<Desc/Clms Page number 1>
Verfahren zur Herstellung eines cosynthetischen Faktors und seine Verwendung
Die Erfindung betrifft die Erzeugung einer neuen Substanz mit biologischer Wirksamkeit, die von verschiedenen Species des Genus Streptomyces gebildet wird. Die neue Substanz, die im folgenden als cosynthetischer Faktor-1 und an einigen Stellen als CF-1 bezeichnet wird, besitzt die Eigenschaft, die Bildung von Chlortetracyclin in hohen Konzentrationen hervorzurufen, wenn sie bei einer Gärung mittels Stämmen von S. aureofaciens zugesetzt wird, die nur geringe Mengen Chlortretracyclin erzeugen.
An anderer Stelle sind neue, den Tetracyclinen verwandte Verbindungen beschrieben worden, die als 5a (lla) -Dehydrotetracycline bezeichnet wurden. Diese 5a (lla)-Dehydrotetracycline werden von bestimmten Stämmen von S. aureofaciens, z. B. dem Stamm S 1308 erzeugt. Lebensfähige Kulturen von S. aureofaciens, Stamm S 1308, sowie mehrerer Varianten desselben sind bei der American Type Culture
EMI1.1
nen jedoch durch ein geeignetes katalytisches Reduktionsverfahren in das bekannte Breitspektrum-Antibiotikum-Tetracyclin übergeführt werden.
Es wurde nun gefunden, dass bei Zugabe der neuen erfindungsgemässen Substanz zu einem beispielsweise mit S. aureofaciens, Stamm S 1308 (ATCC Nr. 12748), beimpften Fermentationsmedium und Züch- tung der Kultur unter üblichen aeroben Bedingungen die gebildete Chlortetracyclinmenge von etwa 100
EMI1.2
tion eine derartig hohe Chlortetracyclinkonzentration gebildet wird, während bei der gleichen Fermentation gewöhnlich nur minimale Chlortetracyclinmengen entstehen, sind noch nicht geklärt und es soll auch keine Theorie fur diese Erscheinung angegeben werden. Es wird jedoch angenommen, dass C.
F-1 nicht als Precursor anzusehen ist, was sich daraus ergibt, dass die Zugabe von 1/lg CF-l zu einer ausreichenden Menge von S. aureofaciens ATCC Nr. 12748 zu der Biosynthese von bis zu 57 mg Chlortetracyclin mehr führt, als normalerweise unter den gleichen Bedingungen gebildet wird.
Die neue erfindungsgemässe Substanz besteht aus den Elementen Kohlenstoff, Wasserstoff, Stickstoff und Sauerstoff. Mit gereinigten Proben durchgeführte Elementaranalysen ergeben folgende Werte : Kohlenstoff 50, 33%, Wasserstoff 5,00go, Stickstoff 12, 18%, Sauerstoff (direkt) 32, 5 ? f1/o. Die Verbindung hat ein verhältnismässig niedriges Molekulargewicht von 340 bis 360. Die aus den Analysenwerten abgeleitete
EMI1.3
Der cosynthetische Faktor-1 hat einen Rf-Wert von 0, 07, wenn man das Papierchromatogramm mit n-Butanol/Wasser (1 : 1) entwickelt und einen Rf-Wert von 0, 28 bis 0, 35 bei der Entwicklung mit n-Butanol-Essigsäure/Wasser (3:1:4) und einen Rf-Wert von 0, 30 bis 0, 40 bei der Entwicklung mit Ammoniak/ Wasser von PH 10.
Die Chromatogramme werden bei 250C unter Verwendung von Whatman Papier Nr. 1 laufen gelassen und die Gegenwart von CF-1 lässt sich durch seine charakteristische gelbgrüne Fluoreszenz unter ultraviolettem Licht feststellen.
Bei einer Gegenstromverteilung nach Craig mit 50 Rohren, Phenol/Chloroform (1 : 1) als organischer Phase und 0, ln-HCl als wässeriger Phase erscheint CF-1 als Einzelkomponente mit einer Spitzenkonzentration bei Rohr 31.
<Desc/Clms Page number 2>
Ein Infrarotabsorptionsspektrum einer Probe der Verbindung, wie sie aus verdünnter Salzsäurelösung erhalten wird (Säure-Form) wird in üblicher Weise erhalten (Vermischen mit Kaliumbromidkristallen und Verpressen zu einer Scheibe). Die Säure-Form der Verbindung zeigt charakteristische Absorption im Infrarotgebiet des Spektrums bei den folgenden in Mikron angegebenen Wellenlängen : 2, 84 ; 3, 18 ; 3, 35 ; 3, 55 ;
EMI2.1
ist in der Fig. 1 wiedergegeben.
