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Verfahren zum Züchten der Wuchshefe Torula utilis auf Melasseabfallaugen
Die Erfindung bezieht sich auf ein Verfahren zum Züchten der Wuchshefe Torula utilis
(Torulopsis utilis) auf Melasseabfallaugen unter Zusatz stickstoffhaltiger Nährsalze,
wie Ammonsulfat, Diammonphosphat und Superphosphat.
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Ein solches Züchten ist nur dann wirtschaftlich, wenn Abfallaugen
zur Verfügung stehen, die sonst wertlos sind. Diese Abfallaugen sollen nach den
bisherigen Erfahrungen auch zuckerhaltig sein. Praktisch wurden zur Züchtung der
Wuchshefe Torula utilis bisher Sulfitlaugen, Hydrolysate von Holz, Schilf oder Kartoffelkraut,
Molke und Abfallsaft beim Obstpressen verwendet.
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An Hand gut reproduzierbarer Standardversuche bei Anwendung reiner
Glukose und Nährsalzen wurde festgestellt, daß man bei Einhaltung optimaler Bedingungen
aus 100 g Glukose 210 g Hefe (25 a/o Trockensubstanz) bzw. 52,5 g Hefetrockensubstanz
gewinnen kann. Als theoretische Grenze einer maximalen Ausbeute wurden 60 g Hefetrockensubstanz
aus 100 g Glukose angenommen (Zeitschr. angew. Chemie, 51, 475, 1938; Bio. Z., 301,
143, 1939, Artikel von Fink und Mitarbeitern). Beim Züchten von Hefen im industriellen
Maßstab auf Holzhydrolysaten wurden aus 100 Teilen vergorenem Zucker Ausbeuten von
51 bis 60% Hefemasse erzielt. Mithin werden die nach der obengenannten Veröffentlichung
theoretisch vorausgesetzten Mengen erreicht. Bei diesen Versuchen gelangte man auch
zu der Ansicht, daß die Wuchshefe Torula utilis durch dauernd wiederholte Kultivierung
an ein neues Milieu gewöhnt und sogar dazu gebracht werden kann, neben Zucker auch
andere kohlenstoffhaltige Stoffe, z. B. organische Säuren, für den Aufbau der Zellsubstanz
zu verwenden (Fink, H., Zeitschr. f. Spiritusind., 45, 1936).
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Diese Annahme wurde durch Versuche bei Verwendung einer Abfallösung
eines Gemisches vorwiegend organischer Säuren mit Zusatz von Nährsalzen bestätigt.
Nach der Kohlenstoffbilanz war das Ergebnis quantitativ bescheiden. Diese Versuche
rechtfertigen nicht die Annahme, daß die Wuchshefe Torula utilis durch Adaption
dahin gebracht werden kann, bei allen bisher für ihre Züchtung verwendeten Melasselaugen
neben Zucker auch andere kohlenstoffhaltige Stoffe für ihr Wachstum auszunutzen,
und noch weniger den Schluß, daß sich für die Züchtung der Wuchshefe Torula utilis
Melasseabfallaugen ohne jeglichen Zuckergehalt eignen.
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Für die Züchtung der Wuchshefe Torula utilis ist jedoch nicht jede
Art Schlempe als geeignetes Medium zur Zellsubstanzsynthese geeignet. Auf Melasseschlempe
von der alkoholischen Gärung vermehrt sich z. B. die Torulahefe sehr schlecht, insbesondere
bei der ursprünglichen Dichte von 1,034 bis 1,038. Bessere Ergebnisse wurden erzielt,
wenn die Melasseschlempe auf 1,022 bis 1,026 verdünnt wurde. Durch dieses Verdünnen
wird die Wirtschaftlichkeit beeinträchtigt, da mehr Gärraum und Dampf zum eventuellen
Einengen der vergorenen Maische benötigt wird. Es gibt Schlempen, die für die --Züchtung
der Wuchshefe Torula utilis vollkommen ungeeignet sind, z. B. die Melasseschlempe
der Butanol-AcetonwGärung.
