DE1792403A1 - Verfahren zur Herstellung von L-Lysin - Google Patents

Description

Die vorliegende Erfindung betrifft ein Verfahren zur Herstellung von Ir-Lysin, insbesondere durch Fermentation-, Speziell betrifft die Erfindung ein Verfahren zur Herstellung von L-Iysin. durch Fermentation unter Verwen-rdung von Mikroorganismen mit neuartigen Nährstoffbedürf— nissen·

Gemäß dem bisherigen Stand der Technik gehörten zu . den Mikroorganismen, die zur Produktion von L-Lysin verwendet wurden,, verschiedene Mutanten, die Homoserin, Threonin. + M&thionini, Threonin + Cystathionin oder Threonin: + Hom0cystein für ihr Wachstum benötigen (UBA-Patentschrift 2 979 439)·· Das Plus-Zeichen (+), wie es in der vorliegenden Beschreibung verwendet wird, zeigt diejenigen Fälle an, in denen Mikroorganismen gleichzeitig zwei oder mehrere Arten von Aminosäuren für ihr Wachstum benötigen·- '

Einer der Nachteile der obigen Fermentationsverfah-ren nach dem Stand der Technik bestand darin, daß die Verwendung der genannten mutanten Mikroorganismen eine unzu- , friedenstellend niedrige Ausbeute an L-Lysin lieferte, insbesondere mit Bezug auf die als Ausgangsmaterial in dem Nährmedium verwendete Zuckermenge. Darüber hinaus sind diese Verfahren duroh das verwendete Rohmaterial relativ kostspielig in der Durchführung, wefl. verhältnismäßig große

■ p ' * Mengen an Aminosäuren oder Nährsubstanzen, die

enthalten, zu dem ZUchtungsmediumi hinzugegeben werden

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mußten, um ein wirksames Fermentationsverfahren zu erhalten.

Ziel der vorliegenden Erfindung ist ein verbessertes Verfahren zur Herstellung von L-Lysin durch Fermentation, welches die Nachteile und Mangel der bisherigen Verfahren ausschaltet.

Ein weiteres Ziel der Erfindung ist ein Verfahren zur Herstellung von L-Lysin durch Fermentation, welches auf wirksame und relativ einfache Art und Weise durchgeführt werden kann.

Ein weiteres Ziel der Erfindung ist ein Verfahren zur Herstellung von L-Lysin durch Fermentation, welches vorteilhaft im industriellen Maßstab bei niedrigen Kosten unter Erzielung von hohen Produktausbeuten durchgeführt v/erden kann»

Ein weiteres Ziel der Erfindung ist die Produktion von L-Ly s in*.

Biese und weitere Ziele und Vorteile der vorliegenden Erfindung gehen für den Fachmann aus der folgenden Beschreibung und den Ansprüchen hervor·

Um ein vorteilhafteres Verfahren zur Herstellung von L-Lysin durch Fermentation im industriellen Maßstab zu erstellen, wurde im Rahmen der vorliegenden Erfindung die Fähigkeit zahlreicher verschiedener mutanter Stämme zur

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Produktion von L-Lysin untersucht,. Insbesondere wurde festgestellt, daß Cornynebacterium glutamioum M-9ol ATCO 13287 und ATCC 14296 außerordentlich gut zur !»roduktion von L-Lysin durch Fermentation geeignet sind (vgl«. USA-Patentschrift 2 979 439)ο Die mikobiologischen Eigenschaften von Cornynebacterium glutamicum wurden zuerst in der USA-Patentschrift 3 oo3 925 veröffentlicht,;.£&..welcher der Mikroorganismus als Micrococcus glutamiaus identifiziert wurde, und ferner in einer kürzlich durchgeführten Untersuchung von Kinoshita et ale vom mikrobiologischen und taxonomischen Standpunkt aus. Diese Untersuchung wurde in "Amino Acid·", VoI» 2, 42 (196o) und "Recent progress in microbiology¹¹, Vol.· 8„ 334 (1962) veröffentlicht und ergab, daß der Mikroorganismus richtigerweise als Cornynebacterium zu klassifizieren ist. Er wurde als Cornynebacterium glutamicum bezeichnet. Biese Stämme, die die Ausgangsstamme gemäß der Erfindung sind, sind Mutanten mit Nährstoffbedürftigkeitseigenschaften für Homoserin* Threonin + Methionin, Threonin + Cystathioniil· oder Threonin. + Homocystin oder Threonin für ihr Wachstum» Durch Bestrahlung dieser Ausgangsstämme mit UV-Strahlen ergab sich erfindungsgemäß, daß spezielle mutante Stämme erhalten werden, die sowohl die für die Ausgangsstamme beschriebenen Nährstoffbedürfnisse als auch weiterhin eine Nährstoffbedürftigkeit für Leucin, Histidin oder Isoleucin +Valin]

