen Nähr- Glucose 12 °/
stoffe enthält. Diese Nährstoffe sind wohlbekannt 15 Ammoniumhydrogenphösphät '.'.'.'. 0,1%
und umfassen eine Kohlenstoff quelle, eine Stickstoff- Diammoniumhydrogenphosphat... 0,1 °/0
quelle, anorganische Verbindungen u. dgl., die von Magnesiumsulfat 0,05 %
dem verwendeten Bakterienstamm in geeigneten Μηησϋττίπΐίί^ nnruo/
Mengen verwertet werden. Als Quelle tür Kohlenstoff F;C(wm c.iifst η am οι
.......
. *-,-,
T^t
-Kr
1-löCill 11 J-bUnaL U,UUZ /λ
können beispielsweise Glucose, Saccharose, Mannose, 20 Kaliumsulfat 0 3°/
Gelactose, Fuctose, Maltose, Lactose, Trehalose, Harnstoff 0 5°l°
Cellobiose, Raffinose, Arabit, Sorbit, Inosit, Xylose, Casaminosäure
o'l °/°
Arabinose, Stärkehydrolysatlösung, Rübenmelassen, Biotin 5'5 y/1
Restmelassen (Rummelassen) u. dgl. verwendet werden. Thiamin 2Oo'y/l
Diese Substanzen können entweder einzeln oder in 25
Form von Gemischen aus zwei oder mehr dieser Ester organischer Säuren, wie in der nachstehenden
Substanzen verwendet werden. Als Quelle für Stick- Tabelle angegeben, wurden nur der Kultur von
stoff sind verschiedene anorganische und organische M. glutamicus ATCC 13 058 zugesetzt.
Verbindungen, wie z. B. Ammoniak, Ammonium- 2730 ml des Mediums dieser Zusammensetzung sulfat, Ammoniumchlorid, Ammoniumnitrat, Ammo- 30 wurden in einen 5 Liter fassenden Schüttelfermenter niumcarbonat, Ammoniumacetat usw., Nitrate, Harn- gegeben und unter Druck sterilisiert. Dann wurden stoff oder andere stickstoffhaltige Stoffe, wie Fleisch- 270 ml einer Impfkultur der unten angegebenen extrakt, Hefeextrakt, Maisquellwasser, die getrockne- Stämme, die 12 Stunden in einem 5 % Glucose, 1 °/0 ten, löslichen Rückstände der Alkoholdestillation, Pepton, 0,5 % Fleischextrakt, 0,5% Ammonium-Caseinhydrolysat, Fischmehl, Sojabohnenölmehl, Sei- 35 sulfat, 0,05% Kaliumhydrogenphosphat, 0,05% Didenraupenpuppen, Treber u. dgl. verwendet werden. kaliumhydrogenphosphat, 0,025% Magnesiumsulfat, Auch diese Stoffe können entweder einzeln oder in 0,001% Mangansulfat, 0,001% Eisen(II)-sulfat, 0,5% Form von Gemischen aus zwei oder mehr dieser Harnstoff und 10 y/1 Biotin enthaltenden Medium Stoffe verwendet werden. Weiterhin ist es erforderlich, vorgezüchtet worden waren, zugesetzt. Es wurde zu dem Kulturmedium für das Wachstum der Bak- 40 48 Stunden bei einer Temperatur von 33° C unter terien unentbehrliche bzw. wesentliche Bestandteile zu Rühren (600 UpM) und Belüften (3 Liter/Minute) gegeben, wie z. B. Aminosäuren, wie Asparaginsäure, züchtet. Während der Züchtung wurde der pH-Wert Glutaminsäure, Threonin, Methionin usw., und/oder der Kulturbrühe mit 30%iger Harnstofflösung auf 7,0 Vitamine, wie z. B. Biotin, Thiamin, Cobalamin usw. eingestellt. Die Konzentrationen und die Ausbeute Zu anorganischen Verbindungen, die zu dem Kultur- 45 der nach Abschluß der Fermentation in der Kulturmedium gegeben werden können, gehören unter brühe gebildeten L-Glutaminsäure sind für jeden anderem Kaliumdihydrogenphosphat, Kaliummono- Versuch in der nachfolgenden Tabelle angegeben.
