Verfahren zur Herstellung von Zitronensäure Vorliegende Erfindung bezieht sich auf ein sub- merses vegetatives Fermentationsverfahren zur Her stellung von Zitronensäure aus Kohlenhydrat und Eisen enthaltenden Materialien unter Verwendung eines Kulturmediums, das Kupferionen enthält.
Aus früheren Untersuchungen (u. a. USA-Patent Nr. 2492667) ist hervorgegangen, dass kleine Mengen Eisen im Kohlenhydratmedium die Erzeugung von grossen Mengen eines die Bildung von Zitronensäure hemmenden Zelltypus des fermentierenden Organis mus begünstigt. Es wurde auch gezeigt, dass bei einer konstant gehaltenen Fe+++-Konzentration von etwa 0,0002-0,0008 /0o die unerwünschte Wirkung des Eisens durch die Verwendung von Zn-I-+ vermindert werden kann.
Zweck der Erfindung ist nun die Verminderung der Bildung unproduktiver vegetativer Zellen und die Eliminierung der nachteiligen Wirkung des Eisens auf die Zellen, ohne das Eisen aus dem Kulturmedium entfernen zu müssen.
Das erfindungsgemässe Verfahren zur Herstellung von Zitronensäure durch submerse Fermentation mittels Aspergillus niger eines Kohlehydrat ent haltenden Mediums, das einen für die Zitronensäure produktion an sich ungünstigen Gehalt von 0,2 Teilen oder mehr Eisen pro Million Teile Medium sowie einen für die Zitronensäureproduktion ungünstigen Gehalt an andern Kationen aufweist, ist dadurch ge kennzeichnet,
dass durch Einverleibung von Kupfer ionen abgebenden Verbindungen in der Fermenta- tionsbrühe am Aspergillus niger während der Haupt wachstumsperiode eine Änderung der Zellstruktur und des Metabolismus herbeigeführt wird, welche sich in einer vermehrten Zitronensäurebildung auswirkt.
Unter der Hauptwachstumsperiode des Aspergillus niger wird diejenige Zeit verstanden, in welcher die Mikroorganismen ihr Hauptwachstum entwickeln, was ungefähr in den ersten 50 Stunden nach Inocu- lierung eintritt. Nach dieser Periode ist nur noch ein unbedeutendes Wachstum zu beobachten.
Man hat die Wirkung von Spuren Cu++ auf das allgemeine Sporen- und vegetative Wachstum bei optimalen Zuchtbedingungen, so wie sie bei Ober flächen-Fermentationsmethoden bestehen, eingehend studiert. Sogar unter diesen Umständen war ein be stimmtes Ansprechen der Pilze auf das Kupfer schwie rig zu erreichen. Noch weniger kennt man den Ein fluss des Cu++ auf das Wachstum und den Stoff- wechsel solcher Pilze unter Bedingungen, die ihren natürlichen Verhältnissen fremd sind, wie z.
B. bei submerser Zucht, wobei die normale Zellmorphologie in hohem Grade verändert wird und dadurch bio chemische Reaktionen auf bestimmte Ziele gelenkt werden.
An Hand der Beispiele wird nun der spezielle, dem Eisen entgegenwirkende Einfluss, welcher durch die Verwendung von Kupferionen im Fermentations- substrat hervorgerufen wird, erläutert. Fermentations- bedingungen und Analysenmethoden sind dieselben wie die im USA-Patent Nr. 2492667 beschriebenen. Es wurde dabei eine ausgewählte Aspergillus-niger-Art als Vergleichsbasis zur Bestimmung der Wirkung des Kupfers verwendet. Die typischen oder optimalen Zuchtmerkmale sind die gleichen, wie im oben ge nannten Patent beschrieben.
