DE2212854A1

DE2212854A1 - Verfahren zur Herstellung des Antibiotikums Heliomyzin

Info

Publication number: DE2212854A1
Application number: DE19722212854
Authority: DE
Inventors: Netschajewa Geb Aksjonowa; Gauze Georgij Fransewitsch; Kowscharowa Geb Komarowa; Preobraschenskaja Geb Lebedewa; Maksimowa Geb Mirenburg; Chimki Moskowskoj Oblasti; Ucholina Rosa Sergejewna
Original assignee: VNII ISYSKANIJU NOWYCH ANTIBIO
Current assignee: VNII ISYSKANIJU NOWYCH ANTIBIO
Priority date: 1971-03-17
Filing date: 1972-03-16
Publication date: 1972-11-02
Also published as: DE2212854C3; GB1355163A; DE2212854B2; FR2130267B1; FR2130267A1; CH568387A5; SU350364A1

Description

VEEi¹AHEEN ZUR HERSTELLUNG.DES ANTIBIOTIKUMS HELIOMYZHf Priorität vorn 17. März 1971 UdSSR Nr. 1626871

Die vorliegende Erfindung bezieht sich auf ein Verfahren zur Herstellung des Antibiotikums HflliosiyKin, welches in Form einer 4%igen Salbe zur Heilung von Verbrennungen, verschiedener Formen von Pyodermie und auf dem Gebiete der medizinischen Kosmetik Verwendung findet, da es antibakterielle und gefäßverengende Wirkung in sich vereinigt·

Es ist ein Verfahren zur Herstellung des Antibiotikums Heliomyzin aus der Kultur des Strahlenpilzes Actinomyces flavochromogenes var heliomycini bekannt. Die Ausgangskultur züchtet man im Subraersverfahren auf einem Nährmedium, welches 1,0 Gewichtsprozent Sojamehl; 1,5 "bis 2,0 Gewichtsprozent Stärke; 0,1 Gewichtsprozent Kaliuradihydrogenphosphat? 0,3 Gewichtsprozent Natriumchlorid} 0,3 Gewichtsprozent KaI-ziumkarbonat} 0,1 Gewichtsprozent Pottwaltran; bis 100 ml Wasser enthält.

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Dasselbe Nährmedium kann zum Züchten von Impfmyzelium verwendet werden·

Aus der erhaltenen Kulturflüssigkeit trennt man das Myzelium durch Filtrieren ab. Das Antibiotikum extrathiert man mit Aceton aus dem Myzelium, das eine Feuchtigkeit von 60 Gewichtsprozent aufweist. Die Extraktion wird 4 Mal durchgeführt« Für jede Extraktion nimmt man dreifaches Volumen von Azeton 2.um Gewicht des feuchten Myzeliums. Der erste wenigaktiven Extrakt wird verworfen und dem Gemisch des zweiten und dritten Extraktes doppeltes Volumen von destilliertem Wasser zugegeben. Mit dem vierten Extrakt wird die sekundäre Extraktion des Myzeliums der nächsten Fermentation durchgeführt» Das ausgefallene kristalline Heliomyzin v.drd abfiltriert und mit destilliertem Wasser gewaschen. Wenn das Rohhelioniyzin infolge einer Verunreinigung durch öl schlecht trocknet, wird es zusätzlich mit Petrolather gewaschen.

Die Ausbeute an Eohheliomyzin beträgt 3 Gewichtsprozent, bezogen auf das feuchte Myzelium. Das Rohpräparat enthält 80 bis 85 Gewichtsprozent Heliomyzin· (Siehe Urheberschein der UdSSR Ho· 266149).

Ein Nachteil des bekannten Verfahrens zur Herstellung von Heliomyzin aus der Kultur Actinomyces flavochroinogenes var heliomycini ist eine große Variabilität des Stammes. Bei häufigem Überimpfen und längerer Lagerung wird die Kultur in aktive und wenigaktive Varianten gespalten. Die größte Fähigkeit, das Antibiotikum in dem Lyzelium zu speichern, ist den

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Varianten eigen, deren Kolonien beim Wachstum auf einem festen organischen Nährmedium kein Luftmyzelium "besitzen, auf mineralischem Nährmedium ein spärliches Luftmyzelium aufweisen und ein graubraunes Pigment ausscheiden· In diesem Zusammenhang ist die Ausbeute an Rohantibiotikum niedrig (3 Gewichtsprozent, bezogen auf das feuchte Myzelium bei der Verwendung aktiver Varianten der Kultur Actinomyces flavochromogenes var heliomycini) .

Ziel der vorliegenden Erfindung ist., es, die genannten Nachteile zu vermeiden«

In Übereinstimmung mit dem Ziel wurde die Aufgabe gestellt, durch die Verwendung eines neuen Stammes die Ausbeute an Endprodukt zu steigern.

