DE865045C - Verfahren zur Herstellung von Streptomycin - Google Patents
Verfahren zur Herstellung von StreptomycinInfo
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- C12P19/00—Preparation of compounds containing saccharide radicals
- C12P19/44—Preparation of O-glycosides, e.g. glucosides
- C12P19/46—Preparation of O-glycosides, e.g. glucosides having an oxygen atom of the saccharide radical bound to a cyclohexyl radical, e.g. kasugamycin
- C12P19/54—Preparation of O-glycosides, e.g. glucosides having an oxygen atom of the saccharide radical bound to a cyclohexyl radical, e.g. kasugamycin the cyclohexyl radical being bound directly to a nitrogen atom of two or more radicals, e.g. streptomycin
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Description
Die Anzahl der Stämme von Streptomyces griseus,
welche für die Herstellung von Streptomycin durch Fermentierung in Nährmedien geeignet sind, ist verhältnismäßig
gering. Alle Streptomycin erzeugenden Stämme stammen von einigen wenigen Mutterstämmen
ab, welche aus natürlichen Quellen gewonnen worden sind. Es hat sich in der Vergangenheit als möglich
erwiesen, durch Aussonderung aus natürlichen Stämmen Tochterstämme zu erhalten, welche etwas höhere
Streptomycinausbeuten liefern als die Mutterstämme. Die auf diesem Wege erzielbaren Verbesserungen sind
aber für technisch-wirtschaftliche Zwecke nicht ausreichend.
Gegenstand vorliegender Erfindung ist ein Verfahren zur Herstellung von Streptomycin, mit Hilfe
künstlich veredelter Stämme von Streptomyces gri-* seus, das dadurch gekennzeichnet ist, daß Sporen
eines Streptomycin erzeugenden Stammes von Streptomyces griseus mit ultraviolettem Licht bestrahlt, die
überlebenden Sporen isoliert, die isolierten Sporen in separaten Nährmedien fortgepflanzt, der Streptomycingehalt
der fermentierten Medien ermittelt, auf Grund dieser Ermittlung die veredelten Stämme,
welche befähigt sind, erheblich höhere Streptomycinausbeuten zu liefern als die Mutterstämme, ausgewählt
und zur Herstellung von Streptomycin verwendet werden. Hierdurch gelingt es, hohe Streptomycinausbeuten
liefernde Stämme sehr viel rascher zu entwickeln als es bisher möglich war und Stämme zu
erzeugen, die Ausbeuten liefern, die 40 bis 60 % und mehr über den Ausbeuten liegen, die mit den Mutterstämmen
erhältlich sind.
In Ausübung der Erfindung kann man z. B. derart verfahren, daß Sporen eines ausgewählten Mutterstammes
von ' Streptomyces griseus, die in einem, flüssigen Medium suspendiert oder auf eine geeignete
Oberfläche eines Nährmediums, z. B. Agar, ausgebreitet sind, kurze Zeit, z. B. mehrere Minuten, der
Einwirkung ultravioletten Lichtes ausgesetzt werden. Die Zeitdauer der Bestrahlung, die abhängig ist von
der Entfernung der Sporen von der Lichtquelle, ist so
ίο zu bemessen, daß eine Zerstörung oder Abtötung der Mehrzahl der Sporen stattfindet. Im allgemeinen ist
es ratsam, mindestens 90% der Sporen zu zerstören. Gute Ergebnisse werden erhalten, wenn etwa 99 °/„ der
Sporen durch die Bestrahlung abgetötet werden. Die überlebenden Sporen werden isoliert und zur Entwicklung
individueller Kulturen von Streptomyces griseus verwendet, was auf verschiedenen Wegen geschehen
kann. Man verfährt z. B. derart, daß die überlebenden Sporen auf Nähragar ausgestrichen
werden, um die individuellen Kulturen und Kolonien zu entwickeln und diese Kulturen in Gegenwart eines
Nährmediums zwecks Sporensprossung und Kulturenentwicklung fermentiert werden. Die so erhaltenen
Stammkulturen werden zur Beimpfung von Nährmedien verwendet und die beimpften Medien vorzugsweise
bei einer Temperatur von etwa 280 für die Dauer von 3 oder 4 Tagen fermentiert, bis eine
maximale Streptomycinerzeugung stattgefunden hat.
