DE2048659A1

DE2048659A1 - Verfahren zur Gewinnung hochmolekularer Nucleinsäuren durch Fermentation

Info

Publication number: DE2048659A1
Application number: DE19702048659
Authority: DE
Inventors: Takeo; Tomita Fusao; Ito Saiga; Machida Tokio Suzuki (Japan). P C12d 13-06
Original assignee: Kyowa Hakko Kogyo Co Ltd
Current assignee: KH Neochem Co Ltd
Priority date: 1969-10-14
Filing date: 1970-10-03
Publication date: 1971-11-04
Also published as: CA949477A; JPS5535106B1; GB1331950A; FR2065376A5

Description

2048659 Andrejewski & Honke Patentanwälte

Diplom-Physiker Dr. Walter Andrajewski

Diplom-Ingenieur Anwaltsakte: 35 _7o2/H _Dr.._{|ng<
Manfred Honke}

Essen, den 1. Okt. 197o K*ttwig«r Straß· 36

Patentanmeldung
KYOWA HAKKO KOGYO K.K.
6-1, 1-Chome, Ohte-machi
Chiyoda~ku- Tokyo /Japan

Verfahren zur Gewinnung hochmolekularer Nucleinsäuren durch Fermentation

Vorliegende Erfindung betrifft ein Verfahren zur Gewinnung von Desoxyribonucleinsäuren und/oder Ribonucleinsäuren (hier als hochmolekulare Nucleinsäuren bezeichnet), welches dadurch gekennzeichnet ist, daß man aerob einen Mikroorganismus züchtet, der imstande ist, Desoxyribonucleinsäure und/oder Ribonucleinsäure in einem Kulturmedium zu produzieren, welches einen Kohlenwasserstoff oder ein Kohlehydrat als Hauptkohlenstoffquelle enthält, eine wesentliche Menge an Desoxyribonucleinsäure und/oder Ribonucleinsäure ansammelt,und die angesammelte Desoxyribonucleinsäure und/oder Ribonucleinsäure aus der Fermentationslösung gewinnt.

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Patentanwälte Dr. W. Andrejewtki, Dr. M. Honke, 43 Essen, Kettwiger Straße 36

Als Ergebnis ausgedehnter Studien ist ein verbessertes Verfahren zur Produktion hochmolekularer Nucleinsäuren gefunden worden, welches auf die kommerzielle Produktion hochmolekularer Nucleinsäuren unter Verwendung von preiswerten Kohlenwasserstoffen oder Kohlehydraten als Rohmaterialien anwendbar ist.

Hochmolekulare Nucleinsäuren sind bisher durch Extraktion aus Zellen von Mikroorganismen - sowohl von höheren Tieren als auch von höheren Pflanzen - erhalten worden, welche in verschiedener Weise zerstört worden sind. Jedoch sind die Extraktions- und Rückgewinnungsverfahren dieser Methoden infolge sowohl der beträchtlichen Verluste an Nucleinsäuren als auch der Anwesenheit der Rückstände der zerstörten Zellen mehr oder weniger gewagt. Im Gegensatz dazu 1st es beim Verfahren der vorliegenden Erfindung nicht notwendig, die Zellen zu zerstören. Ferner können andere unerwünschte hochmolekulare Verbindungen als die hochmolekularen Nucleinsäuren leicht entfernt werden.

Die vorliegende Erfindung kann vorteilhaft auf die kommerzielle Herstellung hochmolekularer Nucleinsäuren angewendet werden. Das Obenschwimmende, das durch Entfernung der mikrobiellen Zellen aus der Fermentationsbrühe erhalten ist, kann nach einem konventionellen Verfahren behandelt werden, (wie im Beispiel 1 erläutert), um auf einfache Art und preiswert hochmolekulare Nucleinsäuren zu gewinnen.

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Patentanwälte Dr. W. Andrejewski, Dr. M. Honke, 43 Essen, Kettwiger Straße

Es ist im Vorhergehenden berichtet worden, hochmolekulare Nucleinsäuren aus Zellen von Mikroorganismen sowohl von Tieren als auch von Pflanzen zu extrahieren und zu gewinnen. Jedoch ist ein Verfahren zum Züchten und Anhäufen hochmolekularer Nucleinsäuren direkt in einem Kulturmedium niemals früher veröffentlicht bzw. darüber berichtet worden, und es stellt erfindungsgemäß eine neue Lehre dar.

