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Verfahren zur Biosynthese von Antibiotika der Tetracyclinreihe
Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Biosynthese von Antibiotika der Tetracyclinreihe, wie Tetracyclin, Chlortetracyclin, Bromtetracyclin, Oxytetracyclin, 6-Desmethyltetracyclin, 7-Chlor-6-desmethyltetracyclin u. dgl. durch einen neuartigen Fermentationsprozess, bei dem zwei oder mehr Mikroorganismen der Gattung Streptomyces zum Einsatz kommen.
Selbstverständlich ist bekannt, die Tetracyclinantibiotika durch Fermentation mit einem einzigen reinen Stamm herzustellen. Tatsächlich ist dies der übliche Weg zur Herstellung dieser Antibiotika. Die Herstellung von Chlortetracyclin durch S. aureofaciensistz. B. in der USA-Patentschrift Nr. 2, 482, 055 beschrieben. Die USA-Patentschrift Nr. 2, 516, 080 beschreibt die Herstellung von Oxytetracyclin durch S. rimosus. Die österr. Patentschrift Nr. 208506 befasst, sich mit der Herstellung von Tetracyclin durch S. aureofaciens und die österr.
Patentschrift Nr. 219198 beschreibt die Herstellung von 6-Desmethyltetra- cyclin und 7 Chlor- 6-desmethyltetracyclin durch S. aureofaciens. Fermentationen mit reinen Einzelstämmen wurden bisher allein zur Herstellung dieser Antibiotika angewendet, obwohl die Freihaltung dieser Reinstämme von allfälligen Mutanten usw. nur mit grossen Schwierigkeiten erreichbar ist.
Das erfindungsgemässe Verfahren zur Herstellung von Antibiotika der Tetracyclinreihe wie der oben genannten erfolgt mit Hilfe eines normalerweise zur Erzeugung des gewünschten Tetracyclin-Antibiotikums befähigten Stammes von Streptomyces aureofaciens unter submersen, aeroben Bedingungen und ist dadurch gekennzeichnet, dass die Fermentation unter synergistischer Steigerung der Bildungdes gewünsch- ten Tetracyclin-Antibiotikums in Gegenwart mindestens eines weiteren Stammes der Arten Streptomyces
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Die Erfindung beruht somit auf der überraschenden Entdeckung, dass es möglich ist, eine Mischung von zwei oder mehr ausgewählten Stämmen von Mikroorganismen der Art Streptomyces einzusetzen und in vielen Fällen eine erstaunlich, nur durch einen synergistischen Effekt erklärbare Ausbeutesteigerung bei der Herstellung der Tetracycline zu erreichen, selbst wenn solche Stämme, wenn mit ihnen einzeln fermentiert wird, keine oder nur relativ geringe Mengen der Tetracyclin-Antibiotika erzeugen. Diese Erscheinung wird im folgenden als Cosynthese bezeichnet. Ebenso überraschend ist die Entdeckung, dass beide Glieder des cosynthetisierenden Paares der Mikroorganismen nicht von der gleichen Art sein müssen und in der Tat muss nur einer der verwendeten Stämme von einer der normalerweise das gewünschte Tetracyclin-Antibiotikum produzierenden Arten der Gattung Streptomyces sein.
Der wirksame Stamm kann selbst auf Grund etwaiger Stoffwechselblockierung unfähig zur Herstellung eines Tetracyclin-Antibiotikums in wesentlichen Mengen sein. Einige Stämme von S. aureofaciens zeigen cosynthetische Herstellung von Te-
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mit einer nicht Tetracyclin erzeugenden Art, wie z. B. S. lavendulae oder S. grises erreicht werden.
Der genaue Vorgang, nach welchem die Stämme synergistisch ineinander eingreifen, ist nicht gänzlich geklärt. Es ist möglich, dass es bei jedem Paar der Stämme einen"Donator"-und einen"Acceptor"- Stamm gibt. Der Acceptorstammbestimmtdie Art des zu erzeugenden Tetracyclin-Antibiotikums und der Donatorstamm unterstützt dessen Produktion. Die Wirkung eines speziellen Stammes kann in Abhängigkeit
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davon, mit welchem andern Stamm er zusammen verwendet wird, variieren. Mit andern Worten, ein
Stamm kann ein Donatorstamm in einem Paar und ein Acceptotstamm im andern Paar sein. Wenn ein Stamm eines Paares selbst ein guter Produzent eines speziellen Antibiotikums ist, wird er üblicherweise das Acceptorglied eines Paares an dem er teilnimmt, bilden.
Es ist jedoch zu betonen, dass diese Erklärung einzig auf Betrachtungen basiert, die nicht vollständig an experimentellen Daten überprüft wurden.
Sie ist auch nicht als die einzig mögliche Erklärung der Erfindung aufzufassen. Doch abgesehen von der theoretischen Erklärung erreicht man Synergismus, indem man nach den hier beschriebenen Massnahmen und Verfahren arbeitet.
Die Auswahl der Stämme zwecks Erzielung einer Cosynthese der Tetracycline wird leicht ausgeführt nach den klassichen Wegen der Stammauswahl, die dem Fachmann geläufig sind. Eine übliche Methode besteht darin, dass m an eine Petrischale, die ein Nähragar enthält, mit Sporen einer Lagerkultur beimpft, nachdem man die Sporen mit einem Mutationen hervorrufenden Mittel behandelt hat. Nach der Inkubation der beimpften Schale ergibt sich aus der Beobachtung der gebildeten Kolonien, dass bestimmte Kolonien in auffälliger Weise von der Stammkultur unter gleichen Umständen sich unterscheiden. Typische Änderungen gegenüber der Stammkultur sind z.
B. dunkelbraune Kolonien, verglichen mit den normalerweise braun-gelben Kolonien ; Mikrokolonien, verglichen mit normalen Kolonien ; Riesenkolonien im Gegensatz zu normalen Kolonien ; blass-gelbe Kolonien,. farblose Kolonien, dunkelgrüne Kolonien ; kupferrote Kolonien im Gegensatz zu normalerweise braun-gelben Kolonien ; rauhe oder glatte Kolonien im Gegensatz zu normalerweise geriffelten Kolonien ; Kolonien mit nicht diffundierbarem Pigment im Gegensatz zu normalen Kolonien, die ein braun-gelbes diffundierbares Pigment besitzen ; Kolonien mit einem fluoreszierenden Diffusionshof im Gegensatz zu einem nicht fluoreszierenden Hof und Kombinationen dieser und zahlreicher anderer Abänderungen.
Selbst wenn keine augenscheinliche Unterscheidung der Kolonien vorliegt, zeigt sich häufig eine Veränderung bei weiterer Untersuchung von willkürlich herausgegriffenen isolierten Individuen, z. B. durch Untersuchung der Antibiotikumproduktion bei der Fermentation in Reinkulturschüttelflaschen, durch Untersuchung, welche Art Kohlehydrat verwertet wird, wobei man sich der spektrophotometrischen, der spektrofluormetrischen, der papierchromatographischen oder irgend einer andern Prüfung mittels physikalischer, chemischer oder biologischer Untersuchung, wie sie gerade
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fellost, Cobaltionen, Colchicin, polynucleare Kohlenwasserstoffe u. dgl.) physikalische Massnahmen (Verreiben). Ultraviolettstrahlen, Röntgenstrahlen und Stickstofflost sind von spezieller Brauchbarkeit als Mutierung erzeugende Mittel.
Nachdem eine Gruppe von Varianten ausgewählt ist, besteht der nächste Schritt zur Erreichung einer cosynthetischen Fermentation darin, zu bestimmten, welche dieser Varianten geeignet sind, biologisch zusammenzuwirken. Dies kann rein empirisch festgestellt werden, d. h. durch Fermentationen mit Kom- binationen zweierodermehrererausgewählterStämme und indem man Menge und Art der erzeugten Tetracycline mit denen vergleicht, die durch die Varianten der Zusammensetzung erzeugt werden, wenn man sie in getrennten Fermentationen anwendet. Da jedoch cosynthetische Varianten nur selten vorliegen, obwohl es viele cosynthetische Typen gibt und da viele Typen sehr spezifisch in ihrer biologischen Zusammenwirkung nur mit bestimmten andern cosynthetischen Typen sind, kann diese Methode mühevoll sein.
Es ist deshalb vorzuziehen, von einem Stamm eines cosynthetischen Paares auszugehen, dessen Eignung als cosynthetischer Partner bereits festgestellt ist und diesen als Testorganismus bei der Suche nach neuen cosynthetischen Partnern einzusetzen. Auf diesem Wege wird die Anzahl von Kombinationen, die zu untersuchen sind, von einer sehr grossen Anzahl von Möglichkeiten auf nur einen Versuch für jeden Stamm reduziert. Der Test besteht darin, dass man eine gemeinsame Fermentation mit jedem neu zu untersu-
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dass Stämme von S. aureofaciens brauchbar zur Durchführung der Erfindung sind. Weiterhin wurden viele andere Varianten von S. aureofaciens festgestellt, die erfindungsgemäss verwendet werden können.
Diese Stämme sind Glieder der Art S. aureofaciens, da sie direkte Abkömmlinge des Chlortetracyc- lin-produzierenden, aus Boden isolierten S. aureofaciens A 377 sind, der in der USA-Patentschrift Nr. 2, 482,055 beschrieben ist und dessen Kultur an der Northern Regional Research, Laboratory, Peoria, Illinoisals NRRL 2209 hinterlegt ist. Die Mutation erzeugenden Mittel und selektiven Agentien, die zur Erlangung dieser Stämme angewendet wurden, waren Ultraviolettbestrahlung, Nicotinbehandlungen mit Stickstofflost und Behandlung mit Phagen.
Diese Stämme besitzen die gleichen allgemeinen Charakteristika, wie sie die Stämme besitzen, die die Tetracycline produzieren und unterscheiden sich in der gleichen allgemeinen Weise, wie die Tetracyclin produzierenden und Chlortetracyclin produzierenden Stämme von S. aureofaciens sich voneinander unterscheiden, was in einer Anzahl wissenschaftlicher Abhandlungen, die veröffentlicht wurden, beschrieben ist.
Die unten angeführten Daten dienen zur Erläuterung der Charakteristika zweier dieser neuen Stämme T-219 und E-504 im Vergleich mit dem Originalstamm A 377, der unter der Bezeichnung NRRL 2209 erhältlich ist.
Streptomyces aureofaciens Stämme T - 219 und E - 504 wurden unterschieden vom Streptomyces aureofaciens-Stamm A 377 (NRRL 2209) durch Beobachtung der Wachstumscharakteristika in verschiedenen Nährmedien bei einer Inkubationstemperatur von 26, 50C.