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aufweisen. Diese neuen mutant en Stämme "besitzen sogar eine größere Fähigkeit zur Produzierung von L-Lysin als die ursprünglichen Stämme. Speziell werden die Ausbeute, bezogen auf die Ausgangsmenge an Zucker, und die L-Lysin-Konzentration, in der erhaltenen Kulturflüssigkeit durch Verwendung der neuartigen mutanten Stämme bis zu etwa Io - 25 *f₀ erhöhte

Die neuartigen erfindungsgemäßen mutanten Stämme sind:

Cornynebacterium glutamicum M-9ol-2347 ATCC 21253_r Corny neb act er ium glutamicum M-9ol-2279 A(DCC 21254, Cornynebacterium glutamicum M-9ol—2234 ITCC 21255, Cornynebacterium glutamicum KY 9494 ATCCf 21299 und Cornynebacterium glutamicum KY Ioo92 ATCC 213ooe

In Tabelle 1 sind die Nährstoffbedürfnisse der Ausgangsstämme und der neuartigen erfindungsgemäß angewendeten Stämme zusammengefaßt.

Tci.belie I Mikroorganismus

Cornynebacterium glutamicum M-90I (Ausgangsstamm)ATCC 13287

Nährstoff-Bedürfnisse

CHomoserin) oder

(Threonin + Methionin) oder

(Threonin + Cystathionin) oder
(Threonin + Homocystein)

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Tabelle (Fortsetzung)

Mikroorganismus

Oornynebacterium glutamicum M-90I-N0·. 2547 ATCC 21253

Cornynebacterium glutamicum

M-y01-No₀ 2279 ATÖc 21254

Cornynebacterium glutamicum M-90I-N0. 2234 ATCC 21255 Nährstoff-Bedürfniese (Homoserin + Leucin oder

(Threonin. + , _T , .^ Homocystein)+ ^Leucin

^Homoserin + Histidin oder

(Homoserin) +

(Threonin +
Methionin) ⁺.

(Threonin. +
CystatMonin)

(Threonin +
Homocystein)

Isoleucin + ¥alin oder ■

Isoleucin + Valin oder

+ Isoleucin ■+ Valin oder

+ Isoleucin + Valin

Cornynebacterium glutamicum ATCC Ϊ4296 (Ausgangsstamm)

Cornynebaoterium glutamicum KY 9494 ATCC 2129?

Cornynebacterium glutamicum KY 10092 ATCC 21300 Threonin

(Threonin) + Histidin

(Threonin) + Leucin

Selbstverständlich sind die Mutanten mit den obigen Iafarstoffbedürfnissen Mikroorganismen, die nicht in Gegenwart