Nach der Erfindung ist es möglich, hochmolekulare Nucleinsäuren durch Fermentation zu gewinnen; dieses Verfahren wird hier künftig als hochmolekulare Nucleinsäure-Fermentation bezeichnet, und es kann mit Vorteil auch auf die kommerzielle Herstellung hochmolekularer Nucleinsäuren angewendet werden, da fast alle die so produzierten hochmolekularen Nucleinsäuren in wässriger Lösung gelöst werden.

Alle in der vorliegenden Beschreibung durch ATCC-Nummern erwähnten Stämme sind der Öffentlichkeit frei zugängig, und sie sind bei der American Type Culture Collektion hinterlegt worden.

Mikroorganismen, welche für den Zweck der vorliegenden Erfindung bevorzugt verwendet werden können, schließen z.B. die folgenden ein:

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Patentanwälte Dr. W. Andreiewski, Dr. M. Honke, 43 Essen, Kettwiger Straße

- 3a-

Arthrobaoter paraffineus ATCC 15 590

Arthrobacter simplex ATCC 15 799

Brevibacterium ketoglutamicura ATCC 15 587

Microooccus ureae ATCC 21 288

Arthrobacter hydrocarboglutamicus ATCC 15 585

Corynebacterium hydrooarboclastus ATCC 15 592

. Pseudomonas fluorescens ATCC 948

Pseudomonas aeruginosa ATCC 15 246

Aspergillus orycae ATCC 7 252

Candida lipolitica ATCC 8 861.

Verschiede Mikroorganismen der vorliegenden Erfindung können ohne Rücksicht auf die Gattung und die Familie in der Systemkunde (taxonomy) verwendet werden· Die Gruppe, bestehend aus Arthrobaoter, Brevibacterium, Micro-coccus, Corynebacterium, Pseudomonas, Aspergillus und Candida wird jedoch bevorzugt.

Bessere Ergebnisse können durch Verwendung von η-Paraffin und verschiedenen Kohlenwasserstoff-Fraktionen, die n-Paraffin als C-Quelle enthalten, erhalten werden. Vorzugsweise enthalten solche n-Paraffine 10 bis 22, insbes. 12 bis 18 C-Atome. Es 1st jedoch möglich, verschiedene andere C-Quellen, wie jede Art von assimilierbaren Kohlenwasserstoffen und Kohlehydraten, z.B. Glukose, Sorbit u.dgl., organischen Säuren oder Alkohole, vorzugsweise Cg-bis C_2Q-Säuren oder Alkohole u.dgl. zu verwenden, welche durch den Mikroorganismus assimilierbar sind.

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Als N-Quelle können sowohl anorganische als auch organische Stickstoff-Quellen verwendet werden.

Bei der Durchführung der erfindungsgemäßen Fermentation wird ein Medium verwendet, welches einen Kohlenwasserstoff oder ein Kohlehydrat als Hauptkohlenstoff-Quelle zusammen mit der vorerwähnten Stickstoff-Quelle enthält. Anorganische Salze und erforderliche Wachsturn-fördernde Substanzen werden dem Medium zugesetzt. Das Kulturmedium wird dann sterilisiert und anschließend mit einem Mikroorganismus beimpft. Man züchtet unter aeroben Bedingungen im allgemeinen bei 2o bis 6o°C, vorzugsweise bei J>o bis 42°C. Während der Züchtung wird zwecks Einstellung auf ein p„ von 4 bis 10, vorzugsweise von 6 bis 9* Harnstofflösung, Ammoniakwasser, Ammoniak oder Ammoniumoarbonatlösung zugeführt.

Die Fermentation ist im allgemeinen nach ca. 7 Tagen beendet, aber es ist vorzuziehen, die Fermentation fortzusetzen, bis die Bestimmung der Nucleinsäuren ein Maximum anzeigt.

Die nachfolgenden, jedoch nicht begrenzenden Beispiele erläutern die Erfindung.