Verbindungen, wie z. B. Ammoniak, Ammonium- 2730 ml des Mediums dieser Zusammensetzung sulfat, Ammoniumchlorid, Ammoniumnitrat, Ammo- 30 wurden in einen 5 Liter fassenden Schüttelfermenter niumcarbonat, Ammoniumacetat usw., Nitrate, Harn- gegeben und unter Druck sterilisiert. Dann wurden stoff oder andere stickstoffhaltige Stoffe, wie Fleisch- 270 ml einer Impfkultur der unten angegebenen extrakt, Hefeextrakt, Maisquellwasser, die getrockne- Stämme, die 12 Stunden in einem 5 % Glucose, 1 °/0 ten, löslichen Rückstände der Alkoholdestillation, Pepton, 0,5 % Fleischextrakt, 0,5% Ammonium-Caseinhydrolysat, Fischmehl, Sojabohnenölmehl, Sei- 35 sulfat, 0,05% Kaliumhydrogenphosphat, 0,05% Didenraupenpuppen, Treber u. dgl. verwendet werden. kaliumhydrogenphosphat, 0,025% Magnesiumsulfat, Auch diese Stoffe können entweder einzeln oder in 0,001% Mangansulfat, 0,001% Eisen(II)-sulfat, 0,5% Form von Gemischen aus zwei oder mehr dieser Harnstoff und 10 y/1 Biotin enthaltenden Medium Stoffe verwendet werden. Weiterhin ist es erforderlich, vorgezüchtet worden waren, zugesetzt. Es wurde zu dem Kulturmedium für das Wachstum der Bak- 40 48 Stunden bei einer Temperatur von 33° C unter terien unentbehrliche bzw. wesentliche Bestandteile zu Rühren (600 UpM) und Belüften (3 Liter/Minute) gegeben, wie z. B. Aminosäuren, wie Asparaginsäure, züchtet. Während der Züchtung wurde der pH-Wert Glutaminsäure, Threonin, Methionin usw., und/oder der Kulturbrühe mit 30%iger Harnstofflösung auf 7,0 Vitamine, wie z. B. Biotin, Thiamin, Cobalamin usw. eingestellt. Die Konzentrationen und die Ausbeute Zu anorganischen Verbindungen, die zu dem Kultur- 45 der nach Abschluß der Fermentation in der Kulturmedium gegeben werden können, gehören unter brühe gebildeten L-Glutaminsäure sind für jeden anderem Kaliumdihydrogenphosphat, Kaliummono- Versuch in der nachfolgenden Tabelle angegeben.
Zugesetzter Ester
| M. glutamicus | 13 032 | Ausbeute | B. lactofermentus | Ausbeute | |
| ATCC | Menge | (7o) | ATCC 13 869 | (7o) | |
| Zugesetzte | Erzeugte | L-Glutaminsäure | 59,2 | Erzeugte Menge | |
| Estermenge | Konzentration | 58,8 | L-Glutaminsäure | ||
| (mg/ml) | 57,5 | Konzentration | |||
| (%) | 67,1 | 57,3 | (mg/ml) | ||
| 0,2 | 66,6 | 56,9 | |||
| 0,15 | 65,2 | 55,8 | |||
| 0,1 | 65,0 | 55,0 | |||
| 0,2 | 64,5 | 55,1 | |||
| 0,2 | 63,2 | 45,1 | 44,5 | ||
| 0,2 | 62,3 | ||||
| 0,2 | 62,5 | ||||
| 0,2 | 51,2 | ||||
| 50,5 |
Tri-n-butylcitrat .. Tri-n-amylcitrat ..
Tri-n-hexylcitrat .. Di-n-butylsuccinat Di-n-butylmalat ..