Diese Aufgabe wurde dadurch gelöst, daß man in dem Verfahren zur Herstellung des Antibiotikums Heliomyzin durch Bereitung von Impfmaterial der Kultur des Heliomyzinproduzenten, Beimpfen mit diesem von Nährmedium unter anschließender Fermentation, Abtrennung des Myzeliums und Isolierung aus diesem des Endproduktes erfindungsgemäß als Kultur des Heliornysinproduzenten den Stamm 6303 Actinomyces variabilis var roseoluß verwendet, der durch folgende kulturmorphologische und physiologische Eigenschaften gekennzeichnet wird: er bildet auf dem mineralischen Nährmedium Gause No, 1 ein reichliches graues Luftmyzelium, das Substratmyzelium ist farblos, er färbt das Nährmedium schwach braun-rosa oder>-

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violett-braun, die Sporenträger sind spiralförmig mit 2 bis 4· Windungen der Spirale, die Sporen sind mit langen Härchen bedeckt; ι

auf dem organischen Nährmedium Gause No. 2 ist daß Luftmyzelium zunächst cremefarben, dann grau, das Substratmyzel ist graubraun-gelb bis dunkelgraubraun; auf dem Czapek-Nährmedium und Lindenbein-Nährmedium ist das Luftmyzelium reichlich grau, das Substratmyzelium bräunt auf dem Glukose-Aspargin-Agar ist das Luftmyzelium spärlich, zunächst cremefarben, dann grau, das Substratrayzelium graubraun-gelb, färbt das Nährmedium nicht, nimmt auf flüssigen Nährmedien bei einer Temperatur von 28⁰C Laktose, Galaktose, Saccharose gut, Glukose mäßig und Dulzit schwach auf; abgetrennt aus dem Boden und selektioniert durch natürliche Wahl und Ultraviolettbestrahluu^; =

Das erfindungsgemäße Verfahren wird wie folgt durchgeführt.

Als Ausgangskultur verwendet man den Stamm Nr. 6383 Actinomyces variabilis var roseousl. Diese Kultur unterscheidet sich von der früher beschriebenen Kultur Nr· 2915 Actinomyces flavochromogenes var heliomycini durch die Bildung eines braunen Substretmyseliums und löslicher Pigmente bräunlichrosa-

farbener oder violett-brauner Farbtöne beim Wachstum auf synthetischen Nährmedien sowie durch reichliches Sporentragen des grauen Luftmyzeliums auf diesen Nährmedien.

Die Ausgangskultur wird im Submersverfahren auf dem Sojamehl-Stärke-Nährmedium gezüchtet·

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Das gleiche Nährmedium kann zur Züchtung von Impfmyzelium verwendet werden.

Das Antibiotikum ist im Myzelium enthalten, welches von der Kulturflüssigkeit durch Filtrieren abgetrennt wird» Das Antibiotikum extrahiert man mit Azeton aus dem Myzelium, das eine Feuchtigkeit von etwa 60 Gewichtsprozent aufweist· Die Extraktion wird 4 Mal durchgeführt· Für jede Extraktion nimmt

ein dreifaches Volumen von Azeton zum Gewicht des feuchten Myzeliums. Der erste wenigaktive Extrakt wird verworfen und dem Gemisch des zweiten und dritten Extraktes doppeltes Volumen von destilliertem Wasser zugesetzt·

Mit dem vierten Extrakt führt man die sekundäre Extraktion des Myzeliums der nächsten Fermentation durch· Es fällt kristallines Heliomyzin aus, welches abfiltriert und mit destilliertem Wasser gewaschen wird* Falls das Rohantibiotikum infolge einer Verunreinigung durch öl schlecht trocknet, wird dieses zusätzlich mit Petrolätheri gewaschen· Die Ausbeute an Rohheliomyzin beträgt 4 Gewichtsprozent, bezogen auf das feuchte Myzelium, Das Rohpräparat enthält 80-85 Ge- * wichtsprozent Heliomyzin, bezogen auf das chemisch reine kristalline Präparat.

Ein Vorteil des vorliegenden Verfahrens ist die Verwendung eines neuen und produktiveren Stammes, des Stammes Nr, 6383 Actinomyces variabilis var roseousl, bei dessen Verwendung die Ausbeute an kristallinem Heliomyzin auf 4 Gewichtsprozent, bezogen auf das feuchte Myzelium, gesteigert werden kann. ,

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Beispiel

Zur Herstellung von Sporenmaterial züchtet man den Stamm Nr♦ 6383 Actinomyces variabilis var roseolus in Reagenzgläsern mit abgeschrägtem synthetischem Nährmedium Gause Nr, 1 während 10 Tage "bei einer Temperatur von 28⁰C. Zur Herstellung von Impfmyzelium werden mit den Sporen der Kultur Erlenmeyerkolben von 500 ml Fassungsvermögen beimpft, die 100 ml Nährmedium der folgenden Zusammensetzung (in Gewichtsprozenten) enthalten: Sojamehl 1,0; Stärke 1,0} Natriumchlorid 0,3; Kalziumkarbonat 0,3; Kaliumdihydrogenphosphat; Wasser bis 100 ml, pH des Nährmediums nach der Sterilisation 7*0·

Das Impfmyzelium züchtet man in den Kolben 2 Tage bei einer Temperatur von 28⁰C auf Schaukeln, die bei 200 U/min arbeiten,

5 Gewichtsprozent des gezüchteten Impfmyzeliums (400 ml im Kolben) bringt man in Impffermenter von 45 Liter Fassungsvermögen ein, die 20 Liter Nährmedium der folgenden Zusammen- ■! setzung (in Gewichtsprozenten) enthalten: Sojamehl 1,0; Stärke j 1,0; NaCl 0,3; CaCO- 0,3; KH₂PO^ 0,1; Pottwaltran 0,1; Wasser bis 100 ml; pH des Mediums nach der Sterilisation 7,0.