Die aus Ammoniumhydroxydlösung von PH 7 erhaltene Verbindung (Neutralform) zeigt in einer Kaliumbromidscheibe charakteristische Absorption im Infrarotgebiet des Spektrums bei den folgenden in Mikron angegebenen Wellenlängen : 3, 12 ; 3, 37 ; 3, 55 ; 6, 07 ; 6, 33 ; 6, 63 ; 7, 00 ; 7, 25 ; 7, 44 ; 7, 88 ; 8, 13 ; 8, 53 ; 8, 73 ; 9. 25 ; 9, 55 ; 9, 63 ; 9, 84 ; 10, 28 ; 10, 42 ; 11, 57 ; 11, 75 ; 12, 60 ; 12, 96 ; 14, 50. Diese Infrarotkurve ist in der Fig. 2 wiedergegeben.
Ein an einer Probe der Verbindung in 0, Oln-HCl bei einer Konzentration von 10, 7 ug/ml bestimmtes Ultraviolettabsorptionsspektrum zeigt charakteristische Absorptionsmaxima bei 230 mu, 250 mu,
EMI2.2
693. Diese Ultraviolettabsorpdonskurve ist in der Fig. 3 wiedergegeben.
Ein an einer Probe der Verbindung in O, Oln-NHOH mit einer Konzentration von 10, 7 Mikrogram/ml bestimmtes Ultraviolettabsorptionsspektrum zeigt charakteristische Absorptionsmaxima bei 248 mil,
EMI2.3
349 und 1215. Diese Kurve ist in der Fig. 4'wiedergegeben.
Wie aus den weiter unten angegebenen Beispielen hervorgeht, wird der neue cosynthetische Faktor-1 von verschiedenen Organismen des Genus Streptomyces erzeugt, was sich aus der Förderung der Tetracyclinerzeugung ergibt, die eintritt, wenn derartige Gärmaischen zu einem Fermentationsmedium zugesetzt werden, das mit einer 5a (11a)-Dehydrotetracyclin erzeugenden Kultur von S. aureofaciens, z. B. des ATCC-Stammes 12748, beimpft ist. Alle diese Organismen sind Species des Genus Streptomyces. Die folgenden Species von Mikroorganismen können mit Erfolg zur Erzeugung des cosynthetischen Faktors-1 verwendet werden.Der Vitamin-B erzeugende S. albus, S. rimosus, S.
Platensis und S. hygroscopicus, die alle Oxytetracyclin bilden ; die angeblich'neue Species S. viridifaciens, die Chlortetracyclin und Tetracyclin erzeugt ; der Chlortetracyclin und Tetracyclin erzeugende S. aureofaciens ; der Streptomycin erzeugende S. grises und der Puromycin erzeugende S. albo-niger.
Der erfindungsgemäss für die Erzeugung des cosynthetischen Faktors-1 bevorzugt verwendete Organsmus ist ein neuer Stamm von S. aureofaciens, der W-5 genannt wird, da er die Fähigkeit besitzt, grössere Mengen dieser neuen Substanz zu bilden.
Der neue Stamm ist ein Mitglied der Species S. aureofaciens, da er ein direkter Abkömmling des Chlortetracyclin erzeugenden Stammes von S. aureofaciens A 377 ist, der aus einer Bodenprobe isoliert und in der USA-Patentschrift Nr. 2, 482, 055 beschrieben wurde und dessen Kultur bei den Northern Regional Research Laboratories, Peoria, Illinois unter der Bezeichnung NRRL 2209 hinterlegt ist. Als mutagene und selektive Mittel für die Gewinnung dieses neuen Stammes wurden unter anderem verwendet : Ultraviolettbestrahlung, Behandlungen mit Nikotin und Stickstofflost und Einwirkung von Phagen.
CF-1 kann von praktisch allen Stämmen von S. aureofaciens, von andern Streptomyces-Stämmen sowie von andern Mikroorganismen und von Mutanten dieser Stämme erzeugt werden. Die zur Untersuchung neuer Stämme auf ihr CF-1-Bildungsvermögen angewendete Methode ist in den Beispielen angegeben.
Der für die Erzeugung der neuen Substanz bevorzugte neue Stamm besitzt die gleichen allgemeinen Charakteristika wie die die Tetracycline erzeugenden Stämme und unterscheidet sich von diesen in der gleichen allgemeinen Weise, wie sich die Tetracyclin und Chlortetracyclin erzeugenden Stämme von S. aureofaciens untereinander unterscheiden, wie dies in einer Anzahl wissenschaftlicher Veröffentlichungen beschrieben worden ist. Die im folgenden aufgeführten Daten dienen zur Erläuterung der Abweichungen des Stammes W-5 von dem ursprünglichen als NRRL 2209 erhältlichen Stamm A 377.
