DE2011618A1

DE2011618A1 - Enzyme zur Hydrolyse von Dextran

Info

Publication number: DE2011618A1
Application number: DE19702011618
Authority: DE
Inventors: Auf Nichtnennung Antrag
Original assignee: Brown, Robert G., Halifax, Nova Scotia (Kanada)
Priority date: 1969-03-11
Filing date: 1970-03-11
Publication date: 1970-10-08
Also published as: SE333343B; FR2037925A5; GB1268016A; CA918585A; US3699002A

Description

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Herstellung von Dextran hydrolysierenden Enzymen mittels Mikroorganismen.

Es ist bekannt, daß das Enzym Dextranase Dextran hydrolysiert, indem die Glucosidbindungen zwischen den Monosaccharideinheiten des Polysaccharide aufgespalten werden. Dextranase kann beispielsweise für die teilweise Hydrolyse von nativem Dextran zu klinischem Dextran verwendet werden. Ein neues Verwendungefeld für die Dextranase liegt auf dem Gebiete der Zahnmedizin. Es kann zur Verhinderung von Zahnkaries verwendet werden. In diesem Fall hydrolysiert die Dextranase

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Dextranabscheidungen auf den Zähnen, die durch bakterien gebildet werden, die auf den Zähnen vorhanden sind. Dadurch soll Karies verhindert oder reduziert werden.

einem bekannten und technisch anwendbaren Verfahren zur Herstellung von Dextranase wird ein geeigneter Mikroorganismus auf einem Dextran enthaltenden Substrat lcuLtivLert-, wobei der Mikroorganismus Dextranase bildet. Die dextranase wird dann isoliert.

Der Erfindung lag die Aufgabe zugrunde, ein vorteilhaftes Verfahren zur Herstellung von Dextranase mittels Mikroorga— fc nismen zu entwickeln.

Die Erfindung beruht auf der Erkenutuis, daiJ Dextranase mittels Mikroorganismen hergestellt werden kann, indem fiu Mikroorganismus gezüchtet wird, der in eine»! u.e tode-s· trau enthaltenden Substrat auf dem noiiLenstol'f ties uetodext raus aLs Energiequelle wuchst. Ueeigne te Mikroorganismen können ausgewählt werden dur"b eine Mireicheriin.'srJnilt ivicrung von Mikroorganismen in einem Wachs bumsmoriium, üa^ i\.e todextran enthält. 'Dabei ist dor lvoliLeus to If des lvetodex trans in wesentliche·) die einzige KnergiequeiIe für das Wachstum der Mikroorganismen.

* Es konnte Test;» es te I It worden, dart eine geringe heuge

eines Leicht; assimilierten ivoh Lonhydrats das Wachstum dor Mikroorganismen zusätzlich fördert und die Enzyiiuuisbeuto wesentlich erhöht. Solche Kohlenhydrate sind beispielsweise Glucose, Galactose, Mannose, Dextran und Saccharose,,

Die entstehende Dextranase kanu mittels bekannter Verfahren isoliert und gewonnen werden.,

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Soll die Dextranase gereinigt werden wie sie erhalten wird, dann wird dies durch eine höhere Konzentration der Dextranase im Verhältnis zu anderen vorhandenen Substanzen

erleichtert, üei verschiedenen technischen Anwendungszwecken braucht die Dextranase nicht gereinigt zu werden und kann als Rohprodukt gewonnen werden. In diesem Zusammenhang ist es von großem Vorteil, daß die Dextranaseaktivität je Mengeneinheit hoch ist.

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Herstellung von Dextranase mittels Mikroorganismen, das dadurch gekenn— zeichnet ist, daß ein Mikroorganismus gezüchtet wird, der auf einem iietodextrau enthaltenden Substrat wächst, wobei der Kohlenstoff des Ketodextrans als Energiequelle dient.