Die Fermentationsmedien werden dann auf ihren Streptomycingehalt geprüft. Die Anzahl der aus den
durch die Bestrahlung nicht abgetöteten Sporen entwickelten Kulturen kann z. B. 400 oder 500 oder auch
mehr betragen, Durch Vergleich der S1;reptomycinausbeuten,
welche mit den einzelnen Kulturen erzielt worden sind, ist es möglich, eine Anzahl von Stämmen
von Streptomyces griseus auszuwählen, welche im Vergleich mit dem Mutterstamm eine besonders
starke Erhöhung der Streptomycinausbeute geliefert haben. Obwohl die Ausbeuteerhöhungen an Streptomycin
erheblichen Schwankungen unterliegen, ist es im allgemeinen möglich, aus einer einmaligen ultravioletten
Lichtbehandlung der vorstehend beschriebenen Art mehrere veredelte Stämme von Streptomyces
griseus zu gewinnen, welche Streptomycinausbeuten liefern, die wesentlich höher sind als die mit
den Mutterstämmen erzielbaren Ausbeuten. Die so erhaltenen ausgewählten Stämme können einer zusätzlichen
Bestrahlung mit ultraviolettem Licht oder auch mehreren derartigen Bestrahlungen unterworfen
werden. Hierdurch kann man veredelte Stämme von Streptomyces griseus gewinnen, die befähigt sind,
sehr· viel höhere Ausbeuten an Streptomycin zu liefern als die Mutterstämrne. Die erfindungsgemäß veredelten
Stämme zeigen im Vergleich zu den Mutterstammen keine ausgeprägten morphologischen Veränderungen.
Das wesentliche Kennzeichen der veredelten Stämme ist ihre Fähigkeit, hohe Strepto-•mycinausbeuten
zu liefern.
Die Herstellung von Streptomycin mit Hilfe von veredelten Stämmen kann in üblicher Weise erfolgen.
Die veredelten Stämme liefern hohe Ausbeuten; mit den meisten gebräuchlichen Nährmedien, wie gefunden
wurde, kann man aber die Ausbeute noch weiter verbessern, indem man die Zusammensetzung
des Nährmediums den ausgewählten Stämmen von Streptomyces griseus derart anpaßt, daß optimale
Bedingungen vorliegen.
Beispiel· ι
Ein Stamm von Streptomyces griseus, der bei 3tägiger Fermentierung in einer hefehaltigen Nährflüssigkeit
bei 28° unter Tauchbedingungen und Belüftung eine Streptomycinausbeute von 180 mcg/ccm
lieferte, wurde als Mutterstamm - ausgewählt. Eine Vorratssuspension dieses Stammes in Wasser,
welche eine geringe Menge von Natriumlaurylsulfat enthielt, wurde nach Filtration durch sterile Watte in
eine sterile Flasche gegossen. Acht Portionen dieser Suspension von je 10 ecm wurden in Petrischalen gegeben,
die mit einem Abstand von 61 cm von einer ultravioletten
Lichtquelle aufgestellt wurden. Die Schalen wurden unter gleichmäßiger Bewegung durch Schütteln
etwa I1Z2 Minuten der Wirkung des Lichtes ausgesetzt,
wobei etwa 95 °/0 der Sporen abgetötet wurden. Die bestrahlten, die überlebenden Sporen enthaltenden
Suspensionen wurden dann in einer sterilen- Flasche vereinigt und für die Entwicklung von Kulturen aus
den überlebenden Sporen verwendet. Von Zeit zu Zeit wurden 1 ecm Portionen von der Suspension entnommen,
der Reihe nach verdünnt und auf Hefeextrakt-Dextrose-Agar (1 °/0 Hefeextrakt, 0,5 °/0 Dextrose,
2 % Agar, mit Wasser auf 100 °/0 aufgefüllt) ausgestrichen.
Nach 6tägiger Inkubation bei 280 wurden alle gut isolierten Kolonien auf Agar übertragen, der 15 ecm
von Hefeextrakt-Dextrose-Agar enthielt und bei etwa 280 für die Dauer von 72 Stunden fermentiert.