Differenzierung von Streptomyces aureofaciens Stamm W-5 und Streptomyces aureofaciens Stamm A 377 (NRRL 2209) durch Beobachtung der Wachstumscharakteristika auf verschiedenen Medien nach Bebrütung bei 26, 50C.
<Desc/Clms Page number 3>
1. Glycerin Asparagin Fleischextraktagar.
EMI3.1
<tb>
<tb>
Glycerin <SEP> 1, <SEP> 0 <SEP> %
<tb> L-Asparagin <SEP> 0, <SEP> 05% <SEP>
<tb> Fleischextrakt <SEP> 0, <SEP> 2 <SEP> lo <SEP>
<tb> KH2PO4 <SEP> 0,05%
<tb> Bacto-Agar <SEP> 1, <SEP> 5 <SEP> % <SEP>
<tb> Destilliertes <SEP> Wasser, <SEP> q. <SEP> s. <SEP> 100, <SEP> 0 <SEP> % <SEP>
<tb> Einstellung <SEP> mit <SEP> 50% <SEP> KOH <SEP> auf <SEP> PH <SEP> 7, <SEP> 0 <SEP>
<tb> pH <SEP> nach <SEP> Sterilisation <SEP> 7, <SEP> 2 <SEP>
<tb> Streptomyces <SEP> aureofaciens
<tb> Stamm <SEP> W-5 <SEP> Stamm <SEP> A <SEP> 377
<tb> Wachstum <SEP> normal <SEP> bis <SEP> gut, <SEP> hyalin <SEP> bis <SEP> semiopak, <SEP> gut
<tb> weiss
<tb> Lufthyphen <SEP> spärlich <SEP> bis <SEP> mässig, <SEP> weiss <SEP> schwach <SEP> bis <SEP> normal, <SEP> weiss
<tb> bis <SEP> hellgrau
<tb> Sporulation <SEP> spärlich,
<SEP> dunkelgrau <SEP> hellgrau
<tb> Diffundierbares <SEP> Pigment <SEP> keines <SEP> hellgelb
<tb> Unterseite <SEP> weiss, <SEP> semiopak <SEP> gelb <SEP> bis <SEP> hellorangegelb
<tb>
2. Dextrin-Czapek-Dox-Agar.
EMI3.2
<tb>
<tb>
Dextrin <SEP> 1, <SEP> 0 <SEP> uso <SEP>
<tb> NaN03 <SEP> 0,2 <SEP> %
<tb> K2HPO4 <SEP> 0,1 <SEP> %
<tb> MgS04. <SEP> 7HzO <SEP> 0, <SEP> 05 <SEP> ujo <SEP>
<tb> KCl <SEP> 0, <SEP> 05 <SEP> %
<tb> FeSO. <SEP> 7H2O <SEP> 0,001%
<tb> Bacto- <SEP> Agar <SEP> 1, <SEP> 5 <SEP> ujo <SEP>
<tb> Destilliertes <SEP> Wasser, <SEP> q. <SEP> s.
<SEP> 100, <SEP> 0 <SEP> ujo <SEP>
<tb> pH <SEP> nach <SEP> Sterilisation <SEP> 7, <SEP> 2 <SEP>
<tb> Streptomyces <SEP> aureofaciens
<tb> Stamm <SEP> W-5 <SEP> Stamm <SEP> A <SEP> 377
<tb> Wachstum <SEP> sehr <SEP> dünn, <SEP> klar <SEP> hyalin <SEP> bis <SEP> durch-gut
<tb> scheinend <SEP> weiss
<tb> Lufthyphen <SEP> keine <SEP> reichlich, <SEP> mausgrau <SEP> * <SEP>
<tb> bis <SEP> bleigrau <SEP> * <SEP>
<tb> wasserhelle <SEP> Oberflächenkügelchen
<tb> Sporulation <SEP> keine <SEP> überreich
<tb> Diffundierbares <SEP> Pigment <SEP> keines <SEP> Spur, <SEP> Blassgelb
<tb> Unterseite <SEP> klar <SEP> hyalin <SEP> bis <SEP> durchscheinend <SEP> kein <SEP> Pigment, <SEP> Spur <SEP> rosa
<tb> weiss
<tb>
* Color Harmony Manual, 3. Auflage, Container Corporation of America.
<Desc/Clms Page number 4>
3. AP 4-Maisquell-Agar.
EMI4.1
<tb>
<tb>
Maisquellwasser <SEP> 0, <SEP> 4 <SEP> % <SEP>
<tb> Saccharose <SEP> 1, <SEP> 0 <SEP> 0/0 <SEP>
<tb> MgSC. <SEP> 7H2O <SEP> 0, <SEP> 025% <SEP>
<tb> KH2PO4 <SEP> 0,2 <SEP> %
<tb> (NHHPO4 <SEP> 0, <SEP> 2 <SEP> % <SEP>
<tb> Bacto-Agar <SEP> 2, <SEP> 0 <SEP> o
<tb> Leitungswasser, <SEP> q. <SEP> s.
