DE916573C

DE916573C - Verfahren zur Herstellung von Streptomycin

Info

Publication number: DE916573C
Application number: DEM10375A
Authority: DE
Inventors: Eugene Lambert Dulaney
Original assignee: Merck and Co Inc
Current assignee: Merck and Co Inc
Priority date: 1950-07-25
Filing date: 1951-07-25
Publication date: 1954-08-12

Description

Verfahren zur Herstellung von Streptomycin Die Patentinhaberin hat bereits früher ein Verfahren entwickelt, das die Herstellung von Streptomycin mit Ausbeuten von etwa 8oo bis iioo,ug/ccm rrit Hilfe einer neuen Kultur gestattet, welche die Bezeichnung S.griseus DulaneyL-118 führt. Diese Kultur wurde dadurch erhalten, daß Sporen eines Stammes von S. griseus, welche gegen Anfangsstreptomycinkonzentrationen von mindestens goo,ug/ccm widerstandsfähig waren, mit ultraviolettem Licht bestrahlt wurden, um eine Mutation hervorzurufen. Die Sporen, die diese Behandlung überlebten, bildeten unter günstigen Wachstumsbedingungen Kolonien von S. griseus, von denen diejenigen, die in erhöhtem Maße Streptomycin produzierten, ausgewählt wurden und wiederum mit ultraviolettem Licht bestrahlt wurden. Die weiteren Operationen, nämlich Bildung einer Kolonie, Ausleseverfahren und Bestrahlung, wurden so oft wiederholt, bis sich ein mutierter Stamm von S. griseus gebildet hatte, der die Fähigkeit besaß, konstant Streptomycin mit Ausbeuten von mindestens 8oo yg/ccm zu liefern.
Es wurde nun gefunden, daß noch erheblich höhere Streptomycinausbeuten, nämlich solche von etwa i8oo bis 22oo ,ug/ccm erzielt werden können, indem man eine neue, bestimmte Kultur verwendet, die durch mutierende Einwirkung von ultraviolettem Licht und von weichen X-Strahlen auf einen Vaterstamm von S. griseus gewonnen wurde und nachfolgend als S. griseus albus mutant (Dulaney Z-38) bezeichnet ist. Diese neue Kultur kann vorteilhaft dadurch erhalten werden, daß man Sporen von S. griseus Dulaney L-118 der mutierenden Wirkung von ultraviolettem Licht und weichen X-Strahlen unterwirft. Ein zur Gewinnung der neuen Kultur führendes Verfahren sei nachstehend beschrieben Eine Oberflächenkultur von S. griseus wird mit sterilem destilliertem Wasser behandelt. Die hierbei gebildete wäßrige Suspension der Sporen wird durch mehrere Schichten steriler absorbierender Baumwolle filtriert. Die filtrierte Sporensuspension wird dann der ultravioletten Bestrahlung mit einer Wellenlänge von 2,537 A während einer Zeit unterworfen, in der etwa 99 % der Sporen abgetötet werden (etwa 2 Minuten). Die so behandelte Suspension wurde dann mit destilliertem Wasser verdünnt und eine gewisse Menge der verdünnten Suspension über eine mit Nähragar beschickte Petrischale gesprüht. Der N ähragar kann z. B. aus einem wäßrigen Medium bestehen, das 2,5 °/o Glukose, 0,4 % Sojabohnenmehl, o,25 °!o Natriumchlorid, o,5 °/a lösliche, bei der Herstellung von Trinkalkohol durch Hefefermentation von Getreidekörnern anfallende Schlempe enthält und mit Agar verfestigt worden ist. Nach Inkubation bis zum guten Wachstum und guter Sprossung wurden die Kolonien auf geneigt verlaufende Flächen aus dem gleichen Medium gebracht. Nachdem auch hier gutes Wachstum und gute Sprossung in Erscheinung traten, wurde den einzelnen Agarflächen sterilisiertes Wasser zugefügt und separate Sporensuspensionen aus jeder Agarfläche gewonnen. Bestimmte Mengen von jeder Sporensuspension wurden in Flaschen übergeführt, die ein Medium, bestehend aus 1 °/o Glukose, 1 °/o enzymatisch verdautem Casein, 1 °/o Natriumchlorid, o,6 °/o Fleischextrakt, Rest destilliertes Wasser, enthielten. Die Flaschen wurden unter dauernder Bewegung etwa 48 Stunden fermentiert und das sich hierbei entwickelnde vegetative Wachstum zur Beimpfung von Flaschen verwendet, welche ein wäßriges Medium von folgender Zusammensetzung enthielten : 2 °/o Glukose, 4. °,lo Sojabohnenmehl, 0,25 °/o Natriumchlorid und 5 °/o Schlempe, die bei der Herstellung von Trinkalkohol durch Hefefermentation von Getreidekörnern angefallen war.
Das oben erläuterte Verfahren der Mutation und Abtrennung wurde mit zusätzlichen Sporensuspensionen von S. griseus Dulaney L-118 wiederholt, bis eine Kultur erhalten wurde, die erhöhte Streptomycinausbeuten lieferte.
Eine Sporensuspension von dieser überlegenen Kultur in destilliertem Wasser, die mit o-3 bezeichnet wurde, wurde der Einwirkung weicher X-Strahlen ausgesetzt, bis etwa 9g °/o der Sporen abgetötet waren. Die so erhaltene Suspension wurde mit destilliertem Wasser verdünnt und zwecks Sporenentwicklung auf Nähragar gebracht. Die resultierenden Sporen wurden zur Beimpfung von mit Nährmedium beschickten Flaschen verwendet und diese in der vorstehend beschriebenen Weise einer fermentierenden Behandlung unterworfen.
Die aus o-3 erhaltene, höhere Ausbeuten liefernde Kultur wurde mit R-315 bezeichnet. Sporen dieser Kultur wurden in gleicher Weise mit X-Strahlen behandelt und aus den so behandelten Kulturen eine Kultur T-535 abgetrennt, die als Vaterstamm für weitere Mutationen verwendet wurde.