Sporensuspensiönen in Wasser, die einen geringen Betrag von Natriumlaurylsulfat enthielten, wurden
zur Beimpfung der Flaschen verwendet, die mit einem Medium von folgender Zusammensetzung beschickt
waren: 1 % NaCl, 1% Dextrose, 0,5% NaNo3,
0,1 % MgSO4, 0,1% K3HPO4, 0,1 % CaCl2, 10 mg/1
FeSO4, 2 mg/1 ZnSO4, Wasser 100 Volumprozent,
25 °/0 Trockenhefe, pn = 6,5.
Alle Bestandteile außer K2HOP4 und CaCl2 werden
zusammen in Wasser gelöst. K2HPO4 und CaCl2
werden separat gelöst und später zugefügt. Die Lösung wird alsdann in Flaschen gegeben und 2,5 °/0
Trockenhefe zugefügt.
Je zwei Flaschen werden mit jedem der isolierten Stämme beimpft und bei 280 unter dauernder Bewegung
und Belüftung des Mediums mit Hilfe eines rotierenden Schüttlers fermentiert. Nach 3tägiger
und 4tägiger Inkubation werden Proben des fermentierten Mediums aus den Flaschen entnommen und die
Proben aus den mit dem gleichen Stamm beimpften Doppelflaschen zwecks Bildung einer einzigen Probe
miteinander vereinigt und der Streptomycingehalt der so gewonnenen Proben ermittelt.
Das vorstehend beschriebene Verfahren wurde mit itwa 500 Stämmen von Streptomyces griseus durchgeführt,
die aus Sporen entwickelt wurden, welche die ultraviolette Bestrahlung überlebt hatten. Es ergab
sich, daß 30 °/0 der Stämme Streptomycinausbeuten
lieferten, die mehr als 15 % höher waren als die mit den Mutterstämmen erhältlichen Streptomycinaus-
beuten. 26 von diesen höhere Ausbeuten liefernden Stämmen, welche bei dem Prüfen die besten Streptomycinausbeuten
aufwiesen, wurden auf Hefeextrakt-Dextrose-Agar übertragen, bei 28° 4 bis 5 Tage zwecks
Sporenbildung fermentiert und die Sporensuspensionen zur Beimpfung von mit Hefemedium beschickten
Doppelflaschen in der vorstehend beschriebenen Weise verwendet.
Die beimpften Medien wurden in der früher beschriebenen Weise fermentiert und nach 3 und 4 Tagen
auf ihren Streptomycingehalt geprüft. Auf Grund der Prüfungsergebnisse wurden zwei Stämme ausgewählt,
welche die höchsten Streptomycinausbeuten lieferten. Sporen von Kulturen dieser Stämme wurden zur Beimpfung
von vier Flaschen benutzt, die mit hefehaltiger Nährflüssigkeit beschickt waren. Die beimpften
Flaschen wurden bei 280 unter Bewegung und Belüftung fermentiert. Eine entsprechende Anzahl von
Flaschen wurde mit Sporen des nichtbestrahlten Mutterstammes von Streptomyces griseus beimpft und
unter gleichen Bedingungen fermentiert. Die in den verschiedenen Flaschen befindlichen fermentierten
Medien wurden nach 3tägiger Inkubation auf ihren Streptomycingehalt geprüft; die Streptomycinausbeuten
und die prozentualen Ausbeuteerhöhungen der bestrahlten Stämme im Vergleich zu den Mutterstämmen
sind aus folgender Tabelle ersichtlich:
Streptomycinerzeugung
Flasche A | Kontroll | Veredelte | Ausbeute | |
B | kultur | Kultur | erhöhung | |
C | mg/ccm | mg/ccm | in % | |
Nr. ι | - D | 146 | 240 | 65 |
Flasche A | 146 | 240 | 65 | |
B | 156 | 260 | 66 | |
-. C | 156 | 260 | 66 | |
Nr. 2 | D | 170 | 240 | 41 |
170 | 240 | 41 | ||
170 | 260 | 53 | ||
170 | 214 | 26 | ||
Das Verfahren nach Beispiel 1 wurde wiederholt mit der Maßgabe, daß ein Mutterstamm von Streptomyces
griseus angewendet wurde, der 270 mg/ccm Streptomycin lieferte, wenn er in einem Sojabohnenmehlmedium
folgender Zusammensetzung fortgepflanzt wurde:
Sojabohnenmehl 2%
Dextrose 1 %
Natriumchlorid 1 %
aufgefüllt mit destilliertem Wasser auf 100%.