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EMI3.2
<tb>
<tb> Glycerin <SEP> 10 <SEP> g
<tb> 1-Asparagin <SEP> 0, <SEP> 5 <SEP> g <SEP>
<tb> Ochsenfleischextrakt <SEP> 2 <SEP> g
<tb> KH2PO" <SEP> 0, <SEP> 5 <SEP> g
<tb> Bacto-Agar <SEP> 15 <SEP> g
<tb> destilliertes <SEP> Wasser <SEP> ad <SEP> 1000 <SEP> ml
<tb> Einregelung <SEP> mit <SEP> 500/piger <SEP> KOH <SEP> auf <SEP> pH <SEP> 7, <SEP> 0 <SEP>
<tb> pH-Wert <SEP> nach <SEP> Sterilisierung <SEP> 7,
2
<tb>
Streptomyces aureofaciens
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<tb>
<tb> Stamm <SEP> T-219 <SEP> Stamm <SEP> E-504 <SEP> Stamm <SEP> A <SEP> 377
<tb> Wachstum <SEP> gut <SEP> bis <SEP> reichlich, <SEP> tief-gut, <SEP> dunkelkoffer- <SEP> gut
<tb> braun* <SEP> bis <SEP> dunkelbraun <SEP> braun* <SEP> bis <SEP> eichbraun
<tb> Lufthyphen <SEP> spärlich <SEP> bis <SEP> reichlich, <SEP> spurenweise <SEP> weiss <SEP> schlecht <SEP> bis <SEP> ausreichend,
<tb> weiss <SEP> weiss <SEP> bis <SEP> leichtgrau
<tb> Sporenbildung <SEP> spärlich, <SEP> reichlich <SEP> keine <SEP> leicht <SEP> grau
<tb> werdend <SEP> beim <SEP> Wachsturn <SEP> der <SEP> Ränder,
<tb> grau
<tb> Diffundierbares <SEP> Pigment <SEP> leicht <SEP> gelbgrün <SEP> bis <SEP> tief <SEP> leicht <SEP> bernstein-leicht <SEP> gelb
<tb> bernsteinfarben <SEP> farben
<tb> Rückseite <SEP> tief <SEP> braun* <SEP> bis <SEP> dun-dunkelkofferbraun <SEP> gelb* <SEP> bis <SEP> leicht <SEP>
<tb> kelbraun* <SEP> bis <SEP> eichbraun* <SEP> orangegelb
<tb>
*) Color Harmony Manual, Third Edition, Container Corp. of America
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2.
Dextrin Czapek-Dox-Agar :
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<tb>
<tb> Dextrin <SEP> 10 <SEP> g
<tb> NaNOs <SEP> 2 <SEP> g
<tb> K, <SEP> HPO, <SEP> l <SEP> g <SEP>
<tb> MgSO. <SEP> (. <SEP> 7HP <SEP> 0, <SEP> 5 <SEP> g
<tb> KCL <SEP> 0, <SEP> 5 <SEP> g
<tb> FeS04. <SEP> 7H20 <SEP> 0, <SEP> 01 <SEP> g
<tb> Bacto-Agar <SEP> 15 <SEP> g
<tb> destilliertes <SEP> Wasser <SEP> ad <SEP> 1000 <SEP> ml
<tb> pH-Wert <SEP> nach <SEP> Sterilisierung <SEP> 7,2
<tb>
Streptomyces aureofaciens
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<tb>
<tb> Stamm <SEP> T-219 <SEP> Stamm <SEP> E-504 <SEP> Stamm <SEP> A-377
<tb> Wachstum <SEP> dünn, <SEP> ganzrandig <SEP> zart, <SEP> glasartig <SEP> bis <SEP> durch- <SEP> gut
<tb> glasartig <SEP> weiss <SEP> schimmernd <SEP> weiss
<tb> Lufthyphen <SEP> keine <SEP> spärlich, <SEP> weiss <SEP> reichlich, <SEP> mausgrau*,
<SEP> bis
<tb> bleigran* <SEP> Wasserweisse
<tb> Oberflächenkügelchen
<tb> Sporenbildung <SEP> keine <SEP> keine <SEP> überreichlich
<tb> Diffundierbares <SEP> Pigment <SEP> kein <SEP> kein <SEP> Spuren <SEP> blassgelb
<tb> Unterseite <SEP> transparent <SEP> farb- <SEP> glasartig <SEP> bis <SEP> durch-pigmentlos <SEP> Spur <SEP> blasslos <SEP> scheinend <SEP> weiss <SEP> rot*
<tb>
*) Color Harmony Manual, Third Edition, Container Corp. of America 3.
AP Maisquellwasser-Agar :
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<tb>
<tb> Maisquellflüssigkeit <SEP> 4 <SEP> g
<tb> Saccharose <SEP> 10 <SEP> g
<tb> Mg, <SEP> S04. <SEP> 7Hp <SEP> 0, <SEP> 25 <SEP> g <SEP>
<tb> KH2PO4 <SEP> 2 <SEP> g
<tb> (NHPO <SEP> 2 <SEP> g
<tb> Bacto-Agar. <SEP> 20-g <SEP>
<tb> Leitungswasser <SEP> ad <SEP> 1000 <SEP> ml
<tb> pH-Wert <SEP> nach <SEP> Sterilisierung <SEP> 6,5 <SEP> g
<tb>
Streptomyces aureofaciens
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<tb>
<tb> Stamm <SEP> T-219 <SEP> Stamm <SEP> E-504 <SEP> Stamm <SEP> A-377
<tb> Wachstum <SEP> reichlich, <SEP> tiefbraun* <SEP> ausgezeichnet, <SEP> tief-ausgezeichnet
<tb> bis <SEP> dunkelbraun* <SEP> braun <SEP> bis <SEP> dunkelbraun <SEP>
<tb> Lufthyphen <SEP> spärlich <SEP> reichlich <SEP> weiss <SEP> reichlich <SEP> rehbraun*
<tb> Sporenbildung <SEP> spärlich,
<SEP> leicht <SEP> reichlich <SEP> rehbraun* <SEP> überreichlich <SEP> rehgrau <SEP> bis <SEP> biberfarben* <SEP> braun* <SEP>
<tb> lösliches <SEP> Pigment <SEP> olivegelb <SEP> bis <SEP> tief-orange <SEP> bis <SEP> braun <SEP> leicht <SEP> gelb <SEP> bis <SEP> bernbernsteinfarben <SEP> steinfarben
<tb> Unterseite <SEP> tiefbraun* <SEP> bis <SEP> leicht <SEP> braun* <SEP> bis <SEP> leicht <SEP> gelbbraun*
<tb> dunkelbraun* <SEP> schokoladebraun* <SEP>
<tb>
*) Color Harmony Manual, Third Edition, Container Corp. of America
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4.
Andere Medien Streptomyces aureofaciens
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<tb>
<tb> Medium <SEP> Stamm <SEP> T-219 <SEP> Stamm <SEP> E-504 <SEP> Stamm <SEP> A-377
<tb> Nähragar <SEP> annehmbares <SEP> Wachstum, <SEP> bisquitfarben*, <SEP> dürftig <SEP> bis <SEP> annehmbares <SEP> Wachstum. <SEP> gutes <SEP> Wachstum <SEP> keine <SEP> Luftkeine <SEP> Lufthyphen, <SEP> kein <SEP> lösliches <SEP> Pigment <SEP> Keine <SEP> Lufthyphen, <SEP> kein <SEP> lösliches <SEP> hyphen, <SEP> blassgelbes <SEP> lösliches
<tb> Unterseite <SEP> : <SEP> bisquitfarben*. <SEP> Pigment, <SEP> Unterseite <SEP> : <SEP> beige. <SEP> Pigment, <SEP> Unterseite <SEP> : <SEP> blassgelb.
<tb>
Glucose-Asparagin-Fleisch-gutes <SEP> Wachstum, <SEP> tiefbraun <SEP> bis <SEP> schokolade- <SEP> gutes <SEP> Wachstum, <SEP> kamelfarben* <SEP> bis <SEP> gutes <SEP> Wachstum, <SEP> Lufthyphen
<tb> Extrakt-Agar <SEP> braun, <SEP> reichlich <SEP> bis <SEP> überreichliche <SEP> Luft-dunkelmahagonibraun* <SEP> ; <SEP> Lufthyphen <SEP> weiss, <SEP> zunehmend <SEP> grau <SEP> werhyphen <SEP> ; <SEP> weiss <SEP> allmählich <SEP> leicht <SEP> rehbraun* <SEP> mässig <SEP> bis <SEP> reichlich, <SEP> weiss <SEP> allmäh-dend <SEP> mit <SEP> zunehmender <SEP> Spowerdend. <SEP> Sporenbildung <SEP> : <SEP> Reichlich <SEP> bis <SEP> lich <SEP> kätzchenweidengrau <SEP> bis <SEP> asch-renbildung. <SEP> Spurenweise <SEP> gelb-
<tb> überreichlich <SEP> ; <SEP> tiefbraun <SEP> lösliches <SEP> Pigment. <SEP> farben <SEP> * <SEP> werdend, <SEP> Sporenbildung <SEP> :
<SEP> oranges <SEP> lösliches <SEP> Pigment.
<tb> Rückseite <SEP> tiefbraun* <SEP> bis <SEP> schokoladebraun. <SEP> Mässig <SEP> bis <SEP> reichlich, <SEP> leicht <SEP> gelbes <SEP> Unterseite <SEP> : <SEP> Leicht <SEP> gelb <SEP> bis
<tb> lösliches <SEP> Pigment. <SEP> Unterseite <SEP> : <SEP> Ka- <SEP> rötlich <SEP> orange.
<tb> melfarbig <SEP> bis <SEP> dunkelmahagonibraun*
<tb> Waksman's <SEP> Agar <SEP> reichliches <SEP> Wachstum <SEP> tiefbraun* <SEP> bis <SEP> ausgezeichnetes <SEP> Wachstum, <SEP> dunkel-gutes <SEP> Wachstum, <SEP> Lufthyphen,
<tb> schokoladebraun*, <SEP> überaus <SEP> reichliche <SEP> mahagonibraun*, <SEP> überreichliche <SEP> annehmbar <SEP> und <SEP> allmählich
<tb> Lufthyphen, <SEP> weiss <SEP> langsam <SEP> beigebraun <SEP> Lufthyphen,
<SEP> weiss <SEP> allmählich <SEP> biber-reichlich <SEP> weiss <SEP> bis <SEP> schwachwerdend* <SEP> überreichliche <SEP> Sporenbil- <SEP> bis <SEP> schokoladebraun, <SEP> überreichliche <SEP> braun*, <SEP> schwach <SEP> gelbes <SEP> lösdung, <SEP> gelbgrünes <SEP> bis <SEP> bernsteinfarbiges <SEP> Sporenbildung, <SEP> orangebraunes <SEP> lös- <SEP> liches <SEP> Pigment. <SEP> Unterseite <SEP> : <SEP>
<tb> lösliches <SEP> Pigment. <SEP> Unterseite <SEP> : <SEP> Ziegel-liches <SEP> Pigment. <SEP> Unterseite <SEP> :
<SEP> Dunkel-Kamelfarben <SEP> bis <SEP> ziegelbraun <SEP> bis <SEP> schokoladebraun <SEP> mahagonibraun* <SEP> braun
<tb> Kartoffelschnitten <SEP> ausgezeichnet, <SEP> feucht, <SEP> glatt, <SEP> mit <SEP> überreichlich <SEP> feuchtes, <SEP> glattes <SEP> mit <SEP> überreichliches <SEP> feuchtes, <SEP> glattes <SEP>
<tb> Knötchen <SEP> versehenes <SEP> Wachstum, <SEP> das <SEP> Knötchen <SEP> versehenes <SEP> Wachstum, <SEP> mit <SEP> Knötchen <SEP> versehenes
<tb> schliesslich <SEP> gefurcht <SEP> wird <SEP> ;
<SEP> olivfarben. <SEP> kelmahagonibraun*. <SEP> Lufthyphen <SEP> keine <SEP> Wachstum, <SEP> leicht <SEP> braungelb
<tb> Reichliche <SEP> weisse <SEP> Lufthyphen, <SEP> Sporen-bis <SEP> reichlich <SEP> weiss, <SEP> allmählich <SEP> reh-bis <SEP> beige <SEP> bis <SEP> federfarbig, <SEP> kein
<tb> bildung <SEP> keine, <SEP> jedoch <SEP> beginnend, <SEP> sat- <SEP> braun <SEP> werdend <SEP> bei <SEP> Sporenbildung. <SEP> Ro- <SEP> lösliches <SEP> Pigment.