Sporen von T-535 wurden mit ultravioletten Strahlen behandelt und aus den resultierenden Kulturen ein veredelter Stamm V-148 gewonnen. Eine der Abtrennungen von Kultur V-148, z. B. ein Stamm X-69, lieferte überlegene Streptomycinausbeuten. Dieser Stamm wurde wiederum mit ultraviolettem Licht bestrahlt, wobei er eine überlegene Kultur Z-38 lieferte, die nachfolgend als S. griseus albus mutant (Dulaney Z-38) bezeichnet werden soll. Das folgende Diagramm veranschaulicht die Genealogie des Stammes Z-38:

L-218 Ultraviolettes o-3 X-Strahlen R-315 X-Strahlen T-535

Licht

Ultraviolettes

Licht

V-148 Natürliches X-69 Ultraviolettes Z-38

Isolat Licht

Gewisse morphologische Eigenschaften und Reaktionen, wie sie in Bergeys Manual of Determinative Bacteriology angegeben sind und für S. griseus Dulaney L-118 und S. griseus albus mutant (Dulaney Z-38) festgestellt worden sind, sind aus folgender Zusammenstellung ersichtlich

Merkmale von S. griseus

Bergeys Manual of determinative S. griseus S. griseus

Bacteriology 1,-118 Z-38

Fäden . .. .. :.. ... . ... Verästelung, wenige Spiralen gerade, Verästelungen, gerade, Verästelungen,

keine Spiralen gelegentliche Spiralen

Conidia . . . . . . . . . .. . . . stabförmig bis kurz, zylin- übereinstimmend übereinstimmend

Gelatineprobe, Gelatine- drisch, o,8 :x: o,8 bis 1,7,u

stab ....... . ...... grünlichgelbes oder cremefar- in 16 Tagen 5o % des in 16 Tagen 25 °;'o des

benes Oberflächenwachstum, Mediums verflüssigt Mediums verflüssigt

bräunliche Färbung, schnell (Farbe nicht auf- (Farbe nicht auf-

verflüssigt gezeichnet) gezeichnet)

