DE1117261B

DE1117261B - Verfahren zur Herstellung von Tetracyclinen auf biologischem Wege

Info

Publication number: DE1117261B
Application number: DEA34419A
Authority: DE
Inventors: Jerry Robert Daniel Mccormick; Newell Oscar Sjolander; Ursula Hirsch
Original assignee: American Cyanamid Co
Current assignee: Wyeth Holdings LLC
Priority date: 1959-04-13
Filing date: 1960-04-11
Publication date: 1961-11-16
Also published as: BE589652A; NL250490A; DK103176C; GB890148A; ES257216A1; US2998352A; FR1260234A; CH412199A

Description

Verfahren zur Herstellung von Tetracyclinen auf biologischem Wege Die Erfindung betrifft die Herstellung von Tetracyclinen durch Fermentation, und insbesondere befaßt sie sich mit einem neuen Verfahren zur cosynthetischen Herstellung eines Antibiotikums der Tetracyclinreihen, z. B. Tetracyclin, Chlortetracyclin, Bromtetracyclin, Oxytetracyclin, 6-Desmethyltetracyclin, 7-Chlor-6-desmethyltetracyclin u. dgl. durch eine gemischte Fermentation, wobei zwei oder mehr Mikroorganismen der Gattung Streptomyces zum Einsatz kommen.
Selbstverständlich ist bekannt, die Tetracyclinantibiotika durch Fermentationen mit einem einzigen reinen Stamm herzustellen. Tatsächlich ist dies der übliche Weg zur Herstellung dieser Antibiotika. Die Herstellung von Chlortetracyclin durch S.aureofaciens ist z. B. in der deutschen Patentschrift 869 679 beschrieben. Die USA.-Patentschrift 2 516 080 beschreibt die Herstellung von Oxytetracyclin durch S.rimosus. Die deutsche Auslegeschrift 1026 481 befaßt sich mit der Herstellung von Tetracyclin durch S.aureofaciens, und die deutsche Patentschrift 1041213 beschreibt die Herstellung von 6-Desmethyltetracyclin und 7-Chlor-6-desmethyltetracyclin durch S.aureofaciens. Fermentationen mit reinen Einzelstämmen wurden bisher allgemein zur Herstellung dieser Antibiotika angewandt, obgleich die Aufrechterhaltung dieser Reinstämme nur mit großen Mühen erreicht wird.
Erfindungsgemäß wurde gefunden, daß es möglich ist, wirtschaftlich bedeutende Mengen an Tetracyclinantibiotika durch eine synergistische Fermentation mit zwei oder mehr Mikroorganismen, des Stammes Streptornyces zu erzeugen.
Es ist ein überraschendes Kennzeichen der vorliegenden Erfindung, daß es möglich ist, eine Mischung von zwei oder mehr ausgewählten Stämmen von Mikroorganismen der Art Streptomyces einzusetzen und in vielen Fällen eine erstaunliche Steigerung oder einen synergistischen Effekt bei der Herstellung der Tetracycline zu erreichen, selbst wenn solche Stämme, wenn mit ihnen einzeln fermentiert wird, keine oder nur relativ geringe Mengen der Tetracyclinantibiotika erzeugen. Diese Erscheinung wird weiterhin als fermentative Cosynthese bezeichnet. Ebenso überraschend ist die Tatsache, daß beide Glieder des cosynthetisierenden Paars der Mikroorganismen nicht von der gleichen Art sein müssen, und in der Tat muß nur ein Glied des Paars von einer der normalerweise Tetracyclin produzierenden Arten der Gattung Streptomyces sein, ohne daß es jedoch erforderlich ist, daß sie selbst das Antibiotikum bei Einzelkultur erzeugt. Der wirksame Stamm kann selbst auf Grund etwaiger Stoffwechselblockierung unfähig zur Herstellung eines Tetracyclinantibiotikums in wesentlichen Mengen sein. Einige Stämme von S.aureofaciens zeigen cosynthetische Herstellung von Tetracyclin mit Stämmen der Arten S.albo-niger, S.albus, S.griseus u. dgl. In ähnlicher Weise kann eine cosynthetische Wirksamkeit unter Verwendung der Oxytetracyclinerzeugenden Art S.rimosus zusammen mit einer nicht Tetracyclin erzeugenden Art, wie z. B. S.lavendulae_ oder S.griseus, erreicht werden.