Di-n-butylmalonat
n-Butyladipat
n-Butylgluconat .. ohne Zusatz
Die folgenden Ausführungsbeispiele erläutern die Erfindung. Die angegebenen Prozentzahlen sind, wenn
nicht anders angegeben Gewichts-Volumprozente.
2730 ecm eines Kulturmediums, das 12% Glucose, 0,1% Ammoniumhydrogenphösphät, 0,1% Diammo-
7 8
niumhydrogenphosphat, 0,05 % Magnesiumsulfat, Beim Einengen von 1 Liter der Fermentations-
0,004% Mangansulfat, 0,002 % Eisen(II)-sulfat, 0,3 % flüssigkeit unter Druck, Entfernen der Bakterienzellen
Kaliumsulfat, 0,5 % Harnstoff, 5,5 μ g/Liter Biotin, nach Behandlung mit Salzsäure und Auskristalli-
0,1 % Caseinaminosäuren, 10 μ g/Liter Thiamin und sierenlasssn bei einem pH-Wert von 3,2 mit Salzsäure
0,1 % Diisobutylsuccinat enthält, werden in einen 5 werden 57,2 g rohe kristalline L-Glutaminsäure er-
5-Liter-Fermentationskolben gegeben und unter Druck halten.
sterilisiert. Sodann werden 270 ecm einer Impffliissig- B e i s d i e 1 3
keit von Micrococcus glutamicus ATCC Nr. 13 032,
keit von Micrococcus glutamicus ATCC Nr. 13 032,
die die durch 12stündige Schüttelkultur in einem Es wird in ähnlicher Weise wie im Beispiel 1 geKulturmedium
erhalten worden ist, das 5% Glucose, io züchtet, jedoch wird ein durch Säurehydrolyse hergs-1%
Caseinhydrolysat, 0,5% Fleischextrakt, 0,5% stelltes Weizenstärkehydrolysat (das 12,1% direkt
Ammoniumsulfat, 0,05% Kaliumhydrogenphosphat, reduzierende Zucker enthält) verwendet. Als Ester
0,05% Dikaliumhydrogenphosphat, 0,025% Magne- wird 0,1% Di-n-hexylsuccinat verwendet. Es wird
siumsulfat, 0,001 % Mangansulfat, 0,001 % Eisen(II)- 40 Stunden gezüchtet.
sulfat, 0,5 % Harnstoff und 10 μ g/Liter Biotin enthält, 15 Bei Beendigung der Fermentation beträgt die in der
zum Beimpfen in den Fermentationskolben gegeben. Fermentationsflüssigkeit enthaltene Menge an L-Glut-
Das Fermentationsmedium wird dann 48 Stunden aminsäure 58,2 mg/ccm, was einer Ausbeute (bezogen
unter den folgenden Bedingungen gehalten: Tempera- auf Zucker) von 45,7% entspricht. Wird zu dem
tür 34° C, Drehgeschwindigkeit 6C0 Umdrehungen pro Medium kein Di-n-hexylsuccinat gegeben, so werden
Minute, Belüftungsgeschwindigkeit 3 Liter/Minute. 20 nur 49,8 mg/ccm L-Glutaminsäure in einer Ausbeute
Der pH-Wert der Fermentationsflüssigkeit wird mit von 39,1 % (bezogen auf Zucker) gebildet,
einer 30%igen wäßrigen Harnstofflösung bei 7,0 ge- Beim Einengen von 1 Liter der Fermentations-
halten. flüssigkeit unter vermindertem Druck, Entfernen der
Nach der Beendigung der Fermentation beträgt die Bakterienzellen nach Behandlung mit Salzsäure und
in der Fermentationsflüssigkeit enthaltene Menge an 25 Auskristallisierenlassen bei pH = 3,2 mit Salzsäure
L-Glutaminsäure 55,5 mg/ccm und die Ausbeute, be- werden 53,4 g rohe kristalline L-Glutaminsäure erzogen
auf Zucker, 49,0%. Wird kein Diisobutylsucci- halten.
