DE865045C

DE865045C - Verfahren zur Herstellung von Streptomycin

Info

Publication number: DE865045C
Application number: DE1949P0039504
Authority: DE
Inventors: Arabelle Banton Hodges
Original assignee: Merck and Co Inc
Current assignee: Merck and Co Inc
Priority date: 1947-10-18
Filing date: 1949-04-10
Publication date: 1953-01-29
Also published as: FR999986A; FR1017469A; GB677423A

Description

Die Anzahl der Stämme von Streptomyces griseus, welche für die Herstellung von Streptomycin durch Fermentierung in Nährmedien geeignet sind, ist verhältnismäßig gering. Alle Streptomycin erzeugenden Stämme stammen von einigen wenigen Mutterstämmen ab, welche aus natürlichen Quellen gewonnen worden sind. Es hat sich in der Vergangenheit als möglich erwiesen, durch Aussonderung aus natürlichen Stämmen Tochterstämme zu erhalten, welche etwas höhere Streptomycinausbeuten liefern als die Mutterstämme. Die auf diesem Wege erzielbaren Verbesserungen sind aber für technisch-wirtschaftliche Zwecke nicht ausreichend.

Gegenstand vorliegender Erfindung ist ein Verfahren zur Herstellung von Streptomycin, mit Hilfe künstlich veredelter Stämme von Streptomyces gri-* seus, das dadurch gekennzeichnet ist, daß Sporen eines Streptomycin erzeugenden Stammes von Streptomyces griseus mit ultraviolettem Licht bestrahlt, die überlebenden Sporen isoliert, die isolierten Sporen in separaten Nährmedien fortgepflanzt, der Streptomycingehalt der fermentierten Medien ermittelt, auf Grund dieser Ermittlung die veredelten Stämme, welche befähigt sind, erheblich höhere Streptomycinausbeuten zu liefern als die Mutterstämme, ausgewählt und zur Herstellung von Streptomycin verwendet werden. Hierdurch gelingt es, hohe Streptomycinausbeuten liefernde Stämme sehr viel rascher zu entwickeln als es bisher möglich war und Stämme zu erzeugen, die Ausbeuten liefern, die 40 bis 60 % und mehr über den Ausbeuten liegen, die mit den Mutterstämmen erhältlich sind.

In Ausübung der Erfindung kann man z. B. derart verfahren, daß Sporen eines ausgewählten Mutterstammes von ' Streptomyces griseus, die in einem, flüssigen Medium suspendiert oder auf eine geeignete Oberfläche eines Nährmediums, z. B. Agar, ausgebreitet sind, kurze Zeit, z. B. mehrere Minuten, der Einwirkung ultravioletten Lichtes ausgesetzt werden. Die Zeitdauer der Bestrahlung, die abhängig ist von der Entfernung der Sporen von der Lichtquelle, ist so ίο zu bemessen, daß eine Zerstörung oder Abtötung der Mehrzahl der Sporen stattfindet. Im allgemeinen ist es ratsam, mindestens 90% der Sporen zu zerstören. Gute Ergebnisse werden erhalten, wenn etwa 99 °/„ der Sporen durch die Bestrahlung abgetötet werden. Die überlebenden Sporen werden isoliert und zur Entwicklung individueller Kulturen von Streptomyces griseus verwendet, was auf verschiedenen Wegen geschehen kann. Man verfährt z. B. derart, daß die überlebenden Sporen auf Nähragar ausgestrichen werden, um die individuellen Kulturen und Kolonien zu entwickeln und diese Kulturen in Gegenwart eines Nährmediums zwecks Sporensprossung und Kulturenentwicklung fermentiert werden. Die so erhaltenen Stammkulturen werden zur Beimpfung von Nährmedien verwendet und die beimpften Medien vorzugsweise bei einer Temperatur von etwa 28⁰ für die Dauer von 3 oder 4 Tagen fermentiert, bis eine maximale Streptomycinerzeugung stattgefunden hat. Die Fermentationsmedien werden dann auf ihren Streptomycingehalt geprüft. Die Anzahl der aus den durch die Bestrahlung nicht abgetöteten Sporen entwickelten Kulturen kann z. B. 400 oder 500 oder auch mehr betragen, Durch Vergleich der S1;reptomycinausbeuten, welche mit den einzelnen Kulturen erzielt worden sind, ist es möglich, eine Anzahl von Stämmen von Streptomyces griseus auszuwählen, welche im Vergleich mit dem Mutterstamm eine besonders starke Erhöhung der Streptomycinausbeute geliefert haben. Obwohl die Ausbeuteerhöhungen an Streptomycin erheblichen Schwankungen unterliegen, ist es im allgemeinen möglich, aus einer einmaligen ultravioletten Lichtbehandlung der vorstehend beschriebenen Art mehrere veredelte Stämme von Streptomyces griseus zu gewinnen, welche Streptomycinausbeuten liefern, die wesentlich höher sind als die mit den Mutterstämmen erzielbaren Ausbeuten. Die so erhaltenen ausgewählten Stämme können einer zusätzlichen Bestrahlung mit ultraviolettem Licht oder auch mehreren derartigen Bestrahlungen unterworfen werden. Hierdurch kann man veredelte Stämme von Streptomyces griseus gewinnen, die befähigt sind, sehr· viel höhere Ausbeuten an Streptomycin zu liefern als die Mutterstämrne. Die erfindungsgemäß veredelten Stämme zeigen im Vergleich zu den Mutterstammen keine ausgeprägten morphologischen Veränderungen. Das wesentliche Kennzeichen der veredelten Stämme ist ihre Fähigkeit, hohe Strepto-•mycinausbeuten zu liefern.