<SEP> 100, <SEP> 0 <SEP> % <SEP>
<tb> PH <SEP> nach <SEP> Sterilisation <SEP> 6, <SEP> 5 <SEP> % <SEP>
<tb> Streptomyces <SEP> aureofaciens <SEP>
<tb> Stamm <SEP> W-5 <SEP> Stamm <SEP> A <SEP> 377
<tb> Wachstum <SEP> ausgezeichnet, <SEP> weiss <SEP> ausgezeichnet
<tb> Lufthyphen <SEP> überreich <SEP> reichlich, <SEP> rehfarben <SEP> *
<tb> Sporulation <SEP> überreiche, <SEP> silbergrau <SEP> * <SEP> überreich, <SEP> gleichmässig
<tb> bis <SEP> beigegrau <SEP> * <SEP>
<tb> Diffundierbares <SEP> Pigment <SEP> keines <SEP> hellgelb <SEP> bis <SEP> bernstein
<tb> Unterseite <SEP> weiss <SEP> bis <SEP> biber <SEP> hell-lederbraun <SEP>
<tb> bis <SEP> schokolade
<tb>
* Color Harmony Manual, 3. Auflage, Container Corporation of America.
4. Andere Medien.
EMI4.2
<tb>
<tb>
Streptomyces <SEP> aureofaciens
<tb> Medium <SEP> Stamm <SEP> W-5 <SEP> Stamm <SEP> A <SEP> 377
<tb> Nähr-Agar <SEP> Semi-opake <SEP> weisse <SEP> Wachstums <SEP> Foki <SEP> auf <SEP> gutes <SEP> Wachstum, <SEP> keine <SEP> Lufthyphen.
<tb> dünnem <SEP> farblosem <SEP> hyalinem <SEP> Wachs-Unterseite <SEP> : <SEP> blass <SEP> gelb.
<tb> turn. <SEP> Kein <SEP> Luftmycel. <SEP> Blassgelbes <SEP> lösliches <SEP> Pigment
<tb> Unterseite <SEP> : <SEP> klar <SEP> hyalin <SEP> bis <SEP> weiss. <SEP> Keine
<tb> löslichen <SEP> Pigmente.
<tb>
Glucose-Asparagin-normales <SEP> Wachstum <SEP> : <SEP> klar <SEP> hyalin <SEP> bis <SEP> gutes <SEP> Wachstum. <SEP> Lufthyphen <SEP> weiss,
<tb> Fleisch-Medium <SEP> durchscheinend <SEP> weiss. <SEP> Kein <SEP> bis <SEP> spär- <SEP> die <SEP> mit <SEP> zunehmender <SEP> Sporenbildung
<tb> liches <SEP> Luftmycel <SEP> : <SEP> weiss <SEP> bis <SEP> biber. <SEP> * <SEP> zunehmend <SEP> grau <SEP> werden. <SEP> Unterseite <SEP> : <SEP>
<tb> Spärliche <SEP> Sporulation. <SEP> hellgelb <SEP> bis <SEP> rosaorange. <SEP> Spur <SEP> : <SEP> gelbUnterseite <SEP> : <SEP> farblos <SEP> bis <SEP> weiss, <SEP> kein <SEP> oranges <SEP> lösliches <SEP> Pigment.
<tb> lösliches <SEP> Pigment.
<tb>
AP <SEP> 6-Maisquell-Agar2 <SEP> ausgezeichnetes <SEP> Wachstum <SEP> : <SEP> Weiss. <SEP> ausgezeichnetes <SEP> Wachstum. <SEP> ÜberLuftmycel <SEP> ; <SEP> mässig <SEP> bis <SEP> reichlich, <SEP> reichliches <SEP> Luftmycel. <SEP> Überreiche
<tb> silbergrau <SEP> *. <SEP> Mässige <SEP> bis <SEP> reichliche <SEP> Sporulation: <SEP> rehfarben <SEP> *. <SEP> UnterSporulation. <SEP> Unterseite <SEP> : <SEP> weiss <SEP> bis <SEP> seite <SEP> : <SEP> lederfarben <SEP> *. <SEP> Hellbernsteinbiber <SEP> *. <SEP> Kein <SEP> lösliches <SEP> Pigment. <SEP> farbenes <SEP> lösliches <SEP> Pigment.