Bergeys Manua of determinative S. griseus S. griseus

Bacteriology

L-118

Z-38

Synthetisches Agar ... dünn, farblos, ausgebreitet, farbloses Wachstum, farbloses Wachstum,

olivgrün, luftiges (blasiges) kein blasiges Mycell kein blasiges Mycell

Mycell, dick, Puder, wasser-

grün

Stärke-Agar ......... dünn, ausgebreitet, trans- dünn, ausgebreitet, dünn, ausgebreitet,

parent nicht transparent, nicht transparent,

rahmartiges Wachs- rahmartiges Wachs-

tum (crean growth), tum, Stärke hydroly-

Stärke hydrolysiert siert

Dextrose-Agar ... . ... Erhöhung in der Mitte, strah- schwaches Wachstum, schwaches Wachstum,

lig (ausstrahlend) creme- ausgebreitet, farblos ausgebreitet, farblos

farben bis orange, auf-

stehender Rand

AgarFläche (P1ainAgar) abundant, cremefarben, fast farblos, transparentes farblos, transparentes

transparent Wachstum Wachstum

Dextrose-Flüssigkeit . . abundant, gelbliches Häut- Häutchen (Farbe und Häutchen (Farbe und

chen mit grünlicher Farbe, Typus nicht be- Typus nicht beobach-

stark gefaltet obachtet) tet)

Lackmusmilch ....... cremefarbener Ring, koagu- peptonisiert, PH-Wert, peptonisiert, PH-Wert,

liert mit rascher Peptonisie- Farbe und Art des Farbe und Art des

rung, alkalisch werdend Oberflächenwachs- Oberflächenwachs-

tums nicht beobachtet tums nicht beobachtet

Kartoffel ............ gelblich, runzelig schweres Wachstum, schweres Wachstum,

grau, faltig, Kartoffel- gelbbraune Farbe,

färbung (Dunkelung) faltig, Kartoffelver-

färbung (Dunkelung)

Reduktion, Nitrite ... Nitrite, entstanden aus Nitra- Nitrate erzeugt Nitrate erzeugt

ten

Pigment . . ... . . .. . ... nicht löslich nicht löslich nicht löslich

Sauerstoff tension ...... aerobisch, aerobisch aerobisch

Zusätzliche typische bei Bergey nicht aufgeführte Teste ergaben die folgenden Ergebnisse

Test 1 S. griseus L-ii8 S. griseus Z-38

Cellulosezersetzung .............. keine Zersetzung keine Zersetzung

Agar mit apfelsaurem Calcium .... schwaches Wachstum schwaches Wachstum

Tyrosin-Agar.................... kein bemerkbares Wachstum kein bemerkbares Wachstum

Phosphat-Agar . . . . . . . . . . . . . . . . . . sporentragende Fäden in Büscheln vegetatives Mycell

(sporebearing hyphae in clusters)

Sojabohnen-Agar (4,0°;o Soja-

bohnenmehl, 2,5"/, Glukose,

0,250/, Natriumchlorid, 0,50/,

Schlempe, verfestigt mit Agar). . reichliche Sporensprossung, grau bis reichliche Sporensprossung, weiße

graugrüne Sporen Sporen

z °1o Hefeextrakt, o,5 0;%o Glukose-

Agar......................... reichliche Sporensprossung keine Sporensprossung

Sporenimpfstoff' auf Difco-Hefe,

Fleisch-Agar (Nr. B 24q.)2 ...... leichte Sprossung4 praktisch keine Sprossung4

Vegetativer Impfstoff' auf Difco-

Hefe, Fleisch-Agar (B244) ..... etwa 8o °/ö der Kolonien zeigen weniger als i °/o der Kolonien zei-

Sprossung5 gen Sprossung5

i. Sporen aus einer Fermentierungsflasche,wie früher beschrieben, in destilliertem Wasser suspendiert (hierbei wurden Flaschen mit rechteckigem Querschnitt verwendet, die nach Beschickung mit dem Nährmedium auf eine ihrer größeren Seiten gelegt und beimpft werden, während eine relativ große Oberfläche des Nährmediums erhalten wird, auf der ausgedehntes Sporenwachstum stattfinden kann).

2. Der Hefe-Fleisch-Extrakt-Agar Nr. 244 hatte folgende Zusammensetzung:

Bestandteil Gramm pro ioo ccm

des wäßrigen Mediums

Fleischextrakt .......... O,15

Hefeextrakt . . . . . . . . . . . . 0,3

Pepton................. o,6

Dextrose............... o,1

Agar................... 1,5

Zu dieser Mischung wurden auf je ioo ccm je i g Agar zugefügt, um ein verfestigtes Medium von festerer Beschaffenheit zu erhalten.