Man gibt Kupfer vorzugsweise in Form von Kupfersulfat zu, jedoch kann jedes im Kulturmedium lösliche, weder ein giftiges noch ein irgendwie un erwünschtes Anion enthaltende Kupfersalz verwendet werden. Ist die erforderliche Kupfermenge bereits aus früheren Versuchen bekannt, so kann die ganze Menge bereits vor der Inoculierung dem Medium zugesetzt werden. Andernfalls kann das Kupfer in Portionen während der Hauptwachstumsperiode des Aspergillus niger zugesetzt werden, wobei der Bedarf durch die Entwicklung einer fadenähnlichen, nicht säurebildenden Zellstruktur angezeigt wird.
<I>Beispiel 1</I> Nicht kationenfrei gemachter, Asche und Eisen enthaltender Maiszucker wurde für ein die nach folgende Zusammensetzung aufweisendes Gärmedium verwendet, welchem ausserdem die in Tabelle 1 an gegebenen wechselnden Mengen Cu++ und Fe<B>...</B> neben 0,05 /0o Zn++ zugefügt wurden:
Ammoniumcarbonat 0,2% KHZP04 0,014% M9S04 0,1 Kohlenhydrat 12-15% Wasser (kationenfrei) q. s. 4000 cm3 Das Medium wurde mit HZSO4 von Pharma- kopöe-Qualität auf px 2,5-2,65 gestellt, in einem Autoklav bei 0,7 kg/cm2 Überdruck während 10 Mi nuten sterilisiert und in einen Fermentierungszylinder eingeführt.
Die Säuren sind als Zitronensäuremono- hydrat und der umgesetzte Zucker auf die nach der Analysenmethode von Somogyi bestimmte Anfangs konzentration der fermentierbaren Kohlenhydrate berechnet.
EMI0002.0028
<I>Tabelle <SEP> 1</I>
<tb> Versuch <SEP> Asche <SEP> Fe<B>...</B> <SEP> Cu++ <SEP> Säure <SEP> Umwandlung <SEP> Zellmorphologie
<tb> Nr. <SEP> <B>0</B>% <SEP> 0i00 <SEP> 0/00 <SEP> <B>9 <SEP> 0</B>/0
<tb> 1. <SEP> 0,15 <SEP> 0,00091 <SEP> 0,0 <SEP> 0,0 <SEP> 0,0 <SEP> Fadenähnlich, <SEP> nicht <SEP> säurebildende <SEP> Art
<tb> 0,2 <SEP> 400,0 <SEP> 77,0 <SEP> Typisches <SEP> Wachstum; <SEP> dichte <SEP> Anhäufung
<tb> 0,3 <SEP> 307,0 <SEP> 59,0 <SEP> Starker <SEP> Strauchwuchs;
<SEP> dichte <SEP> Anhäufung
<tb> 2. <SEP> 0,19 <SEP> 0,00073 <SEP> 0,1 <SEP> 379,0 <SEP> 73,0 <SEP> Typisches <SEP> Wachstum
<tb> 0,2 <SEP> 412,0 <SEP> 79,2 <SEP> Typisches <SEP> Wachstum
<tb> 3. <SEP> 0,20 <SEP> 0,00036 <SEP> 0,0 <SEP> 0,0 <SEP> 0,0 <SEP> Fadenähnlich, <SEP> keine <SEP> Säurebildung
<tb> 0,1 <SEP> 402,0 <SEP> 77,2 <SEP> Typisches <SEP> Wachstum
<tb> 0,2 <SEP> 385,0 <SEP> 74,2 <SEP> Typisches <SEP> Wachstum
<tb> 4. <SEP> 0,21 <SEP> 0,00055 <SEP> 0,1 <SEP> 423,0 <SEP> 81,5 <SEP> Typisches <SEP> Wachstum
<tb> 0,2 <SEP> 382,0 <SEP> 73,5 <SEP> Geringer <SEP> Strauchwuchs
<tb> 5. <SEP> 0,25 <SEP> 0,00291 <SEP> 0,1 <SEP> 400,0 <SEP> 77,0 <SEP> Typisches <SEP> Wachstum
<tb> 0,2 <SEP> 382,0 <SEP> 73,2 <SEP> Typisches <SEP> Wachstum;
<SEP> geringer <SEP> Strauchwuchs
<tb> 6. <SEP> 0,29 <SEP> 0,00279 <SEP> 0,1 <SEP> <B>361,0</B> <SEP> 69,4 <SEP> Starkes <SEP> Wachstum <SEP> mit <SEP> Neigung <SEP> zur <SEP> Fadenbildung
<tb> 0,2 <SEP> 396,0 <SEP> 76,2 <SEP> Typisches <SEP> Wachstum
<tb> 0,3 <SEP> 393,0 <SEP> 75,6 <SEP> Typisches <SEP> Wachstum Der wichtigste dieser Versuche ist Nr. 3, mit einem Eisengehalt von nur 0,00036 /0O, der eine deutliche hemmende Wirkung auf die Fermentation eines Me diums mit mässigem Aschegehalt zeigte.