<tb> telbraunes <SEP> lösliches <SEP> Pigment. <SEP> sentopasfarbiges <SEP> bis <SEP> dunkelmahagonifarbenes <SEP> lösliches <SEP> Pigment.
<tb>
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4. Andere Medien (Fortsetzung) Streptomyces aureofaciens
EMI6.1
<tb>
<tb> Medium <SEP> Stamm <SEP> T-219 <SEP> Stamm <SEP> E-504 <SEP> Stamm <SEP> A-377
<tb> Purple-Milch <SEP> schweres <SEP> glasartiges <SEP> Wachstumspolster, <SEP> ausgesprochenes <SEP> Wachstumspolster <SEP> schwach <SEP> weisses <SEP> bis <SEP> blassgelbes
<tb> senfbraun, <SEP> leicht <SEP> braunes, <SEP> lösliches <SEP> Pi- <SEP> tief <SEP> rotbraun <SEP> bis <SEP> mahagonibraun, <SEP> Wachstumspolster <SEP> geringe <SEP>
<tb> gment, <SEP> leicht <SEP> alkalische <SEP> Reaktion, <SEP> jedoch <SEP> keine <SEP> auffällige <SEP> Peptonisierung, <SEP> signifikante <SEP> pH"Änderung <SEP> oder
<tb> keine <SEP> auffällige <SEP> Peptonisierung.
<SEP> keine <SEP> PH-Änderung, <SEP> jedoch <SEP> falsche <SEP> anscheinende <SEP> Peptonisierung
<tb> alkalische <SEP> Farbreaktion <SEP> durch <SEP> Dif- <SEP> innerhalb <SEP> 14 <SEP> Tagen.
<tb> fusion <SEP> von <SEP> löslichem <SEP> Pigment.
<tb>
AP <SEP> 6 <SEP> Maisquellflüssigkeit <SEP> reichliches <SEP> Wachstum, <SEP> braun <SEP> bis <SEP> schoko-ausgezeichnetes <SEP> Wachstum, <SEP> leicht <SEP> ausgezeichnetes <SEP> Wachstum,
<tb> Agar* <SEP> * <SEP> ladebraun, <SEP> spärliche <SEP> Lufthyphen, <SEP> weiss, <SEP> pfefferbraun <SEP> bis <SEP> schokoladebraun, <SEP> überreichliche <SEP> Lufthyphen,
<tb> allmählich <SEP> grau, <SEP> im <SEP> Zentrum <SEP> werdend, <SEP> reichliche <SEP> Lufthyphen, <SEP> weiss <SEP> all-ausserordentlich <SEP> reichliche
<tb> spärliche <SEP> Sporenbildung, <SEP> tief <SEP> bernstein- <SEP> mählich <SEP> rehbraun <SEP> bis <SEP> biberbraun <SEP> Sporenbildung, <SEP> rehbraun
<tb> farbenes <SEP> lösliches <SEP> Pigment. <SEP> Unterseite <SEP> :
<SEP> werdend, <SEP> reichliche <SEP> Sporenbildung, <SEP> leicht <SEP> bernsteinfarbiges <SEP> lösGlasartig, <SEP> tiefbraun <SEP> bis <SEP> schokoladebraun. <SEP> tief <SEP> orangebraunes <SEP> lösliches <SEP> Pi-liches <SEP> Pigment, <SEP> Unterseite <SEP> : <SEP>
<tb> gment, <SEP> Unterseite <SEP> :
<SEP> Leicht <SEP> pfeffer- <SEP> Gelbbraun. <SEP>
<tb> braun <SEP> bis <SEP> schokoladebraun
<tb> Q4 <SEP> Agar* <SEP> * <SEP> * <SEP> reichliches <SEP> Wachstum, <SEP> tiefbraun <SEP> bis <SEP> ausgezeichnetes <SEP> Wachstum, <SEP> burgunder-ausgezeichnetes <SEP> Wachstum, <SEP>
<tb> schokoladebraun, <SEP> Lufthyphen <SEP> spärlich, <SEP> farbig <SEP> bis <SEP> ebenholzbraun, <SEP> überreichliche <SEP> blass <SEP> gelb, <SEP> überreichliche <SEP>
<tb> weiss <SEP> bis <SEP> leicht <SEP> grau <SEP> bis <SEP> leicht <SEP> hellbraun, <SEP> Lufthyphen, <SEP> weiss <SEP> bis <SEP> rosentopasfarbig, <SEP> Lufthyphen, <SEP> dunkelbraun,
<tb> dürftige <SEP> Sporenbildung, <SEP> sehr <SEP> tief <SEP> bernstein- <SEP> allmählich <SEP> topasbraun <SEP> werdend, <SEP> über-überreichliche <SEP> Sporenbil- <SEP>
<tb> farbenes <SEP> lösliches <SEP> Pigment, <SEP> Unterseite <SEP> :
<SEP> reichliche <SEP> Sporenbildung, <SEP> sehr <SEP> tief <SEP> rot- <SEP> dung, <SEP> orangebraunes <SEP> lösliTiefbraun <SEP> bis <SEP> schokoladebraun. <SEP> oranges <SEP> lösliches <SEP> Pigment, <SEP> Unterseite <SEP> : <SEP> ches <SEP> Pigment, <SEP> Unterseite <SEP> : <SEP>
<tb> Burgunderfarbig <SEP> bis <SEP> ebenholzbraun. <SEP> Orange <SEP> bis <SEP> orangegelb
<tb>
*) Color Harmony Manual, Third Edition, **) AP6 Agar ***) Q 4-Agar Container Corp. America Saccharose 10 g Maisquellf1üssigkeit 6 g Saccharose 10 g Maisquellflüssigkeit 9 g
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<Desc/Clms Page number 7>
5.
Mikroskopische Beobachtungen Streptomyces aureofaciens
EMI7.1
<tb>
<tb> Medium <SEP> Stamm <SEP> T-219 <SEP> Stamm <SEP> E-504 <SEP> Stamm <SEP> A-377
<tb> Mycel <SEP> Sporen <SEP> Mycel <SEP> Sporen <SEP> Mycel <SEP> Sporen
<tb> Glycerin-Asparagin-Fleisch-biegsam, <SEP> fortlaufend <SEP> rund <SEP> bis <SEP> oval, <SEP> biegsam, <SEP> fortlaufend <SEP> keine <SEP> beobachtet <SEP> biegsam, <SEP> fortlaufend <SEP> kreisförmig <SEP> bis <SEP> oval
<tb> Extrakt-Agar <SEP> verzweigt, <SEP> Durchmesser <SEP> : <SEP> verzweigt, <SEP> verzweigt, <SEP> Durchmesser <SEP> : <SEP>
<tb> Durchmesser <SEP> : <SEP> 0,5 <SEP> - <SEP> 1,0 <SEP> <SEP> Durchmesser: <SEP> Durchmesser:
<SEP> 1,2 <SEP> - <SEP> 1,5 <SEP>
<tb> 0, <SEP> 5-1, <SEP> Op <SEP> 0, <SEP> 7-1, <SEP> Op <SEP> 1, <SEP> 0-1, <SEP> 2 <SEP> ? <SEP>
<tb> AP4 <SEP> Maisquellflüssigkeits- <SEP> biegsam, <SEP> fortlaufend <SEP> kreisförmig <SEP> bis <SEP> oval, <SEP> biegsam, <SEP> fortlaufend <SEP> kreisförmig, <SEP> oval, <SEP> biegsam, <SEP> fortlaufend <SEP> kreisförmig <SEP> bis <SEP> oval
<tb> Agar <SEP> verzweigt, <SEP> Durchmesser <SEP> : <SEP> verzweigt, <SEP> Durchmesser <SEP> : <SEP> verzweigt, <SEP> Durchmesser <SEP> : <SEP>
<tb> Durchmesser <SEP> : <SEP> 0,5 <SEP> - <SEP> 1,0 <SEP> <SEP> Durchmesser: <SEP> 0,5 <SEP> - <SEP> 1,0 <SEP> <SEP> Durchmesser:
<SEP> 1,1 <SEP> - <SEP> 1,5 <SEP>
<tb> 0, <SEP> 5-1, <SEP> O11 <SEP> 0, <SEP> 5-1, <SEP> 0 <SEP> p <SEP> 0, <SEP> 8-1, <SEP> 0 <SEP> p <SEP>
<tb> Waksman'sAgar <SEP> biegsam, <SEP> fortlaufend <SEP> kreisförmig <SEP> oval, <SEP> biegsam, <SEP> fortlaufend <SEP> kreisförmig <SEP> bis <SEP> oval, <SEP> biegsam, <SEP> fortlaufend <SEP> kreisförmig <SEP> bis <SEP> oval
<tb> verzweigt, <SEP> Durchmesser <SEP> : <SEP> verzweigt, <SEP> Durchmesser <SEP> verzweigt, <SEP> Durchmesser <SEP> : <SEP>
<tb> Durchmesser: <SEP> 0,5 <SEP> - <SEP> 1,0 <SEP> <SEP> Durchmesser: <SEP> 0, <SEP> 5-1, <SEP> 0 <SEP> p <SEP> Durchmesser:
<SEP> 0,5 <SEP> - <SEP> 1,0 <SEP>
<tb> 0, <SEP> 5 <SEP> - <SEP> 1,0 <SEP> <SEP> 0,5 <SEP> - <SEP> 1,0 <SEP> <SEP> 0,5 <SEP> - <SEP> 1,0 <SEP>
<tb>
Die Morphologie von Mycel und Sporen der Streptomyces aureofaciens-Stämme T-219 und E-504 sind offensichtlich ähnlich einander und auch ähnlich dem Originalstamm A -377
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Lebensfähige Kulturen der S. aureofaciens-Stämme E-504 und T-219, welche zu der beschriebenen
Cosynthese der Tetracycline in Übereinstimmung mit der Erfindung verwendbar sind, wurden an der
American Type Culture Collection in Washington DC. niedergelegt, wo diese Stämme die ATCC-Emp- fangsnummer 13191 bzw. 13192 erhielten.
Weiterhin können die S. aureofaciens-Stämme die an der
American Type Culture Collection unter der ATCC-Empfangsnummer 13189 bzw. 13190 niedergelegt wur- den, ebenso für die Cosynthese der Tetracycline entsprechend der Erfindung eingesetzt werden.
Ausser den oben aufgeführten Stämmen von S. aureofaciens, die am American Type Culture Collection niedergelegt wurden, zeigte es sich, dass viele andere Stämme von S. aureofaciens und von allen andern bekannten Tetracyclin - produzierenden Arten der Gattung Streptomyces, wie z. B. S. hygroscopicus,
S. platensis, S. rimosus und S. viridifaciens ebenso wie geeignet ausgewählte Mutanten von jedem dieser
Stämme zu der hier beschriebenen Cosynthese der Tetracycline eingesetzt werden können.
Viele Stämme der Gattung Streptomyces sind zur Cosynthese der Tetracycline fähig, vorausgesetzt, dass sie unter den geeigneten Bedingungen wachsen und dass sie in der richtigen Kombination mit einem oder mehreren der begleitenden Stämme, deren Auswahl vorhergehend beschrieben wurde, gemischt werden. Man lässt die Stämme von Streptomyces. die man von Kultursammelstellen erhält, oder die man aus dem Boden isoliert, oder die aus diesen Stämmen durch dem Fachmann geläufige Verfahren abgeleiteten Mutanten unter den Bedingungen wachsen, wie sie normalerweise zur Kultur von Streptomyces zum Zwecke der Erzeugung von Antibiotika oder andern Produkten angewendetwerden.