nat zugegeben, ansonsten jedoch unter den gleichen B e i s d i e 1 4
Bedingungen wie im vorliegenden Beispiel gearbeitet,
Bedingungen wie im vorliegenden Beispiel gearbeitet,
so werden nur 44,9 mg/ccm L-Glutaminsäure in einer 30 Es wird wie unter Beispiel 1 gearbeitet, doch werden
Ausbeute (bezogen auf Zucker) von 39,7 % gebildet. an Stelle des dort verwendeten Diisobutylsuccinats
Durch Einengen von 1 Liter der Fermentations- 0,2 % Di-n-butylmalat verwendet.
flüssigkeit unter vermindertem Druck, Entfernen der Bei Beendigung der Fermentations haben sich in der
Bakterienzellen nach Behandlung mit Salzsäure und Fermentationsflüssigkeit 69,0 mg/ccm L-Glutaminsäure
Auskristallisierenlassen bei einem pH-Wert von 3,2 35 gebildet, was einer Ausbeute von 46,0 % (bezogen auf
mit Salzsäure werden 44,0 g rohe kristalline L-Gluta- Zucker) entspricht. Wenn ohne Zugabe von Di-n-butyl-
minsäure erhalten. malat gearbeitet wird, erhält man nur 58,5 mg/ccm
. . L-Glutaminsäure in einer Ausbeute (bezogen auf Zuk-
BeisPie12 ker) von 39,0%.
2730 ecm eines Kulturmediums, das ein durch Salz- 4° Beim Einengen von 1 Liter der Fermentationsflüs-
säurehydrolyse hergestelltes Süßkartoffelstärkehydro- sigkeit, Entfernen der Bakterienzellen nach Behand-
lysat (13,5% direkt reduzierende Zucker), 0,1% Am- lung mit Salzsäure und Auskristallisierenlassen bei
moniumhydrogenphosphat, 0,1 % Diammoniumhy- pH = 3,2 mit Salzsäure werden 56,5 g rohe kristalline
drogenphosphat, 0,05% Magnesiumsulfat, 0,004% L-Glutaminsäure erhalten.
Mangansulfat, 0,3% Kaliumsulfat, 10 μ g/Liter Biotin 45 R .
und 0,2 % Diisoamylsuccinat enthält, werden in einen Beispiel 5
5-Liter-Fermentationskolben gegeben und unter Druck Es wird wie unter Beispiel 1 bearbeitet, jedoch unter
sterilisiert. Verwendung von 0,1 % Di-n-butylmalonat an Stelle
Das Kulturmedium wird mit 270 ecm einer Impf- von Diisobutylsuccinat.
flüssigkeit von Micrococcus glutamicus ATCC 50 Nach Beendigung der Fermentation beträgt die in
Nr. 13032 beimpft. Das auf diese Weise beimpfte der Fermentationsflüssigkeit enthaltene Menge an
Fermentationsmedium wird 48 Stunden unter den L-Glutaminsäure 65,5 mg/ccm und die Ausbeute (befolgenden
Bedingungen gehalten: Temperatur 34°C, zogen auf Zucker) 46,8%. Wenn kein Di-n-butyl-Drehgeschwindigkeit
550 Umdrehungen pro Minute, malonat verwendet wird, werden nur 57,5 mg/ccm Belüftungsgeschwindigkeit 3 Liter/Minute. Der pH- 55 L-Glutaminsäure in einer Ausbeute von 41,1% (be-Wert
der Fermentationsflüssigkeit wird mit Hilfe einer zogen auf Zucker) erhalten.
15%igen wäßrigen Ammoniaklösung bei 7,0 gehalten. Beim Einengen von 1 Liter der Fermentationsflüs-
Nach 10 Stunden wird das Kaliumsalz von Penicillin G sigkeit, Entfernen der Bakterienzellen nach Behand-
in einer Menge von 5 Einheiten je ecm zu der Kultur lung mit Salzsäure und Auskristallisieren bei einem
gegeben. 60 pH-Wert von 3,2 mit Salzsäure werden 54,0 g rohe
Bei Beendigung der Fermentation beträgt die in der kristalline L-Glutaminsäure erhalten.
