AT215075B - Mikrobiologisches Verfahren zur Gewinnung von Cobalaminen - Google Patents

Description

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  Mikrobiologisches Verfahren zur Gewinnung von Cobalaminen 
Vorliegende Erfindung betrifft ein Verfahren zur Gewinnung von Cobalaminen durch Züchtung von Cobalamin produzierenden Actinomyceten in wässerigen Nährlösungen unter aeroben, insbesondere submersen Bedingungen, und Aufarbeitung der   Gärprodukte in   an sich bekannter Weise. Wesentlich für die Erfindung ist, dass man die Gärung unter Verwendung eines Stammes von Nocardia rugosa 3760/1957 (hinterlegt im Institut für Mikrobiologie der Rutgers Universität in New-Brunswick, NJ., USA.), zweckmässig in Gegenwart oberflächenaktiver Substanzen, wie des Kondensationsproduktes des Äthylenoxydes mit Sorbit-Monooleat durchführt. 



   Die erwähnte Gattung Nocardia wurde samt vielen andern Gattungen vom Inhalt des Verdauungsapparates des Rindes isoliert. Sie weist nicht nur besondere morphologische. und kulturelle Eigenschaften auf, sondern auch die Fähigkeit, bedeutende Mengen von Cobalaminen zu erzeugen. 



   Beschreibung des Stammes Nocardia und dessen Klassifizierung :
Morphologische Eigenschaften :
Das aus Hyphen mit   0, 6 - 0, 8/l   Durchmesser gebildete Mycel ist zu Beginn der Züchtung gewunden, dann mehr oder weniger eckig gebogen, nach ungefähr 12 Stunden spärlich verzweigt, strahlenförmig von einer mittleren Zone ausgehend. Nach   20 - 24   Stunden beginnt die Verzweigung der Hyphen unter Frag-   mentationimbakterienartiger Form, wobei   die einzelnen Fragmente eine Länge von ungefähr 8 bis   20JL   aufweisen. Die Verästelung dehnt sich in wenigen Stunden fast auf die ganze Kolonie aus. 



   Die Bruchstücke können gerade, in mehr oder weniger stumpfen Winkeln oder verschiedenartig gebogen sein ; das Mycel und die Bruchstücke lassen sich leicht mit den gebräuchlichen Farbstoffen (Fuchsin, Methylenblau   usw.) färben.   Sie sind Grampositiv, sind Säuren gegenüber unbeständig und Alkohol gegen- über nur teilweise beständig. 



   Kultur-Eigenschaften :
Auf   Fleischbrühe-Agar   hat man innerhalb 24 Stunden eine vorzügliche Entwicklung. Die Kolonien bilden einen dicken, honigfarbigen, rauhen, runzelartigen Belag cremeartiger Beschaffenheit. In den über 15 Tagen alten Kulturen beobachtet man im Substrat ein braunes Pigment. 



     AufKartoffel-Agar beobachtet   man eine mittelmässige, im allgemeinen glatt ablaufende Kultur mit rauhen, runzeligen Stellen. Die Kultur ist farblos und weich. 



   Auf Asparagin-Agar hat man eine mittelmässige Kultur in Form eines dicken, farblosen, erhabenen, feuchten Belages, der sich in der dickeren Schicht des Schräg-Agars runzelig zeigt, beobachtet. 



   Auf Glycerin-Nähragar beobachtet man eine reichlich runzelartige Kultur, die an Korallenbildung erinnert, eine   dunke1cremige   Färbung und keine besondere Festigkeit aufweist. Im Alter von 15 Tagen verbreitet sich im Substrat ein umbrinusfarbiges Pigment. 



   'Auf Sabouraud-Agar beobachtet man eine sehr reichliche Kultur, deren Belag farblos und weich ist und an Korallenbildung erinnert. 



   In   Fleischbrühe   entwickelt sich eine schleimartige Haut, die sich am Boden des Reagenzglases absetzt. Die Fleischbrühe bleibt klar. In Milch bildet sich bei einem Alter von 8 Tagen ein Koagulum, das ausfällt und ein klares Serum ergibt. Die Milch wird nicht peptonisiert, das PH bleibt unverändert. Gelatine wird verflüssigt, diastasische Aktivität negativ. Der Organismus ist nicht pathogen. 



   Optimum des pH   :     6,     8-7, 2 ; Temperatur 34-36 C.   

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   Differentielle Eigenschaften :
Es werden Cobalamine erzeugt. In Schüttelkultur verbreitet sich nach ungefähr 120 Stunden ein intensiv rotbraunes Pigment. 