Der genaue Vorgang, nach welchem die Stämme synergistisch ineinander eingreifen, ist nicht gänzlich geklärt. Es ist möglich, daß es bei jedem Paar der Stämme einen »Donator-« und einen »Akzeptor« Stamm gibt. Der Akzeptorstamm bestimmt, welches Tetracyclinantibiotikum in der Produktion gesteigert wird, und der Donatorstamm unterstützt diese Produktion. Die Wirkung eines speziellen Stammes kann in Abhängigkeit davon, mit welchem anderen Stamm er zusammen verwendet wird, variieren. Mit anderen Worten, ein Stamm kann ein Donatorstamm in einem Paar und ein Akzeptorstamm im anderen Paar sein. Wenn ein Stamm eines Paares selbst ein guter Produzent eines speziellen Antibiotikums ist, wird er üblicherweise das Akzeptorglied eines Paares, an dem der teilnimmt, bilden. Es ist jedoch zu betonen, daß diese Erklärung einzig auf Betrachtungen basiert, die nicht vollständig an experimentellen Daten überprüft wurden. Sie ist auch nicht als die einzig mögliche Erklärung der Erfindung aufzufassen. Doch abgesehen von der theoretischen Erklärung, erreicht man Synergismus, indem man nach den hier beschriebenen Maßnahmen und Verfahren arbeitet.
Die Auswahl der Stämme zwecks Erzielung einer fermentativen Cosynthese der Tetracycline wird leicht ausgeführt nach den klassischen Wegen der Stammauswahl, die dem Fachmann geläufig sind. Eine übliche Methode besteht darin, daß man eine Petrischale, die ein Nähragar enthält, mit Sporen einer Lagerkultur beimpft, nachdem man die Sporen mit einem Mutationen hervorrufenden Mittel behandelt hat. Nach der Inkubation der beimpften Schale ergibt sich aus der Beobachtung der gebildeten Kolonien, daß bestimmte Kolonien in auffälliger Weise von der Stammkultur unter gleichen Umständen sich unterscheiden. Typische Änderungen gegenüber der Stammkultur sind z. B. dunkelbraune Kolonien, verglichen mit den normalerweise braungelben Kolonien; Mikrokolonien, verglichen mit normalen Kolonien; Riesenkolonien im Gegensatz zu normalen Kolonien; Maßgelbe Kolonien, farblose Kolonien, dunkelgrüne Kolonien; kupferrote Kolonien im Gegensatz zu normalerweise braungelben Kolonien; rauhe oder glatte Kolonien im Gegensatz zu normalerweise geriffelten Kolonien; Kolonien mit nicht diffundierbarem Pigment im Gegensatz zu normalen Kolonien, die ein braungelbes diffundierbares Pigment besitzen; Kolonien mit einem fluoreszierenden Diffusionshof im Gegensatz zu einem nicht fluoreszierenden Hof und Kombinationen dieser und zahlreicher anderer Abänderungen. Selbst wenn keine augenscheinliche Unterscheidung der Kolonien vorliegt, zeigt sich häufig eine Veränderung bei weiterer Untersuchung von willkürlich herausgegriffenen isolierten Individuen, z. B. durch Untersuchung der Antibiotikumproduktion bei der Fermentation in Reinkulturschüttelflaschen, durch Untersuchung, welche Art Kohlehydrat verwertet wird, wobei man sich der spektrophotometrischen, der spektrofiuormetrischen, der papierchromatographischen oder irgendeiner anderen Prüfung mittels physikalischer, chemischer oder biologischer Untersuchung, wie sie gerade gegeben sind, bedient. Alle diese Methoden sind Standardmaßnahmen zur Auswahl mikrobiotischer Varianten und den Fachleuten geläufig. Mutation erzeugende Mittel, die zur Herstellung von Varianten brauchbar sind, sind Bestrahlung (Röntgenstrahlen, Ultraviolett, -x-, ß- oder y-Strahlen, Infrarotstrahlen, Mikrowellen, kosmische Strahlung, Ultraschall), reaktive Chemikalien (Stickstofflost, Schwefellost, Cobaltionen, Colchicin, polynucleare Kohlenwasserstoffe u. dgL), physikalische Maßnahmen (Verreiben). Ultraviolettstrahlen, Röntgenstrahlen und Stickstofflost sind von spezieller Brauchbarkeit als Mutation erzeugende Mittel.