Beispiel 1

Arthrobacter simplex (ATCC Nr.15 799) wurde in einem Medium gezüchtet, welches Fleischextrakt (1#), Pepton (1$) NaCl (0,5$) und Glukose (2$) enthielt und einen eingestellten p_H-Wert von 7,2 (vor der Sterilisation) hatte. Das Züchten fand zwecks Gewinnung einer Saatkultur in 24 Stunden unter Schütteln statt.

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Die Saatkultur wurde dann verwendet, um ein Medium (3,0 1), das Fleischextrakt (1%), Pepton {!%), NaCl (0,5$) und Glukose (10$) enthielt und eine eingestelltes p_H von 7,2 (vor der Sterilisation) aufwies. Es wurden eine 5 1-Gärflasche und ein Vol.-Verhältnis von 10$ verwendet. Die Züchtung wurde in J50 Std. bei 30⁰C unter Rühren (400 r.p.m.) und Belüften ( 1 l/Min.) durchgeführt.

Das Medium wurde mit Ammoniakwasser auf ein p„ von 6,5 bis 7,5 eingestellt. Wenn die Züchtung beendet war, war die Glukose fast verbraucht.

Zu 1 1 der vergorenen Flüssigkeit, die nach Entfernung der Mikrobenzellen aus den Fermentbrühen erhalten war, wurden ca. 500 ml Phenol zugefügt, welches durch eine Natriumchlorid (0,15 Mol) und Natriumeitrat (0,01 Mol) enthaltende Lösung gesättigt war. Die behandelte Lösung wurde geschüttelt und zentrifugiert. Danach wurde die anfallende obere Schicht gesammelt. Nach zweimaliger Wiederholung wurden die oberen Schichten vereinigt, wobei man eine wässrige Lösung erhielt, welcher 1 Äquivalent 95#ig· Äthanols (oder Methanols) zugefügt wurde.

Die erhaltenen faserförmigen Niederschläge wurden gewonnen und ergaben Roh-Desoxyribonucleinsäuren. Diese wurden gereinigt, indem man sie zweimal der Ribonuclease-Behandlung und einer ähnlichen Phenol-Behändlung unterwarf. Man erhielt 0,7 g gereinigte Desoxyribonucleinsäure. Es wurde gefunden, daß das

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Molekulargewicht dieses Präparates größer als 5 x 10^ war, wenn es mittels der Gradient-Sacciarose-Centrifugierungs-Dichte-Methode unter Verwendung von Desoxyribonucleinsäure von "phage" als Standard (Modifizierte Methode von J.Marmur: J.Mol.Biol. 3,208-196l) bestimmt wurde.

Naoh Entfernung der faserartigen Niederschläge wurde der Fermentationslösung 1 Äquivalent 95#ig·Äthanol zugefügt, und die anfallenden Niederschläge wurden gesammelt und vereinigt, sie ergaben die Roh-Ribonucleinsäure. Diese wurde der Desoxyribonuclelnsäure-Behandlung und der Phenol-Behandlung unterworfen. Es fielen 2,0 g gereinigte Ribonucleinsäure an. Um lösliche Ribonucleinsäure zu erhalten, wurde dieser Natriumchlorid (1 Mol ) zugefügt und gerührt. Das Überstehende wurde gesammelt, und es wurde die zweifache Menge seines Volumens an 95#ig. Äthanol zugesetzt. Die anfallenden Niederschläge wurden in Natriumchlorid (0,1 Mol) gelöst und weiter mit Isopropanol gefällt. Man erhielt 0,1 g lösliche Ribonucleinsäure.

Beispiel 2

Micrococcus ureae (ATCC Nr. 21 288) wurde in einem Medium gezüchtet, welches Fleischextrakt (1#), Pepton (1#), NaCl (0, und Sorbit (2$) enthielt und ein eingestelltes p« von 7*2 (vor der Sterilisation) aufwies. Die Züchtung wurde zwecks Erhalt einer Saatkultur innerhalb von 24 Std. unter Schütteln ausgeführt. Man impfte die Saatkultur auf ein Medium (3,0 1),

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welches Fleischextrakt (IJi), Pepton (IJi), NaCl (0,5$) und Sorbit (10$) enthielt und ein eingestelltes p„ von 7,2 (vor dem Sterilisieren) aufwies. Man verwendete eine 5 1-Gärflasche mit einem Vol.-Verhältnis von 10$. Die Züchtung wurde unter Rühren (4oo r.p.m.) und Belüften (1 l/Min.) in 48 Std. bei 3o° C durchgeführt. Das Medium wurde mit Ammoniakwasser auf ein P_H von 6,5 bis 7*5 eingestellt.