3. Das negative Impfmaterial wurde derart präpariert, daß 40 ccm des nachstehend beschriebenen flüssigen :Mediums in einen 25o ccm Inhalt besitzenden, mit Wasser verschlossenen Erlenmeyer-Kolben gegeben und bei 27° 2o Stunden auf einer Rotationsschüttelapparatur fermentiert wurden.
Das hierzu verwendete wäßrige Medium enthielt in je ioo ccm enzymatisch hydrolysiertes Casein, i,o g Dextrose und 0,3 g Fleischextrakt.
4. Zwecks Beimpfung mit Sporen wurden Sporen aus einer Kultur gemäß i in sterilem Wasser mit genügender Verdünnung suspendiert, so daß bei Erzeugung schleifenförmiger Streifen auf dem Testmedium und Fermentierung bei 27° während 6 Tagen sich separate Kolonien entwickelten und individuell auf Sprossungsfähigkeit geprüft werden konnten.
5. Eine Schleife des vegetativen Impfmaterials, das, wie vorstehend unter 3 beschrieben, präpariert worden ist, wurde auf das Testmedium gebracht; die Verdünnung war derart, daß nach Fermentierung der Testplatte während 6 Tagen bei 27° sich separate Kolonien entwickelten und individuell auf Sprossung geprüft werden konnten.

Beispiel i Sporen von Nähragarflächen der vorstehend erwähnten S. griseus Stämme L-ii8, X-69 und Z-38 wurden zur Beimpfung einzelner Flaschen verwendet, welche das folgende Nährmedium enthielten: 1 °/o Glukose, 10/, enzymatisch verdautes Casein, 10/, Natriumchlorid, o,6 °/o Fleischextrakt, aufgefüllt mit destilliertem Wasser. Die das Nährmedium enthaltenden Flaschen wurden auf einem Rotationsschüttelapparat bei 28° fermentiert, bis gutes Wachstum in Erscheinung trat. Nach 48stündiger Inkubation wurde das vegetative Wachstum zur Beimpfung eines 25o-ccm-Erlenmeyer-Kolbens verwendet, der 40 ccm des folgenden Mediums enthält: Glukose........................ 2,5 °/a Sojabohnenmehl ................ 4,0 °/o Natriumchlorid ................. o,25 lösliche, bei der Herstellung von Trinkalkohol anfallende Schlempe, aufgefüllt mit Wasser .. .. ..... . . o,5 °/o pH-Wert vor Destillation ... .... . 7,38 Die das Nährmedium enthaltenden Flaschen wurden auf einem Rotationsschüttler bei 28° und 22o Umläufen pro Minute fermentiert, bis eine maximale Streptomycinbildung stattgefunden hatte. Die Ergebnisse vergleichender Versuche sind aus der folgenden Zusammenstellung ersichtlich

Potenz der Kulturflüssigkeit

Stamm--Nr. je Kubikzentimeter

nach 4 Tagen 1 nach 5 Tagen

L-118...... 670*) 635*)

X-69.-...... 86o 148o

Z-38....... 1205 2000

*) Die Streptomycin-Ausbeute des Stammes L-ii8 ist

niedrig infolge der Tatsache, daß die Fermentierungstempe-

ratur höher war als der optimale Wert für Stamm L-ii1..

Beispiel 2 Ein 5 1 fassender Fermentator wurde mit 3,2 1 eines Nährmediums beschickt, das 4°/o Sojabohnenmehl, 0,250/, Natriumchlorid, 0,5"/" lösliche, bei der Herstellung von Trinkalkohol anfallende Schlempe, 2,5)/, Dextrose enthält und mit destilliertem Wasser aufgefüllt war. Etwa o,5 Teile Kobalt pro Million -wurden in Form von Kobaltnitrat dem Nährmedium zugefügt und das Medium nach Sterilisation mit 5 °/o einer vegetativen Kultur von S. griseus albus mutant (Z-18) beimpft.