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nur der von den Ausgangsstammen benötigten Aminosäuren wachsen, sondern die nur "bei Zugabe der Aminosäuren, die ihren speziellen Nährstoffbedürftigkeitseigenschaften entsprechen, zu dem Medium wachsen. Diese Mutanten sind neuartige, bisher unbekannte L-Lysin-produzierende Mikroorganismen· Bei der Durchführung einer L-Lysin-Fermentation unter Verwendung der erfindungsgemäßen Mutanten sind die Zusammensetzung des Grundmediums und die Züchtungsbedingungen praktisch dieselben, wie sie überlicherweise angewendet werden und z.B. in der USA-Patentschrift 2 979 439 beschrieben sind. So ist entweder ein natürliches oder ein synthetisches Nährmedium geeignet, solange es die für das Wachstum des speziellen verwendeten Mikroorganismus notwendigen Nährstoffe enthält· Solche Nährstoffe sind in der Technik bekannt und umfassen Substanzen wie eine Kohlenstoff quelle, eine Stickstoffquelle, anorganische Verbindungen und dgl. in angemessenen Mengen, die von dem verwendeten Mikroorganismus ausgenutzt werden. So kommen als Kohlenstoff quellen beispielsweise Kohlenhydrate, wie Glucose, Fructose, Maltose, Sucrose, Stärke, Stärkehydrokysate, Melassen usw. oder jene andere geeignete Kohlenstoffquelle, wie Glycerin, Sorbit, ferner organische Säuren wie Essig- ■ säure usw. in Frage. Biese Substanzen können entweder einzeln oder in Gemischen zweier oder mehrerer verwendet

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werden« Als Stickstoffquelle können verschiedene Arten von anorganischen oder organischen Salzen oder Verbindungen verwendet werden, wie z.B. Ammoniumchlorid, Ammoniumsulfat, Ammoniumnitrat, Ammoniumacetat. Ammoniumphosphat usw., oder natürliche stickstoffhaltige Substanzen, wie Maisquellflüssigkeit, Hefeextrakt, Fleischextrakt, Pepton, Fischmehl, BouLlon, Oaseinhydrolysate, ßasaminosäure, Fischpreßsafte, Reiskleieextrakt uew., Auch diese Stoffe können einzeln oder in Gemischen zweier oder mehrerer verwendet werden. Anorganische Verbindungen, die zu dem Züchtungsmedium hinzugegeben werden können, sind z.B. Magnesiumsulfat, Natriumphosphat, Kaliumdihydrogenphosphat, Kaliummonohydrogenphosphat, Eisensulfat, Mangansulfat, Manganchlorid, Calciumchlorid, Oalciumcarbonat, Natriumchlorid usw.. Wenn jedoch Rohmaterialien, wie z.B. Abfallmelassen, verwendet werden, die größere Mengen anorganischer stoffe enthalten, kann die Fermentation ohne Zugabe zusätzlicher anorganischer Substanzen zu dem Medium durchgeführt werden.

Darüber hinaus ist es für die Produktion von L-Iiysin natürlich notwendig, die entsprechenden, für das Wachstum der Mikroorganismen benötigten Aminosäuren als Nährsubstanzen zu dem Züchtungsmedium hinzuzufügen. Man kann die Aminosäuren per se oder gemischte, verschiedene Arten von Aminosäuren enthaltende Lösungen, die aus natürlichen

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Substanzen gewonnen werden, verwenden. Vorzugsweise werden jedoch im allgemeinen verschiedene Proteinhydrolysate, wie z.Bo. "Mieki" (Handelsname für ein Gluten- oder Soja— bohnenmehlhydrolysat, aus welchem die Glutaminsäure entfernt worden ist), mikrobielle Hydrolysate, Sojabohnenkuchenhydrolysate, Weizenglutenkuchenhydrolysate und dgl. verwendet. Wie in Tabelle 2 gezeigt wird, sind die benötigten Mengen erheblich geringer als diejenigen, die bei Verwendung der Ausgangsstamme notwendig sind. Dies ist eines der hervorragenden Merkmale der Erfindung.

Nährsubstanz

zugegebene
Menge (g./dl.)

Tabelle 2

produzierte Menge an L-Lysin (mg./ml.)