   Zwecks Feststellung derArtzugehörigkeit des Stammes wurden die Krassilinikov (1941) und Waksman und Henrici   (1943)-Bestimmungsschlüssel angewendet, aber   weder der eine noch der andere gestattet eine Klassifizierung. Daraus schliesst man, dass derselbe noch nie isoliert und umso weniger beschrieben und bezeichnet wurde. Es wurde daher der Name"Nocardia rugosa"mit der vorher angeführten Beschreibung vorgeschlagen. 



   Die Kulturbrühen des neuen isolierten Stammes enthalten einen Wachstumsfaktor für die Stäm-   me :   
Lactobacillus leichmanii ATCC 4797, der Vitamin B 12 oder Desoxyribonucleotide erfordert,
Lactobacillus lactis DORNER (ATCC 10697),
Escherichia Coli 113/3, der Vitamin B 12 oder Methionin erfordert. 



   Die Identität des Wachstumsfaktors dieser Stoffe mit denjenigen zur Herstellung von Cobalaminen wurde mittels Chromatographie und Papier-Elektrophorese bewiesen, sowie durch darauffolgende Bioautographien auf E. Coli 113/3-Platten. 



   Biologische Methoden zur Titrierung der B   12-Aktivitätder Kulturbrühen :  
1. Methode mit Lactobacillus lactis DORNER ATCC 10697
2. Methode mit Lactobacillus leichmanii ATCC 4797
3. Methode mit Escherichia Coli 113/3, auf flüssigem Nährboden
4. Methode mit Escherichia Coli   113/3   auf Platten. 



    Gärungstechnik :   
Der für die Gärung verwendete, für die Entwicklung und die Vermehrung der Gattung Nocardia passende Nährboden besteht im wesentlichen aus einer Kohlehydratquelle, aus einer Stickstoffquelle und aus einer Anzahl von Salzen. Die Kohlehydrate können sein : Glucose, Maltose, Saccharose, Dextrin, Lactose, Mannose, Galaktose. Es können auch Kohlehydrat enthaltende Stoffe, wie Maisquellwasser, Melasse, Malzextrakt   u. dgl.   verwendet werden. Auch verschiedene Fette, wie Specköl, Sesamöl und Erdnuss- öl können Verwendung finden. 



   Als Stickstoffquelle kommen Peptone, Kaseinhydrolysate, Fleischextrakt, Hefeextrakt, Kasein, Ammoniumsulfat, Ammoniumnitrat, Asparagin, Cystein, Tryptophan, Thyrosin, Cystin in Betracht. 



   Man setzt der Nährbrühe noch, je nach Bedarf, folgende Salze hinzu   :NaHPO,KHPO,CaCO,     MgCL,     CaCL,     CuSO,     FeSO,     ZnSO, MgSO   und Kobalt als Chlorid oder Nitrat oder in Form von organischen Verbindungen. Zur Erzielung hoher Vitaminausbeuten ist die   Anwesenheit von oberflächenak-   tiven Stoffen, insbesondere dem Kondensationsprodukt des Äthylenoxyds mit Sorbit-Monooleat (im Handel als Tween 80 benannt) in den Kulturbrühen, wie denen der Reihe   derpartiellenEster   der HexitolAnhydride und der Fettsäuren oder deren Polyoxyalkylenderivate (Tween, Span usw. ) von grundlegender   Bedeutung.

   Die Brühe wird mit Salzsäure oder Natronlauge auf ein PH 6, 7-6, 9 gebracht, dann sterilisiert und mit einer gut entwickelten, auf Nähragar nach Roux gut gewachsenen Kultur beimpft.   



   Unter geeigneten Lüftungs- und Schüttelverhältnissen bebrütet man bei einer Temperatur zwischen 30 und   370C   für eine genügend lange Zeit, um eine gute Entwicklung des Mikroorganismus zu erzielen, was man im allgemeinen nach 24 - 28 Stunden erreicht. 



   Die auf diese Weise erhaltene Suspension verwendet man, um das Nährmedium zu beimpfen, das für den eigentlichen Gärungsprozess dient. Die zu verwendende Beimpfungsmenge schwankt zwischen 5 und   100/0   der Nährbrühe im umgekehrten Verhältnis zum Entwicklungsausmass. Man arbeitet dann unter 
 EMI2.1 
 unreinigungen über. 



   Die Gärung kann als abgeschlossen betrachtet werden, wenn die Resultate von zwei aufeinanderfolgenden Titrierungen des erzeugten Vitamins zeigen, dass man keine Konzentrationszunahme derselben in der Brühe hat, was man in normalen Fällen nach 120 Stunden Gärung beobachtet. Die Kulturbrühe mit einem PH um 6 zeigt in diesem Stadium eine mässige Dichte, ist braunrot und hat einen nicht unangenehmen und nicht andauernden Geruch. 