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Eingehende Versuche haben gezeigt, daß als Nährsubstrat zum Züchten
der Wuchshefe Torula utilis unter bestimmten Voraussetzungen auch die Abfalllauge
der Zitronensäureherstellung sehr gut brauchbar ist, welche bisher wirtschaftlich
keine Verwendung gefunden hat, mit Ausnahme einer Verarbeitung auf Pottasche, wozu
die -Laugen unter Aufwand erheb= licher Kosten eingedampft wurden. Bei der Zitronensäureherstellung
wird die. Zitronensäure nach Beendigung des Gärprozesses in der Hitze mit Kalkmilch
in Form des Calciumcitrates-ausgefällt, dann filtriert und gewaschen. Die Abfallauge
zeigt eine Dichte von 1,03 bis 1,075 und enthält je nach dem Ablauf des Gärungsprozesses
0 bis 2,511/o Zucker und praktisch alle Nichtzuckerstoffe der ursprünglichen Melasse,
bis auf Stickstoff und Phosphor, und Reste an Zitronensäure. Zunächst ergab sich
bei den Versuchen, daß diese Melasseabfallauge in der- angegebenen Dichte als Nährsubstrat
für das Züchten der Wuchshefe Torula
utilis im Vergleich mit anderen
dazu verwendeten Melasseabfallaugen recht wenig geeignet war und quantitativ unbefriedigende
Ergebnisse zeitigte, insbesondere wenn der Zuckergehalt der Abfallauge gering war.
Ein besseres Ergebnis zeigte sich, wenn die Abfallauge verdünnt wurde. Darunter
litt aber die Wirtschaftlichkeit des Verfahrens.
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Durch oft wiederholte Züchtung der Torula utilis unter Verwendung
der jeweils geernteten Hefe als Ansatz zur nächsten Vergärung und unter Verwendung
von Abfallauge allmählich steigender Dichte gelang es aber, die Torula utilis an
die Dichte, wie sie ursprünglich bei der Abfallauge der Zitronenherstellung vorhanden
ist, sowie an die darin enthaltenen Nichtzuckerstoffe zu adaptieren.
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Der durch den Wuchs der Hefe Torula utilis entstehende Verbrauch von
organischen Säuren, die einen Teil der Nichtzuckerstoffe bilden, bewirkt ein Ansteigen
des PH-Wertes der Gärlösung über 4,5, gewöhnlich nach 5- bis 6stündiger Gärdauer.
Es machte sich deshalb notwendig, den pH-Wert in 1/z- oder 1stündigen Intervallen
mittels Schwefelsäure auf 4,5 einzustellen. Diese Tendenz zum Alkalisieren der Maische
dauert meist bis zur B. Gärstunde.
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Die Erfindung besteht also darin, daß beim Verfahren zum Züchten der
Wuchshefe Torula utilis auf Melasseabfallaugen unter Zusatz stickstoffhaltiger Nährsalze,
wie Ammonsulfat, Diammonphosphat und Superphosphat, als Nährsubstrat eine Abfallauge
der Zitronensäureherstellung von einer Dichte von 1,03 bis 1,075 und einem Zuckergehalt
von 0 bis 2,50% verwendet wird, der pH-Wert des Substrates auf 4,5 eingestellt und
nach Erkalten die Abfallauge durch Kochen in bekannter Weise sterilisiert und dann
filtriert wird, worauf sie nach dem Einstellen mit vorher adaptierter Wuchshefe
in üblicher Weise bei etwa 30' C unter intensiver Belüftung, zweckmäßig nach
dem Zulaufverfahren, verheft wird.
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Das Verfahren kann kontinuierlich oder diskontinuierlich ausgeführt
werden.
