DE2212854C3

DE2212854C3 - Verfahren zur Herstellung des Antibiotikums Heliomyzin

Info

Publication number: DE2212854C3
Application number: DE2212854A
Authority: DE
Inventors: Georgij Fransewitsch Gauze; Ija Nikolajewna Moskau Kowscharowa Geb. Komarowa; Tatjana Semjonowna Maksimowa Geb. Mirenburg; Natalja Petrowna Chimki Moskowskoj Oblasti Netschajewa Geb. Aksjonowa; Tatjana Pawlowna Preobraschenskaja Geb. Lebedewa; Rosa Sergejewna Ucholina
Original assignee: WSESOJUSNYJ NAUTSCHNO-ISSLEDOWATELSKIJ INSTITUT PO ISYSKANIJU NOWYCH ANTIBIOTIKOW AKADEMII MEDISINSKICH NAUK SSR MOSKAU
Current assignee: WSESOJUSNYJ NAUTSCHNO-ISSLEDOWATELSKIJ INSTITUT PO ISYSKANIJU NOWYCH ANTIBIOTIKOW AKADEMII MEDISINSKICH NAUK SSR MOSKAU
Priority date: 1971-03-17
Filing date: 1972-03-16
Publication date: 1974-11-28
Also published as: FR2130267A1; DE2212854A1; CH568387A5; FR2130267B1; DE2212854B2; SU350364A1; GB1355163A

Description

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Es ist ein Verfahren zur Herstellung des Antibiotikums Heliomyzin, welches in Form einer 4%igen Salbe zur Heilung von Verbrennungen, verschiedener Formen von Pyodermie und auf dem Gebiete der medizinischen Kosmetik Verwendung findet, aus der Kultur des Strahlenpilzes Actinomyces fiavochromogenes var helioinycini bekannt (Journal Antibiotiki (russisch) 1958, Band 3, Nr. 2, S. 28, und Journal Antibiotiki (russisch) 1962, Band VlI, Nr. 10, S. 874). Die Ausgangskultur züchtet man im Submersverfahren auf einem Nährmedium, welches 1,0 Gewichtsprozent Sojamehl, 1,5 bis 2,0 Gewichtsprozent Stärke, 0,1 Gewichtsprozent Kaliumdihydrogcnphosphat, 0,3 Gewichtsprozent Natriumchlorid, 0,3 Gewichtsprozent Kalziumkarbonat, 0,1 Gewichtsprozent Pottwaltran, bis 100 ml Wasser enthält.

Dasselbe Nährmedium kann zum Züchten von Impfmyzelium verwendet werden.

Aus der erhaltenen Kulturflüssigkeit trennt man das Myzelium durch Filtrieren ab. Das Antibiotikum extrahiert man mit Azeton aus dem Myzelium, das einen Wassergehalt von 60 Gewichtsprozent aufweist. Die Extraktion wird viermal durchgeführt. Für jede Extraktion nimmt man das dreifache Volumen an Azeton zum Gewicht des feuchten Myzeliums. Der erste wenig aktive Extrakt wird verworfen und dem Gemisch des zweiten und dritten Extraktes das doppelte Volumen an destilliertem Wasser zugegeben. Mit dem vierten Extrakt wird die sekundäre Extraktion des Myzeliums der nächsten Fermentation durchgeführt. Das ausgefallene kristalline Heliomyzin wird abfiltriert und mit destilliertem Wasser gewaschen. Wenn das Rohhcliomyzin infolge einer Verunreinigung durch öl schlecht trocknet, wird es zusätzlich mit Petroläther gewaschen.

Die Ausbeute an Rohheliomyzin beträgt 3 Gewichtsprozent, bezogen auf das feuchte Myzelium. Das Rohpräparat enthält 80 bis 85 Gewichtsprozent Heliomyzin (s. Urheberschein UdSSR, Nr. 266 149).

Ein Nachteil des bekannten Verfahrens zur Herstellung von Heliomyzin aus der Kultur Actinomyces flaYochroniügenes var hcliomycini ist eine große Variabilität des Stammes. Bei häufigem Überimpfen und längerer Lagerung wird die Kultur in aktive und wenig aktive Varianten gespalten. Die große Fähigkeit, das Antibiotikum in dem Lyzelium zu speichern, ist den Varianten eigen, deren Kolonien beim Wachstum auf einem festen organischen Nährmedium kein Luftmyzelium besitzen, auf mineralischem Nährmedium ein spärliches Luftmyzelium aufweisen und ein graubraunes Pigment ausscheiden. In diesem Zusammenhang ist die Ausbeute an Rohantibiotikum niedrig (3 Gewichtsprozent, bezogen auf das feuchte Myzelium bei der Verwendung aktiver Varianten der Kultur Actinomyces (lavochromogenes var heliomycini).