<tb>
<Desc/Clms Page number 5>
4. Andere Medien. (Fortsetzung)
EMI5.1
<tb>
<tb> Streptomyces <SEP> aureofaciens
<tb> Medium <SEP> Stamm <SEP> W-5 <SEP> Stamm <SEP> A <SEP> 377
<tb> Waksman's <SEP> Agar <SEP> gutes <SEP> Wachstum <SEP> ; <SEP> weiss <SEP> bis <SEP> hellgelb <SEP> gutes <SEP> Wachstum. <SEP> Lufthyphen <SEP> normal,
<tb> Luftmycel <SEP> : <SEP> normal <SEP> bis <SEP> gut, <SEP> weiss, <SEP> das <SEP> reichlich <SEP> werden <SEP> ; <SEP> weiss <SEP> bis <SEP> taupebraun <SEP> * <SEP>
<tb> biber <SEP> * <SEP> bis <SEP> aschfarben <SEP> * <SEP> wird. <SEP> Nor-Unterseite <SEP> : <SEP> Kamelhaarfarben <SEP> * <SEP> bis
<tb> male <SEP> Sporulation. <SEP> Unterseite:
<SEP> hell- <SEP> lehmziegelbraun <SEP> *. <SEP> Hellgelbes <SEP> löshelb <SEP> * <SEP> bis <SEP> rosa-taupe-farben <SEP> * <SEP> bis <SEP> liches <SEP> Pigment.
<tb> taupe-farben-braun <SEP> *. <SEP> Gelbes <SEP> bis
<tb> bernsteinfarbenes <SEP> lösliches <SEP> Pigment.
<tb>
Kartoffelkeil <SEP> ausgezeichnetes <SEP> glattes <SEP> feuchtes <SEP> kno- <SEP> überreiches, <SEP> feuchtes, <SEP> glattes <SEP> knotenbildendes <SEP> Wachstum: <SEP> hellrehfar- <SEP> tenbildendes <SEP> Wachstum: <SEP> hellbraunben* <SEP> bis <SEP> kupferbraun <SEP> * <SEP> bis <SEP> ziegel-gelb* <SEP> bis <SEP> beige* <SEP> bis <SEP> Ceder-farben*.
<tb> rot*. <SEP> Kein <SEP> Luftmycel. <SEP> Hellrehfarbe-Kein <SEP> lösliches <SEP> Pigment.
<tb> nes* <SEP> lösliches <SEP> Pigment.
<tb>
Purpurmilch <SEP> schwacher, <SEP> aber <SEP> deutlicher <SEP> Wachs- <SEP> schwacher <SEP> weisser <SEP> bis <SEP> blassgelber
<tb> tumskragen, <SEP> wenig <SEP> signifikante <SEP> PH- <SEP> Wachstumskragen. <SEP> Wenig <SEP> signifikante
<tb> Veränderung. <SEP> Keine <SEP> sichtbare <SEP> Pepto- <SEP> pH-Veränderung, <SEP> noch <SEP> sichtbare
<tb> nisation <SEP> in <SEP> 14 <SEP> Tagen. <SEP> Peptonisation <SEP> in <SEP> 14 <SEP> Tagen.
<tb>
* Color Harmony Manual, 3. Auflage, Container Corporation of America.
2
AP 6-Agar
EMI5.2
<tb>
<tb> Saccharose <SEP> 1,0 <SEP> %
<tb> MgSO. <SEP> 7 <SEP> H <SEP> 0 <SEP> 0, <SEP> 025% <SEP>
<tb> KHzP04 <SEP> 0, <SEP> 2 <SEP> 0/0 <SEP>
<tb> (NH2)3PO4 <SEP> 0,2 <SEP> %
<tb> Maisquellwasser <SEP> 0,6 <SEP> % <SEP>
<tb> Bacto-Agar <SEP> (gereinigt) <SEP> 2,0 <SEP> %
<tb> H2O <SEP> q. <SEP> s. <SEP> 100,0 <SEP> %
<tb>
5.
Mikroskopische Beobachtungen
EMI5.3
<tb>
<tb> Streptomyces <SEP> aureofaciens
<tb> Medium <SEP> Stamm <SEP> W-5 <SEP> Stamm <SEP> A <SEP> 377
<tb> Mycel <SEP> Sporen <SEP> Mycel <SEP> Sporen
<tb> Glycerin-Asparagin- <SEP> gekrümmt, <SEP> Spheroidal <SEP> bis <SEP> gekrümmt, <SEP> Spheroidal <SEP> bis <SEP>
<tb> Fleischextrakt-Agar <SEP> kontinuierlich <SEP> ovoidal <SEP> kontinuierlich <SEP> ovoidal
<tb> verzweigt <SEP> # <SEP> 0,5-1,0 <SEP> <SEP> verzweigt <SEP> # <SEP> 1,2-1,5
<tb> # <SEP> 0,5 <SEP> - <SEP> 1,0 <SEP> <SEP> # <SEP> 1,0-1,2
<tb>
<Desc/Clms Page number 6>
5.