Fermentationsflüssigkeit enthaltene Menge an L-GIu- . . . ,
taminsäure 64,5 mg/ccm und die Ausbeute (bezogen eispie
auf Zucker) 47,2%. Wenn das Diisoamylsuccinat Die Fermentation wird wie unter Beispiel 2 durch-
nicht zugegeben, ansonsten jedoch unter den gleichen 65 geführt, jedoch unter Verwendung von 0,1% n-Butyl-
Bedingungen wie im vorliegenden Beispiel gezüchtet adipat an Stelle des dort verwendeten Diisoamylsucci-
wird, erhält man nur 52,5 mg/ccm L-Glutaminsäure in nats.
einer Ausbeute (bezogen auf Zucker) von 38,4%. Bei Beendigung der Fermentation beträgt die in der
Fermentationsflüssigkeit gebildete Menge an L-Glutaminsäure
62,0 mg/ccm und die Ausbeute (bezogen auf Zucker) 41,3 %. Wird ohne Verwendung von
n-ßutyladipat gearbeitet, so erhält man nur 58,0 mg/ ecm L-Glutaminsäure in einer Ausbeute von 38,7 °/„
(bezogen auf Zucker).
Beim Einengen von 1 Liter der Fermentationsflüssigkeit unter vermindertem Druck, Entfernen der
Bakterienzellen nach Behandlung mit Salzsäure und Auskristallisierenlassen bei pH = 3,2 mit Salzsäure
werden 52,5 g rohe kristalline L-Glutaminsäure erhalten.
Die Fermentation wird wie unter Beispiel 2 durchgeführt, jedoch werden an Stelle des dort verwendeten
Diisoamylsuccinats 0,2 °/0 n-Butylgluconat benutzt.
Bei Beendigung der Fermentation beträgt die in der Fermentationsflüssigkeit enthaltene Menge an L-Glutaminsäure
64,5 mg/ccm und die Ausbeute (bezogen auf Zucker) 43,0%. Wird kein n-Butylgluconat zu dem
Medium gegeben, werden nur 57,2 mg/ccm L-Glutaminsäure in einer Ausbeute von 38,1 °/0 (bezogen auf
Zucker) erhalten.
Wenn man 1 Liter der Fermentationsflüssigkeit einengt, die Bakterienzellen nach einer Behandlung mit
Salzsäure entfernt und bei einem pH-Wert von 3,2 mit Salzsäure auskristallisieren läßt, erhält man 53,3 g
rohe kristalline L-Glutaminsäure.
2730 ecm eines Kulturmediums, das 12°/o Glucose, 0,1 % Ammoniumhydrogenphosphat, 0,1 °/0 Diammoniumhydrogenphosphat,
0,05 % Magnesiumsulfat, 0,004 % Mangansulfat, 0,002 °/0 Eisen(II)-sulfat, 0,3 °/0
Kaliumsulfat, 0,5% Harnstoff, 5,5 μ g/Liter Biotin, 10 μ g/Liter Thiamin und 0,1 % Tri-n-amylcitrat enthält,
werden in einen 5-Liter-Fermentationskolben gegeben und unter Druck sterilisiert. Es wird mit
270 ecm einer Impf flüssigkeit von Micrococcus glutamicus ATCC Nr. 13032 angeimpft, die durch 12stündige
Schüttelkultur in einem Kulturmedium, das 5% Glucose, 1% Caseinhydrolysat, 0,5% Fleischextrakt,
0,5% Ammoniumsulfat, 0,05% Kaliumhydrogenphosphat, 0,05 % Dikaliumhydrogenphosphat, 0,025 %
Magnesiumsulfat, 0,001% Mangansulfat; 0,001% Eisen(II)-sulfat, 0,5% Harnstoff und 10 μ g/Liter
Biotin enthält, erhalten worden ist. Das auf diese Weise beimpfte Medium wird 48 Stunden unter den
folgenden Bedingungen gehalten: Temperatur 34°C, Drehgeschwindigkeit 600 Umdrehungen pro Minute,
Belüftungsgeschwindigkeit 3 Liter/Minute. Der pH-Wert der Fermentationsflüssigkeit wird mit Hilfe einer
30%igen Harnstofflösung auf 7,0 eingestellt.