M-9ol

M-901- M-9ol- M-9ol-

(Ausgangs- No»2234 No»2279 No»2347

stamm) ATCG ATCC ATCC

ATCC 21255 21254 21253 13287

Getrock	2	• 0	37	.4	48.6	50.9	48.6
netes
Weizen-	3	• 0	4o	►3	52.1	49.5	52.1
gluten-	4	• 0	44	.1	49-9	47.9	49.9
kuchen-	5	.0	43	.4	48.7	47.5	48.7
hydroly-
s at
	1	-5	38	.5	51.4	49.2	5ο·4
Mieki	2	.0	42	.4	48.1	46.0	45.2

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- Io -

Anmerkung Ii Zusammensetzung des Grundmediumst 18 g/dl

Melassen (als Glucose) und 4 g/dl Ammonium— sulfat

Anmerkung 2» Züchtungsverfahren: 3 1 dee Züchtungamediums werden in einen 5 l-Jarfermenter eingebracht und sterilisiert. Die oben angegebenen Stämme werden eingeimpft und bei einem pH-Wert von 7,o, einer Temperatur von 3o°0, einer Belüftung mit 3 l/min und einer Etihrgeschwindigkeit von 4oo rpm 7o Stunden lang gezüchtet·

Die Züchtung wird unter aeroben Bedingungen, wie a.B. aerobem Schütteln der Kultur oder durch Hühren einer Submerskultur, bei einer Temperatur von etwa 24 bis 37°G, vorzugsweise etwa 3o°0, und einem pEHÄfert von etwa 5-8,5, vorzugsweise etwa 7,ο durchgeführt. Fach 2 bis 5 Tagen der Züchtung unter diesen Bedingungen werden wesentliche Mengen an Ir-Lysin in der erhaltenen KuIturflüssigkeit angereichert gefunden.

Nach Abschluß der Fermentation kann das Ir-lysin von der Züchtungsflüssigkeit mit den üblichen Mitteln, wie z.B· durch Behandlung mit einem Ionenaustauscherharz, Extraktion mit lösungsmitteln, Ausfällung mit Metallsalzen, Chromatographie oder dgl·, abgetrennt werden. Bin wesentliches Merkmal der Erfindung besteht darin, daß fast kein Ir-Valin

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- li -

als Nebenprodukt entsteht, womit einea^ der Probleme ausgeschaltet wird, welche bei Verwendung der Ausgangsstamme zur Produzierung von L-Lysin auftreten. Dieser Vorteil zeigt sich besonders bei Verwendung der mutanten Stämme Cornynebacterium glutamicum ATCC 21255 (einer Mutante, die Isoleucin + VaIin-bedürftig ist) und Cornynebacterium glutamicum ATCC 21253 (einer Leucin-bedürftigen Mutante). Das Reinigungsverfahren wird auf diese V/eise wesentlich vereinfacht .

Die folgenden Beispiele sollen die Erfindung erläutern, jedoch nicht beschränken. Palis nicht anders angegeben, beziehen sich die Prozentangaben auf das Gewicht pro Liter Wasser.

Beispiel 1

Eine Einsaatkulturflüssigkeit wird hergestellt, indem man 2oo ml eines Züchtungsmediums, enthaltend 5 g/dl Abfallmelassen (als Glucose), o,o5 g/dl Kaliumhydrogenphosphat, ^o»o5 g/dl Dikaliumhydrogenphosphat, o,3 g/dl Harnstoff und 4 d/dl Mieki, in einen 5oo ml-Erlenmeyerkolben gibt. Cornynebacterium glutamicum M-9ol~2234 ATCC 21255 wird in den Kolben eingeimpft. Die Züchtung wird dann unter aerobem Schütteln 24 Stunden lang bei 3o°C durchgeführt.