Ziel der vorliegenden Erfindung ist es, die genannten Nachteile zu vermeiden.

In Übereinstimmung mit dem Ziel wurde die Aufgabe gestellt, durch die Verwendung eines neuen Stammes die Ausbeute an Endprodukt zu steigern.

Gegenstand der Erfindung ist ein Verfahren zur Herstellung des Antibiotikums Heliomyzin durch Züchten von Heliomyzin produzierenden Mikroorganismen, das dadurch gekennzeichnet ist, daß man als Mikroorganismus den Stamm 6383 Actinomyces variabilis var roseolus, hinterlegt im Museum für Kulturen des Institutes zur Auffindung neuer Antibiotika der AMN der UdSSR, verwendet.

Das erfindungsgemäße Verfahren wird wie folgt durchgeführt:

Als Ausgangskultur verwendet man den Stamm Nr. 6383 Actinomyces variabilis var roseolus. Diese Kultur unterscheidet sich von der früher beschriebenen Kultur Nr. 2915 (Journal Antibiotiki (russisch) 1962, Band VII, Nr. 10 S. 874) Aclinomyces (lavochromogenes var heliomycini durch die Bildung eines braunen Substratmyzeliums und löslicher Pigmente bräunlichrosafarbener oder violettbrauner Farbtöne beim Wachstum auf synthetischen Nährmedien sowie durch reichliches Sporentragen des grauen Luftmyzeliums auf diesen Nährmedien.

Die Ausgangskultur wird im Submersverfahren auf dem Sojamehl-Stärke-Nährmedium gezüchtet.

Das gleiche Nährmedium kann zur Züchtung von Impfmyzelium verwendet werden.

Das Antibiotikum ist im Myzelium enthalten, welches von der Kulturflüssigkeit durch Filtrieren abgetrennt wird. Das Antibiotikum extrahiert man mit Azeton aus dem Myzelium, das eine Feuchtigkeit von etwa 60 Gewichtsprozent aufweist. Die Extraktion wird viermal durchgeführt. Für jede Extraktion nimmt man das dreifache Volumen an Azeton zum Gewicht des feuchten Myzeliums. Der erste wenig aktive Extrakt wird verworfen und dem Gemisch des zweiten und dritten Extraktes das doppelte Volumen an destilliertem Wasser zugesetzt.

Mit dem vierten Extrakt führt man die sekundäre Extraktion des Myzeliums der nächsten Fermentation durch. Es fällt kristallines Hel-jmyzin aus, welches abfiltriert und mit destilliertem Wasser gewaschen wird. Falls das Rohantibiotikum infolge einer Verunreinigung durch Öl schlecht trocknet, wird dieses zusätzlich mit Petroläther gewaschen. Die Ausbeute an Rohheliomyzin beträgt 4 Gewichtsprozent, bezogen auf das feuchte Myzelium. Das Rohpräparat enthält 80 bis 85 Gewichtsprozent Heliomyzin, bezogen auf das reine kristalline Präparat.

Ein Vorteil des vorliegenden Verfahrens ist die Verwendung eines neuen und produktiveren Stammes, des Stammes Nr. 6383 Actinomyces variabilis var roseolus, hinterlegt im Museum für Kulturen des Institutes zur Auffindung neuer Antibiotika der AMN der UdSSR, bei dessen Verwendung die Ausbeute an kristallinem Heliomyzin auf 4 Gewichtsprozent, bezogen auf das feuchte Myzelium, gesteigert werden kann.

Beispiel

Zur Herstellung von Sporenmaterial züchtet man den Stamm Nr. 6383 Actinomyces variabilis var

roseolus, hinterlegt im Museum für Kulturen des Institutes zur Auffindung neuer Antibiotika der AMN der UdSSR, in Reagenzgläsern mit abgeschrägtem synthetischem Nährmedium Gauze Nr. I₁ während 10 Tage bei einer Temperatur von 2i\°C. Das synthetische Nährmedium Gauze Nr. J ist ein Nährmedium, das nach dem Erfinder Gauze benannt ist. Dieses Nährmedium hat folgende Zusammensetzung: Stärke 20 g, K₈HPO₄ 0,5 g, MgSO₄ 0,5 g, KNO₃ 1 g, NaCI 0,5 g, FeSO₄ 0,01 g, Agar 20 bis 30 g, Leitungswasser

1 Liter, pH des Mediums 7,0 bis 7,2 g. Zur Herstellung von Impfmyzelium werden mit den Sporen der Kultur Erlenmeyerkolben von 500 ml Fassungsvermögen beimpft, die 100 ml Nährmedium der folgenden Zusammensetzung (in Gewichtsprozenten) enthalten: Sojamehl 1,0; Stärke 1,0; Natriumchlorid0,3; Kalziumkarbonat 0,3; Kaliumdi'hydrogenphosphat; Wasser bis 100 ml, pH des Nährmediums nach der Sterilisation 7,0.