Bei Beendigung der Fermentation beträgt die in der Fermentationsflüssigkeit enthaltene Menge an L-Glutaminsäure
60,4 mg/ccm und der Restzuckergehalt 0,8%. Wird kein Tri-n-amylcitrat zu dem Medium
gegeben, so werden nur 48,2 mg/ccm L-Glutaminsäure gebildet, während der Restzuckergehalt 0,7% beträgt.
Beim Einengen von 1 Liter der Fermentationsflüssigkeit, Entfernen der Bakterienzellen nach Behandlung
mit Salzsäure und Auskristallisierenlassen bei pH = 3,2 mit Salzsäure werden 55,Og rohe kristalline
L-Glutaminsäure erhalten.
2730 ecm eines Kulturmediums, das ein durch Säurehydrolyse
hergestelltes Süßkartoffelstärkehydrolysat (13,5% direkt reduzierende Zucker), 0,1% Ammoniumhydrogenphosphat,
0,1% Diammoniumhydrogenphosphat, 0,05% Magnesiumsulfat, 0,004% Mangansulfat,
0,3% Kaliumsulfat, 10 μ g/Liter Biotin und 0,2% Tri-n-butylacetylcitrat enthält, werden in einen
5-Liter-Fermentationskolben gegeben und unter Druck
ίο sterilisiert. Das Medium wird mit 270 ecm einer Impfflüssigkeit
von Micrococcus glutamicus ATCC Nr. 13032 versetzt. Das Medium wird darin 48 Stunden
unter den folgenden Bedingungen gehalten: Temperatur
340C, Drehgeschwindigkeit 550 Umdrehungen pro Minute, Belüftungsgeschwindigkeit 3 Liter/Minute.
Der pH-Wert der Fermentationsflüssigkeit wird mit Hilfe einer 15%igen wäßrigen Ammoniaklösung auf
7,0 gehalten. Nach 10 Stunden werden 5 Einheiten ecm des Kaliumsalzes von Penicillin G zu der Kultur
gegeben.
Nach Beendigung der Fermentation haben sich in der Fermentationsflüssigkeit 68,7 mg/ccm L-Glutaminsäure
gebildet. Der Restzuckergehalt (direkt reduzierende Zucker) beträgt 0,6%. Wird zu dem Medium
kein Tri-n-butylacetylcitrat gegeben, so werden nur 51,2 mg/ccm L-Glutaminsäure gebildet, und der Restzuckergehalt
beträgt 1,1%.
Beim Einengen von 1 Liter der Fermentationsflüssigkeit unter vermindertem Druck, Entfernen der
Bakterienzellen nach Behandlung mit Salzsäure und Auskristallisierenlassen bei pH = 3,2 mit Salzsäure
erhält man 58,0 g rohe kristalline L-Glutaminsäure.
2730 ecm eines Kulturmediums wie im Beispiel 2, jedoch mit einem durch Säurehydrolyse erhaltenen
Weizenstärkehydrolysat (12,1% direkt reduzierende Zucker) sowie 0,15% Tri-n-hexylcitrat, werden in
einen 5-Liter-Fermentationskolben gegeben und unter Druck sterilisiert. Es wird 40 Stunden in der gleichen
Weise wie im Beispiel 9 gezüchtet.
Bei Beendigung der Fermentation liegt in der Fermentationsflüssigkeit
eine Menge an L-Glutaminsäure von 59,8 mg/ccm vor, und der Restzuckergehalt
beträgt 0,4%. Arbeitet man ohne Zugabe von Trin-hexylcitrat zu dem Medium, so werden nur 50,2 mg/
ecm L-Glutaminsäure gebildet, während der Restzuckergehalt 0,7 % beträgt.
