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Verfahren zur Herstellung von Streptomycin McDaniel und Hodges haben
ein Verfahren zur Entwicklung von Stämmen von A. griseus gefunden, die als Streptomyces
griseus bezeichnet wurden, hoch beständig gegen Streptomycin sind und in Medien
mit hohen Anfangskonzentrationen von Streptomycin gut wachsen. Nach Angaben von
McDaniel und Hodges haben diese Stämme erhalten, welche gut in Medien wachsen, die
5oo bis 6oo /ig;'ccm an Streptomycin und mehr enthalten. Derartige Stämme gestatten
zwar eine gewisse Erhöhung an Streptomycinausbeuten, die Ausbeuteerhöhung bewegt
sich aber nicht in entsprechendem Ausmaß zu der Vergrößerung der Streptomycinbeständigkeit.
Dies berechtigt zu der Annahme, daß die Streptomycinausbeute und die Beständigkeit
gegen Streptomycin von verschiedenen physiologischen Funktionen der Organismen abhängig
sind. Es wurde gefunden, daß Stämme von A. griseus, die bis zu einer hohen Widerstandsfähigkeit
entwickelt worden sind, diese Widerstandsfähigkeit beibehalten, wenn sie der Einwirkung
von ultraviolettem Licht unterworfen werden. Es wurde ferner gefunden, daß ein Stamm
von A. griseus, der gegen Streptomycinkonzentrationen von wenigstens 5oo yg/ccm
widerstandsfähig ist, durch Behandlung mit ultraviolettem Licht eine Umwandlung
zu einem Streptomycinstamm erfährt, der höhere Ausbeuten an Streptomycin liefert.
Durch Auswahl der besten der so erhältlichen höhere Ausbeuten liefernden Stämme
und Wiederholung der Behandlung mit ultraviolettem Licht und Aussonderung der hierdurch
verbesserten Stämme wurden eine Anzahl von veredelten Stämmen erzeugt, die zwei-
bis dreimal soviel Streptomycin lieferten als der unter den gleichen Bedingungen
angewendete
Mutterstamm. Die mit diesen veredelten Stämmen erzielbaren
erhöhten Ausbeuten treten insbesondere in Erscheinung, wenn die Bedingungen der
Züchtung z. B. mit Bezug auf die Zusammensetzung des Nährmediums so gewählt werden,
daß optimale Bedingungen für die Züchtung des veredelten Stammes vorliegen.
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Auf den vorstehend angegebenen Grundlagen wurde ein Verfahren zur
Herstellung von Streptomycin entwickelt, das dadurch gekennzeichnet ist, daß ein
wässeriges Nährmedium unter Tauchbedingungen und Belüftung mit einem Stamm von A.
griseus behandelt wird, der unter dem Einfluß einer ultravioletten Bestrahlung eines
Mutterstammes von A. griseus entstanden ist, gegen eine Anfangsstreptomycinkonzentration
von mindestens 5oopg/ccm widerstandsfähig ist und befähigt ist, konstant mindestens
80o Mg
Streptomycin je Kubikzentimeter zu bilden.
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Bei der Herstellung der veredelten Stämme von A. griseus, welche als
A. griseus Dulaney L-ii8 bezeichnet werden, kann man z. B. derart verfahren, daß
eine sterile Suspension von Sporen des Ausgangsstammes in einer Flasche oder Schale
der Einwirkung ultravioletten Lichts von hoch tötender Wellenlänge, z. B. etwa 2,537
A, während eines Zeitraumes unterworfen wird, der ausreicht, 99 % oder mehr
der Sporen abzutöten. Die hierfür erforderliche Zeit, welche im allgemeinen mehrere
Minuten beträgt, kann beträchtlich schwanken, je nach der Entfernung der Lichtquelle
von der Sporensuspension. Die Suspension der überlebenden Sporen wird dann verdünnt
und auf Nähragar, z. B. Hefeextrakt-Dextrose-Agar (enthaltend etwa i °/p Hefeextrakt,
0,5 % Dextrose und 2 O/, Agar), übertragen. Die so gezüchteten Actinomycetekolonien
werden auf ein entsprechendes Medium übertragen und auf diesem Sporen entwickelt.
Sporen aus diesen Kulturen werden dann zur Impfung des Fermentationsmediums verwendet.