Bei fehlenden Kupferionen entwickelte sich in der Aspergillus-niger- Art eine fadenähnliche, keine Säure bildende Zell- form. Mit der eventuellen Ausnahme des Versuchs Nr. 6, in welchem 0, t 0100 Kupfer die Bildung einer Zucht mit vermindertem Säurebildungsvermögen nicht verhinderte, fermentierten alle Versuche mit 0,1 bis 0,20/00 Cu++ befriedigend.
<I>Beispiel 2</I> In einer weiteren Reihe von Versuchen mit nicht entkationisiertem Maiszucker wurde das Verhältnis der Konzentration des Cu++ und Fe<B>...</B> zueinander variiert. Die Ergebnisse dieser Versuche, ausgeführt in einem gleichartigen Zuckermedium wie in Beispiel 1, sind die nachfolgenden:
EMI0003.0001
<I>Tabelle <SEP> II</I>
<tb> Versuch <SEP> Fett<B>.</B> <SEP> ++ <SEP> Cu++ <SEP> Säure <SEP> Ausgangszucker <SEP> Umwandlung
<tb> Nr. <SEP> <B>0</B>/<B>00 <SEP> 0</B>/<B>00 <SEP> 9 <SEP> 9</B> <SEP> /<B>0</B>
<tb> 0,01 <SEP> 0,05 <SEP> 393,0 <SEP> 505,0 <SEP> 77,8
<tb> 20 <SEP> 0,05 <SEP> 0,05 <SEP> 349,0 <SEP> 505,0 <SEP> 69,1
<tb> 0,1 <SEP> 0,05 <SEP> 256,0 <SEP> 505,0 <SEP> 50,7
<tb> 0,15 <SEP> 0,05 <SEP> 62,0 <SEP> 505,0 <SEP> 14,2
<tb> 0,01 <SEP> 0,1 <SEP> 380,0 <SEP> 505,0 <SEP> 77,4
<tb> 21 <SEP> 0,05 <SEP> 0,1 <SEP> 3<B>1</B>7,0 <SEP> 500,0 <SEP> 65,4
<tb> 0,1 <SEP> 0,1 <SEP> 272,0 <SEP> 505,0 <SEP> 53,9
<tb> 0,15 <SEP> 0,1 <SEP> 149,0 <SEP> 500,0 <SEP> <B>29,8</B>
<tb> 0,01 <SEP> 0,2 <SEP> 375,0 <SEP> 500,0 <SEP> 75,0
<tb> 22 <SEP> 0,05 <SEP> 0,2 <SEP> 341,0 <SEP> 500,0 <SEP> 68,2
<tb> 0,1 <SEP> 0,2 <SEP> 181,0 <SEP> 500,
0 <SEP> 36,2
<tb> 0,15 <SEP> 0,2 <SEP> 68,0 <SEP> 500,0 <SEP> 13,6
<tb> 0,01 <SEP> 0,3 <SEP> 378,0 <SEP> 500,0 <SEP> 75,6
<tb> 23 <SEP> 0,05 <SEP> 0,3 <SEP> 344,0 <SEP> 500,0 <SEP> 68,8
<tb> 0,1 <SEP> 0,3 <SEP> 274,0 <SEP> 500,0 <SEP> 54,8
<tb> 0,<B><I>1</I></B>5 <SEP> 0,3 <SEP> 133,0 <SEP> 500,0 <SEP> 26,6
<tb> 0,01 <SEP> 0,5 <SEP> 370,0 <SEP> 500,0 <SEP> 74,0
<tb> 24 <SEP> 0,05 <SEP> 0,5 <SEP> 327,0 <SEP> 500,0 <SEP> 65;
4
<tb> 0,1 <SEP> 0,5 <SEP> 298,0 <SEP> 500,0 <SEP> 60,6