Ein anderer 51 fassender Fermentator wurde mit 3,21 eines Nähmediums beschickt, das 3 °/o Sojabohnenmehl, 2 °/o Dextrose, 0,75 °,'o lösliche, bei der Herstellung von Trinkalkohol anfallende Schlempe, 0,25 0, 1, Natriumchlorid enthielt, mit destilliertem Wasser aufgefüllt war und o,5 Teile Kobalt pro Million in Form von Kobaltnitrat enthielt. Nach Destillation wurde das Medium mit 5 °/o einer vegetativen Kultur von S. griseus Dulaney L-118 beimpft. Die beiden beimpften :Medien wurden bei 27° unter mechanischem Umrühren und Belüftung fermentiert, bis eine maximale Streptomycinbildung in jedem Fermentator erreicht war. Am Ende der Fermentation wurden die folgenden Ausbeuten von Streptomycin und Vitamin Bit festgestellt:

Streptomycin Vitamin Bla

Impf- basiert 3785 1

material Maximum Maximalzeit Volumen

,ug/ccm in Stunden in Milligramm

... 1140 113**) 950

Z-38.... 1830*) 118**) o

*) Die Streptomycinausbeute bei Stamm Z-38 würde etwas

höher gewesen sein, wenn die Optimaltemperatur von 28,5°

bei diesem Versuch verwendet worden wäre.

**) Bei Anwendung von Fermentatoren mit 56 775 1 Inhalt

würde die Zeit für die Erzielung maximaler Streptomycin-

produktion So Stunden für L-ii8 und iio Stunden für Z-38

betragen haben.

Beispiel 3 Sporen von S. griseus albus mutant (Dulaney Z-38) wurden in einem sterilen Medium, das i °/o Dextrose, i °/a enzymatisch verdautes Casein, o,6 °/o Fleischextrakt enthielt und mit Wasser aufgefüllt war, unter Belüftung und Umrühren bei 27° 26 bis 48 Stunden bis zur Erzielung eines guten Wachstums fermentiert. Portionen von je i ccm der erhaltenen Kulturflüssigkeit wurden zur Beimpfung einer Anzahl von Flaschen verwendet, die das oben beschriebene Nährmedium enthielten, und diese Kulturen wurden bei 27° unter Belüftung und Rühren während 2o bis 24 Stunden fermentiert, bis etwa 5 bis 7 mg/ccm von vegetativem Wachstum (Trockengewicht) entstanden waren und 3 bis 4 mg/ccm Zucker zurückblieben. Die Flascheninhalte wurden dann zusammengegossen, um ein Impfmaterial für die Herstellung von Streptomycin zu erhalten.

Eine Anzahl von Fermentatoren von je 51 Inhalt wurden mit Portionen von je 3200 ccm eines sterilen Mediums beschickt, das 3,5 °/o Sojabohnenmehl, 2,75 % Dextrose, 0,5 °/o lösliche, bei der Herstellung von Trinkalkohol anfallende Schlempe in Trockenform, 0,25 °/o Natriumchlorid, 0,4 ccm Sojabohnenöl pro ioo ccm enthielt und mit destilliertem Wasser aufgefüllt war. Dies ist das bevorzugte Medium für Z-38. Jeder der Fermentatoren wurde mit i50 ccm des präparierten Impfmaterials beimpft und bei einer Temperatur von 28,5° während 112 bis 118 Stunden mit mechanischer Durchmischung unter Belüftung unter verschiedenen Bedingungen fermentiert. Die unter den verschiedenen Bedingungen des Umrührens und der Belüftung erhaltenen Streptomycinausbeuten sind aus der folgenden Tabelle ersichtlich; die angegebenen Streptomycinausbeuten sind Durchschnittswerte, die in je drei oder auch mehr getrennten Fermentatoren erhalten wurden.

Wirkung der Kraft

bei der Streptomycin-Erzeugung Z-38

Aufgenommene

Gesamtkraft Annähernde utreptomycin-

Pferdekraft Luftgeschwin- ausbeute aus der

je 3g85 1 von digkeit fermentierten

belüftetem 0,3048 m/Std. Flüssigkeit

Kulturmedium mg/ccm

0,0024 72 9385

0,0049 36 1656

0,0072 36 1726

o,oogi 36 igi9

o,oo96 36 2051

0,0230 36 2077

Zum Vergleich'wurde ein gleicher Versuch in den nämlichen 51 enthaltenden Fermentatoren durchgeführt. Hierbei wurde ein vegetativer Impfstoff von Kultur L-118 und das folgende steril zubereitete Nährmedium verwendet: Sojabohnenmehl 3,0°/0, Dextrose 2,0 °/o, lösliche, bei der Herstellung von Trinkalkohol anfallende Schlempe in Trockenform o,75 °/o, Natriumchlorid 0,25 %. Die Fermentation wurde bei 27° durchgeführt.