Die Bezeichnung ¹¹Ke to dextran" bezieht sich auf ein Dextranderivat, das dadurch gekennzeichnet ist, daß ein Teil der sekundären Hydroxylgruppen (-*CJü.(OH)--r) im Dextran in "Ke to gruppen (-GO-) umgewandelt worden sind. Auf jeder Seite dieser Gruppe befindet sich somit ein Kohlenstoffatom. Ketodextran ist bekannt und wird chemisch durch eine geeignete Oxidation von Dextran erhalten. Es sind verschiedene Oxida*- tionsmethoden zur Herstellung von Ketodextran bekannt wie beispielsweise mittels Dimethylsulfoxid und Essigsäurean-r hydrid. Der Substitutionsgrad, d.h. die durchschnittliche Anzahl von Ketogruppen je Monosaccharideinheit oder je Einheiten des Monosaccharide im Dextran kann innerhalb breiter Grenzen variiert werden. Während der Oxidation der sekundären Hydroxylgruppen werden eventuell vorhandene primäre Hydroxylgruppen gleichzeitig zu Äldehydgruppen oxidiert. Es kann ebenfalls ein solches Oxidationsprodukt verwendet werden, und die Bezeichnung "Ketodextran" schließt auch solche Produkte ein. Es ist auch möglich, Hydroxylgruppen im Dextran durch

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Substituenten wie beispielsweise Phenylboronatgruppen zu blockieren, die dann später nach der Oxidation zum Ketodextran leicht entfernt werden können. Hierbei kann das Oxidationsverfahren auf bestimmte freie Hydroxylgruppen gerichtet werden, falls Ketogruppen in bestimmten Positionen der monomeren Einheit des Dextrans erwünscht sind. Durch die Bezeichnung "Ketodextran" ist beispielsweise ein Dextran bezeichnet, von dem ein Teil der sekundären Hydroxylgruppen in den Glucoseringen an den Kohlenstoffatomen 2, 3 oder 4 in Ketogruppen umgewandelt worden sind. Dies kann beispielsweise anhand folgender Formel erklärt werden, bei denen die sekundäre Hydroxylgruppe am Kohlenstoff 3 oxidiert worden ist.

-0-CH₂ -0-CH₂

vor Oxidation nach Oxidation

Das Substrat und die gewählten bedingungen für die Züchtung der Mikroorganismen in Gegenwart von Ketodextran können gewählt werden entsprechend der Verfahrensweise, die verwendet wird, wenn Mikroorganismen in der Gegenwart von unverändertem Dextran gezüchtet werden. Der Gehalt an Keto— dextran kann ebenfalls wie bei dem Verfahren mit unverändertem Dextran im uereich von 0,1 bis 10 % im Zuchtmedium sein und so beispielsweise bei 0,5 bis 5 °/o liegen. Die Gewinnung und Isolierung des Enzyms nach der Züchtung kann nach herkömmlichen

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enzymchemischen Methoden, durchgeführt werden. Bas gewonnene Produkt kann oft ohne eine weitere Reinigung verwendet werden, da die Enzymaktivität aufgrund des vorteilhaften Verfahrens nach der Erfindung sehr hoch liegt.

Das Verfahren nach der Erfindung wird in den folgenden Beispielen im einzelnen erläutert.

ii ei spiel 1

1 ml einer Sporensuspension von Penicillium funiculosuiii, die 10 Sporen enthielt, wurde verwendet, um 100 ml eines sterilen Mediums folgender Zusammensetzung zu inokulieren bzw. zu beimpfen: io' g üetodextran; 1 g lief eextrakt; 0,5 g figSo^i 1 g iMii^wOy; 0,5 g 1UIgPl)₄; 0,5 g .K₂IiPO₄ und

1 1 Wasser, ,-tan ließ die Kultur vier Tage lang bei 25 0 in 250 ml Erlenmeyer—u.ol ben wachsen, die r.nf einer rotierenden Schüttelvorrichtung befestigt <:ören und 70 ml Medium on';-hielten. Das für das obi/re Medium verwendete Ketodextran mit eiuera Substitutionsgrad von 20 % ((Uh, 20-lie to gruppen Je 100 (ilucoseeinheiten; wurde erhalten, indem Dextran mit einem Molekulargewicht (M ) von 20 000 mit Diraethylsulfoxid