Die Fermentationslösung wurde in ähnlicher im Beispiel 1 beschriebener Weise zwecks Erhalt hochmolekularer Nucleinsäuren behandelt. Man erhielt aus 1 1 Fermentationslösung 0,5 g gereinigte Desoxyribonucleinsäure und 0,5 g rohe Ribonucleinsäure.

Beispiel 3

Pseudomonas fluorescens (ATCC Nr.948) wurde in 24 Std. unter Schütteln in einem ähnlichen im Beispiel 2 beschriebenen Medium gezüchtet. Man beimpfte dann ein Medium (3,0 1), welches KH₂PO₄(0,2Ji), Na₂HPO₄(0,2%), MgSO₄.7HgO(O,l#), MnSO₄.4^0(0,002$), FeSO₄.7H₂O (0,02#), ZnSO₄.7H₂O (0,001$), (NH₄ J₃SO₄(0,5Jg) CuCl₂.4H₂O (0,0003Ji), Maiswasser (0,1Ji), Hefeextrakt (0,1Ji) und η-Paraffin (ein Gemisch aus C2o*Cn~,C-jhU.C.,,-),-10Ji-v/v-enthielt, in einer 5 1-Gärflasche bei einem Vol.-Verhältnis von 10$,

Die Züchtung wurde in ähnlicher in den Beispielen 1 und 2 beschriebener Weise in 72 Std. bei 30⁰C unter Rühren (βΟΟ r.p.m.) und Belüften (3 l/Min.) durchgeführt. Das Medium wurde mit Ammoniakwasser auf ein p„ von 7*0 bis 7*5 eingestellt.

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Wenn die Züchtung abgeschlossen war, war das η-Paraffin vollständig verbraucht. Die Mikrobenzellen wurden aus der Fermentationslösung entfernt, und das Überstehende wurde in ähnlicher im Beispiel 1 beschriebener Weise behandelt. Man erhielt aus 1 1 Überstehendem 1,0 g gereinigte Desoxyribnucleinsäure und 1,8 g rohe Ribonucleinsäure.

Beispiel 4

Aspergillus oryzae (ATCC Nr. 7 252) wurde 96 Std. bei 25° C in ähnlicher im Beispiel 3 beschriebener Weise gezüchtet unter Verwendung einer ähnlichen im Beispiel 5 beschriebenen Saatkultur und eines ähnlichen Fermentationsmediums.

Die Fermentationslösung wurde in ähnlicher im Beispiel 1 beschriebener Weise behandelt und ergab 0,4 g gereinigte Desoxyribonucleinsäure und 0,7 g rohe Ribonucleinsäure.

Beispiel 5

Candida lipolitica (ATCC Nr. 8861) wurde in ähnlicher im Beispiel j5 beschriebener Weise und unter Verwendung eines ähnlichen im Beispiel J5 beschriebenen Saatmediums gezüchtet.

Das Fermentationsmedium wurde in ähnlicher im Beispiel J> beschriebener Weise bereitet durch Zufügen von Span-80 (Handelsmarke für ein nonionicoberflächenaktives Mittel, das durch die Atlas Chemical Co., Ltd,, vertrieben wird).

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Die Züchtung wurde in 96 Std. bei j5o°C ausgeführt, und die anfallende Fermentationslösung wurde in ähnlicher im Beispiel 1 beschriebener Weise behandelt. Man erhielt aus 1 1 Fermentationslösung 0,2 g einer gereinigten Desoxyribonucleinsäure und 0,7 g Roh-Ribonucleinsäure.

Ansprüche

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Claims

Patentanwälte Dr. W. Andrejewski, Dr. M. Honke, 43 Essen, Kettwiger Straße

- Io -

Patentansprüche :

1. Verfahren zur Gewinnung von Desoxyribonuoleinsäure und/oder Ribonucleinsäure durch Fermentation, dadurch gekennzeichnet, daß man einen Mikroorganismus züchtet, welcher imstande ist, Desoxyribonucleinsäure und/oder Ribonucleinsäure in einem Kulturmedium zu produzieren, welches Kohlenwasserstoffe oder Kohlehydrate als Haupt-Kohlenstoffquellen enthält, und daß man die angesammelte Desoxyribonucleinsäure und/oder Ribonucleinsäure gewinnt.