3 1 eines Züchtungsmediums, enthaltend 18 g/dl Abfall-

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melassen (als Glucose), 4 g/dl Ammoniumsulfat und 1,5 d/gl Mieki, werden in einen 5 1-Jarfermenter eingebracht und sterilisiert. Anschließend werden 5oo ml der obigen Einsaatkulturflüssigkeit in das Fermentationsmedium eingeimpft und die Züchtung begonnen. Während der Züchtung werden eine Belüftung mit etwa 3 l/min und eine Rührgeschwindigkeit von etwa 4oo rpm sowie eine Temperatur von 3o C aufrechterhalten. Der pH-Y/ert wird mit Ammoniakwasser auf etwa 6,8 —7,ο eingestellt. Nach 7o Stunden der Züchtung beträgt die Konzentration an L-Lysin in der erhaltenen Kulturflüssigkeit 48,7 mg/ml (als Hydrochlorid) und die Ausbeute, bezogen auf die Zuckermenge, 27»ο $. Die Konzentration des als Nebenprodukt erzeugten L-Valins beträgt weniger als o,3 mg/ml.^Wenn man die Züchtung in derselben Weise, jedoch unter Verwendung des Ausgangsstammes Cornynebacterium glutamicum ATCC 13287 als Kontrollversuch durchführt, betragen die Konzentrationen an produziertem L-Iysin bzw. L-Valin 37,2 mg/ml bzw* 1,8 mg/ml*

Nach Abschluß der Züchtung wird die Kulturflüssigkeit filtriert und mit einem stark sauren Ionenaustauscherharz gemäß den üblichen Arbeitsweisen behandelt. Anschließend wird die Abflußlösung auf einen pH-Wert von 5.ο eingestellt und konzentriert, um die Kristallisierung zu bewirken. ¹AIs Ergebnis werden 12o g rohe Kristalle von

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Ir-Iysinhydro.chlorid erhalten.

Beispiel 2

3 1 eines Züchtungsmediums, enthalten 16 g/dl Sucrose, o,15 g/dl Kalinmhydrogenphaaphat, o,o5 g/dl Dikaliumhydrogenphosphat, 4. g/dl· Ammoniumsulfat, o,o5 g/dl Magnesiumsulfat, o,oo2 g/dl Mangansulfat, o,oo2 g/dl Eisensulfat, 3o /ug/1 Biotin, 12ο· /Ug/ml· Methionin, 3oo /ug/ml Threonin, 5oo xig/ml Leucin und loo Axg/aüL Cystin, werden in einen 5 1-Jarfermenter' eingebracht und sterilisiert· 5oo. ml der Einaaatkulturflüssigkeit von Cornynebacterium glutamieum M-901-2347 ATCO 21253·, die zuvor durch Züchtung in der gleichen Weise wie in Beispiel 1 erhalten worden ist, werden in das Fermentationsmedium eingeimpft ο Die Züchtung wird dann unter denselben Bedingungen wie in Beispiel 1 durchgeführt»

Fach 7o Stunden der Züchtung beträgt die Konzentration an L-Lysin in der erhaltenen Kulturflüssigkeit 54,6 mg/ml (als Hydrochlorid), Die Ausbeute, bezogen auf die Zuckermenge, beträgt 34,2 <fo. Die Menge an Ir-Valin, die als Nebenprodukt in dem Medium produziert worden ist, beträgt weniger*als o,5 mg/ml. Wenn man die Züchtung bei einem Kontröliversuch in derselben Weise wie es oben beschrieben worden ist, jedoch mit der Abwandlung, daß der Ausgangsstamm Oornynebacterium glutamieum ATCC 13287 als

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Mikroorganismus verwendet wird, und daß in dem Ausgangsferment ationsmedium kein Leucin enthalten ist, durchführt, beträgt die erhaltene Konzentration an L-Ly sin 42,1 mg/mlβ 3XLe Menge des beim Kontrollverauob. als Nebenprodukt erzeugten L-Valine beträgt 1,7 mg/kl.

Beispiel 3

Die Züchtung wird in derselben Weise wie in Beispiel 1 durchgeführt, mit der Abwandlung, daß öornynebacterium glutamicum M-9ol-2279 ATOO 21254 ale lineaatstamm verwendet wird. Als Ergebnis wird eine Kulturflüssigkeit erhalten, die 5o,7 mg/ml L-Lysin (als Hydroohlorid) enthält« Die Ausbeute, bezogen auf die in dem Medium verwendete Zuckermenge, beträgt 28,1 #.