Yv

und Essigsäureanhydrid oxidiert wurde. Die extrazellulären Enzyme wurden untersucht, indem die feste Phase (Pellets) mit te Is Zentrifugierung aus dem Medium entfernt wurden, die überstehende Flüssigkeit bei 2° C gegen destilliertes Wasser dialysiert wurde und dann das nicht dialysierbare Material lyophilisiert wurde. Die intrazellulären Enzyme wurden gemessen, indem die Zellen' mechanische zerbrochen wurden, die Zelltrümmer durch Zentrifugierung entfernt wurden und die überstehende Flüssigkeit dann dialysiert und lyophiiisiert wurde. Eine Enzymeinheit ist definiert als die Menge» die das Äquivalent von einem u-mblo isonialtose'-Monohydrat aus

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Dextran (H^ - 2υ ϋϋυ) in einer Stunde bei 30° C unter den unten angegebenen bedingungen erzeugt. Das Dextran ^2υυ mg; wurde in 10 ml 0,03 M Phosphat-Puffer, aufgelöst, pi, b,u, und es wurde Dextranase (variierende weugen in 2 ml Vasser) zugesetzt„ Die Reaktionsbedingungen wurden so eiugesteL11;, daß nicht mehr als ein Drittel des Substrats innerhalb einer Stunde hydrolysiert wurde,, unter Verwendung der oben beschriebenen Methode erhielt man folgende Ausbeuten: Ί^ιί^Γ) Einheit en/iug an intrazellulären Enzymen und 07 Liinlie i ten/iul an extrazellulären Enzymen.

uei einem identischen Versuch wurde das entsprechende * Dextran anstelle von Ketodextran (Stand der Technik) verwendet, und man erhielt Ausbeuten von b iiiiuhei te u/mg und 0,6 Einheiten/ml.

Daraus ist zu erseheu, daIi die Ausbeute au Dextranase um ein Mehrfaches erhöht wird, wenn ketodextrau aus te LIe von Dextran als Substrat verwendet wird.

iieispiel 2

Bei diesem Versuch wurden der gleiche Mikroorganismus und dio gLeiohe Verfahrensweise verwendet, wie sie in Beispiel 1 beschrieben sind. Für die üextrauaseorzeuguuff wurde ketodextran mit einem unterschiedlichen Substitutionsgrad verweudet. Die dabei erhalteneu Ergebnisse sind in der folgenden Tabelle 1 zusammengestellt.

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TABELLE I

Substitutions- grad %	Intrazelluläre Akt iv-i t ä t s e in- heiten je mg
O	6
2 ' ■	9
20	kh5
35	205
58 .	205

ExtraζelIuIäre Aktivitätseinheiten je ml

0,6

6,3

67,0

22^,0

Ketodextrane mit einem Substitutionsgrad von 20 bis 58 % ergaben gute Dextranaseausbeuten₀ Ein Substitutionsgrad von ergab eine ζehnlaehe Erhöhung der extrazellulären Aktivität. . Dies ist eine wesentliche Verbesserung, jedoch nicht so wirtscha'ftlich wie bei der Verwendung von höheren Substitutions graden,,

Beispiel 3

In diesem Beispiel wird das Medium durch Glucose ersetzt, wobei die Glucose in einer Konzentration von 0,7, 1jk und 2,8 mg/ml verwendet wird. Die Züchtungsbedingungen und die Untersuchungsverfahren wurden wie oben beschrieben durchgeführt. Es wurde Ketodextran verwendet, das einen Substitutionsgrad von 20 $ besaß. Die Ergebnisse sind in TABELLEII zusammengefaßt„

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TABELLE II

Glucose (mg je
ml Medium)

Wachstum (mg je ml Medium)

Intrazelluläre Extrazelluläre Aktivität Aktivität (Einheiten je mg (Einheiten je nichtdialysier- ml) bares Material)

O	2,0
0,7	2,4
1,4	4,2
2,8	3,8

	67
746	170
762	3OU
480	61

Aus den Ergebnissen dieser Tabelle ist zu ersehen, daß die Dextranaseausbeute weiter erhöht werden kann, indem das Wachstumsmedium mit Glucose versetzt wird, Bei der Verwendung eines Ketodextrans mit einem Substitutionsgrad von 20 % lag die optimale Zusatzmenge an Glucose bei etwa 1,4 mg/ml. Dadurch wurde die Wachstumsmenge und die intrazelluläre Dex—
tranasekonzentration erhöht, wodurch die Ausbeute an intrazellulärer Dextranase etwa um das Vierfache erhöht wurde.
Die Konzentration der extrazellulären Dextranase erhöhte
sich von 67 auf 300 Einheiten/ml.