Mikroskopische Beobachtungen (Fortsetzung)
EMI6.1
<tb>
<tb> Streptomyces <SEP> aureofaciens
<tb> Medium <SEP> Stamm <SEP> W-5 <SEP> Stamm <SEP> A <SEP> 377
<tb> Mycel <SEP> Sporen <SEP> Mycel <SEP> Sporen
<tb> AP4-Maisquell-Agar <SEP> gekrümmt, <SEP> Spheriodal <SEP> bis <SEP> gekrümmt, <SEP> Spheroidal <SEP> bis <SEP>
<tb> kontinuierlich <SEP> ovoidal <SEP> kontinuierlich <SEP> ovoidal
<tb> verzweigt <SEP> # <SEP> 0,5-1,0 <SEP> <SEP> verzweigt <SEP> #1,2-1,5
<tb> ) <SEP> 0, <SEP> 5-I, <SEP> 0 <SEP> ( <SEP> O, <SEP> 8-1. <SEP> 0 <SEP>
<tb> Waksman's <SEP> Agar <SEP> gekrümmt, <SEP> Spheroidal <SEP> bis <SEP> gekrümmt, <SEP> Spheroidal <SEP> bis <SEP>
<tb> kontinuierlich <SEP> ovoidal <SEP> kontinuierlich <SEP> ovoidal
<tb> verzweigt <SEP> (HO, <SEP> 5-1, <SEP> Oil <SEP> verzweigt <SEP> 0. <SEP> 5-1, <SEP> 0 <SEP>
<tb> 0, <SEP> 5-l.
<SEP> Ofi <SEP> (p0, <SEP> 5-l, <SEP> 0j. <SEP> t <SEP>
<tb>
EMI6.2
<Desc/Clms Page number 7>
dann mit Wasser extrahiert und der wässerige Extrakt wird im Vakuum eingeengt und an einer Säule mit Florisil chromatographiert. Florisil ist ein aktiviertes Magnesiumsilikat von etwa folgender Zusammen-
EMI7.1
nen werden eingeengt, mit Salzsäure auf PH 1 eingestellt und filtriert. Das Filtrat wird abgekühlt und angeimpft. Die gebildeten CF-1-Kristalle werden abfiltriert, gewaschen und im Vakuum getrocknet. Das Rohprodukt kann in üblicher Weise durch Umkristallisieren aus O. ln-HCl gereinigt werden.
Die folgenden Beispiele erläutern die Erfindung, ohne sie zu beschränken.
Beispiel I : Bereitung des Inokulums
Ein typisches für die Züchtung des primären Inokulums verwendeies Medium wird nach folgender Vorschrift bereitet :
EMI7.2
<tb>
<tb> Saccharose <SEP> 30, <SEP> 0 <SEP> g <SEP>
<tb> Maisquellwasser <SEP> 16, <SEP> 5 <SEP> ml <SEP>
<tb> Ammoniumsulfat <SEP> 2, <SEP> 0 <SEP> g
<tb> Calciumcarbonat <SEP> 7, <SEP> 0 <SEP> g <SEP>
<tb>
Wasser auf 1000 ml
Anteile dieses Mediums von jeweils 8 ml werden in eine Reihe von 20 cm (8 inch) Reagensgläsern eingebracht und 20 min unter einem Druck von etwa 1 atü im Autoklaven sterilisiert.
Sporen des Stammes S. aureofaciens W-5 werden mit sterilem destilliertem Wasser von einem Schrägagar abgewaschen, wobei eine Suspension erhalten wird, die etwa 60. 106 Sporen/mI enthält. 0, 33 ml dieser Suspension werden zur Beimpfung jedes der 8 ml des oben beschriebenen Mediums enthaltenden Reagensgläser verwendet. Dann wird 24 h bei 280C auf einer Schüttelvorrichtung mit Hin- und Herbewegung bei 116 Schwingungen/min inkubiert.
Beispiel 2 : Fermentation
Ein Fermentationsmedium wird nach folgender Vorschrift bereitet :
EMI7.3
<tb>
<tb> (NH4)2SO4 <SEP> 5,0 <SEP> g
<tb> CaCO3 <SEP> 9,0 <SEP> g
<tb> NH4Cl <SEP> 1,5 <SEP> g
<tb> MgCl2.6H2O <SEP> 2,0 <SEP> g
<tb> FeSO4.7H2O <SEP> 0,06 <SEP> g
<tb> MnSO4.4H2O <SEP> 0,05 <SEP> g
<tb> CoCl2.6H2O <SEP> 0,005 <SEP> g
<tb> ZnSO4.7H2O <SEP> 0,1 <SEP> g
<tb> Maisquellwasser <SEP> 25,0 <SEP> g
<tb> Baumwollsamenmehl <SEP> 55,0 <SEP> g
<tb> Maisstärke <SEP> 55,0 <SEP> g
<tb>
Wasser aut 1000 ml
Jeweils 25 ml des Mediums werden in 250 ml Erlenmeyer-Kolben eingebracht und mit jeweils 0, 5 ml Schmalzöl versetzt. Die das Fermentationsmedium und das Schmalzöl enthaltenden Kolben werden in einem Autoklaven 20 min unter einem Druck von etwa 1 atü sterilisiert.