<tb> 0,15 <SEP> 0,5 <SEP> 138,0 <SEP> 500,0 <SEP> 27,6 Diese Tabelle zeigt deutlich die dem Eisen ent gegengesetzte Wirkung der Cu++ für einen grossen Bereich der Fe+++-Konzentrationen. 0,05-0,1 /00 Cu++ hob die Wirkung von bis zu 0,050/00 Fe<B>...</B> auf und lieferte eine befriedigende Ausbeute an Säure. Es sei jedoch darauf hingewiesen, dass bei Verwen dung von 0,50100 Cu++ die 0,1-0,150100 Fe<B>...</B> nicht in so hohem Grade neutralisiert wurden, dass man normale wirtschaftliche Säureausbeuten erhielt.
Nichts destoweniger wurden in Gegenwart von 0,10/00 Fe<B>...</B> mehr als 50% der Ausgangs-Kohlenhydrate mit 0,05-0,5 %0o Cu++ durch Fermentation umgewandelt. <I>Beispiel 3</I> Wie bereits erwähnt wurde, ist es eine bekannte Tatsache, dass bei der vegetativen Fermentation die unerwünschte Wirkung des Eisens, bei etwa 0,0002 bis 0,00080/00 Fe+++, durch Verwendung von Zn++ vermindert werden kann. Die nachfolgende Tabelle zeigt nun, dass Cu++ und Zn++ in ihrer gegen das Eisen gerichteten Wirkung nicht gleichwertig sind.
EMI0003.0015
<I>Tabelle <SEP> III</I>
<tb> Versuch <SEP> Cu++ <SEP> Zn++ <SEP> Säure <SEP> Ausgangszucker <SEP> Umwandlung <SEP> Zellmorphologie
<tb> Nr. <SEP> <B>0</B>/<B>00 <SEP> 0</B>/<B>00 <SEP> 9 <SEP> 9 <SEP> 0</B>/<B>0</B>
<tb> 30 <SEP> 0,0 <SEP> 0,0 <SEP> 0,0 <SEP> 507 <SEP> - <SEP> nicht <SEP> typisch: <SEP> fadenähnlich,
<tb> keine <SEP> Säurebildung
<tb> 31 <SEP> 0,0 <SEP> 0,005 <SEP> 0,0 <SEP> 507 <SEP> - <SEP>
<tb> 32 <SEP> 0,0 <SEP> 0,01 <SEP> 0,0 <SEP> 507 <SEP> - <SEP>
<tb> 33 <SEP> 0,0 <SEP> 0,02 <SEP> 0,0 <SEP> 507 <SEP> - <SEP>
<tb> 34 <SEP> 0,0 <SEP> 0,04 <SEP> 0,0 <SEP> 507 <SEP> - <SEP>
<tb> 35 <SEP> 0,0 <SEP> 0,08 <SEP> 0,0 <SEP> 507 <SEP> - <SEP>
<tb> 36 <SEP> 0,0 <SEP> _ <SEP> 0,16 <SEP> 0,0 <SEP> 507 <SEP> - <SEP>
<tb> 37 <SEP> 0,0 <SEP> 0,32 <SEP> 66,0 <SEP> 507 <SEP> 18,0 <SEP> nicht <SEP> typisch:
<SEP> fadenähnliche
<tb> Anhäufung
<tb> 38 <SEP> 0,005 <SEP> 0,0 <SEP> 213,0 <SEP> 507 <SEP> 42,0 <SEP> dichte <SEP> bis <SEP> fadenähnliche
<tb> Anhäufung
<tb> 39 <SEP> 0,01 <SEP> 0,0 <SEP> 207,0 <SEP> 507 <SEP> 40,0 <SEP>
EMI0004.0001
Versuch <SEP> Cu++ <SEP> Zn++ <SEP> Säure <SEP> Ausgangszucker <SEP> Umwandlung <SEP> Zellmorphologie
<tb> Nr. <SEP> <B>0</B>/<B>00 <SEP> 0</B>/<B>00 <SEP> 9 <SEP> 9</B> <SEP> /o
<tb> 40 <SEP> 0,02 <SEP> 0,0 <SEP> 367,0 <SEP> 507 <SEP> 72,4 <SEP> typisch: <SEP> dichte <SEP> Anhäufung