Aufgenommene

Gesamtkraft Annähernde Streptomycin-

Pferdekraft Luftgeschwin- ausbeute aus der

je 3,785 1 digkeit fermentierten

von belüftetem 0,3048 m/Sek. Flüssigkeit

Kulturmedium mg/ccm

0,0012 36 350

0,00=5 36 78o

0,0024 36 iooo

0,0920 36 980

Aus den Tabellen geht hervor, daß bei der Kultur L-118 bei Anwendung von 0,0024 Pferdekraft pro 37851 Fermentierungsmedium ein Maximalwert von iooo,ug/ccm Streptomycin erhalten wird, der auch bei weiterem Anwachsen der Pferdekraft nicht überschritten werden kann.

Bei der Kultur Z-38 hat dagegen eine Steigerung der angewendeten Pferdekraft pro 3,785 1 Fermentierungsflüssigkeit auf den Wert o,oog eine erhöhte Streptomycinausbeute nämlich von 2ooo,ug/ccm zur Folge. Beispiel 4 Die Herstellung des Impfmediums von S. griseus albus mutant (Dulaney Z-38) und die Anwendung dieses Mediums zum Impfen von Portionen des Nährmediums von je 3200 ccm in 51 fassende Fermentatoren wurde wie im Beispiel 3 durchgeführt. Die beimpften Medien wurden dann bei verschiedenen Temperaturen mit konstantem mechanischem Umrühren und Belüftung fermentiert, bis maximale Streptomycinbildung festgestellt werden konnte. Das Rühren wurde in jedem Falle mit Hilfe von zwei Turborührern durchgeführt, die so umliefen, daß die gesamte absorbierende Kraft o,oogi Pferdekraft je 3785 1 betrug. Die Streptomycinausbeute bei den verschiedenen angewendeten Fermentationstemperaturen ist aus der folgenden Zusammenstellung ersichtlich. Die angegebenen Werte sind bei jedem Beispiel Durchschnittswerte von zwei oder mehrseparat durchgeführten Fermentationen.

Zeit in Stunden bis

Temperaturen Streptomycin- zur maximalen

0° C ausbeute Streptomycin-

ausbeute

25 118o 118

27 2041 118

29 2194 104

31 414 72

Zusätzliche Versuche haben ergeben, daß die optimale Fermentationstemperatur bei Anwendung von S. griseus albus mutant (Dulaney Z-38) bei 28,5° liegt. Beispiel 5 Die Herstellung des Impfmediums von S. griseus albus mutant.(Dulaney Z-38) und die Anwendung dieses Mediums zum Impfen von Portionen des Nährmediums von je 3200 ccm in 51 fassende Fermentatoren wurde wie im Beispiel 3 durchgeführt. Die Medien wurden vor der Impfung mit Hilfe einer Natriumhydroxydlösung auf bestimmte PH-Werte eingestellt. Dies kann vor oder nach der Sterilisierung geschehen. Die beimpften Medien wurden bei einer Temperatur von 28,5° unter konstantem Umrühren und konstanter Belüftung fermentiert, bis maximale Streptomycinerzeugung erzielt war. Das Rühren wurde bei jedem Beispiel mit zwei Turborührern durchgeführt, die mit solcher Geschwindigkeit umliefen, daß die gesamte absorbierende Kraft o,oogi Pferdekraft je 3,785 1 betrug.

Die Fermentierungen wurden in zwei getrennten Versuchen durchgeführt; ein Versuch diente zur Bestimmung der vergleichsweisen Wirkung der pa-Einstellung vor und nach der Sterilisation; der andere Versuch diente zur Ermittlung des Optimums der PH-Einstellung vor Sterilisation. Die bei den Versuchen erhaltenen Streptomycinausbeuten sind aus der folgenden Tabelle ersichtlich. Die Werte sind Durchschnittswerte aus zwei oder mehr getrennt durchgeführten Fermentationen.