Beispiel 4

Das Medium kann auch durch andere leicht assimilierbare oder assimilierte Zuckerarten als Glucose ergänzt werden.
Einige Beispiele sind in der folgenden TABELLE III angegeben. Der Substitutionsgrad des verwendeten Ketodextrans lag bei
35 %.

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TABELLE III

Zusatz

Zusatz (1,
ml Medium)

mg per Intrazelluläre Dextranase (Einheiten je mg niehtdialysier~ bares Material)

Extrazelluläre Dextranase (Einheiten je ml)

—	205
Glucose	636
Galactose	703
Saccharose	516
Mannose " -~	550
Dextran (M.W. 20 000)	_

224 444 476 394 390 620

Aus den in TABELLE. ΪΙΙ angeführten Ergebnissen ist zu ersehen, daß Glucose, Galactose, Saccharose, Dextran und Mannose das Ketodextran enthaltende Medium in vorteilhafter Weise unterstützen. In allen Fällen erhielt man eine hervorragende Ausbeute an Dextranase.

Beispiel 5

In diesem Beispiel wurden¹ Penicillium lilacinuin (American Type Culture Collection 10114), Spicaria violaeca (ATCC 10525) und Penicillium Venioulosum (ATCC IO5I3) anstelle von Penicillium funioulosum verwendet, um Dextranase herzustellen. Der Subetitutionsgrad des verwendeten Ketodextruna lag bei 20 54. Die Ergebnisse dieser Untersuchung sind in der TABELLE IV zusammengefaßt.

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TiUiELLE IV

Organismus

Subotrat

Intrazelluläre Extrazelluläre Dextranase Dextranase (Einheiten je (Einheiten mg nichtdialy~ je mL) siertes Material)

P, lilacinum	Dextran	7,4
	ketodextran	17,0
	Ketodextran +
	1, 4 mg UIu-
	eose/ml	18,7
S. violacea	Dextran	6,0
	Ketodextran +
	1,4 mg GIu-
	cose/iiil	12,0
P₀ venuculosum Dextran




ketodextran
Ketodextran +
1,4 mg IiI u~
cose/ml

4,5

18,8

24,3 1,5

o,53 0,24

0,10

Diese üeispiele zeigen, daß auch andere Mikroorganismen als Penicillium funiculQSum stimuliert werden können, um erhöhte Mengen an Dextranase unter Verwendung von Ketodextrau und Mediurazusätzeu zu erzeugen. Jedoch können nicht alle Mikroorganismen stimuliert werden.

Für den Mikroorganismus ist es wesentlich, daß er auf dem Kohlenstoff des Ketodextrans wächst und diesen in einem Substrat, das Ketodextran enthält, als Energiequelle verwendet, Penicillium funiculosum, Ponicillium lilaoinum und Spioaria violacea haben diese charakteristischen Eigenschaften,

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Es können auch eine ganze Reihe anderer Mikroorganismen verwendet werden. Geeignete Mikroorganismen können aus Erde isoliert werden, die den Orten entnommen wird, an denen Abfallerzeugnisse aus Papiermühlen verworfen werden. In einem solchen Falle wird ein Wachstumsmedium aus anorganischen Salzen und Ketodextran als im wesentlichen die einzige Kohlenstoffquelle für das Wachstum des Mikroorganismus in ähnlicher Weise wie in Beispiel 1 beschrieben, hergestellte Das Wachstumsmedium wird mit Erde beimpft, jedoch sind nur diejenigen Organismen fähig zu wachsen, die durch Ketodextran stimuliert werden zur Erzeugung einer erhöhten Menge an Dextranase. Diejenigen Mikroorganismen^ die so nicht wachsen können, entwickeln sich nicht„ JSiach einem etwa zweitägigen Wachstum wird ein Teil der Kultur entfernt und in ein frisches Medium gegeben,, Diese Verfahrensweise wird mehrere Male wiederholt und dann wird eine Kultur ausgewählt, die eine erhöhte. Menge an Dextranase erzeugt, wie sie auf Ketodextran wächst» In einigen Fällen ist ein festes Medium vorteilhafter für die Isolierung. Zu diesem Zweck können beispielsweise 2 % Agar-Agar zugesetzt werden, um das Medium festwerden zu lassen.