Eine Sporensuspension dieses ausgewählten Stammes von Streptomyces griseus wurde mit ultraviolettem
Licht, wie in Beispiel 1 beschrieben, bestrahlt, wobei etwa 99 % der Sporen abgetötet wurden. Die überlebenden
Sporen wurden, wie in Beispiel 1 beschrieben, auf Hefeextrakt-Dextrose-Agar entwickelt, wobei
Stammkulturen von veredelten Stämmen von Streptomyces griseus, und zwar 500 derartiger Kulturen, erzeugt
wurden. Sporen von diesen 500 Kulturen wurden zur Beimpf ung von je drei Flaschen verwendet,
die mit einem Sojabohnenmehlmedium der oben beschriebenen Zusammensetzung beschickt waren. Die
beimpften Flaschen wurden bei 28° unter dauernder Bewegung und Belüftung fermentiert und nach 3, 4
und 5 Tagen der Streptomycingehalt ermittelt. Die Ergebnisse dieser Prüfungen zeigten, daß etwa 30 %
der veredelten Stämme Streptomycinausbeuten lieferten, die mindestens 20 % höher waren als die mit
dem Mutterstamm erzielbaren Ausbeuten. Etwa 8 % der veredelten Stämme gaben Ausbeuten, welche um
mindestens 50 % höher waren als die mit dem Mutterstamm erzielbaren Ausbeuten.
Es hat sich gezeigt, daß die erfindungsgemäß veredelten
Stämme auch beim Arbeiten im großen wesentlieh erhöhte Streptomycinausbeuten liefern und diese
Ausbeuten noch weitergehend erhöht werden können, wenn man Nährmedien verwendet, welche Sojabohnenmehl
enthalten und z. B. aus einem Gemisch von etwa 2 °/0 Sojabohnenmehl, 1 °/0 Dextrose und 1 °/0 Natriumchlorid
bestehen, das mit Wasser auf 100 % aufgefüllt worden ist.
Claims (4)
1. Verfahren zur Herstellung von Streptomycin, dadurch gekennzeichnet, daß Sporen eines Streptomycin
erzeugenden Stammes von Streptomyces griseus mit ultraviolettem Licht bestrahlt, die überlebenden
Sporen isoliert, die isolierten Sporen in separaten Nährmedien fortgepflanzt, der Streptomycingehalt
der fermentierten Medien ermittelt, auf Grund dieser Ermittlung die veredelten Stämme
von Streptomyces griseus, welche befähigt sind, höhere Streptomycinausbeuten zu liefern als der
Mutterstamm, ausgewählt und zur Herstellung von Streptomycin verwendet werden.
2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet,
daß die Bestrahlung der Sporen mit ultraviolettem Licht unter solchen Bedingungen durchgeführt
wird, daß mindestens 90 % der Sporen abgetötet werden.
3. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet,
daß Kulturen, welche höhere Streptomycinausbeuten liefern als die Muttersubstanz, no
einer erneuten Behandlung gemäß Ansprüchen 1 und 2 unterworfen und die hierbei ausgewählten
veredelten Stämme zur Herstellung von Streptomycin verwendet werden.
4. Verfahren zur Herstellung von Streptomycin, dadurch gekennzeichnet, daß die nach Ansprüchen 1
und 2 veredelten Stämme von Streptomyces griseus in Nährmedien fermentiert werden, welche
Sojabohnenmehl enthalten und z. B. aus einem Gemisch von etwa 2 % Sojabohnenmehl, 1 °/0 Dextrose
und ι % Natriumchlorid bestehen, das mit Wasser auf 100 % aufgefüllt ist.
) 5660 1.
Applications Claiming Priority (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
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---|---|
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Family Applications (1)
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---|---|---|---|
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- 1948-08-18 GB GB21780/48A patent/GB677423A/en not_active Expired
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-
1949
- 1949-04-10 DE DE1949P0039504 patent/DE865045C/de not_active Expired
Also Published As
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FR999986A (fr) | 1952-02-06 |
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