Die Nährmedien enthalten übliche Kohlenstoff- und Stickstoffquellen, wesentliche Mineralien und Wachstumsfaktoren und werden zusammengesetzt mit Inhaltsstoffen, wie Saccharose, Stärke, tierischen oder pflanzlichen Fetten, Maisquellflüssigkeit, Sojabohnenmehl, Baumwollsamenmehl, Hefe und verschiedenen Salzen. Man lässt die Kulturen bei Temperaturen von 20 bis 350C wachsen unter aeroben Bedingungen, wie man sie normalerweise in Schüttelflaschen erhält oder sie werden in bewegten Fermentationsgefässen belüftet. Die Kulturen werden gemischt, in Kombinationen von zwei oder mehreren gleichzeitig, entweder am Anfang der Fermentationszeit oder an einem bestimmten Zeitpunkt während der Fermentation. Die Endfermentationsmaischen sind für Tetracycline durch übliche Verfahren erprobt.
Es ergab sich eine Cosynthese von Tetracyclinen in solchen Kombinationen von Stämmen, beidenen sich. eine gesteigerte Bildung von einem oder mehreren Tetracyclinen gegenüber den Kontrollversuchen herausstellte, die entweder einzeln fermentiert wurden oder nach Beendigung der Fermentationszeit zusammengemischt wurdeif. Diese Verfahren sind ausführlicher in den folgenden Beispielen beschrieben. Die folgenden spezifischen Beispiele beschreiben in grösserem Detail die Erfindung.
Beispiel1 :HerstellungderImpfkultur.
Das Impfh turmedium wurde entsprechend folgendem Rezept hergestellt :
EMI8.1
<tb>
<tb> Saccharose <SEP> 30,0 <SEP> gMaisquellflüssigkeit <SEP> 16,5 <SEP> ml
<tb> (NHSC4 <SEP> 2, <SEP> 0g- <SEP>
<tb> CaC03 <SEP> 7, <SEP> 0 <SEP> g <SEP>
<tb> Wasser <SEP> ad <SEP> 1000 <SEP> ml
<tb>
8 aliquote ml dieses Mediums wurden in jede einer Reihe von Versuchsröhren von 20 cm gegeben und in einem Autoklaven 20 min lang bei einem Druck von 1,5 kg/crrf sterilisiert. Sporen von S. aureofaciens ATCC 13191 wurden von einem Agarschnittmitsterilem destilliertem Wasser heruntergewaschen und bildeten eine Suspension, die annähernd 60x16 Sporen/ml enthielt. Jeweils 0,33 ml dieser Suspension wurden zur Beimpfung jeder der Röhren, die 8 ml des Impfkulturmediums, wie es oben aufgeführt wurde, enthielt, verwendet.
Das beimpfte Schüttelrohr wurde danach für 24 h bei 280C auf einer hin-und hergehenden Schüttelmaschine, die mit 116 Bewegungen/min arbeitete, inkubiert. In gleicher Weise wurde die Impfkultur von sämtlichen Stämmen, die in den folgenden Beispielen verwendet werden, hergestellt.
Beispiel 2 : Herstellung des Fermentationsmediums :
Das Fermentationsmedium wurde entsprechend dem folgenden Rezept hergestellt :
EMI8.2
<tb>
<tb> (NH4) <SEP> 2S04 <SEP> 5, <SEP> 0 <SEP> g
<tb> CaCOs <SEP> 9, <SEP> 0 <SEP> g
<tb> NH4Cl <SEP> 1, <SEP> 5 <SEP> g
<tb> MgC12. <SEP> 6H <SEP> O <SEP> 2, <SEP> 0 <SEP> g
<tb> FeS04. <SEP> 7H20 <SEP> 0, <SEP> 04g <SEP>
<tb> MnS0. <SEP> 4H <SEP> O <SEP> 0, <SEP> 05g <SEP>
<tb>
<Desc/Clms Page number 9>
EMI9.1
<tb>
<tb> COSO".
<SEP> 6H20 <SEP> 0, <SEP> 005 <SEP> g <SEP>
<tb> ZnSO"o7H20 <SEP> 0, <SEP> 1 <SEP> g
<tb> Maisquellflüssigkeit <SEP> 25,0 <SEP> g
<tb> Baumwollsamenmehl <SEP> 2,0 <SEP> g
<tb> Maisstärke <SEP> 55, <SEP> 0 <SEP> g
<tb> Wasser <SEP> ad <SEP> 1000 <SEP> ml
<tb>
Mengen von 25 ml Medium wurden in 250 ml Erlenmeyer-Kolben gegeben und zu jedem Kolben
EMI9.2
EMI9.3
<tb>
<tb> Harz-enthalogenierte <SEP> Maisquellflüssigkeit <SEP> 30 <SEP> g/l
<tb> CaCOs <SEP> 7 <SEP> g/l <SEP>
<tb> (NH4) <SEP> 2S04 <SEP> 5 <SEP> g/l <SEP>
<tb> Stärke <SEP> mit <SEP> niedrigem <SEP> Chlorgehalt <SEP> 55 <SEP> g/l
<tb> MnSO. <SEP> (. <SEP> 4H2 <SEP> 0 <SEP> 50 <SEP> mg/l <SEP>
<tb> HgPC <SEP> (85%) <SEP> 200 <SEP> mg/l
<tb>
Das Medium wurde mit destilliertem Wasser auf das gewünschte Volumen aufgefüllt.
25 ml des Mediums wurden in 250 ml Erlenmeyer-Kolben gegeben und dazu zu jeder Flasche 0,5 ml Schmalzöl zugesetzt. Die Kolben wurden mit Baumwolle verstopft und während 15 min bei 1200C im Autoklaven erhitzt und danach auf Raumtemperatur abgekühlt.
Beispiel 4 : Cosynthese von 7-Chlor-6-desmethyl-tetracyclin in einer gemischten Fermentation der S. aureofaciens-Stämme ATCC 13191 und ATCC 13189.
Die Impfkulturen von Streptomyces aureofaciens ATCC 13191 und Streptomyces aureofaciensATCC 13189 wurden angesetzt, wie in Beispiel 1 beschrieben. Eine Anzahl 250 ml Erlenmeyer-Kolben, die jeweils 25 ml Fermentationsmedium enthielten, wurden danach, wie in Beispiel 2 beschrieben, hergestellt.
Drei Fermentationskolben wurden mit aliquoten Anteilen von 1,0 ml der Impfkultur von S. aureofaciens ATCC 13191 beimpft und drei weitere Kolben mitImpfkultur vonS. aureofaciens ATCC 13189. Sämtliche beimpftenFermentationskolben wurden bei 250C auf einer rotierendenSchüttelmaschine bei 180 Umdr/min während eines Zeitraumes von 48 h inkubiert, nach welcher Zeit Mischungen von 20 ml Fermentationsmaische, die S. aureofaciens ATCC 13191 enthielt, und 5 ml Fermentationsmaische, die S. aureofaciens ATCC 13189 enthielt, hergestellt wurden, wobei einer der 3 Kolben, der mit einem speziellen Stamm
EMI9.4
von weiteren 72 h inkubiert, so dass die gesamte Inkubationszeit in allen Fällen 120 h betrug.
Die nach 120 h geernteten Maischen der Kolben mit dem Einzelstamm und die Maische, die nach 120 h aus den Kolben mit den beiden Stämmen geerntet wurden, wurden auf antibiotische Wirksamkeit mittels einer biologischen Versuchstechnik untersucht (turbidimetrisch, mit Staphylococcus aureus), wobei die folgenden Resultate erhalten wurden :
EMI9.5
<tb>
<tb> 7 <SEP> -Chlor- <SEP> 6-desmeth <SEP> ylte <SEP> tracyclin <SEP>
<tb> Mikroorganismen <SEP> lt. <SEP> biologischem <SEP> Versuch
<tb> jg/ml
<tb> ATCC <SEP> 13191,120 <SEP> halt <SEP> < <SEP> 0, <SEP> 5 <SEP>
<tb> ATCC <SEP> 13189,120 <SEP> halt <SEP> < <SEP> 3
<tb> ATCC <SEP> 13191 <SEP> + <SEP> ATCC <SEP> 13189 <SEP> gemischt <SEP> nach <SEP> 205
<tb> 48 <SEP> h, <SEP> bestimmt <SEP> nach <SEP> 120 <SEP> h
<tb>
<Desc/Clms Page number 10>
Beispiel 5 :
Cosynthese von Chlortetracyclin in einer gemischten Fermentation von S. aureofaciens ATCC 13191 und S. aureofaciens ATCC 13192.
Eine AP 6 Agarschale wurde dünn mit Sporen von S. aureofaciens besät, welche einer Behandlung mit einem Mutationen erzeugenden Mittel, Stickstofflost, unterworfen worden waren. Nach der üblichen Inkubation bei 270C während 3 Tagen wurde eine nichtübliche Kolonie beobachtet. Diese war gekennzeichnet durch ein unterschiedlich fluoreszierendes gelbgrünes diffundierbares Pigment und eine Farbe der Kolonie, die mehr senffarben war, als diejenige des ursprünglichen Stammes. Diese Kolonie wurde abgetrennt, übertragen und auf einen Q 4-Schrägagar bei 270C 2 Wochen lang inkubiert, um Sporen zu erzeugen. Diese Sporen wurden zur Herstellung einer Impfkultur von ATCC 13192 verwendet, entsprechend den Anweisungen, wie sie in Beispiel 1 gegeben wurden.
Diese Impfkultur wiederum wurde in üblicher Weise zur Herstellung einer 24-Stundenmaische zum Test auf Cosynthese angesetzt. Dieser wurde ausgeführt, wie in dem vorhergehenden Beispiel 4 beschrieben, mit der einen Ausnahme, dass an Stelle von S. aureofaciens ATCC 13189 der Stamm ATCC 13192 eingesetzt wurde und dass das Verhältnis von ATCC 13192 zu S. aureofaciens ATCC 13191 in der Mischung 50 : 50 war an Stelle von 80 : 20, wie in Beispiel 4.
Man erhielt die folgenden Resultate :
EMI10.1
<tb>
<tb> Chlortetracyclin-Gehalt
<tb> Mikroorganismen <SEP> (biologischer <SEP> Test)
<tb> Pg/ml
<tb> ATCC <SEP> 13191, <SEP> 120 <SEP> h <SEP> alt <SEP> 0
<tb> ATCC <SEP> 13192,120 <SEP> h <SEP> alt <SEP> 0
<tb> ATCC <SEP> 13191 <SEP> + <SEP> ATCC <SEP> 13192 <SEP> gemischt <SEP> nach <SEP> 110
<tb> 24 <SEP> h, <SEP> bestimmt <SEP> nach <SEP> 120 <SEP> h
<tb>
Beispiel 6 : CosynthesevonChlortetracyclinin einer gemischten Fermentation von S. aureofaciens ATCC 13192 und S. aureofaciens S-2242.
Eine dunkel-ziegelrote Kolonie, die kein Antibiotikum produzierte, wurde als unüblicher Typ einer Kolonie von einer AP 6-Agarschale, die mitnormalem S. aureofaciens-Stamm besät war, ausgelesen. Diese Kolonie wurde auf einen Q 4-Schrägagar übertragen und bei 270C 17 Tage lang inkubiert zur Sporenerzeugung. Der erhaltene Stamm, als S-2242 bezeichnet, wurde auf cosynthetische Aktivität mit dem Stamm ATCC 13192 des vorhergehenden Beispiels 5 getestet, wobei die in Beispiel 5 aufgeführte Technik angewendet wurde. Weiterhin wurden Versuche angestellt mit einer Probe, die aus einer 50/50-Mischung der 120 h alten Maischen der Einzelfermentationen beider Mikroorganismen bestand.