Ein hierfür geeignetes Medium kann z. B. folgende Zusammensetzung haben: Sojabohnenmehl
.................... 209 Dextrose .......................... io g Natriumchlorid
. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . io g destilliertes Wasser . . . . . .
. . . . . . . . . . . 11
Vor der Sterilisation wird das Medium mit Natriumhydroxyd
auf pH-Werte von vorzugsweise 7 bis 7,2 eingestellt.
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Nach Impfung wird das Medium der Inkubation bei etwa 28° unter Tauchbedingungen
und Belüftung unterworfen. Nach einem Zeitraum von 3 bis q. Tagen wird der Streptomycingehalt
festgestellt.
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Die Ausbeuten, welche durch verschiedene aus Sporen, die die ultraviolette
Bestrahlung überlebt haben, gezüchtete Kulturen erhalten werden, schwanken innerhalb
weiter Grenzen, aber ein beträchtlicher Teil der Kulturen ergibt Streptomycinausbeuten,
die wesentlich größer sind als die Ausbeuten, die mit dem gegen Streptomycin widerstandsfähigen
Ausgangsstamm von A. griseus erhältlich sind. Die besten der veredelten Stämme werden
abgesondert und als Stammkulturen für die weitere Behandlung durch ultraviolette
Bestrahlung verwendet.
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Gewöhnlich liefert eine einmalige ultraviolette Bestrahlung und Absonderung
einer Kolonie einen veredelten Stamm von A. griseus, der befähigt ist, etwa den
doppelten Betrag von Streptomycin wie der Mutterstamm zu liefern. Die Maximalvermehrung,
die durch eine einmalige ultraviolette Bestrahlung erzielbar ist, beträgt im allgemeinen
etwa qo bis 5o°/0. Wenn die durch eine einmalige ultraviolette Bestrahlung erzielten,
die höchsten Ausbeuten liefernden Stämme einer zusätzlichen ultravioletten Bestrahlung
unterworfen und die hierbei überlebenden Sporen in der oben beschriebenen Weise
zu neuen Kulturen entwickelt werden, können weitere Ausbeutesteigerungen von etwa
q.o bis 50 °/o und mehr erzielt werden. Selbstverständlich ist es praktisch nicht
möglich, die Veredelung der griseus-Stämme mit Bezug auf Ausbeutevermehrung in unbeschränkter
Weise fortzuführen. Im allgemeinen genügt es, veredelte Stämme zu erzeugen, die
befähigt sind, die zwei- bis dreifache Menge an Streptomycin zu liefern wie der
gegen Streptomycin beständige Ausgangsstamm. Beispiel i Als Ausgangsstamm wurde
ein Stamm A verwendet, der aus A. griseus ausgewählt worden ist und aus einem Waksman-Stamm
Nr. q. nach dem MeDaniel-Verfahren entwickelt worden ist, eine Widerstandsfähigkeit
gegen mindestens 5oo,ug/ccm von Streptomycin aufwies und befähigt war, 250 ,ug/ccm
Streptomycin unter Tauchbedingungen mit Belüftung in einem Medium folgender Zusammensetzung
zu liefern Sojabohnenmehl ... . . . . . . . . . . . . . . . . . 2o g Dextrose
.......................... io g Natriumchlorid . . . . . . . . . . . . . . . . .
. . . . io g destilliertes Wasser ....... . . . . . . . . . . i 1 Sporen
aus diesem Stamm wurden in Wasser suspendiert und der Einwirkung ultravioletten
Lichts von einer Wellenlänge von 2,537 A bei einer Entfernung von 25,40 cm i2 Minuten
lang unterworfen. Hierbei wurden etwa 990/, der Sporen getötet. Die überlebenden
Sporen wurden dann auf Hefeextrakt-Dextrose-Agar gebracht und die entwickelten Actinomycetekolonien
auf Agar derselben Zusammensetzung übertragen. Die hier entwickelten Sporen wurden
alsdann zum Impfen von Flaschen verwendet, die ein Nährmedium von folgender Zusammensetzung
enthielten Sojabohnenmehl . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 2o g Dextrose
.......................... io g Natriumchlorid . . . . . . . . . . . . . . . . .