In 100 Stunden und unter den in Beispiel 1 beschriebenen Bedingungen wachsen in einem Medium, das 1 % Ketodextran enthält, 2,0 mg/ml Penicillium funtculosum, 0,9 mg/ml Penioillium lilacinum und 0",5 mg/ml Spicar^ia violacca. Es handelt sich dabei um Trockengewicht je ml«, Der Substitutionsgrad des Ketodextrans lag bei 20 $>.

Das Penicillium funiculosum nach Beispiel 1 wurde aus Erde Isoliert, auf die Pulpabfälle abgeführt worden waren. Das in Beispiel 1 beschriebene Medium wurde mit 2 % Agar-Agar verfestigt. Dieses Medium wurde in eine Petri—Schale gegeben

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und eine kleine Menge der Erde wurde über die Oberfläche des Agar-Agars verteilte Nach einer Inkubation von drei Tagen bei 25° C entwickelten sich einige Kolonien» Ein Impfstoff aus diesen Kolonien wurde auf frisches Agar-Agar Überführt. Diese Verfahrensweise wurde solange wiederholt, bis saubere Kulturen erhalten wurden. Eine solche Kultur wurde als Penicillium funiculosum entsprechend Thorn, "The Penicillia", identifiziert.

In einem anderen Falle wurde ein flüssiges Medium verwendet, das die in Beispiel 1 beschriebene Zusammensetzung besaß . Eine kleine Erdprobe wurde in einen 250 ml—Erlen— meyer-Kolben gegeben, der 70 ml Medium enthielt. Der Kolben wurde drei Tage lang bei 25° C auf einer Rotationsschüttelvorriohtung bewegt. Ein kleiner Teil der entstandenen Kultur wurde auf ein frisches flUssiges Medium überführt und weitere drei Tage inkubiert. Dieses Verfahren wurde zweimal wiederholt. Schließlich wurde diese Kultur auf dem im oberen Absatz beschriebenen festen Medium aufgetragen bzw. aufgestreift. Es wurde eine reine Kultur einer Penicillium—Spesies isoliert, deren Mycel—Fragmente eine hefeähnliche Art des Wachstums ergaben. Die Möglichkeit der Fragmentierung wäre für Fermentationen im großen Ausmaße von Vorteil.

In ähnlicher Weise wurden andere Penicillium-Kulturen, die nicht in bezug auf die Spezies identifiziert wurden, sondern durch Anreicherungskultivierungen wie oben beschrieben herausgewählt wurden, stimuliert, um Dextranase mittels Ketodextran zu erzeugen, und zwar in Fällen, in denen das Waohstum der Kultur in 100 Stunden und in einem Medium, das 1 % Ketodextran mit einem 20 folgen Substitutionsgrad enthielt, bei mindestens 0,5 mg Trookengewieht je ml lag.

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Das Medium enthielt O_S1 $ iiefeextrakt „ Dieses wurde zugesetzt als Quelle für Spurenmineralien, Vitamine und Wachstumsfaktoren, Obgleich ein Mefeextrakt in dieser Konzentration das Wachstum der Mikroorganismen fördert, können Mikroorganismen, die Ketodextran als eine -Kohlenstoffquelle verwenden, unterschieden werden, indem auf einem Medium kultiviert wird, das Ketodextran und iiefeextrakt und Salze enthält oder auf einem Medium, das Iiefeextrakt und lediglich Salze enthält. Das Wachstum ist bei dem ersteren bedeutend besser als beim letzteren.

Der in diesem Medium enthaltene Zusatz hefe beeinflußt nicht die Isolierungseigenschaften des Mediums, weil der Gehalt an Kohlenstoff so gering ist. Viele hefeextraktähnliche Zusätze wie Leberextrakt, Fleischextrakt, Gehirnkerninfusions— extrakt (brain heart infusion extract) enthalten Kohlenstoff, jedoch muß darauf achtgegeben werden, daß zu große Zusätze an Kohlenstoff die Selektivität des Ketodextrans zerstören.