Das Impfmyzelium züchtet man in dem Kolben

2 Tage bei einer Temperatur von 2S⁰C auf Schaukeln, die bei 200 U/min arbeiten.

5 Gewichtsprozent des gezüchteten Impfmyzeliums (400 ml im Kolben) bringt man in Irrpffermenter von 45 Liter Fassungsvermögen ein, die 20 Liter Nährmedium der folgenden Zusammensetzung (in Gewichtsprozenten) enthalten: Sojamehl 1,0; Stärke 1,0; NaCl 0,3; CaCO₃ 0,3; K H₃PO₄ 0,1; Pottwaltran 0,1; Wasser bis 100 ml; pH des Mediums nach der Sterilisation 7,0.

Man sterilisiert 45 Minuten bei einer Temperatur von 120⁰C. Dann erfolgt die Züchtung bei einer Temperatur von 28"C unier einerr. Druck von 0,3 bis 0,5 at, bei einem Belüftungsgrad von 1 Liter Luft je 1 Liter Nährmedium in der Minute bei eingeschaltetem Rührwerk, das bei 300 U/min arbeitet.

Nach 48 Stunden Züchten wird das Impfmaterial den Fermentern zugeführt. In die Fermenter von 500 Liter Fassungsvermögen bringt man Nährmedium der folgenden Zusammensetzung (in Gewichtsprozenten) ein: Sojamehl 1,0; Stärke 2,0; NaCl 0,3; CaCO₃0,3; KH₁PO₄O₁I; Pottwaltran 0,1; Wasser bis 100 ml, pH des Nährmediums nach der Sterilisation 7,0. Man sterilisiert 45 Minuten bei einer Temperatur von 120° C. Die Beimpfung erfolgt aus den Impfapparaten, wobei man 20 Liter Impfmaterial je

:o 300 Liter Nährmedium (5 bis 7 Gewichtsprozent Impfmaterial) nimmt. Die Fermentation erfolgt bei einer Temperatur von 28°C unter einem Druck von 0,3 bis 0,5 at, bei einem Belüftungsgrad von 1 Liter Luft je 1 Liter Nährmedium in der Minute bei eingeschaltetem Rührwerk, das bei 300 U/min arbeitet. Die Fermentation dauert 96 bis 120 Stunden.

Man filtriert die Kulturflüssigkeit und erhält gegen 30 kg Myzelium mit einem Wassergehalt von etwa 60 Gewichtsprozent.

Das Myzelium extrahiert man mit Azeton viermal. Für jede Extraktion nimmt man das dreifache Volumen an Azeton (90 Liter) zum Gewicht des feuchten Myzeliums. Der erste wenig aktive Extrakt wird verworfen und dem Gemisch des zweiten und dritten Extrakts das doppelte Volumen an destilliertem Wasser (360 Liter) zugesetzt. Dabei fällt das Rohheliomyzin aus, welches man abfiltriert und mit destilliertem Wasser wäscht. Falls das Rohpräparat infolge einer Verunreinigung durch Öl schlecht trocknet, wird es zusätzlich mit 5- bis lOfachem Volumen von Petroleumäther zum kristallinen Rohpräparat gewaschen.

Die aus 30 kg feuchtem Myzelium (Feuchtigkeit 60%) erzielte Ausbeute an Rohpräparat beträgt 1200 g. Das Rohpräparat enthält 80 bis 85 Gewichtsprozent Heliomyzin, umgerechnet auf das reine kristalline Präparat.

Claims

Patentanspruch:

Verfahren zur Herstellung des Antibiotikums Heliomyzin durch Züchten von Heliorayzin produzierenden Mikroorganismen, dadurch gekennzeichnet, daß man als Mikroorganismus den Stamm 6383 Actinomyces variabilis var roseolus, hinterlegt im Museum für Kulturen des Institutes zur Auffindung neuer Antibiotika der AMN der UdSSR, verwendet.