Es ergaben sich folgende Resultate :
EMI10.2
<tb>
<tb> Chlortetracyclin-Gehalt
<tb> Mikroorganismen <SEP> (biologischer <SEP> Test)
<tb> lig/ml
<tb> ATCC <SEP> 13192, <SEP> 120 <SEP> h <SEP> alt <SEP> 0
<tb> S-2242, <SEP> 120 <SEP> halt <SEP> 20 <SEP>
<tb> ATCC <SEP> 13192 <SEP> + <SEP> S-2242, <SEP> gemischt <SEP> nach <SEP> 740
<tb> 24 <SEP> h, <SEP> getestet <SEP> nach <SEP> 120 <SEP> h
<tb> ATCC <SEP> 13192 <SEP> + <SEP> S-2242, <SEP> gemischt <SEP> und <SEP> 20
<tb> getestet <SEP> nach <SEP> 120 <SEP> h
<tb>
Beispiel 7 : Cosynthese von Chlortetracyclin in einer Mischfermentation von S. aureofaciens S-2242 und S. aureofaciens S-2895.
Der Stamm S-2895 wurde aus einer mit Stickstofflost behandelten Suspension von S. aureofaciensSporen erhalten. Dieses Individium wurde von einer AP4-Agarschale, die mit durch Stickstofflost behandelten Sporen von S. aureofaciens beimpft worden war, als eine grosse flache, leuchtend orangebraune Kolonie ausgelesen. Die Kolonie wurde auf einen Q 4-Schrägagar übertragen. Nach Inkubation bei 27, 5 C
<Desc/Clms Page number 11>
während 2 Tagen zeigte sich eine charakterische gelbgrüne Fluoreszenz in diesem Agar und es wurde beo- beachtet, dass der fluoreszierende Stoff in den Agar eindiffundiert war. Bei der Fermentation mit den Spo- ren dieses Individiums ergab sich eine grünlich braune Maische, die eine prächtige Fluoreszenz bei nor- malern Tageslicht aufwies.
Die Maische zeigte keine antibiotische Aktivität. Eine Mischfermentation, wobei der Stamm S-2242 aus Beispiel 6 und S-2895 eine deutliche Cosynthese zeigten und wobei nach dem Verfahren wie in Beispiel 5 gearbeitet wurde, ergab die folgenden Testergebnisse.
EMI11.1
<tb>
<tb>
Chlortetracyclin <SEP> -Gehalt <SEP>
<tb> Mikroorganismen <SEP> (biologischer <SEP> Test)
<tb> Jlg <SEP> ! <SEP> ml <SEP>
<tb> S-2242,120 <SEP> halt <SEP> 33 <SEP>
<tb> S-2895, <SEP> 120 <SEP> halt <SEP> 3
<tb> S-2242 <SEP> + <SEP> S-2895, <SEP> gemischt <SEP> nach <SEP> 24 <SEP> h, <SEP> 424
<tb> getestet <SEP> nach <SEP> 120 <SEP> h
<tb>
EMI11.2
8s CosyntheseS-2895 und S. aureofaciens ATCC 12750.
Impfkulturen von S. aureofaciens S-2895, dessen Herkunft in Beispiel 7 beschrieben ist und von
S. aureofaciens ATCC 12750 wurden entsprechend Beispiel 1 angesetzt. Eine Anzahl von 250mlErlen- meyer-Kolben, die jeweils 25 ml Fermentationsmedium enthielten, wurden entsprechend Beispiel 2 her- gestellt. Drei dieser Fermentationskolben wurden mit aliquoten Teilen von jeweils 1,0 ml vom Stamm
S-2895 beimpft, drei weitere Kolben mit Impfkultur S. aureofaciens ATCC 12750. Sämtliche beimpften
Fermentationskolben wurden bei 259C auf einer rotierenden Schüttelmaschine, die mit 180 Umdr/min arbeitete während einer Zeitdauer von 24 h inkubiert. Eine 24-Stunden-Kultur von S-2895 wurde dann im Verhältnis 50 : 50 mit einer 24-Stunden-Kultur von S. aureofaciens ATCC 12750 gemischt.
Sowohl die übrigen Kolben, die Einzelstämme enthielten, als auch die Kolben, die die Mischungen mit beiden
Stämmen enthielten, wurden von neuem bei 25 C auf einer rotierenden Schüttelmaschine für weitere 96 h , inkubiert, so dass eine Gesamtinkubationszeit von 120 h in sämtlichen Fällen erfolgte.
Die Kolben mit den 120 h alten Maischen der Einzelstämme und die Kolben mit den 120 h alten Maischen von beiden Stämmen wurden untersucht, wobei sich folgende Ergebnisse zeigten :
EMI11.3
<tb>
<tb> Chlortetracyclin-Gehalt
<tb> Mikroorganismen <SEP> (biologischer <SEP> Test)
<tb> < ng/ml
<tb> S-2895,120 <SEP> halt <SEP> 3
<tb> ATCC <SEP> 12750, <SEP> 120 <SEP> h <SEP> 331
<tb> S-2895 <SEP> + <SEP> ATCC <SEP> 12750, <SEP> gemischt <SEP> nach <SEP> 24 <SEP> h, <SEP> 3860
<tb> getestet <SEP> nach <SEP> 120 <SEP> h
<tb>
Beispiel 9 : Cosynthese von Chlortetracyclin in einer Mischfermentation von S. aureofaciens S-2895 und S. aureofaciens E-475.
Das Material von einer reifen Maische von S. aureofaciens wurde auf AP6-Agar nach den Verfahren der Verdunnungsaufstrichmethode aufgestrichen und bei 27, inkubiert. Eine Kolonie die grösser und blasser in der Farbe erschien als die typischen Kulturen des Ausgangsstammes, wurde ausgelesen, isoliert und auf einem Schrägagar aufgestrichen. Nach Sporenbildung wurde dieses Individium E-475 zur Fermentation verwendet. Die entstehende Maische war dunkelrot-braun und enthielt kein Chlortetracyclin.
Wenn dieser Stamm jedoch in einer Mischfermentation mit S-2895 eingesetzt wurde, dessen Herkunft in Beispiel 7 aufgeführt ist, wurde Chlortetracyclin cosynthetisiert. Es ergab sich ein Anstieg der Antibiotikumaktivität gegenüber Staphylococcus aureus, der 830 pg Chlortetracyclin/ml der 120 h alten Maisehe entsprach.
<Desc/Clms Page number 12>
Beispiel 10 : Cosynthese von Chlortetracyclin in einer Mischfermentation von S. aureofaciens S-2895 und S. viridifaciens ATCC 11989.
Eine Mischfermentation von S-2895, dessen Herkunft in Beispiel 7 beschrieben ist und S. viridi- faciens ATCC 11989 wurde entsprechend Beispiel 8 durchgeführt. Weiterhin wurden Versuche mit einer Probe durchgeführt, die zusammengesetzt war aus einer Mischung 50 : 50 der 120 h alten Maischen der Einzelfermentationen der beiden Mikroorganismen.
Es ergaben sich folgende Ergebnisse :
EMI12.1
<tb>
<tb> Chlortetracyclin-Gehalt
<tb> Mikroorganismen <SEP> (fluorometrischer <SEP> Test)
<tb> g/ml
<tb> S-2895,120 <SEP> halt <SEP> 0
<tb> ATCC <SEP> 11989, <SEP> 120halt <SEP> IM <SEP>
<tb> S-2895 <SEP> + <SEP> ATCC <SEP> 11989, <SEP> gemischt <SEP> zozo
<tb> nach <SEP> 24 <SEP> h, <SEP> getestet <SEP> nach <SEP> 120 <SEP> h
<tb> S-2895 <SEP> + <SEP> ATCC <SEP> 11989, <SEP> gemischt <SEP> 80
<tb> und <SEP> getestet <SEP> nach <SEP> 120 <SEP> h
<tb>
Beispiel 11 : Cosynthese von Chlortetracyclin in einer Mischfermentation von S. aureofaciens S-2895 und S. aureofaciens ATCC 12552.
Nach dem Verfahren von Beispiel 8 wurde eineMischfermentationvon S-2895, dessen Herkunft in Beispiel 7 beschrieben ist und S. aureofaciens ATCC 12551 durchgeführt, wobei sich folgende Ergebnisse zeigten :
EMI12.2
<tb>
<tb> Chlortetracyclin-Gehalt
<tb> Mikroorganismen <SEP> (fluorometrischer <SEP> Test)
<tb> ssg/ml
<tb> S-2895, <SEP> 120 <SEP> halt <SEP> 0
<tb> ATCC <SEP> 12551,120 <SEP> h <SEP> alt <SEP> 60
<tb> S-2895 <SEP> + <SEP> ATCC <SEP> 12551, <SEP> gemischt <SEP> 375
<tb> nach <SEP> 24 <SEP> h, <SEP> getestet <SEP> nach <SEP> 120 <SEP> h
<tb>
Beispiel 12 : Cosynthese von Chlortetracyclin in einer Mischfermentation von S. aureofaciens S-2895 und S. aureofaciens ATCC 10762.
Die Stämme S-2895, dessen Herkunft in Beispiel 8 beschrieben ist, und S. aureofaciens ATCC 10762 wurden zu einer Mischfermentation entsprechend Verfahren nach Beispiel 10 eingesetzt. Man erhielt folgende Testergebnisse :
EMI12.3
<tb>
<tb> Chlortetracyclin-Gehalt
<tb> Mikroorganismen <SEP> (biologischer <SEP> Test)
<tb> ,ug/ml
<tb> S-2895, <SEP> 120 <SEP> halt <SEP> 2
<tb> ATCC <SEP> 10762,120 <SEP> h <SEP> alt <SEP> 24
<tb> S-2895 <SEP> + <SEP> ATCC <SEP> 10762, <SEP> gemischt <SEP> 181
<tb> nach <SEP> 24 <SEP> h, <SEP> getestet <SEP> nach <SEP> 120 <SEP> h
<tb> S-2895 <SEP> + <SEP> ATCC <SEP> 10762, <SEP> gemischt <SEP> 8
<tb> und <SEP> getestet <SEP> nach <SEP> 120 <SEP> h
<tb>
<Desc/Clms Page number 13>
Beispiel 13 : Cosynthese von Chlortetracyclin in einer Mischfermentation von S. aureofaciens
S-2895 und S. aureofaciens V-655.
Eine Sporensuspension S. aureofaciens ATCC 12748 wurde auf AP 6- Agar in der Weise aufgebracht, dass die einzelnen Kolonien unterschieden werden konnten. Verschiedene Kolonien, die als typisch für den Stamm betrachtet werden konnten, wurden isoliert. Eine dieser Kolonien zeigte auf einem Q4-Schräg- agar ein unterschiedliches Aussehen von dem Normaltyp. Sie wuchs sehr dunkel, nahezu schwarz. Ent- sprechend Beispiel 1 wurde eine Impfkultur hergestellt.