Die Herstellung von Streptomycin mit Hilfe von veredelten Stämmen kann in üblicher Weise erfolgen. Die veredelten Stämme liefern hohe Ausbeuten; mit den meisten gebräuchlichen Nährmedien, wie gefunden wurde, kann man aber die Ausbeute noch weiter verbessern, indem man die Zusammensetzung des Nährmediums den ausgewählten Stämmen von Streptomyces griseus derart anpaßt, daß optimale Bedingungen vorliegen.

Beispiel· ι

Ein Stamm von Streptomyces griseus, der bei 3tägiger Fermentierung in einer hefehaltigen Nährflüssigkeit bei 28° unter Tauchbedingungen und Belüftung eine Streptomycinausbeute von 180 mcg/ccm lieferte, wurde als Mutterstamm - ausgewählt. Eine Vorratssuspension dieses Stammes in Wasser, welche eine geringe Menge von Natriumlaurylsulfat enthielt, wurde nach Filtration durch sterile Watte in eine sterile Flasche gegossen. Acht Portionen dieser Suspension von je 10 ecm wurden in Petrischalen gegeben, die mit einem Abstand von 61 cm von einer ultravioletten Lichtquelle aufgestellt wurden. Die Schalen wurden unter gleichmäßiger Bewegung durch Schütteln etwa I¹Z₂ Minuten der Wirkung des Lichtes ausgesetzt, wobei etwa 95 °/₀ der Sporen abgetötet wurden. Die bestrahlten, die überlebenden Sporen enthaltenden Suspensionen wurden dann in einer sterilen- Flasche vereinigt und für die Entwicklung von Kulturen aus den überlebenden Sporen verwendet. Von Zeit zu Zeit wurden 1 ecm Portionen von der Suspension entnommen, der Reihe nach verdünnt und auf Hefeextrakt-Dextrose-Agar (1 °/₀ Hefeextrakt, 0,5 °/₀ Dextrose, 2 % Agar, mit Wasser auf 100 °/₀ aufgefüllt) ausgestrichen. Nach 6tägiger Inkubation bei 28⁰ wurden alle gut isolierten Kolonien auf Agar übertragen, der 15 ecm von Hefeextrakt-Dextrose-Agar enthielt und bei etwa 28⁰ für die Dauer von 72 Stunden fermentiert. Sporensuspensiönen in Wasser, die einen geringen Betrag von Natriumlaurylsulfat enthielten, wurden zur Beimpfung der Flaschen verwendet, die mit einem Medium von folgender Zusammensetzung beschickt waren: 1 % NaCl, 1% Dextrose, 0,5% NaNo₃, 0,1 % MgSO₄, 0,1% K₃HPO₄, 0,1 % CaCl₂, 10 mg/1 FeSO₄, 2 mg/1 ZnSO₄, Wasser 100 Volumprozent, 25 °/₀ Trockenhefe, pn = 6,5.