2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß der Mikroorganismus ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus Arthrobacter, Brevibacterium, Micrococcus, ( orynebaoterium, Pseudomonas, Aspergillus und Candida.

j5. Verfahren nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, daß der Mikroorganismus ausgewählt ist aus Arthrobacter der ATCC Nr. 15 590, 15 799 und 15 58j5.

4. Verfahren nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, daß der Mikroorganismus Brevibacterium ketoglutamicum ATCC Nr. 15 587 ist.

5. Verfahren nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, daß der Mikroorganismus Mikrococcus ureae ATCC Nr. 21 288 ist.

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Patentanwälte Dr. W. Andrejewskl, Dr. M. Henke, 43 Esten, Kettwiger StraBe

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6. Verfahren nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, daß der Mikroorganismus Corynebacterium hydrocarboclastus ATCC Nr. 15 592 ist.

7. Verfahren nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, daß der Mikroorganismus Pseudomonas fluorescens ATCC Nr. 948 oder Pseudomonas aeruginosa ATCC Nr. 15 246 ist.

8. Verfahren naoh Anspruoh 2, dadurch gekennzeichnet, daß der Mikroorganismus Aspergillus oryzae ATCC Nr. 7 252 ist.

9. Verfahren naoh Anspruch 2, daduroh gekennzeichnet, daß der Mikroorganismus Candida lipolitioa ATCC Nr. 8 86l ist.

10. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß Desoxyribonuoleinsäure und/oder Ribonucleinsäure unter aeroben ZUchtungsbedingungen in ca. 7 Tagen bei einer Temperatur von ca. 20 bis 6o°C und einem p„ von ca. 4 bis 10 produziert werden.

11. Verfahren nach Anspruoh 1, dadurch gekennzeichnet, daß der Mikroorganismus, der ausgewählt ist aus Arthrobacter paraffineus ATCC Nr. 15 590, Arthrobaoter simplex ATCC Nr, 15 799, Arthrobacter hydrocarboglutamious ATCC Nr.15 583* Brevibacterium ketoglutamioum ATCC Nr. 15 5Ö7* Microcoocus ureae ATCC Nr. 21 288, Corynebaoterium hydrocarboclastus ATCC Nr. 15 592, Pseudomonas fluorescens ATCC Nr. 948, Pseudomonas aeruginosa ATCC Nr. 15 246, Aspergillus orycae ATCC Nr. 7 252 und Candida lipolitica ATCC Nr. 8 861 aerob In ca. 7 Tagen bei oa. 20 bis 6o° C und einem p_H von ca. 4 bis 10 gezUohtet wird.

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1-2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß die Kohlenstoffquelle Glukose ist.

13. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß die Kohlenstoffquelle Sorbit ist.

14. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß die Kohlenstoffquelle ein η-Paraffin mit 10 bis 22 C-Atomen ist.

15. Verfahren zur Produktion von Desoxyribonucleinsäure und/oder Ribonucleinsäure durch Fermentation, dadurch gekennzeichnet, daß man einen Mikroorganismus, ausgewählt aus Arthrobacter, Brevibacterium, Micrococcus, Corynebacterium, Pseudomonas, Aspergillus und Candida in einem Kulturmedium züchtet, das als Hauptkohlenstoffquelle Glukose, Sorbit, η-Paraffine mit 10 bis 22 C-Atomen und organische Säuren oder Alkohole mit 2 bis 20 C-Atomen enthält, und daß man die angesammelte Desoxyribonuoleinsäure und/oder Ribonucleinsäure daraus gewinnt.

16. Verfahren nach Anspruch 15* dadurch gekennzeichnet, daß Desoxyrlbonucleinsäure und/oder Ribonuelelnsäure in ca. 7 Tagen bei ca. 2o bie 60⁰C und einem p„ von ca. 4 bis 10 unter aeroben Züohtungsbedingungen produziert werden«

PAe Dr.AndreJeweki, Dr.Honke

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