Bei der Fermentation in dem in Beispiel 2 be- schriebenen Medium ergab sich eine dunkelgrün gefärbte Maische, die kein Chlortetracyclin enthielt und auch keine andere antibiotische Aktivität autwies. Als jedoch dieses Individuum V-655 in einer Mischfermentation mit S-2895 entsprechend dem Verfahren nach Beispiel 8 angesetzt wurde, ergaben sich fol- gende Resultate :
EMI13.1
<tb>
<tb> Chlortetracyclin-Gehalt
<tb> Mikroorganismen <SEP> (biologischer <SEP> Test)
<tb> < ng/ml
<tb> S-2895, <SEP> 120 <SEP> halt <SEP> < <SEP> 2
<tb> V-655,120 <SEP> halt <SEP> < <SEP> 2
<tb> S-2895 <SEP> + <SEP> V-655, <SEP> gemischt <SEP> nach <SEP> 1160
<tb> 24 <SEP> h, <SEP> getestet <SEP> nach <SEP> 120 <SEP> h
<tb>
Beispiel 14 :
Cosynthese von Chlortetracyclin in einer Mischkultur von S. aureofaciens ATCC
13189 und S. aureofaciens ATCC 12749.
Eine Mischfermentation von S. aureofaciens ATCC 13189und S. aureofaciens ATCC 12749 wurde nach dem Verfahren von Beispiel 10 durchgeführt. Die nach 120 h geernteten Maischen wurden auf antibioti- sche Aktivität getestet, wobei sich folgende Resultate ergaben :
EMI13.2
<tb>
<tb> Chlortetracyclin-Gehalt
<tb> Stamm <SEP> Nr. <SEP> (biologischer <SEP> Test)
<tb> Pg/ml
<tb> ATCC <SEP> 13189, <SEP> 120halt <SEP> 3
<tb> ATCC <SEP> 12749, <SEP> 120 <SEP> h <SEP> alt <SEP> 279
<tb> ATCC <SEP> 13189 <SEP> + <SEP> ATCC <SEP> 12749, <SEP> gemischt <SEP> 4770
<tb> nach <SEP> 48 <SEP> h, <SEP> getestet <SEP> nach <SEP> 120 <SEP> h
<tb> ATCC <SEP> 13189 <SEP> + <SEP> ATCC <SEP> 12749, <SEP> gemischt <SEP> 121
<tb> und <SEP> getestet <SEP> nach <SEP> 120 <SEP> h
<tb>
Beispiel 15 :
Cosynthese von Chlortetracyclin in einer Mischfermentation von S. aureofaciens ATCC 12749 und S. aureofaciens ATCC 13190.
Eine Mischfermentation von S. aureofaciens ATCC 12749 und S. aureofaciens ATCC 13190 wurde ent- sprechend der Technik, wie sie in Beispiel 8 beschrieben ist, durchgeführt, mit den Ausnahmen, dass die
EMI13.3
<Desc/Clms Page number 14>
EMI14.1
<tb>
<tb> hChlortetracyclin-Gehalt
<tb> Mikroorganismen <SEP> (fluorometrischer <SEP> Test)
<tb> ,ug/ml
<tb> ATCC <SEP> 12749, <SEP> 120 <SEP> halt <SEP> 160 <SEP>
<tb> ATCC <SEP> 13190,120 <SEP> h <SEP> alt <SEP> 15
<tb> ATCC <SEP> 12749 <SEP> + <SEP> ATCC <SEP> 13190, <SEP> gemischt <SEP> 4200
<tb> nach <SEP> 24 <SEP> h, <SEP> getestet <SEP> nach <SEP> 120 <SEP> h
<tb>
Beispiel 16 : Auswirkung desMischenscosynthetischer Stämme von verschiedenem Alter.
Impfkulturen yon Streptomyces aureofaciens ATCC 12748 und S. aureofaciens ATCC 13190 wurden entsprechend Beispiel 1 angesetzt. Das Fermentationsmedium wurde entsprechend Beispiel 2 hergestellt.
Eine Anzahl von 250 ml Erlenmeyer-Kolben, die jeweils 25 ml dieses Fermentationsmediums enthielten, wurden sterilisiert und gekühlt. Die Hälfte dieser Kolben wurde mit aliquoten Teilen von jeweils 1, 0 ml
Impfkultur von S. aureofaciens ATCC 12748 und die übrigen mit aliquoten Teilen von 1, 0 ml S. aureo- faciens ATCC 13190 beimpft. Eine Mischung von 50 : 50, die'aus 12, 5 ml Fermentationsmedium mit 1 ? aureofaciens ATee 12748 und 12,5 ml Fermentationsmedium mitS. aureofaciensATCC 13190 bestand, wurde ebenfalls. hergestellt. Sämtliche Flaschen mitbeimpftem Fermentationsmedium wurden an- schliessend bei 25 C inkubiert auf einer rotierenden Schüttelmaschine, die mit 180 Umdr/min arbeitete.
In Zwischenräumen von 24,48, 72 und 96 h wurden weitere 50 : 50-Mischungen beider Stämme herge- stellt, indem 12,5 ml Fermentationsmaische von S. aureofaciens ATCC 12748, die zum Zeitpunkt 24, 48, 72 oder 96henmommen wurden, mit jeweils 12,5 ml von S. aureofaciens ATCC 13190, die im gleichen i Alterszustand entnommen wurden, vereinigt wurden. Die Gesamtinkubationszeit war in beiden Fällen, so- wohl bei den Kolben, die Einzelstämme als auch bei den Kolben, die 2-Stamm-Mischungen enthielten, unter den oben angeführten Bedingungen 120 h.
Bei den 2-Stamm-Mischungen war die Inkubationszeit von 120 h die Summe der Fermentationszeit der Einzelstämme vor der Mischung (24, 48, 72 und 96 h) und der Fermentationszeit mit beiden Stämmen nach der Mischung (96,72, 48 und 24 h), die nach 120 h geern- teven Maischen wurden darauf auf ihren Chlorietracjlin-Gehalt durch den fluorometrischen Test unter- sucht.
Die Testresultate waren folgende :
EMI14.2
<tb>
<tb> Chlortetracyclin-Gehalt
<tb> Mikroorganismen <SEP> fluorometrischer <SEP> Test <SEP> bei <SEP> einem <SEP> Alter
<tb> von <SEP> 120 <SEP> h <SEP> g/ml
<tb> ATCC <SEP> 12748 <SEP> 110
<tb> ATCC <SEP> 13190 <SEP> 10
<tb> . <SEP> ATCC <SEP> 12748 <SEP> + <SEP> ATCC <SEP> 13190 <SEP> gemischt <SEP> nach <SEP> 0 <SEP> h <SEP> 1390
<tb> 24 <SEP> h <SEP> 700
<tb> 48 <SEP> h <SEP> 1470
<tb> 72 <SEP> h <SEP> 1100
<tb> 96 <SEP> h <SEP> 280
<tb>
Beispiel 17 : Auswirkung des unterschiedlichen Prozentgehaltes von Mischungen cosynthetischer Stämme.
Impfkulturen von Streptomyces aureofaciens ATCC 12748 und S. aureofaciens ATCC 13190 wurden angesetzt, wie in Beispiel 1 beschrieben. Das Fermentationsmedium wurde hergestellt wie in Beispiel 2.
Eine Anzahl 250 ml Erlenmeyer-Kolben mit jeweils 25 ml Fermentationsmedium wurden sterilisiert und gekühlt. Die Hälfte dieser Flaschen wurde mit aliquoten Teilen von jeweils 1, 0 ml S. aureofaciens ATCC
EMI14.3
auf einer rotierenden Schüttelmaschine, die mit 180 Umdr/min lief, inkubiert. Nach Beendigung der Inkubationszeit von 48 h wurden verschiedene Mengen der Fermentationsmaische von S. aureofaciens
<Desc/Clms Page number 15>
ATCC 12748 und S. aureofaciens ATCC 13190 in der Weise vereinigt, dass sich ein Gesamtvolumen von jeweils 25 ml ergab, so dass die Mischungen der beiden Stämme verschiedene relative Verhältnisse der beiden Fermentationsmaischen enthielten.
Sämtliche Kolben, sowohl die mit Einzelstämmen als auch die mit 2-Stamm-Mischungen, wurden erneut bei 250C auf einer rotierenden Schüttelmaschine für wei- tere 72 h inkubiert, so dass die gesamte Inkubationszeit in allen Fällen 120 h betrug. Die nach 120 h ge- ernteten Maischen wurden anschliessend auf ihren Chlortetracyclin-Gehalt mittels fluorometrischem und biologischem Test (turbidimetrisch mit S. aureus) untersucht. Die Ultraviolettabsorptionsspektren der ver- schiedenen 2-Stamm-Mischfermentationsmaischen zeigten Gipfel bei 368 mg, was Chlortetracyclin ent- spricht.
Die Ergebnisse waren die folgenden :
EMI15.1
<tb>
<tb> Chlortetracyclin-Gehalt
<tb> fluorometrischer <SEP> Test <SEP> beim <SEP> Altern
<tb> von <SEP> 120 <SEP> h <SEP> blglml
<tb> S. <SEP> aureofaciens <SEP> ATCC <SEP> 12748 <SEP> allein <SEP> 110
<tb> S. <SEP> aureofaciens <SEP> A <SEP> TCC <SEP> 13190 <SEP> allein <SEP> 10
<tb> Kombination <SEP> : <SEP> (gewachsen <SEP> als <SEP> cosynthetisierendes <SEP> Paar)
<tb> S. <SEP> aureofaciens <SEP> ATCC <SEP> 12748 <SEP> S. <SEP> aureofaciensATCC <SEP> 13190
<tb> % <SEP> %
<tb> 100 <SEP> 0 <SEP> 110
<tb> 96 <SEP> 4 <SEP> 2450
<tb> 92 <SEP> 8 <SEP> 2280
<tb> 84 <SEP> 16 <SEP> 2960
<tb> 68 <SEP> 32 <SEP> 2180
<tb> 60 <SEP> 40 <SEP> 2140
<tb> 40 <SEP> 60 <SEP> 820
<tb> 32 <SEP> 68 <SEP> 330
<tb> 16 <SEP> 84 <SEP> 100
<tb> 8 <SEP> 92 <SEP> 100
<tb> 4 <SEP> 96 <SEP> 20
<tb> 0 <SEP> 100 <SEP> 10
<tb>
Beispiel 18 :
Cosynthese von Chlortetracyclin in einer Mischfermentation von S. aureofaciens ATCC 12749 und S. aureofaciens V-655.
Eine Mischfermentation wurde nach dem Verfahren von Beispiel 8 durchgeführt, wobei S. aureofaciens ATCC 12749 mit dem Individuum V-655, dessenHerkunft in Beispiel 13 beschrieben ist, kombiniert wurde. Es ergaben sich folgende Ergebnisse :
EMI15.2
<tb>
<tb> Chlortetracyclin-Gehalt
<tb> Mikroorganismen <SEP> (biologischer <SEP> Test)
<tb> g/ml
<tb> ATCC <SEP> 12749, <SEP> 120 <SEP> h <SEP> alt <SEP> 463
<tb> V-655, <SEP> 120 <SEP> h <SEP> alt <SEP> < <SEP> 2
<tb> ATCC <SEP> 12749 <SEP> + <SEP> V-655, <SEP> gemischt <SEP> nach <SEP> 1810
<tb> 24 <SEP> h, <SEP> getestet <SEP> nach <SEP> 120 <SEP> h
<tb>
Beispiel 19 : Cosynthese von Chlortetracyclin in einer Mischfermentation von S. aureofaciens V-655 und S. aureofaciens S-2242.