Alle Bestandteile außer K₂HOP₄ und CaCl₂ werden zusammen in Wasser gelöst. K₂HPO₄ und CaCl₂ werden separat gelöst und später zugefügt. Die Lösung wird alsdann in Flaschen gegeben und 2,5 °/₀ Trockenhefe zugefügt.

Je zwei Flaschen werden mit jedem der isolierten Stämme beimpft und bei 28⁰ unter dauernder Bewegung und Belüftung des Mediums mit Hilfe eines rotierenden Schüttlers fermentiert. Nach 3tägiger und 4tägiger Inkubation werden Proben des fermentierten Mediums aus den Flaschen entnommen und die Proben aus den mit dem gleichen Stamm beimpften Doppelflaschen zwecks Bildung einer einzigen Probe miteinander vereinigt und der Streptomycingehalt der so gewonnenen Proben ermittelt.

Das vorstehend beschriebene Verfahren wurde mit itwa 500 Stämmen von Streptomyces griseus durchgeführt, die aus Sporen entwickelt wurden, welche die ultraviolette Bestrahlung überlebt hatten. Es ergab sich, daß 30 °/₀ der Stämme Streptomycinausbeuten lieferten, die mehr als 15 % höher waren als die mit den Mutterstämmen erhältlichen Streptomycinaus-

beuten. 26 von diesen höhere Ausbeuten liefernden Stämmen, welche bei dem Prüfen die besten Streptomycinausbeuten aufwiesen, wurden auf Hefeextrakt-Dextrose-Agar übertragen, bei 28° 4 bis 5 Tage zwecks Sporenbildung fermentiert und die Sporensuspensionen zur Beimpfung von mit Hefemedium beschickten Doppelflaschen in der vorstehend beschriebenen Weise verwendet.

Die beimpften Medien wurden in der früher beschriebenen Weise fermentiert und nach 3 und 4 Tagen auf ihren Streptomycingehalt geprüft. Auf Grund der Prüfungsergebnisse wurden zwei Stämme ausgewählt, welche die höchsten Streptomycinausbeuten lieferten. Sporen von Kulturen dieser Stämme wurden zur Beimpfung von vier Flaschen benutzt, die mit hefehaltiger Nährflüssigkeit beschickt waren. Die beimpften Flaschen wurden bei 28⁰ unter Bewegung und Belüftung fermentiert. Eine entsprechende Anzahl von Flaschen wurde mit Sporen des nichtbestrahlten Mutterstammes von Streptomyces griseus beimpft und unter gleichen Bedingungen fermentiert. Die in den verschiedenen Flaschen befindlichen fermentierten Medien wurden nach 3tägiger Inkubation auf ihren Streptomycingehalt geprüft; die Streptomycinausbeuten und die prozentualen Ausbeuteerhöhungen der bestrahlten Stämme im Vergleich zu den Mutterstämmen sind aus folgender Tabelle ersichtlich:

Streptomycinerzeugung

	Flasche A	Kontroll	Veredelte	Ausbeute
	B	kultur	Kultur	erhöhung
	C	mg/ccm	mg/ccm	in %
Nr. ι	- D	146	240	65
	Flasche A	146	240	65
	B	156	260	66
	-. C	156	260	66
Nr. 2	D	170	240	41
	170	240	41
	170	260	53
	170	214	26

Beispiel 2

Das Verfahren nach Beispiel 1 wurde wiederholt mit der Maßgabe, daß ein Mutterstamm von Streptomyces griseus angewendet wurde, der 270 mg/ccm Streptomycin lieferte, wenn er in einem Sojabohnenmehlmedium folgender Zusammensetzung fortgepflanzt wurde:

Sojabohnenmehl 2%

Dextrose 1 %

Natriumchlorid 1 %

aufgefüllt mit destilliertem Wasser auf 100%.