Beispiel 4

Die Züchtung wird in derselben Weise wie in Beispiel 1 durchgeführt, mit der Abwandlung, daß öornynebac— terium glutamicum KY 9494 AiDOO 21299 als linsaatstamm verwendet wird. Als Ergebnis wird eine Kulturflüeeigkeit erhalten, die 53»2 mg/ml L-Lysin (als Hydroohlorid) enthält»

Beispiel 5

Die Züchtung wird in derselben Weise wie in Beispiel 1 durchgeführt, mit der Abwandlung, daß öornyneba«- terium glutamieum Κγ Ioo92 ATOO 213oo als Ein&aatetamm verwendet wird. Als Ergebnis wird eine Kulturflüssigkeit

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halten, die 51,6 mg/ml L-Ijysin (als Hydrochlorid) enthält·

Aus dieser Beschreibung der Erfindung geht hervor, daß sie in vielfacher Hinsicht variiert werden kann· Solche Variationen sind nicht als Abweichungen vom Grundgedanken und Geltungsbereich der Erfindung zu werten, sondern alle solchen Modifikationen sollen in den Bereich der folgenden Patentansprüche fallen.

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Claims (1)

1. Patent an Sprüche

   Ια Verfahren zur Herstellung von I-Lysin durch Fermentation, dadurch gekennzeichnet, daß man einen mutanten Stamm von Corny ne.bacterium glutamicum, der für sein Wachstum außer den NährStoffbedürfnissen der Ausgangsstamme ATCC 13287 und ATCC 14296 noch Leucin, Histidin oder Isoleucin und Valin benötigt, unter aeroben Bedingungen in einem wäßrigen Uährmedium züchtet, welches eine für das Wachstum der Mikroorganismen ausreichende Menge an Homoserin, Threonin und Methionin, Threonin und Cystathionin,. Threonin und Homocystein oder Threonin und Leucin, Histidin oder Isoleucin und Valin enthält, daß man L-Lysin in der erhaltenen Kulturflüssigkeit anreichert und daraus gewinnt·

   2, Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß die für das Wachstum benötigten Aminosäuren in dem Medium als Bestandteil eines Proteinhydrolysate^ vorhanden sind·

   3* Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß man die Züchtung bei einer Temperatur von etwa 24 bis 37⁰C und einem pH-Wert von etwa 5 bis 8,5 durchführt.

   4β Verfahren zur Herstellung von L-Lysin durch Fermentation, dadurch gekennzeichnet, daß man einen Mikro-

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   Organismus, der

   Cornynebacterium glutamicum ATCO 21253 Cornynebacterium glutamicum ATCC 21254 Cornynebacterium glutamicum ATCC 21255 oder Cornynebacterium glutamicum ATCC 21299 oder Cornynebacterium glutamicum ATCC 213oo sein kann, unter aeroben Bedingungen in einem wäßrigen Nährmedium züchtet,, welches eine für das Wachstum der Mikroorganismen ausreichende Menge an Homoserin, Threonin und Methionin, Threonin und Cystathionin, Threonin und Homocytein oder Threonin und leucin, Histidin oder Isoleucin und· Valin enthält, daß man Ir-Lysin in der erhaltenen Kulturflüssigkeit anreichert und daraus gewinnt»

   5» Verfahren nach Anspruch 4, dadurch gekennzeichnet, daß die für das Wachstum benötigten Aminosäuren in dem Medium als Bestandteil einer natürlichen Substanz vorhanden sind·

   6.. Verfahren nach Anspruch 5» dadurch gekennzeichnet, daß diese natürliche Substanz ein Proteinhydrolysat ist.

   7· Verfahren nach Anspruch 5» dadurch gekennzeichnet, daß die natürliche Substanz Mieki (wie in der Beschreibung definiert), ein mikrobielles Hydrolysat, ein Sojabohnenkuchenhydrolysat oder ein Weiζenglutenkuchen-

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   hydrolysat ist«,

   8c Verfahren nach Anspruch 4, dadurch gekennzeichnet, daß man die Züchtung bei einer Temperatur von etwa 24 bis 37⁰C und einem pH-Wert von etwa 5 bis 8,5 durchführt O

   Z 847
   Eichh.:P.

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