Wirkung nach PH-Einstellung vor und nach der Sterilisation

Anfangs- Zeit für maximale Streptomycin-

pH-Wert pA-Einstellung Streptomycin- ausbeute

der Probe ausbeute pg/ccm

in Stunden

6,6 7,0 vor Sterilisation 112 1769

6,8 7,o nach Sterilisation 118 1555

6,4 6,5 nach Sterilisation 104 1378

6,2 6,o nach Sterilisation 104 1266

Wirkung verschiedener PH-Einstellungen vor und nach der Sterilisation

Anfangs- 0/, erte PH-Einstellung ccm 30 /" @1a O 111 Zeit für Maximal- ausbeute

der Probe Vor Sterilisation zugefügt ausbeute in Stunden frgjccm

6,65 3.3 (PH etwa 7,0) 112 1913

6,33 2,2 (pH weniger als 7,0) 118 1859

6,5 4,2 (PH größer als 7,0) 96 1799

Aus der vorstehenden Tabelle ist ersichtlich, daß bessere Ergebnisse erzielt werden, wenn die pH-Werte vor der Sterilisation eingestellt werden, und daß optimale Resultate.erzielt werden, wenn der pH-Wert vor der Sterilisation etwa 7,o beträgt.

Aus den vorstehend beschriebenen Beispielen ist ersichtlich, daß die folgenden Kriterien zusätzlich zu den typischen bereits vorher angegebenen Testresultaten zur Unterscheidung von S. griseus albus mutant (Dulaney Z-38) von seinem Mutterstamm S. griseus (Dulaney L-ii8) Verwendung finden können.

Z-38 L-ii8

optimale Fermentationstemperatur . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 28,5° C 27° C

Fermentationszeit für maximale Streptomycinerzeugung..... iio Std. - 8o Std.

Optimaler pH-Wert des Mediums vor Sterilisation . . . . . .. . . 7,0 6,2 bis 6,4

- - - - nach Sterilisation ..... .. . 6,5 bis 6,6 6,1 bis 6,3

Minimale Kraft, Absorption für maximale Streptomycinerzeu-

gung beim Fermentieren der belüfteten Medien (Pferde-

kraft je 3,7851) ..................................... 0,009 0,0024

Annähernde Maximalausbeute von Streptomycin (lig/ccm der

Kulturflüssigkeit) ..................................... 2000 iooo

Vitamin-Bi.-Gehalt der fermentierten Flüssigkeit . . . . . . . . . 0 95o mg pro 3785 1

Kulturflüssigkeit

Claims

PATENTANSPRÜCHE: r. Verfahren zur Herstellung von Streptomycin, dadurch gekennzeichnet, daß ein wäßriges Nährmedium mit durch mutierende Einwirkung von ultraviolettem Licht und weichen X-Strahlen aus einem Vaterstamm von S. griseus gewonnenen mutierten Streptomyces griseus fermentiert wird.
2. Verfahren nach Anspruch i, dadurch gekennzeichnet, daß S. griseus Dulanev L-ii8 als Vaterstamm verwendet wird.
3. Verfahren nach Ansprüchen i und 2, dadurch gekennzeichnet, daß S. griseus albus mutant Dulaney Z-38 zur Fermentierung des Nährmediums verwendet wird. q..
Verfahren nach Ansprüchen i bis 3, dadurch gekennzeichnet, daß die Fermentierung submers unter Belüftung und vorteilhaft unter mechanischem Durchmischen durchgeführt wird.
5. Verfahren nach Ansprüchen i bis q., dadurch gekennzeichnet, daß die Fermentierung bei Temperaturen zwischen 27 und 29°, vorzugsweise bei etwa 28,g° durchgeführt wird.
6. Verfahren nach Ansprüchen i bis 5, gekennzeichnet durch Anwendung eines sterilen Nährmediums, dessen pH-Wert vor der Sterilisation vorteilhaft auf etwa 7 eingestellt wird.
7. Verfahren nach Anspruch 6, dadurch gekennzeichnet, daß der pH-Wert des wäßrigen Mediums nach der Sterilisation auf etwa 6 bis 7 eingestellt wird.