Die Herkunft von V-655 ist in Beispiel 13 beschrieben. S-2242 wurde nach dem Verfahren von Beispiel 6 erhalten. Die Mischfermentation mit diesen beiden Individuen wurde durchgeführt unter Anwendung der Technik, wie sie in Beispiel 8 beschrieben ist. Es ergaben sich folgende Resultate :
<Desc/Clms Page number 16>
EMI16.1
<tb>
<tb> Chlortetracyclin-Gehalt
<tb> Mikroorganismen <SEP> (biologischer <SEP> Test)
<tb> fg/ml
<tb> V-655,120 <SEP> halt <SEP> < 2 <SEP>
<tb> S-2242, <SEP> 120 <SEP> halt <SEP> < <SEP> 2
<tb> V-655 <SEP> + <SEP> S-2242, <SEP> gemischt <SEP> nach <SEP> 124
<tb> 24 <SEP> h, <SEP> getestet <SEP> nach <SEP> 120 <SEP> h
<tb>
Beispiel 20 : Cosynthese von Chlortetracyclin in einer Mischfermentation von S. aureofaciens
V-655 und S. aureofaciens ATCC 13192.
Entsprechend dem Verfahren von Beispiel 8 wurde die Cosynthese von Chlortetracyclin durch Mischfermentation durchgeführt von V-655, dessen Herkunft in Beispiel 13 beschrieben ist und S. aureofaciens
ATCC 13192. Die Ergebnisse sind folgende :
EMI16.2
<tb>
<tb> Chlortetracyclin-Gehalt
<tb> Mikroorganismen <SEP> (biologischer <SEP> Test).
<tb>
,ug/ml
<tb> V-655,120 <SEP> halt <SEP> < <SEP> 2
<tb> ATCC <SEP> 13192, <SEP> 120 <SEP> h <SEP> alt <SEP> < <SEP> 2 <SEP>
<tb> V-655 <SEP> + <SEP> ATCC <SEP> 13192, <SEP> gemischt <SEP> nach <SEP> 416
<tb> 24 <SEP> h, <SEP> getestet <SEP> nach <SEP> 120 <SEP> h
<tb>
Beispiel 21 : Cosynthese von Tetracyclin in einer Mischfermentation von S. aureofaciens ATCC 13192 und S. hygroscopicus (A-9538-1).
Eine Mischfermentation von S. aureofaciens A : : "C 13192 und S. hygroscopicus wurde entsprechend dem Verfahren nach Beispiel 10 durchgeführt. Es ergaben sich folgende Resultate :
EMI16.3
<tb>
<tb> Mikroorganismen <SEP> Test./lg/ml
<tb> ATCC <SEP> 13192, <SEP> 120halt <SEP> 0
<tb> S. <SEP> hygroscopicus <SEP> (A-9538-1) <SEP> 120 <SEP> h <SEP> alt <SEP> 640 <SEP> (Oxytetracyclin)
<tb> ATCC <SEP> 13192 <SEP> + <SEP> S. <SEP> hygroscopicus <SEP> gemischt <SEP> nach <SEP> 530 <SEP> (Oxytetracyclin)
<tb> 24 <SEP> h, <SEP> getestet <SEP> nach <SEP> 120 <SEP> h <SEP> + <SEP> 250 <SEP> (Tetracyclin)
<tb> ATCC <SEP> 13192 <SEP> + <SEP> S. <SEP> hygroscopicus <SEP> gemischt <SEP> und <SEP> 350 <SEP> (Oxytetracyclin)
<tb> getestet <SEP> nach <SEP> 120 <SEP> h
<tb>
Beispiel 22 :
Cosynthese von Chlortetracyclin in einer Mischfermentation von S. aureofaciens ATCC 12749 und S. aureofaciens V-15.
Dieses Individuum S. aureofaciens V-15 wurde von einer AP4-Agarschale als orangebraune Kolonie ausgelesen, wie sie typisch für ihren S. aureofaciens-Ausgangsstamm, der sich wieder von einem Chlortetracyclin erzeugenden, mit Mutierungen hervorrufenden Mitteln behandelten, Stamm ableitet, sind.
Dieses Individuum erzeugte eine rote Maische und ergab keine antibiotische Aktivität. Bei einer Mibchfer- mentation von V-15 mit S. aureofaciens ATCC 12749 entsprechend dem Verfahren nach Beispiel 8, ausgenommen, dass die Mischung nach 48 h, an Stelle von 24 h hergestellt wurde, ergaben sich folgende Resultate :
<Desc/Clms Page number 17>
EMI17.1
<tb>
<tb> Chlortetracyclin
<tb> Mikroorganismen <SEP> fluorometrischer <SEP> Test <SEP> biologischer <SEP> Test
<tb> ,g/ml <SEP> ug/ml <SEP>
<tb> ATCC <SEP> 12749,120 <SEP> h <SEP> alt <SEP> 170 <SEP> 182
<tb> V-15, <SEP> 120 <SEP> halt <SEP> 20 <SEP> < 2
<tb> ATCC <SEP> 12749 <SEP> + <SEP> V-15 <SEP> gemischt <SEP> nach <SEP> 2250 <SEP> 2738
<tb> 48 <SEP> h, <SEP> getestet <SEP> nach <SEP> 120 <SEP> h
<tb>
Beispiel 23 :
Cosynthese von 7-Chlor-6-desmethyltetracyclin in einer Mischfermentation von V-15 und S. aureofaciens. ATCC 13191.
Wie in Beispiel 22 ausgeführt, ergibt das Individuum V-15 eine rote Maische, die nur eine sehr geringe antibiotische Aktivität besitzt. Falls S. aureofaciens ATCC 13191 in dem Fermentationsmedium nach Beispiel 2 wächst, erzeugt er kein Tetracyclin-Antibiotikum und ergibt keine antibakterielle Aktivität (turbidimetrischer Test mit S. aureus). Bei einer Mischfermentation mit V-15 und S. aureofaciens ATCC 13191 (3 ml V-15,48 h alte Maische zugefügt zu 25 ml 48 h alter Maische von S. aureofaciens ATCC 13191, geerntetnach 120 h) enthielt die resultierende Maische etwa 200 mglml 7-Chlor-6-desmethyltetracyclin.
Beispiel 24 : Cosynthese von 6-Desmethyltetracyclin in einer Mischfermentation von S. aureofaciens ATCC 13191 und S. aureofaciens A-8291.
Eine Bodenprobe wurde mit sterilem destilliertem Wasser ausgelaugt. Dieses Auslaugewasser wurde anschliessend mit einem grossen Volumen sterilen destillierten Wassers verdünnt und aliquote Mengen dieser verdünnten Lösung auf AP 6-Nähragar gebracht. Die erhaltenen Kolonien zeigen einen charakteristischen kräftigen und erdigen Geruch. Eine Kolonie, die blass-grün-gelb und durchschimmernd war und einen farblosen Rand aufwies, wurde ausgelesen und erwies sich nach taxonomischer Untersuchung als S. aureofaciens. Die Kultur wurde in üblich¯; Weise entwickelt; die Fermentationsmaische zeigte eine dunkelgrün Farbe. Diese Kultur erhielt die Bezeichnung A-8291. Impfkulturen von S. aureofaciens ATCC 13191 undA-8291 wurden, wie in Beispiel 1 beschrieben, angesetzt.
Es wurde eine Anzahl Kolben, die das Fermentationsmedium nach Beispiel 2 enthielten, angesetzt. Die eine Hälfte dieser Flaschen wurde mit S. aureofaciens ATCC-13191 und die andere Hälfte A-8291 beimpft. Sämtliche Flaschen wurden 30 Tage lang bei 25 C inkubiert. Nach dieser Zeit wurden gleiche Volumina der beiden Einzelfermentationen vereinigt und 10 Teile/Million 2, 5-Dimercapto-l, 3, 4-thiadiazol (DMTD) zu der Mischung zugesetzt.
Die Fermentation wurde 120 h lang fortgesetzt. Gleichzeitig wurden 10 Teile/Million DMTD zu den Einzelfermentationen zugesetzt, welche ebenfalls 120 weitere Stunden fortgesetzt wurden. Nach der Ernte ergaben sich folgende Ergebnisse :
EMI17.2
<tb>
<tb> 6-Desmethyltetracyclin-Gehalt
<tb> Mikroorganismen <SEP> (biologischer <SEP> Test)
<tb> Pg/ml
<tb> ATCC <SEP> 13191, <SEP> 120 <SEP> h <SEP> alt <SEP> < <SEP> 5
<tb> A8291, <SEP> 120halt <SEP> < 5 <SEP>
<tb> ATCC <SEP> 13191 <SEP> + <SEP> A-8291, <SEP> gemischt <SEP> nach <SEP> 100
<tb> 30 <SEP> h, <SEP> getestet <SEP> nach <SEP> 120 <SEP> h
<tb>
Beispiel 25 : Cosynthese von Bromtetracyclin in einer Mischfermentation von S. aureofaciens A-8291 und S. aureofaciens ATCC 12751.
Ein Medium mit niedrigem Halogengehalt wurde hergestellt wie in Beispiel 3 und dazu 200 mg/l Kaliumbromid (chloridfrei) zugefügt. Einzelkolben mit diesem Medium wurden mit A-8291, dessen Herkunft in Beispiel 24 beschrieben ist, beimpft und mit S. aureofaciens ATCC 12751. Nach 24 h wurden gleiche Volumina gemischt und die Fermentation der einzelnen und der gemischten Proben für weitere 96 h fortgesetzt.
Es ergaben sich folgende Resultate :
<Desc/Clms Page number 18>
EMI18.1
<tb>
<tb> Bromtetracyclin- <SEP> Gehalt <SEP>
<tb> Mikroorganismen <SEP> (fluorometrischer <SEP> Test)
<tb> pg/ml
<tb> A-8291,120 <SEP> h <SEP> alt <SEP> < 25
<tb> ATCC <SEP> 12751, <SEP> 120 <SEP> halt <SEP> < <SEP> 5
<tb> A-8291 <SEP> + <SEP> ATCC <SEP> 12751, <SEP> gemischt <SEP> nach <SEP> 550
<tb> 24 <SEP> h, <SEP> getestet <SEP> nach <SEP> 120 <SEP> h
<tb>
Beispiel 26 : CosynthesevonOxytetracyclinineiner Mischfermentation von S. aureofaciens ATCC 13192 und S. rimosus ATCC 10970, Mutante 0-1066.
Eine Stammspolensuspension von S. rimosus ATCC 10970 wurde der Mutierung hervorrufenden Wirkung von Röntgenstrahlen ausgesetzt, worauf die behandelten Sporen zur Beimpfung einer AP 6-Nähragarschale verwendet wurden. Eine ungewöhnlich pigmentierte Kolonie wurde ausgelesen und erhielt die Bezeichnung 0-1066. Sie wurde verwendet zur Erzeugung von Stammsporen in üblicher Weise. Es zeigte sich, dass nachdem eine 24 h alte Schüttelflaschenkultur dieses Individuums mit einem entsprechenden Präparat, von ATCC 13192 gemischt wurde, die reife Maische, nachdem die erhaltene. Mischfermentation weitere 96 h fermentiert worden war. Cosynthese von Oxytetracyclin ergab.
Die Ergebnisse sind die folgenden :
EMI18.2
<tb>
<tb> Oxytetracyclin-Gehalt
<tb> Mikroorganismen <SEP> (biologischer <SEP> Test)
<tb> ,ug/ml
<tb> A <SEP> TCC <SEP> 13192, <SEP> 120 <SEP> halt <SEP> < 10 <SEP>
<tb> 0-1066,120 <SEP> halt <SEP> < <SEP> 2
<tb> ATCC <SEP> 13192 <SEP> + <SEP> 0-1066, <SEP> gemischt <SEP> nach <SEP> 187 <SEP> i <SEP>
<tb> 24 <SEP> h, <SEP> getestet <SEP> nach <SEP> 120 <SEP> h
<tb>
Beispiel 27 : Cosynthese von Tetracyclin in einer Mischfermentation von S. aureofaciens ATCC 13192 und S. aureofaciens E-1018.