<tb> 41 <SEP> 0,04 <SEP> 0,0 <SEP> 339,0 <SEP> 502 <SEP> 67,5 <SEP>
<tb> 42 <SEP> 0,08 <SEP> 0,0 <SEP> 346,0 <SEP> 502 <SEP> 69,2 <SEP>
<tb> 43 <SEP> 0,16 <SEP> 0,0 <SEP> 407,0 <SEP> 502 <SEP> 81,1 <SEP> typisch:
<SEP> dichte <SEP> Anhäufung,
<tb> überdurchschnittliche <SEP> Ausbeute Diese Versuche zum Vergleich des dem Eisen entgegenwirkenden Einflusses des Cu++ und Zn++ wurden in einem gleichartigen, nicht entkationisierten 0,0008 /" F'e+++ enthaltenden Maiszuckermedium des Beispiels 1 durchgeführt. Man sieht hieraus, dass Zinkkonzentrationen bis zu 0,16 /0o nicht genügten, die unerwünschte, durch das Fe<B>...</B> und andere im Rohzucker enthaltenen Spurenelemente bedingte Zell- entwicklung zu verhindern.
Bei 0,320/00 Zn++ zeigte sich eine Neigung zur Bildung von säurebildendem Zellmaterial. Im Vergleich dazu ist es interessant festzustellen, dass Kupfer schon bei 0,02%0 zur Er- zeugung einer ganz typischen Zeltform imstande war.
<I>Beispiel 4</I> Auch in den Fällen, bei denen es wegen des vermin derten Aschengehaltes vorteilhafter war, mit kationen- freien, Kohlenhydrat enthaltenden Rohstoffen zu arbeiten, war die hemmende Wirkung des Kupfers noch immer deutlich erkennbar. Die nachfolgende Tabelle zeigt die dem Eisen entgegenwirkenden Eigen schaften des Cu++ und Zn++ in einem Nährmedium, welchem entkationisierter Maiszucker und 0,010/00 Fe... zugegeben wurden.
Das für diesen Vergleich verwendete Maiszuckermedium wies die nachfolgende Zusammensetzung auf: Ammoniumcarbonat 0,2 /o KH,P04 0,014 /o MgS0, 0,10/0 CaC12 0,0060/00 Mo03 0,050/00 H20 0,0060/00 Morpholin 0,50/00 Kohlenhydrat (kationenfrei) 12,0-15,00/0 Wasser (kationenfrei) q. s.
4000 cm3 Dieses Kulturmedium wurde mit Salzsäure von Pharmakopöe-Qualität auf pH 2,5-2,65 gestellt, in einem Autoklav bei 0,7 kg/cm3 Überdruck während 10 Minuten sterilisiert und in den Fermentierungs- zylinder eingeführt.
Die in Tabelle 4 gezeigten Versuchergebnisse dieses Kulturmediums können mit den Resultaten des nicht kationenfrei gemachten Maiszuckers in Tabelle 3 verglichen werden. Das Zink versagte in jeder nor malen Konzentration bei der Bildung von gutem säurebildendem Zellmaterial, während ein beinahe normales Zellwachstum bei nur 0,0250/00 Kupfer auftrat.