Nach der Sterilisation und dem Abkühlen wird 1 ml des nach Beispiel 1 bereiteten Inokulums zu jedem Kolben zugesetzt und die Fermentation auf einer Rundschüttelvorrichtung mit 180 Umdr/min bei 250C 120 h geführt. Die Gehaltsprüfung der Maische ergibt 1 ug cosynthetischen Faktor/ml.
Beispiel 3 : Extraktion aus der Gesamtmaische
200 l einer Gärmaische, die in einem halbtechnischen Fermentationstank mittels des CF-1 erzeugenden Stammes von S. aureofaciens W-5 in dem in Beispiel 2 beschriebenen Medium bereitet wurde und 1 Mikrogram CF-l/ml enthält, werden bei einem pH-Wert von 6 bis 7 unter Verwendung einer Filterhilfe (Hyflosupercel, Diatomeenerde) in einer Menge von etwa 15% des Maischevolumens filtriert. Der Filterkuchen wird mit so viel Wasser gewaschen, dass das Gesamtvolumen des vereinigten neutralen Filtrats dem Volumen der Ausgaugsmaische gleich ist.
Die CF-1-Wirksamkeit des vereinigten neutralen Filtrats beträgt etwa 1 pg/ml. Das vereinigte neutrale Filtrat wird im Vakuum bei einer Temperatur von unter 600C auf etwa 1/4 des Volumens der Ausgangsmaische eingeengt. Das Endvolumen des konzentrierten, vereinigten, neutralen Filtrats beträgt demnach 50 l.
<Desc/Clms Page number 8>
EMI8.1
<Desc/Clms Page number 9>
genBeispiel 4 : Eine Standardprüfung aufCF-1 wird folgendermassen durchgeführt :
Nach der in Beispiel 1 beschriebenen Arbeitsweise wird ein Inokulum von S. aureofaciens S 1308 (ATCC 12748) bereitet.
Anteile von kristallinem CF-1, das wie in Beispiel 3 beschrieben erhalten wurde, werden zu einem Fermentationsmedium gegeben, das wie in Beispiel 2 beschrieben, aufgebaut ist, jedoch 0, 1 j.lg/ml an Riboflavin enthält. Das Medium wird dann sterilisiert, mit dem 24stündigen vegetativen Inokulum von S. aureofaciens S 1308 beimpft, 120 h bei 200C inkubiert und auf seinen Gehalt an Chlortetracyclin geprüft.
EMI9.1
<tb>
<tb> zugesetzter <SEP> CF-1 <SEP> gebildetes <SEP> Chlortetracyclin
<tb> jlg/ml <SEP> (Turbidimetrische <SEP> Prüfung)
<tb> g/ml
<tb> 0 <SEP> 360
<tb> 0, <SEP> 01 <SEP> 925
<tb> 0, <SEP> 02 <SEP> 1500
<tb> 0, <SEP> 04 <SEP> 2550
<tb> 0, <SEP> 08 <SEP> 4270
<tb> 0, <SEP> 16 <SEP> 5600
<tb> 0, <SEP> 32 <SEP> 6200
<tb>
Beispiel 5 :
Nach der in Beispiel 2 beschriebenen Arbeitsweise wird eine 120 h-Fermentation mit S. aureofaciens W-5 durchgeführt. Die gebildete Maische wird ohne pH-Wert-Einstellung filtriert, wodurch man ein W-5-Filtrat erhält.