Ein typisches Individuum von E-475 nach Beispiel 9 wurde Stickstofflost ausgesetzt. Mit der behandelten Sporensuspension wurden AP 6-Agarschalen beimpft. Nach der Beimpfung wurde eine dunkelglänzende Kolonie, Individuum E-1018, welches sich im Aussehen von den übrigen Kolonien der Schale unterschied, auf einen Q4-Sporenbildungsagar übertragen und dem Wachstum überlassen, bis sich Sporen gebildet hatten. Beider Fermentation in dem Medium nach Beispiel 2 ergab sich eine dunkelrotbraune Maische, welche kein Chlortetracyclin enthielt, welche sich von derjenigen von E-475 durch das Papierchromatogramm und durch ihre spektrophotometrischen Daten unterschied.
Eine Mischfermentation von ATCC 13192, deren Herkunft in Beispiel 5 beschrieben ist, und E-1018 wurde nach Beispiel 8 hergestellt und ergab Cosynthese von Tetracyclin. Es ergaben sich folgende Resultate :
EMI18.3
<tb>
<tb> Tetracyclin-Gehalt
<tb> Mikroorganismen <SEP> spektrophotometrischer <SEP> Test
<tb> g/ml
<tb> ATCC <SEP> 13192,120 <SEP> h <SEP> alt <SEP> 0
<tb> E-1018, <SEP> 120 <SEP> halt <SEP> 0
<tb> ATCC <SEP> 13192 <SEP> + <SEP> E-1018, <SEP> gemischt <SEP> nach <SEP> 425
<tb> 48 <SEP> h, <SEP> getestet <SEP> nach <SEP> 120 <SEP> h
<tb>
Beispiel 28 : Cosynthese von 7-Chlor-6-desmethyltetracyclin in einer Mischfermentation von S. aureofaciens E-1018 und S. aureofaciens V-15.
- Zu einem Verfahren der Mischfermentation nach Beispiel 8 wurde E-1018, dessen Herkunft in Bei-
<Desc/Clms Page number 19>
spiel 27 beschrieben ist, in Kombination mit S, aureofaciens V -15, dessen Herkunft in Beispiel 22 beschrieben ist, verwendet. Es ergaben sich folgende Resultate :
EMI19.1
<tb>
<tb> 7-Chlor-6-desmethyltetracyclin-Gehalt
<tb> Mikroorganismen <SEP> (spektrophotometrischer <SEP> Test)
<tb> g/ml
<tb> E-1018, <SEP> 120 <SEP> h <SEP> alt <SEP> < 10
<tb> V-15, <SEP> 120 <SEP> halt <SEP> < <SEP> 5 <SEP>
<tb> E-1018 <SEP> + <SEP> V-15, <SEP> gemischt <SEP> nach <SEP> 45
<tb> 24 <SEP> h <SEP> getestet <SEP> nach <SEP> 120 <SEP> h
<tb>
Beispiel29 :CosynthesevonChlottetracylinineinerMischfermentationvonS.aureofaciensV-15 und S. aureofaciens ATCC 12751.
Das Individuum V-15 wurde entsprechend Beispiel 22 erhalten. Eine Mischfermentation dieses Indi-
EMI19.2
EMI19.3
aureofaciens ATCCBeispiel 30 : Cosynthese von Chlortetracyclin in einer MischfermentationvonS. aureofaciens ATCC 12751 und S. albus.
Eine Mischfermentation, die entsprechend Beispiel 8 hergestellt wurde und wobei S. aureofaciens ATCC 12751 und Streptomyces albus verwendet wurden, zeigte die folgenden Ergebnisse :
EMI19.4
<tb>
<tb> Chlortetracyclin-Gehalt
<tb> Mikroorganismen <SEP> (biologischer <SEP> Test)
<tb> Mg/mi
<tb> ATCC <SEP> 12751, <SEP> 120 <SEP> halt <SEP> 279
<tb> S. <SEP> albus, <SEP> 120 <SEP> halt <SEP> 0
<tb> ATCC <SEP> 12751 <SEP> + <SEP> S. <SEP> albus, <SEP> gemischt <SEP> nach <SEP> 1390
<tb> 24 <SEP> h <SEP> getestet <SEP> nach <SEP> 120 <SEP> h
<tb>
Beispiel 31 : Cosynthese von Chlortetracyclin in einer Mischfermentation von S. aureofaciens ATCC 12751 und S. platensis NRRL 2364.
Unter Verwendung der Verfahren nach Beispiel 10 wurde eine Mischfermentation von S. aureofaciens ATCC 12751 mit S. platensis NRRL 2364 angesetzt, wobei sich folgende Resultate ergaben :
<Desc/Clms Page number 20>
EMI20.1
<tb>
<tb> Chlortetracyclin-Gehalt
<tb> Mikroorganismen <SEP> (biologischer <SEP> Test)
<tb> Pg/ml
<tb> ATCC <SEP> 12751,120 <SEP> h <SEP> alt <SEP> 279
<tb> NRRL <SEP> 2364,120 <SEP> h <SEP> alt <SEP> < <SEP> 2
<tb> ATCC <SEP> 12751 <SEP> + <SEP> NRRL <SEP> 2364, <SEP> gemischt <SEP> nach <SEP> 234
<tb> 24 <SEP> h, <SEP> getestet <SEP> nach <SEP> 120 <SEP> h
<tb> ATCC <SEP> 12751 <SEP> + <SEP> NRRL <SEP> 2364, <SEP> gemischt <SEP> und <SEP> 141
<tb> getestet <SEP> nach <SEP> 120 <SEP> h
<tb>
Beispiel 32 : Cosynthese von Chlortetracyclin in einer Mischfermentation von S. aureofaciens 0-1830 und S. aureofaciens ATCC 13192.
Eine Stammsporensuspension von S. aureofaciensNRRL 2209 wurde zur Erzeugung von Mutierungen ultravioletter Strahlung ausgesetzt und danach zur schwachen Beimpfung einer AP6-Nähragarschale verwendet. Nach der Inkubation entwickelte sich eine grosse Vielzahl verschiedener Kolonientypen, insgesamt 109 Kolonien. Jede dieser Kolonien wurde auf einen Agarschnitt übertragen, um Sporen zu erzeugen, welche wiederum zur Beimpfung von Fermentationsmedien in Schüttelkolben verwendet wurden. Nach einer Inkubationszeit von 24 h wurden die Maischen, deren jede einer Originalkolonie entsprach, einzeln gemischt, mit gleichen Teilen einer 24 h alten Maische von S. aureofaciens ATCC 13192.
Nach einer weiteren Inkubationszeit von 96 h wurde jede Mischfermentation mit den 120 h alten Reinkulturfermentationen der einzelnen Bestandteile verglichen. 87 der Individuen von den ursprünglich 109 Kolonien waren noch mässig gute Erzeuger von Chlortetracyclin in Reinkultur und wurden verworfen. Von den verbleiben- 22 Individuen zeigten 20, die dunkleren, helleren, grösseren, kleineren und verschieden gefärbten Originalkolonien entsprachen, keine Cosynthese mit S. aureofaciens ATCC 13192.
Eines der beiden verbleibenden Individuen, das die Bezeichnung 0-1830 erhielt, zeigte die folgenden Testwerte :
EMI20.2
<tb>
<tb> Chlortetracyclin-Gehalt
<tb> Mikroorganismen <SEP> (fluorometrischer <SEP> Test)
<tb> ilglmi
<tb> ATCC <SEP> 13192, <SEP> 120 <SEP> halt <SEP> < <SEP> 2
<tb> 0-1830,120 <SEP> halt <SEP> < <SEP> 2
<tb> ATCC <SEP> 12193 <SEP> + <SEP> 0-1830, <SEP> gemischt <SEP> nach
<tb> 24 <SEP> h, <SEP> getestet <SEP> nach <SEP> 120 <SEP> h-1050
<tb>
Beispiel 33 : Cosynthese von Oxytetracyclin in einer Mischfermentation von S. aureofaciens ATCC 13192 und S. rimosus AB-115.
Ein Streptomyces-Stamm, der die Bezeichnung AB-115 erhielt, wurde von einer Bodenprobe isoliert, durch eine Behandlung, wie sie in Beispiel 24 beschrieben ist, und als ein Stamm von S. rimosus identifiziert. Eine Mischfermentation von ATCC 13192 und S. rimosus AB-115 wurde nach dem Verfahren von Beispiel 6 durchgeführt und ergab eine synergistische Cosynthese von Oxytetracyclin.
Die Ergebnisse waren die folgenden :
EMI20.3
<tb>
<tb> Oxytetracyclin
<tb> Mikroorganismen <SEP> g/ml
<tb> ATCC <SEP> 13192,120 <SEP> h <SEP> alt <SEP> < <SEP> 9 <SEP>
<tb> S. <SEP> rimosus <SEP> AB-115,120 <SEP> h <SEP> alt <SEP> 2250
<tb> ATCC <SEP> 13192 <SEP> + <SEP> S. <SEP> rimosus <SEP> AB-115 <SEP> gemischt <SEP> 3080
<tb> nach <SEP> 24 <SEP> h, <SEP> getestet <SEP> nach <SEP> 120 <SEP> h
<tb> ATCC <SEP> 13192 <SEP> + <SEP> S. <SEP> rimosus <SEP> AB-115 <SEP> gemischt <SEP> 1180
<tb> und <SEP> getestet <SEP> nach <SEP> 120 <SEP> h
<tb>
<Desc/Clms Page number 21>
Beispiel 34 : Cosynthese von Oxytetracyclin in einer Mischfermentation von S. rimosus und S. aureofaciens E-475.
Eine Mischfermentation von S. rimosus AB-115 und S. aureofaciens E-475 wurde entsprechend Beispiel 6 durchgeführt. Die Ergebnisse der Analyse sind folgende :
EMI21.1
<tb>
<tb> Mikroorganismen <SEP> Test <SEP> btglml
<tb> AB-115 <SEP> 1800 <SEP> (Oxytetracyclin)
<tb> E-475 <SEP> 1780 <SEP> (7-Chlor-6-desmethyltetracyclin)
<tb> AB-115 <SEP> + <SEP> E-475 <SEP> gemischt <SEP> nach <SEP> 3200 <SEP> (Oxytetracyclin)
<tb> 24 <SEP> h, <SEP> getestet <SEP> nach <SEP> 120 <SEP> h <SEP> 100 <SEP> (7-Chlor-6-desmethyltetracyclin)
<tb> AB-115 <SEP> + <SEP> E-475 <SEP> gemischt <SEP> und <SEP> 900 <SEP> (Oxytetracyclin)
<tb> getestet <SEP> nach <SEP> 120 <SEP> h <SEP> 850 <SEP> (7-Chlor-6-desmethyltetracyclin)
<tb>
PATENTANSPRÜCHE :
1.
Verfahren zur Biosynthese von Antibiotika der Tetracyclinreihe wie Tetracyclin, Chlortetracyclin, Bromtetracyclin, Oxytetracyclin, 6-Desmethyltetracyclin und 7-Chlor-6-desmethyltetracyclin mit Hilfe eines normalerweise zur Erzeugung des gewünschten Tetracyclin-Antibiotikums befähigten Stammes von Streptomyces aureofaciens unter submersen, aeroben Bedingungen, dadurch gekennzeichnet, dass die Fermentation unter synergistischer Steigerung der Bildung des gewünschten Tetracyclin-Antibiotikums in Gegenwart mindestens eines weiteren Stammes der Arten. Streptomyces aureofaciens, Str. rimosus, Str. hygroscopicus, Str. platensis oder Str. albus durchgeführt wird.