   Am Schluss des Gärungsverfahrens bildet der Grossteil der Stoffe, die eine APF-Aktivität besitzen, insbesondere die Stoffe der Cobalamingruppe, einen Teil des Zellgewebes und sind in der festen Masse der gegorenen Kulturbrühe lokalisiert. 

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   Um diesen aktiven Stoff zur Verbesserung des Nahrungsmittelwertes zu benützen, kann man ein beliebiges der an sich bekannten Verfahren anwenden. 



   Als Ausführungsbeispiele für diese Verfahren kommen in Betracht : a) Die Kulturbrühe wird bei einem PH zwischen 3 und 6 angesäuert und in einem Autoklaven auf 120 C 30 - 60 min erwärmt ; hierauf wird sie im Vakuum bei einer Temperatur nicht über   400C   bis auf   1/10-1/20   ihres ursprünglichen Volumens eingeengt.

   Die gewonnene sirupartige Masse wird getrocknet und gemahlen, wodurch ein stabiles, für den Gebrauch bereites Pulver gebildet wird. b) Die Kulturbrühe wird zentrifugiert und die flüssige Phase entfernt, während der feste Anteil mit Wasser gewaschen, im Autoklaven während 30 - 60 min auf 1200C erwärmt, hierauf getrocknet, gepulvert und als solche verabreicht wird. c) Die feste Phase der Kulturbrühe, die durch Zentrifugierung und Auswaschung wie unter b) angegeben ist, abgeschieden wurde, wird in einer Wassermenge von 10-59% des ursprünglichen Volumens der Kulturbrühe zu Brei verrieben. Die Suspension wird auf einen PH Wert zwischen 3 und 6 angesäuert und in einem Autoklaven 30 - 60 min erwärmt. Durch Zentrifugieren oder Filterung der Suspension gewinnt man einen wässerigen, die aktiven Stoffe enthaltenden Extrakt, der eingeengt und unter Vakuum getrocknet wird.

   Man erzielt ein Pulver mit hohem Titer, das stabil und für den Gebrauch bereit ist. 



   Die Wahl des einen oder des andern der angegebenen Verfahren, oder einer Kombination derselben, hängt vom Konzentrationswert und der Aktivität, die man den Präparaten zu geben wünscht, ab. Beispielsweise, und nicht zur Beschränkung des Schutzumfanges, werden in der Folge die Schemen von vier   Särungsprozessen angeführt :    
 EMI3.1 
 
 EMI3.2 
 
<tb> 
<tb> :Dextrin <SEP> 8 <SEP> %
<tb> Melasse <SEP> 0, <SEP> 4 <SEP> 0/0 <SEP> 
<tb> Pepton <SEP> 1 <SEP> %
<tb> CaCOs <SEP> 0, <SEP> 5%
<tb> NaCl <SEP> 0, <SEP> 5%
<tb> (NHSO4 <SEP> 0, <SEP> 5% <SEP> 
<tb> FeS04 <SEP> 5 <SEP> Teile <SEP> pro <SEP> Million
<tb> MgCO3 <SEP> 0, <SEP> 2%
<tb> CoCl <SEP> 10 <SEP> Teile <SEP> pro <SEP> Million
<tb> Leitungswasser.
<tb> 
 



   In einem   701   fassenden Stahlfermenter werden, bei   121 C,   50   l   Medium 90 min lang sterilisiert. 



  Das PH wird derart eingestellt, dass man am Ende der Sterilisierung den Wert von   6, 20 bis 6, 45 hat. Nach-   dem auf 330C   abgekühlt   wurde, wird die Beimpfung vorgenommen und 100 cm3 einer Suspension einge-   führt,   die man durch Auswaschung einer auf Nähragar nach Roux gewachsenen Kultur erhält. Während einer Dauer von 25 bis 40 Stunden wird bei   330C   unter Zufuhr von 30 bis 50   l   Luft/min und unter Rühren zwischen 150 und 300 Umdr/min bebrütet. 



   Sobald die Bebrütung beendet ist, schwankt das Trockengewicht des Mycels von 3 bis 5 mg/cm3.
Die Kulturbrühe wird dazu verwendet, um den Nährboden, enthalten in einem Stahlfermenter von grösserem Volumeninhalt, zu beimpfen. Das Verfahren in diesem zweiten Fermenter wird 120-140 Stunden unter den gleichen Verhältnissen, die in der Beimpfung beschrieben sind, durchgeführt. Die Endkonzentration des Vitamins B 12 schwankt von 3 bis 5   y/cm\   das Trockengewicht von 12 bis 14   mg/cm3.   



   Das Mycel wird hierauf von der filtrierten Brühe abgeschieden, mit Wasser extrahiert und hierauf als Zusatz zu konzentriertem Futtermittel verwendet, oder weiterhin gereinigt. 