. ... io g destilliertes Wasser . . . . . . . . . . . . . . . . . 11
Die
geimpften Medien wurden 3 bis 5 Tage unter Tauchbedingungen und Belüftung bei 28°
gehalten und dann auf ihren Streptomycingehalt geprüft. Mehrere dieser Proben zeigten
eine Streptomycinausbeute, die beträchtlich höher war als die mit dem Ausgangsstamm
erzielte
Ausbeute von 250 ,ug;'ccm. Ein Stamm B, welcher eine Ausbeute von qoo,ugccm lieferte,
wurde für die weitere Entwicklung ausgewählt.
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Stamm B wurde ausgestrichen und individuelle Kolonien abgetrennt.
Eine dieser ausgewählten Kolonien, welche die Eigenschaft besaß, höhere Streptomycinausbeuten
zu liefern als die Kultur des Ursprungsstammes B, wurde als Stamm C bezeichnet.
Dieser Stamm lieferte konstant Streptomycinausbeuten von 55o ygccm. Der Stamm C
wurde in der vorher beschriebenen `''eise mit ultraviolettem Licht behandelt. Unter
etwa i5o Absonderungen, welche gezüchtet und untersucht wurden, befanden sich drei
Stämme, die konstant 8oo ,ug/ccm Streptomycin lieferten, wenn sie unter Tauchbedingungen
und Belüftung in einem Medium von folgender Zusammensetzung gehalten wurden: Sojabohnenmehl
. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 20,o g Dextrose ..........................
lo,o g Natriumchlorid . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 10,0 9 bei der Trinkalkoholbereitung
anfallende Trockenschlempe . . . . . . . . . . . . . . . . . . 2,5 g destilliertes
Wasser ................. 1 l Die Entwicklung von Stämmen, die nur etwa 250 ,ug/ccm
Streptomycin lieferten, zu Stämmen, die etwa 8ooo,ug/ccm lieferten, erfordert etwa
3ooo Absonderungen und Prüfungen. Der die höchsten Ausbeuten liefernde Stamm erhielt
die Bezeichnung A. griseus Dulaney L-ii8. Beispiel 2 Als Nährmedien wurden die folgenden
Stoffgemische verwendet
| Medium A Medium B |
| Sojabohnenmehl .......... 2,o o/0 2,5 0/0 |
| Dextrose ................ i,o 0/a 1,5 0/0 |
| Trockenschlempe aus der |
| Trinkalkoholbereitung ... 0,5 0/0 0,750/, |
| Natriumchlorid . . . . . . . . . . . o,250/0 0,25% |
| mit Wasser bis zu ioo °/o aufgefüllt. |
Mit den Medien A und B beschickte Flaschen wurden mit einem vegetativen Wachstum
von A. griseus Dulaney L-ii8, das nach Beispiel i erhalten worden ist, geimpft.
Die geimpften Medien wurden bei 28° unter Tauchbedingungen und Belüftung 3 bis 5
Tage der Inkubation unterworfen. Untersuchungen der fermentierten Kulturflüssigkeiten
ergaben Streptomycinausbeuten von goo bis 95o,ug/ccm bei Medium A und etwa iioo,ug/ccm
bei Medium B. Ausbeuten von gleicher Größenordnung würden beim Arbeiten im Betriebsmaßstab
erzielt.
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Gleiche Ergebnisse wurden erzielt, wenn an Stelle eines vegetativen
Wachstums von A. griseus Dulaney L-118 eine Sporensuspension von A. griseus Dulaney
L-ii8 verwendet wurde.