Man sterilisiert 45 Minuten bei einer Temperatur von 120°C· Dann erfolgt die Züchtung bei einer Temperatur von 28⁰C unter einem Druck von 0,3 bis 0,5 at, bei einem Belüftungsgrad von 1 Liter Luft je 1 Liter Nährmedium in der Minute bei eingeschaltetem Rührwerk, das bei 300 U/min arbeitet·

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Nach 48 Stunden Züchten wird das Impfmaterial den Fermentern zugeführt» In die Fermenter von 500 Liter Fassungsvermögen "bringt man Nahrmedium der folgenden Zusammensetzung (in Gewichtsprozenten) ein: Sojamehl 1,0} Stärke 2,0$ NaCl 0,3ϊ. CaCO^ 0,3; KH₂PO^ 0,1; Pottwaltran 0,1; Wasser bis 100 ml, pH des Nährmediums nach der Sterilisation 7»0.

Man sterilisiert 45 Minuten bei einer Temperatur von 120⁰C· Die Beimpfung erfolgt aus den Impfapparaten, wobei man 20 Liter Impfmaterial de 300 Liter Nährmedium (5 bis 7 Gewichtsprozent Impfmaterial) nimmt. Die Fermentation erfolgt bei einer Temperatur von 28⁰C unter einem Druck von 0,3 bis 0,5 at, bei einem Belüftungsgrad von 1 Liter Luft je 1 Liter Nährmedium in der Minute bei eingeschaltetem Rührwerk, das bei 300 U/min arbeitet. Die Fermentation dauert 96 bis 120 Stunden.

Man filtriert die Kulturflüssigkeit und erhält gegen 30 kg Mizelium mit einer Feuchtigkeit von etwa 60 Gewichtsprozent ·

Das Myzelium extrahiert man mit Azeton 4 Male. Für jede

Extraktion nimmt man dreifaches Volumen von Azeton (90 Liter) . zum Gewicht des feuchten Myzeliums. Der erste wenigaktive Extrakt wird verworfen und dem Gemisch des zweiten und dritten Extraktres doppeltes Volumen von destilliertem Wasser (360 Liter) zugesetzt» Dabei fällt das Rohheliomyzin aus, welches man abfiltriert und mit destilliertem Wasser wäscht. Falls das Rohpräparat infolge einer Verunreinigung durch öl schlecht

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trocknet, wird es zusätzlich mit 5 bis 10 fächern Volumen von Petroleumäther zum kristallinen Eohpräparat gewaschen·

Die aus 30 kg feuchtem Myzelium (Feuchtigkeit 60%) erzielte Ausbeute an Rohpräparat beträgt 1200 g. Das Eohpräparat enthält 80 bis 85 Gewichtsprozent Heliomyzin, umgerechnet auf chemisch reines kristallines Präparat,

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Claims

PATENTANS PR U Crt:

Verfahren zur Herstellung des Antibiotikums Heliomyzin durch Bereitung von Impfmaterial der Kultur des Helioniyzinproduzenten, Beimpften mit diesem von Nährmedium unter anschließender Fermentation, Abtrennung des Myzeliums und Isolierung

des Endproduktes, dadurch gekennzeichnet , daß man als Kultur des Heliomyzinprodusenten den Stamm 6383 Actinomyces variabilis var roseolus verwendet, der durch folgende kultunaorphologische und physiologische Eigenschaften gekennzeichnet wird: er bildet auf dem mineralischen Nährmedium Gause Nr, 1 ein reichliches graues Luftmyzelium, döö SubstratEiyzeliuia ist farblos, er färbt das Nährmedium schwach braun-rosa oder violettbraun, die Sporenträger sind spiralförmig mit 2 bis 4- Windungen, der Spirale, die Sporen sind mit langen Härchen bedeckt; auf dem organischen iiährmedium Gause Nr. 2 ist das Luftmyzelium zunächst cremefarben, dann grau, das Substratiayzel ist graubraun-gelb bis dunkelgraubraun? auf dem Czapek-Mhrmedium und Lindenbein-Nährmedium ist das Luftmyzelium reichlich, grau, das Substratmyzelium braun? auf dem Glukose-Aspargin-Agar ist das Luftmyzelium spärlich ₉ zunächst cremefarben, dann grau, das Substratmyzelium graubraungelb, färbt das Nährmedium nicht, nimmt auf flüssigen Nährmedien bei einer Temperatur von 28⁰C Laktose, Galaktose, Saccharose gut, Glukose mäßig und Dulzit schwach auf; abgetrennt aus dem Boden und selektioniert durch natürliche Wahl und Ultraviolettbestrahlung. _y

ORIGINAL INSPECTED 20984S/11R9