   Beispiel   2 : Nährmedium :   
 EMI3.3 
 
<tb> 
<tb> Glucose <SEP> 4 <SEP> %
<tb> Corn <SEP> steep <SEP> liquor <SEP> 2 <SEP> %
<tb> Hefeextrakt <SEP> 0, <SEP> 5% <SEP> 
<tb> 
 

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 EMI4.1 
 
<tb> 
<tb> Arachisöl <SEP> 0, <SEP> 3%
<tb> CaCO <SEP> 0, <SEP> 5%
<tb> KHPO4 <SEP> 0, <SEP> 2% <SEP> 
<tb> Na2HPO <SEP> 0, <SEP> 5%
<tb> CoCl2 <SEP> 10 <SEP> Teile <SEP> pro <SEP> Million
<tb> Leitungswasser.
<tb> 
 



   Man sterilisiert 90 min lang den Nährboden bei 120 C vor dem Glucosezusatz, den man, getrennt bei 115 C, 20 min lang sterilisiert und unter sterilen Bedingungen zusetzt. 



   Man geht wie im Beispiel 1 vor. 



   Höchsterzeugung 2 - 4 y/cmr innerhalb 110 Stunden. 



   Beispiel 3 : Nährmedium : 
 EMI4.2 
 
<tb> 
<tb> Saccharose <SEP> 7 <SEP> %
<tb> N-Z-Amin <SEP> (Caseinabbauprodukt, <SEP> das
<tb> Aminosäure <SEP> und
<tb> Peptide <SEP> enthält) <SEP> 1 <SEP> %
<tb> (NHSO4 <SEP> 0, <SEP> 5% <SEP> 
<tb> Cystein <SEP> 0,05
<tb> kH2PO4 <SEP> 0, <SEP> 2%
<tb> Na2HPO4 <SEP> 0, <SEP> 5% <SEP> 
<tb> NaCl <SEP> 1 <SEP> %
<tb> CuSO <SEP> 0,5 <SEP> Teile <SEP> pro <SEP> Million
<tb> FeSO4 <SEP> 1 <SEP> Teil <SEP> pro <SEP> Million
<tb> ClCl2 <SEP> 10 <SEP> Teile <SEP> pro <SEP> Million
<tb> Leitungswasser.
<tb> 
 
 EMI4.3 
 Ausbeute erhält man innerhalb von 130 Stunden mit 3-5 y/cm3. 



    Beispiel 4 : Nährmedium :    
 EMI4.4 
 
<tb> 
<tb> Malzextrakt <SEP> 4 <SEP> %
<tb> Glucose <SEP> 4 <SEP> %
<tb> N-ZAmin <SEP> 1, <SEP> 5% <SEP> 
<tb> Com <SEP> Steep <SEP> liquor <SEP> 0,5%
<tb> CaCO <SEP> 0, <SEP> 5%
<tb> (NHSO4 <SEP> 0, <SEP> 5% <SEP> 
<tb> NaCl <SEP> 1 <SEP> %
<tb> CoCl2 <SEP> 10 <SEP> Teile <SEP> pro <SEP> Million
<tb> Leitungswasser.
<tb> 
 



  Man geht wie im Beispiel 2 vor. 



  Höchsterzeugung 3-5 y/cm3 innerhalb 120 Stunden. 

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 Beispiel5 :Nährmedium: 
 EMI5.1 
 
<tb> 
<tb> Glucose <SEP> 4 <SEP> %
<tb> Lactose <SEP> 2 <SEP> %
<tb> Pepton <SEP> 1 <SEP> %
<tb> Hefeextrakt <SEP> 0,25%
<tb> KHPO <SEP> 0, <SEP> 2%
<tb> Na2HPO <SEP> 0, <SEP> 5% <SEP> 
<tb> NaCl <SEP> 1 <SEP> %
<tb> Tween <SEP> 80 <SEP> 0, <SEP> 0510 <SEP> 
<tb> CoCL <SEP> 10 <SEP> Teile <SEP> pro <SEP> Million
<tb> Leitungswasser.
<tb> 
 
 EMI5.2 

Claims (1)

1. - 5 Y/cm.PATENTANSPRUCH : Mikrobiologisches Verfahren zur Gewinnung von Cobalaminen durch Züchtung von Cobalamin produzierenden Actinomyceten in wässerigen Nährlösungen unter aeroben, insbesondere submersen Bedingungen, und Aufarbeitung der Gärprodukte in an sich bekannter Weise, dadurch gekennzeichnet, dass man die Gärung unter Verwendung eines Stammes von Nocardia rugosa 3760/1957 (hinterlegt im Institut für Mikrobiologie der Rutgers Universität in New Brunswick, N. J., USA.), zweckmässig in Gegenwart oberflächenaktiver Substanzen, wie das Kondensationsprodukt des Äthylenoxyds mit Sorbit-Monooleat, durchführt.