Man führt eine S. aureofaciens S 1308-Fermentation wie in Beispiel 4 beschrieben durch, ersetzt jedoch den dort verwendeten kristallinen CF-1 durch 0, 08 ml dieses neutralen W-5-Filtrats. Die erhaltene Maische liefert bei der Gehaltsprüfung folgende Werte :
EMI9.2
<tb>
<tb> ml <SEP> neutrales <SEP> W-5-Filtrat <SEP> gebildetes <SEP> Chlortetracyclin
<tb> je <SEP> ml <SEP> S <SEP> 1308 <SEP> Maische <SEP> (Turbidimetrische <SEP> Prüfung)
<tb> 0, <SEP> 00 <SEP> 150
<tb> 0, <SEP> 08 <SEP> 3410
<tb>
EMI9.3
EMI9.4
<tb>
<tb> Für <SEP> die <SEP> Primärfermentation <SEP> verwendeten <SEP> Kulturen <SEP> Jlg <SEP> CF-1 <SEP> je <SEP> ml <SEP> Primärfermentationsmaische
<tb> Streptomyces <SEP> aureofaciens <SEP> W-5 <SEP> 1, <SEP> 37 <SEP>
<tb> Streptomyces <SEP> albus <SEP> 0, <SEP> 38 <SEP>
<tb> Streptomyces <SEP> rimosus <SEP> 0,
<SEP> 05 <SEP>
<tb> Streptomyces <SEP> platensis <SEP> 0, <SEP> 37 <SEP>
<tb> Streptomyces <SEP> hygroscopicus <SEP> 0, <SEP> 35 <SEP>
<tb> Streptomyces <SEP> griseus <SEP> 0, <SEP> 52 <SEP>
<tb> Streptomyces <SEP> albo-niger <SEP> 0, <SEP> 7 <SEP>
<tb>
<Desc/Clms Page number 10>
EMI10.1
geführt, wobei jedoch das dort verwendete kristalline CF-1 durch unterschiedliche Volumina an neutralem S. aureofaciens W-5-Filtrat ersetzt wird.
Die Gehaltsprüfung der erhaltenen Maischen ergibt folgende Werte :
EMI10.2
<tb>
<tb> ml <SEP> neutrales <SEP> W-5-Filtrat <SEP> je <SEP> ml <SEP> E <SEP> 504-Maische <SEP> gebildetes <SEP> 7-Chlor-6-desmethyltetracyclin
<tb> Turbidimetrische <SEP> Spektrophotometrische
<tb> Prüfung <SEP> lig/ml <SEP> Prüfung <SEP> Mg/ml
<tb> 0, <SEP> 00 <SEP> < 0, <SEP> 5 <SEP> < 50 <SEP>
<tb> 0, <SEP> 04 <SEP> 105 <SEP> 85
<tb> 0, <SEP> 12 <SEP> 180 <SEP> 170
<tb>
Die Zugabe von cosynthetischem Faktor-1 zu der oben beschriebenen S. aureofaciens-Fermentation führt zur erhöhten Bildung von 7-Chlor-6-desmethyltetracyclin.
Beispiel 8 : Ein S. aureofaciens-W-5-Neutralfiltrat wird, wie in Beispiel 5 beschrieben, zubereitet. Jeweils 25 ml des in Beispiel 2 beschriebenen Fermentationsmediums werden in sechs 250 ml-Erlen- meyerkolben eingebracht. Ein Inhibitor der fermentati ven Chlorierung, 2, 5- Dimercapto-1, 3, 4-thiadiazol (DMTD) wird zu zweien der sechs Kolben in dem Verhältnis von 0, 10 mg DMTD/ml Fermentationsmedium gegeben. Alle sechs Kolben werden dann sterilisiert und abgekühlt. Eine S. aureofaciens S 1308Gärung wird, wie in Beispiel 4 beschrieben, durchgeführt, wobei jedoch an Stelle des dort verwendeten kristallinen CF-1 0, 08 ml des S. aureofaciens W-5-Neutralfiltrats eingesetzt werden.
Die Gehaltsprüfung der erhaltenen Maische ergibt folgende Werte :
EMI10.3
<tb>
<tb> ml <SEP> W-5-Neutralfiltrat <SEP> je <SEP> Chlortetracyclin <SEP> Tetracyclin
<tb> ml <SEP> S <SEP> 1308-Maische <SEP> DMTD <SEP> Fluorometrische <SEP> Spektrophotometrische
<tb> gg/ml <SEP> Prüfung <SEP> jg/ml <SEP> Prüfung <SEP> blglmi
<tb> 0 <SEP> 0 <SEP> 220 <SEP> 0
<tb> 0, <SEP> 08 <SEP> 0 <SEP> 1420 <SEP> 130
<tb> 0, <SEP> 08 <SEP> 0, <SEP> 10 <SEP> 110 <SEP> 3410
<tb> 0 <SEP> 0 <SEP> 280 <SEP> 0
<tb> 0, <SEP> 08 <SEP> 0 <SEP> 3300 <SEP> 295
<tb> 0, <SEP> 08 <SEP> 0, <SEP> 10 <SEP> 160-3140 <SEP>
<tb>
DievorstehendenDaienzeigen, dassdieZugabevon cosynthetischem Faktor-1 zu einer S. aureofaciens S 1308-Gärung in Gegenwart eines Chlorierungsinhibitors zu der Bildung von Tetracyclin führt.
**WARNUNG** Ende DESC Feld kannt Anfang CLMS uberlappen**.