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Das Wesen der Erfindung und die damit erzielbaren fortschrittlichen
Wirkungen sind aus den nachfolgenden Tabellen ersichtlich, welche die Ergebnisse
von Versuchen und Vergleichsversuchen enthalten
| Tabelle I |
| Das Verhalten von A. griseus-Kulturen |
| A. griseus A. griseus A. griseus |
| i Waksman Nr. q i Dulaney L-tz8 |
| Fäden, Verzweigung, wenige Spiralen stabförmig bis Verzweigung
Verzweigung |
| Conidien kurz zylindrisch o,8 x o,8 bis i,7 ,a dasselbe dasselbe |
| Gelatinestich grünlichgelbes oder kremfarbiges Oberflächen-
graues Oberflächen- schweres graues |
| Wachstum, bräunliche Färbung, schnelle Ver- Wachstum, schnelle
Oberflächen- |
| flüssigung Verflüssigung Wachstum, |
| schnelle Ver- |
| flüssigung |
| Synthetischer dünne, farblose Verbreitung, olivbraunes Luft-
dasselbe dasselbe |
| Agar mycel, dicke Pulver, wassergrün dasselbe, außer dasselbe,
außer |
| der grünlich- der grünlich- |
| grauen Farbe grauen Farbe |
| Stärke .gar dünne Verbreitung, durchsichtig dünn, durchsichtig
dünn, durchsichtig |
| Traubenzucker- in der Mitte erhöht, strahlenförmig kremfarben
punktförmige krem- punktförmige krem- |
| Agar bis orange, angefressener Rand farbige Kolonien, farbige
Kolonien, |
| später zusammen- später zusammen- |
| gewachsen und gewachsen und |
| geschrumpft geschrumpft |
| Reiner Agar reichlich, kremfarbig, beinahe durchsichtig reichlich,
weiß reichlich, weiß |
| nach grau nach grau |
| umschlagend umschlagend |
| Traubenzucker- reichlichlicher, gelblicher Film mit grünlichem
dasselbe dasselbe |
| Bouillon Stich, stark faltig |
| Lackmusmilch kremfarbiger Ring, unter rascher Peptonisie- Peptonisierung
Peptonisierung |
| rung koaguliert, alkalisch werdend alkalisch alkalisch |
| A. gri#"eus A. griseus A. griseus |
| Waksman Nr. q I Dulaney L-ii8 |
| Kartoffeln gelblich, runzelig sehr schweres graues sehr schweres
graues |
| Wachstum Wachstum |
| Reduktion keine Nitrile aus Nitraten geringe Reduktion sehr
geringe Reduk- |
| tion |
| Proteolytische proteolytische Wirkung in Milch und Gelatine
dasselbe dasselbe |
| Wirkung |
| Pigment nicht löslich dasselbe dasselbe |
| Stärke hydrolysiert dasselbe hydrolysiert |
| Sauerstofftension aerobisch dasselbe dasselbe |
| Zucker- nicht aufgeführt s. Tabelle II s. Tabelle II |
| ausnutzung |
| Empfindlichkeit nicht aufgeführt Empfindlichkeit Empfindlichkeit |
| der A. griseus- |
| Stämme (Akti- |
| nophage) |
| Erzeugung von nicht aufgeführt 4oo,ug/ml Soja- 8oo bis i6oo
lug/ml |
| Streptomycin Bohnenmehl- Sojabohnenmehl- |
| Medium Medium |
| Streptomycin- nicht aufgeführt s. Tabelle III s. Tabelle III |
| Beständigkeit |
| Tabelle II |
| Zuckernutzbarmachung durch A. griseus |
| A. griseus A. griseus |
| Zuckerarten Waksman Dulaney |
| Nr. q L-i i 8 |
| Glukose ................ |
| Lävulose ............... |
| Arabinose .............. -+- |
| Xylose . ... . ...... .. .... -t- -+- |
| Mannose ............... -(- -f- |
| Galaktose .............. |
| Rhamnose . . . . . . . . . . . . . . - - |
| Sorbose ................ - - |
| Sukrose ................ - - |
| Laktose ................ |
| Cellobiose .............. -+- |
| Maltose ................ -+- -+- |
| Raffinose . . . . . . . . . . . . . . . - - |
| Inulin ................. - - |
| Dextrin ................ -f- -+- |
| Salicin ................. - - |
| Tabelle III |
| Widerstandsfähigkeit von A. griseus |
| gegen Streptomycini) |
| Wachstum beim Aufstrich |
| b'lilligramm Streptomycin A. griseus A. griseus |
| per Kubikzentimeter Agar M'aksman Dulaney |
| Nr. q L-ii8 |
| I |
| 0 4-i- I 4+ |
| 4 ~- j 4 -f |
| 200 O i -+- |
| o I + |
| 400 o i |
| o i |
| 6oo 0 2 -1- |
| 0 0 |
| 800 o Spur |
| o |
| o |
| i6oo o o |
| o ! o |
| 1) Agaraufstrichverfahren, Sporenimpfung. |