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Die Verwendung der Melasseschlempe aus der Zitronensäureherstellung
zur Züchtung adaptierter Torulahefe ergab eine überraschend große Ausbeute, die
beträchtlich über der theoretischen Grenze von 60% nach den eingangs erwähnten Veröffentlichungen
lag und 70 bis 85% erreichte. Der aus der Stoffbilanz errechnete günstige ökonomische
Koeffizient spiegelt sich auch in der Kohlenstoffbilanz wieder. Während der aus
der letzteren errechnete ökonomische Koeffizient bei optimaler Zellstubstanzsynthese
aus Glukose etwa 60% beträgt, ergibt die auf die organischen Nichtzuckerstoffe der
Abfallauge bezogene Kohlenstoffbilanz ökonomischer Koeffizienten von 60 bis 70%,
d. h. eine weit bessere Ausnutzung des Kohlenstoffes der organischen Nichtzuckerstoffe
der Lauge als bei Verwertung des Zuckers als Kohlenstoffquelle. Die überaus günstige
Ausbeute ist wahrscheinlich auch noch auf andere Umstände zurückzuführen. Die organischen
Säuren wirken wohl nicht nur als Kohlenstoffquelle, sondern üben auch einen synergistischen
Effekt aus, wie ihn L e o n i a n und L i 11y (Amer. J. Botany, 27, 18, 1940), ferner
Burkholder und McWeigh (Amer. J. Botany, 27, 643, 1940) bei Pilzen der Familie Mucorales
und L u t e r a a n (C. R. hebd. Seances Acad. Sci., 236, 2531, 1953) bei der Hefe
Hansenula ellipsoidospora feststellten. Wahrscheinlich bewirkt auch die Gegenwart
kleiner Mengen von Fumar-, Bernstein-, Milch-, Wein-, Malon-, Zitronensäure u. a.
eine starke Stimulierung des Wachstumes der Mikroorganismen, in dem nicht nur eine
intensive Verwertung der organischen Substanzen, sondern auch des ammoniakalischen
Stickstoffes vor sich geht.
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Ein wichtiger Faktor zur Erzielung der Hefeausbeute ist eine genügende
Belüftung der Maischen sowie ein etwas größerer Hefeansatz, als er normal verwendet
wird. Dieser wird so gewählt, daß die Hefe entsprechend dem Zuckergehalt der Lauge
sich wenigstens sechsmal vermehren kann. Die ausgiebige Belüftung der Maische erfolgt
zweckmäßig mit Hilfe feinporiger Körper.
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Zur Feststellung der Gärbedingungen wurden Versuche durchgeführt,
bei welchen mit 7,5 1 Gärflüssigkeit gearbeitet wurde. Die Versuchsergebnisse sind
in den Tabellen 1 und 2 enthalten.
| Tabelle 1 |
| Die Angaben beziehen sich auf 7,5 1 Maische |
| Versuch Zuckergehalt in g Hefemenge mit 25 % Trockengehalt
Vermehrungs- |
| Dichte der Lauge im Ansatz im Endprodukt verhältnis |
| Nr. Anfang Ende g g der Hefe |
| 1 1,049 0 0 45 570 12,7 |
| 2 1,0635 91 0 45 580 12,9 |
In der Tabelle 1 sind zwei Beispiele von Abfalllaugen angeführt, von denen Nr. 1
überhaupt keinen Zucker aufweist, während Nr. 2 12 g/1 enthält. Die Vermehrung des
Ansatzes von 45 g Hefe bei 9stündigem Zyklus ist in beiden Fällen etwa 15fach. Die
Konzentration der Hefe während der Gärung bleibt genügend hoch und beträgt etwa
20 g Trockensubstanz pro Liter Maische. Die Lauge ohne Zucker gab nur eine um weniges
geringere Ausbeute als die zuckerhaltige Lauge. Ist in der Lauge Zucker enthalten,
so wird er ohne Zweifel in erster Linie verbraucht, und erst später beteiligen sich
organische Nichtzuckerstoffe am Aufbau der Zellen. Im Falle, daß die Hefe nur auf
organische Nichtzuckerstoffe angewiesen ist, werden diese wirksam ausgenutzt, vorausgesetzt,
daß die Hefe gehörig adaptiert ist. Ungefähr ein Drittel der ursprünglichen, in
der Abfallauge vorhandenen Nichtzuckerstoffe werden von der Hefe verbraucht. Beispielsweise
waren in der zuckerfreien Lauge durchschnittlich 45 g organische Trockensubstanz
im Liter enthalten (Versuch Nr. 4). Nach Beendigung des Versuches verblieben 27
g organische Substanz, die Abnahme von 18 g entsprach also 40°/o der ursprünglichen
Menge. Die Abnahme der organischen Nichtzuckerstoffe ist aber nicht immer gleich
und schwankt entsprechend der Zusammensetzung der ursprünglichen Lauge.