Nicht alle Organismen wachsen im ausreichenden Maße in der Gegenwart von Ketodextran zwecks einer wirtschaftlichen Produktionserhöhung der Dextranase, In diesem Zusammenhang muß spezifiziert werden, daß der Organismus vorzugsweise verwendet werden sollte, der auf dem Kohlenstoff des Keto« dextrans als seine wesentliche und einzige Energiequelle wächst und ebenfalls in dem Medium und unter den in Beispiel 1 spezifizierten Bedingungen bis zu mindestens 0,5 mg Trockengewicht je ml über einen Zeitraum von 100 Stunden auf Keto« dextran wächst, das einen Substitutionsgrad von 20 % besitzto

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Claims

PATENTANSPRÜCHE

1. Verfahren zur iiersteilung von Dextranase mittels Mikroorganismen, dadurch gekennzeichnet, daß ein Mikroorganismus gezüchtet wird, der auf einem Ketodextran enthaltenden Substrat wächst, wobei der Kohlenstoff des Ketodextrans als Energiequelle dient.

2. Verfahren nach Anspruch i, dadurch gekennzeichnet, daß das Substrat ein leicht assimiliertes lvohleuhydrat enthält ο

3. Verfahren nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, daß das Leicht assimilierte Kohlenhydrat aus Glucose, Galactose, Saccharose, Dextran und/oder Mannose besteht.

k. Verfahren nach Ansprüchen 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, daß der Mikroorganismus eine Wachstumsrate von mindestens 0,5 mg Trockengewicht je ml in 100 Stunden auf einem Substrat besitzt, das aus 10 g Ketodextran, 1 g iiefeextrakt, 0,5 g MgSO^, 1 g Nu₄NO,, 0,5 g Kh₂PO₄, 0,5 g KgIiPO. und einem Liter Wasser besteht und der Substitutionsgrad des Ketodextrans bei 20 % liegt.

5. Verfahren nach Ansprüchen i oder 2, dadurch gekennzeichnet, daß der Substitutionsgrad des Ketodextrans bei 2 bis 5B % liegt.

6. Verfahreu nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, daß ein leicht assimiliertes Kohlenhydrat wie Glucose, Galactose, Saccharose, Dextran und/oder Mannose verwendet wird und der Substitutionsgrad des Ketodextrans bei 2 bis 58 i» Liegt.

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7. Verfahren nach Ansprüchen 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, daß der Mikroorganismus eine Wachstumsrate von mindestens 0,5 mg Trockengewicht je ml in iOü Stunden auf einem Substrat besitzt, das aus 10 g Ketodextran, i g Hefeextrakt, 0,5 g MgSO^, 1 g NH₄JSO₃, 0,5 g KH₂PO₄, 0,5 g K₂HPO₄ und einem Liter Wasser besteht, und der Substitutionsgrad des Ketodextrans bei 20 % lag und der Substitutionsgrad des Ketodextrans bei 2 bis 58 % liegt.

8. Verfahren nach Ansprüchen 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, daß als Mikroorganismus Penicillium funiculosum, Penicillium lilacinum, Penicillium veniculdsum und Spicaria violacca verwendet werden.

9. Verfahren nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet,

daß als leicht assimiliertes Kohlenhydrat Glucose, Galactose, Saccharose, Dextran und/oder Mannose und als Mikroorganismus Peniciilium funiculosum, Penicillium lilacinum, Penicillium veniculosum und Spicaria violacca verwendet werden_o

10. Verfahren nach Ansprüchen 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, daß der Mikroorganismus eine Wachstumsrate von mindestens 0,5 mg Trockengewicht je ml in 100 Stunden auf einem Substrat besitzt, das aus 10 g Ketodextran, 1 g Hefe— extrakt, 0,5 g MgSO₄, 1 g NH₄NO₃, 0,5 g KH₂PO₄, 0,5 g K₂HPO₄ und einem Liter Wasser besteht und der Substitutionsgrad des Ketodextrans bei 20 % liegt und als Mikroorganismus Penicillium funiculosum, Penicillium lilacinum, Penicillium veniculosum und Spicaria violacca verwendet werden.

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