Beim Einengen von 1 Liter der Fermentationsflüssigkeit unter vermindertem Druck, Entfernen der
Bakterienzellen nach Behandlung mit Salzsäure und Auskristallisierenlassen bei pH = 3,2 mit Salzsäure
erhält man 53,1 g rohe kristalline L-Glutaminsäure.
300 ecm des gleichen Kulturmediums wie im Beispiel 9, jedoch mit einem durch Säurehydrolyse erhaltenen
Maisstärkehydrolysat (12,7% direkt reduzierende Zucker) und 0,10% Octylcitrat, werden in
einen 5-Liter-Fermentationskolben gegeben und unter Druck sterilisiert. Es wird 42 Stunden unter den gleichen
Bedingungen wie im Beispiel 2 gezüchtet.
Bei Beendigung der Fermentation sind in der Fermentationsflüssigkeit
59,3 mg/ccm L-Glutaminsäure enthalten, und der Restzuckergehalt beträgt 0,9%. Wird zu dem Medium kein Tri-n-octylcitrat gegeben,
so werden nur 49,1 mg/ccm L-Glutaminsäure gebildet, während der Restzuckergehalt 1% beträgt.
Beim Einengen von 1 Liter der Fermentationsflüssigkeit
unter vermindertem Druck, Entfernen der Bakterienzellen nach Behandlung mit Salzsäure und
Auskristallisierenlassen bei pH = 3,2 mit Salzsäure erhält man 53,7 g rohe kristalline L-Glutaminsäure.
Die Fermentation wird in der gleichen Weise wie im Beispiel 8, jedoch unter Zugabe von 0,15% Din-propylcitrat
durchgeführt. Die am Ende der Fermentation in der Fermentationsflüssigkeit enthaltene
Menge an L-Glutaminsäure beträgt 59,5 mg/ccm und der Restzuckergehalt 0,8 °/0. Wird kein Di-n-propylcitrat
zugegeben, so werden nur 49,0 mg/ccm L-Glutaminsäure erhalten, und der Restzuckergehalt beträgt
0,7%.
Das Verfahren von Beispiel 8 wird unter Verwendung von 0,10 % Mono-n-octylcitrat an Stelle des dort verwendeten
Esters wiederholt. Am Ende der Fermentation beträgt die in der Fermentationsflüssigkeit enthaltene
Menge an L-Glutaminsäure 60,8 mg/ccm und der Restzuckergehalt 0,7 %. Wird zu dem Medium
kein Mono-n-octylcitrat gegeben, so werden nur 48,5 mg/ccm L-Glutaminsäure gebildet, und der Restzuckergehalt
beträgt 0,7%.
Bei dem erfindungsgemäßen Verfahren wird bei einer Temperatur von 20 bis 400C und bei einem
pH-Wert des Kulturmediums von 5 bis 9 gezüchtet.
Claims (1)
- Patentanspruch:Verfahren zur Herstellung von L-Glutaminsäure durch Züchten eines Glutaminsäure bildenden Mikroorganismus der Art Micrococcus glutamicus in einem eine Kohlenstoffquelle, Stickstoffquelle, anorganische Salze und zum Wachstum des Mikroorganismus notwendige Nährstoffe enthaltenden wäßrigen Nährmedium unter aeroben Bedingungen, dadurch gekennzeichnet, daß man die Fermentation in Gegenwart von 0,01 bis 1,0 Gewichtsprozent eines oder mehrerer Ester von Propyl-, Isopropyl-, Butyl-, Isobutyl-, Amyl-, Isoamyl-, Hexyl-, Heptyl-, Octyl-, Nonyl- oder Decylalkohol mit Citronensäure, Bernsteinsäure, Apfelsäure, Malonsäure, Adipinsäure, GIuconsäure, Acetylcitronensäure oder Acetyläpfelsäure ausführt.
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