| Tabelle 2 |
| Angaben in g, bezogen auf 1 1 Maische |
| Hefeausbeuten an Trockensubstanz |
| Gehalt an Abnahme |
| Versuch Zucker- theoretisch |
| organischer der organischen |
| Nr. gehalt Substanz gesamt aus dem aus Substanz |
| Zuckergehalt Nichtzuckerstoffen |
| 3 12 nicht bestimmt 19 6 13 nicht bestimmt |
| 4 2 45 19 1 18 18 |
| 5 0 62 16,5 0 16,5 23,5 |
In der Tabelle 2 sind Beispiele über die Ausnutzung von Zucker und Nichtzucker durch
die Torula für den Aufbau der Zellmasse angeführt. Der Versuch Nr. 3 zeigt, daß
die Hauptquelle für den Aufbau der Zellmasse nicht der in der Lauge enthaltene Zucker
ist, sondern die organischen @Tichtzuckerstoffe, denn nur ungefähr ein Drittel der
gesamten Ausbeute an Hefe wurde auf Basis vergärbaren Zuckers gebildet. In den Versuchen
Nr. 4 und 5 war die Hefe gezwungen, praktisch nur organische Nichtzuckerstoffe zu
assimilieren, und vermehrte sich dennoch so gut wie beim Versuch Nr. 3. Die Zuckermenge,
die theoretisch zum Erreichen dieser Ausbeuten notwendig wäre, würde beim Versuch
Nr. 4 36 g und beim Versuch Nr. 5 33 g pro Liter Maische betragen. Die Ausnutzung
ist also bei den organischen Nichtzuckerstoffen für den Aufbau der Zellmasse der
Hefe bedeutend wirtschaftlicher als beim Zucker.
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Zuletzt sei noch die Beobachtung angeführt, daß im Laufe der zahlreichen
Züchtungszyklen bei Einhaltung der normalen Reinheit, jedoch nicht unter aseptischen
Bedingungen, und dies auch im Sommer, keine Infektionen auftraten, wobei sich die
Hefe in ausgezeichnetem biologischem Zustand erhalten hat.
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Ausführungsbeispiele 1. Es werden 7,51 Abfallauge mit einem Zuckergehalt
von 2,1% und einer Dichte von 1,034 mit Schwefelsäure auf einen pH-Wert von 4,5
eingestellt. Dann werden 30 g Ammonsulfat, 13 g Diammonphosphat und 5 g Superphosphat
zugegeben und unter gleichzeitiger Belüftung 20 bis 30 Minuten gekocht. Nach dem
Abkühlen wird filtriert. Die Gärung wird mit 1,5 1 Maische und mit einem Ansatz
von 50 g adaptierter Torulahefe mit einem Trockengehalt von 2511/o bei
28' C begonnen; nach einer Stunde werden 0,371 Maische und weiter in 1/2stündigen
Intervallen 0,47, 0,5, 0,5, 0,6, 0,6 und 0,751 Maische zugesetzt, wobei nach 4,5
Stunden das Maximum des Zulaufes erreicht ist. Nach dem ersten Maischezusatz wird
die Temperatur auf 30 bis 32° C erhöht und die Luftmenge, die gleich zu Beginn des
Prozesses 140 1/Stunde beträgt, allmählich auf 750 1/Stunde beim maximalen Zulauf
der Maische gesteigert. Beim weiteren Gärverlauf wird der Zulauf in 1/2stündigen
Intervallen auf 0,6, 0,5, 0,47, 0,34 und 0,3 1 herabgesetzt. Nach 7 Stunden ist
der Zulauf beendet. Die maximale Luftmenge wird bis zum Ende des Zulaufes aufrechterhalten,
dann nach und nach auf die Anfangsmenge reduziert bis zur Beendigung des Zyklus
nach 9 Stunden. In der letzten Stunde kann die Temperatur auf 28' C herabgesetzt
werden. Sinkt der pH-Wert während der Gärung unter 4,5, wird er mittels verdünnten
Ammoniaks eingestellt; steigt er darüber, wird er mit verdünnter Schwefelsäure korrigiert.