EMI0004.0055
<I>Tabelle <SEP> IV</I>
<tb> Ausgangs Versuch <SEP> Cu++ <SEP> Zn++ <SEP> Säure <SEP> zucker <SEP> Umwandlung <SEP> Zellmorphologie
<tb> Nr. <SEP> 0I00 <SEP> 0I00 <SEP> <B>9 <SEP> 9 <SEP> 0</B>/<B>0</B>
<tb> 50 <SEP> 0,0 <SEP> 0,0 <SEP> 27,0 <SEP> 493 <SEP> 5,6 <SEP> .
<SEP> Fadenähnliches, <SEP> sehr <SEP> wenig <SEP> säurebilden des <SEP> Zellmaterial
<tb> 51 <SEP> 0,005 <SEP> 0,0 <SEP> 145,0 <SEP> 493 <SEP> 29,4 <SEP> Fadenähnliches, <SEP> sich <SEP> anhäufendes, <SEP> wenig
<tb> säurebildendes <SEP> Zellmaterial
<tb> 52 <SEP> 0,025 <SEP> 0,0 <SEP> 258,0 <SEP> 493 <SEP> 52,3 <SEP> sich <SEP> anhäufendes, <SEP> fadenähnliches, <SEP> mässig
<tb> säurebildendes <SEP> Zellmaterial
<tb> 53 <SEP> 0,05 <SEP> 0,0 <SEP> 385,0 <SEP> 493 <SEP> 78,1 <SEP> Typisches <SEP> Zellmaterial
<tb> 54 <SEP> 0,1 <SEP> 0,0 <SEP> 361,0 <SEP> 493 <SEP> 73,2 <SEP> Strauchähnliches, <SEP> sich <SEP> dicht <SEP> anhäufendes
<tb> genügend <SEP> säurebildendes <SEP> Zellmaterial
<tb> 55 <SEP> 0,0 <SEP> 0,005 <SEP> 31,0 <SEP> 493 <SEP> 6,3 <SEP> Fadenähnliches, <SEP> sehr <SEP> wenig <SEP> säurebilden des <SEP> Zellmaterial
<tb> 56 <SEP> 0,
0 <SEP> 0,025 <SEP> 29,0 <SEP> 493 <SEP> 5,3 <SEP>
<tb> 57 <SEP> 0,0 <SEP> 0,05 <SEP> 115,0 <SEP> 493 <SEP> 23,3 <SEP>
<tb> 58 <SEP> 0,0 <SEP> 0,1 <SEP> 107,0 <SEP> 493 <SEP> 21,7 <SEP> Es wurde also durch die Verwendung von Kupfer ionen im submersen Fermentationsverfahren gezeigt, dass nichtkationenfrei gemachte Zuckermedien sowie kationenfreies Kohlenhydrat enthaltendes Material fermentiert werden können und gute Ausbeute an Zitronensäure liefern. Die grosse Bedeutung dieser entdeckten Wirkung des Kupfers liegt darin, dass man durch Benützung dieser Eigenschaft das teure Entionisieren des Zuckermediums vermeiden kann.
Dieses Ionenfreimachen war bei den früheren Me thoden für die Entfernung des Hauptteils der Eisen ionen und folglich auch für die Verminderung der Konzentration daraus in dem zu fermentierenden Kulturmedium unerlässlich. Überdies ermöglicht der entdeckte, dem Eisen entgegenwirkende Einfluss des Kupfers die Verwendung von Reaktionsteilnehmern von technischer Qualität, die bis jetzt wegen ihres verhältnismässig hohen Schwermetallgehaltes (Eisen inbegriffen) nicht in Frage kommen.
Zudem bedarf es geringer Sorgfalt hinsichtlich der Wahl des Reak tionsgefässes und der Zeit der Lagerung in diesen Gefässen, weil aufgenommene Verunreinigungen wenig Einfluss auf die Art der Zellform haben werden, falls Kupfer vorhanden ist.