Eine Sporensuspension dieses ausgewählten Stammes von Streptomyces griseus wurde mit ultraviolettem Licht, wie in Beispiel 1 beschrieben, bestrahlt, wobei etwa 99 % der Sporen abgetötet wurden. Die überlebenden Sporen wurden, wie in Beispiel 1 beschrieben, auf Hefeextrakt-Dextrose-Agar entwickelt, wobei Stammkulturen von veredelten Stämmen von Streptomyces griseus, und zwar 500 derartiger Kulturen, erzeugt wurden. Sporen von diesen 500 Kulturen wurden zur Beimpf ung von je drei Flaschen verwendet, die mit einem Sojabohnenmehlmedium der oben beschriebenen Zusammensetzung beschickt waren. Die beimpften Flaschen wurden bei 28° unter dauernder Bewegung und Belüftung fermentiert und nach 3, 4 und 5 Tagen der Streptomycingehalt ermittelt. Die Ergebnisse dieser Prüfungen zeigten, daß etwa 30 % der veredelten Stämme Streptomycinausbeuten lieferten, die mindestens 20 % höher waren als die mit dem Mutterstamm erzielbaren Ausbeuten. Etwa 8 % der veredelten Stämme gaben Ausbeuten, welche um mindestens 50 % höher waren als die mit dem Mutterstamm erzielbaren Ausbeuten.

Es hat sich gezeigt, daß die erfindungsgemäß veredelten Stämme auch beim Arbeiten im großen wesentlieh erhöhte Streptomycinausbeuten liefern und diese Ausbeuten noch weitergehend erhöht werden können, wenn man Nährmedien verwendet, welche Sojabohnenmehl enthalten und z. B. aus einem Gemisch von etwa 2 °/₀ Sojabohnenmehl, 1 °/₀ Dextrose und 1 °/₀ Natriumchlorid bestehen, das mit Wasser auf 100 % aufgefüllt worden ist.

Claims

PATENTANSPRÜCHE:

1. Verfahren zur Herstellung von Streptomycin, dadurch gekennzeichnet, daß Sporen eines Streptomycin erzeugenden Stammes von Streptomyces griseus mit ultraviolettem Licht bestrahlt, die überlebenden Sporen isoliert, die isolierten Sporen in separaten Nährmedien fortgepflanzt, der Streptomycingehalt der fermentierten Medien ermittelt, auf Grund dieser Ermittlung die veredelten Stämme von Streptomyces griseus, welche befähigt sind, höhere Streptomycinausbeuten zu liefern als der Mutterstamm, ausgewählt und zur Herstellung von Streptomycin verwendet werden.

2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß die Bestrahlung der Sporen mit ultraviolettem Licht unter solchen Bedingungen durchgeführt wird, daß mindestens 90 % der Sporen abgetötet werden.

3. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß Kulturen, welche höhere Streptomycinausbeuten liefern als die Muttersubstanz, no einer erneuten Behandlung gemäß Ansprüchen 1 und 2 unterworfen und die hierbei ausgewählten veredelten Stämme zur Herstellung von Streptomycin verwendet werden.

4. Verfahren zur Herstellung von Streptomycin, dadurch gekennzeichnet, daß die nach Ansprüchen 1 und 2 veredelten Stämme von Streptomyces griseus in Nährmedien fermentiert werden, welche Sojabohnenmehl enthalten und z. B. aus einem Gemisch von etwa 2 % Sojabohnenmehl, 1 °/₀ Dextrose und ι % Natriumchlorid bestehen, das mit Wasser auf 100 % aufgefüllt ist.

) 5660 1.