Wenn man den Hefeansatz abrechnet, werden 500 g Hefe mit 25 % Trockengehalt bzw.
125 g Hefetrockensubstanz gewonnen, was eine 74%ige Ausbeute, berechnet auf den
Zuckergehalt von 169 g, bedeutet.
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2. 7,5 1 Abfallauge mit 1,5% Zucker und einer Dichte von 1,073 werden
nach dem Einstellen auf pH 4,5 und dem Zusatz von 17 g Ammonsulfat, 7,5 g Diammonphosphat
und 5 g Superphosphat gemäß Beispiel 1 gekocht, filtriert und unter Verwendung von
40 g adaptierter Ansatzhefe wie oben vergoren. Der Hefezuwachs beträgt 290 g Hefe
mit einem Trockengehalt von 73 g, was einer Ausbeute von 64% entspricht.
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3. Es wird eine größere Menge Abfallauge mit einei Dichte von 1,038
und einem Zuckergehalt von 2 bis 2,5% gemäß den Beispielen 1 und 2 mit Nährsalzen
gekocht und filtriert, worauf 7,5 1 derselben in der oben angegebenen Weise nach
dem Zulaufverfahren vergoren werden. Nach Beendigung des Zulaufes (7. bis B. Stunde)
hält man die Temperatur weiter auf 30 bis 32' C (sie kann ohne Schaden für
die Gärung bis 35' C steigen) und ebenso die maximale Luftmenge; dann zieht
man ein Zehntel, das sind 0,75 1 Maische, ab. Gleichzeitig wird eine gleiche Menge
frischer Lauge zugegeben. Das Abziehen der vergorenen und die Zugabe der frischen
Lauge wird jede Stunde wiederholt. Aus den abgezogenen Laugen wird die Hefe, eventuell
nach der Reifung unter schwacher Belüftung in einem Sammelgefäß, separiert. Die
kontinuierliche Gärung kann so lange fortgesetzt werden, wie keine Infektion eintritt.
Bei der Verarbeitung von insgesamt 37,5 1 Maische betrug die gesamte Ausbeute 3480
g Hefe (25% Trockensubstanz). Bei dem üblichen diskontinuierlichen 9stündigen Verfahren
wurden aus 7,5 1 der gleichen Abfallauge 550 g Hefe (25% Trockengehalt) gewonnen;
bei der Verarbeitung von 37,5 1 Lauge bei diskontinuierlicher Vergärung würde daher
die Ausbeute 2750 g Hefe betragen, d. h. nur 80% der Menge des kontinuierlichen
Verfahrens. Hierzu käme noch der Verlust von 200 g Hefe, die in Form von Ansätzen
für die einzelnen Gärungen notwendig wäre.
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4. Aus 7,5 1 Abfallauge mit 1,2% Zucker und einer Dichte von 1,064
wird nach dem Ansäuern auf p$ 4,5, der Zugabe von 50 g Ammonsulfat, 10 g Diammonphosphat
und 5 g Superphosphat wie oben eine Gärmaische hergestellt, die mit 45 g Ansatzhefe
vergoren wird. Nach 5- bis 6stündiger Gärung beginnt der pH-Wert der Maische zu
steigen, was durch einen intensiven Verbrauch der Nichtzuckerstoffe (organischer
Säuren) bedingt wird. Der pH Wert wird durch Zusatz von Schwefelsäure in 1/2stündigen
Intervallen korrigiert, was meist bis zur B. Gärstunde notwendig ist. Die Ausbeute
an Torula beträgt 600 g Hefe mit 25",':, Trockengehalt, d. h. 150 g Hefetrockensubstanz.
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5. Man bereitet die Abfallauge, welche eine Dichte von 1,049 aufweist,
jedoch keinen Zucker enthält, in
gleicher Weise wie im Beispiel
4. Auch die Vergärung erfolgt in derselben Weise, d. h. diskontinuierlich. Die Ausbeute
an Torula beträgt 550 g (25% Trockensubstanz), d. h. 138 g Hefetrockensubstanz.