Nachdem eine Gruppe von Varianten ausgewählt ist, besteht der nächste Schritt zur Erreichung einer cosynthetischen Fermentation darin, zu bestimmen, welche dieser Varianten geeignet sind, biologisch zusammenzuwirken. Dies kann rein durch Versuch und Irrtum festgestellt werden, d. h. durch Durchführung von Fermentationen, die mit Paaren, dreifachen oder höheren Kombinationen der ausgewählten Stämme beimpft sind und indem man Menge und Art der erzeugten Tetracycline mit denen vergleicht, die durch die Varianten der Zusammensetzung erzeugt werden, wenn man sie in getrennten Fermentationen anwendet. Da jedoch cosynthetische Varianten nur selten vorliegen, obwohl es viele cosynthetische Typen gibt, und da viele Typen sehr spezifisch in ihrer biologischen Zusammenwirkung nur mit bestimmten anderen cosynthetischen Typen sind, kann diese Annäherung von Versuch und Irrtum mühevoll sein. Es ist deshalb vorzuziehen, ein Glied eines cosynthetischen Paares zu besitzen, von dem man weiß, daß es als solches wirkt, und dieses Glied als Testorganismus bei der Suche nach neuen cosynthetischen Varianten einzusetzen. Auf diesem Wege wird die Anzahl von Kombinationen, die zu untersuchen sind, von einer sehr großen Anzahl für jeden Varianten auf nur einen Versuch für jeden Varianten reduziert. Der Test besteht darin, daß- man eine gemischte Fermentation mit jeder neuen Variante und der einen bekannten cosynthetischen Variante durchführt. Auf diese Weise zeigt sich die Feststellung einer neuen cosynthetischen Variante durch einen signifikanten Anstieg in der Erzeugung von Tetracyclinen in der gemischten Fermentation, wenn man sie mit der Einzelfermentation vergleicht, die mit den Einzelkomponenten durchgeführt werden.
Viele derartige Kulturen, von denen es sich zeigte, daß sie fähig sind, cosynthetisch zu wirken, sowohl miteinander als auch mit anderen Varianten, sind bereits bei verschiedenen Stellen hinterlegt, wie z. B. bei dem Northern Regional Research Laboratory, Peoria, Illinois und bei der American Type Culture Collection, Washington, DC. Insbesondere wurden zwei neue Varianten von S.aureofaciens gefunden, welche charakteristische biochemische und biosynthetische Eigenschaften besitzen und die als Beispiel dienen, daß Stämme von S.aureofaciens brauchbar zur Durchführung der vorliegenden Erfindung sind. Weiterhin wurden viele andere Varianten von S.aureofaciens festgestellt, die erfindungsgemäß verwendet werden können.
Diese Stämme sind Glieder der Art S.aureofaciens, da sie direkte Abkömmlinge des Chlortetracyclin produzierenden, aus Boden isolierten S.aureofaciens A-377 sind, der in der Patentschrift 869 679 beschrieben ist und dessen Kultur beim Northern Regional Research Laboratory, Peoria, Illinois, als NRRL 2209 hinterlegt ist. Die Mutation erzeugenden Mittel und selektiven Agenzien, die zur Erlangung dieser Stämme angewandt wurden, waren Ultraviolettbestrahlung, Nicotin, Behandlungen mit Stickstofflost und Behandlung mit Phagen.
Diese Stämme besitzen die gleichen allgemeinen Charakteristika, wie sie die Stämme besitzen, die die Tetracycline produzieren, und unterscheiden sich in der gleichen allgemeinen Weise, wie die Tetracyclin produzierenden und Chlortetracyclin produzierenden Stämme von S.aureofaciens sich voneinander unterscheiden, was in einer Anzahl wissenschaftlicher Abhandlungen, die veröffentlicht wurden, beschrieben ist.

Die unten aufgeführten Daten dienen zur Erläuterung der Charakteristika zweier dieser neuen Stämme T-219 und E-504 im Vergleich mit dem Originalstamm A-377, der unter der Bezeichnung NRRL 2209 erhältlich ist. Streptomyces-aureofaciens-Stämme T-219 und E-504 wurden unterschieden vom Streptomyces-aureofaciens-Stamm A 377 (NRRL 2209) durch Beobachtung der Wachstumscharakteristika in verschiedenen Nährmedien bei einer Inkubationstemperatur von 26,5° C.

1. Glycerin-Asparagin-Ochsenfleisch-Extrakt-Agar

Glycerin ........................ 10 g

1-Asparagin ..................... 0,5 g

Ochsenfleischextrakt ............. 2 g

KH2P04 . . . . . . . . . . . . _ . . . . . . . . . 0,5 g

Bacto-Agar...................... 15 g

Destilliertes Wasser . . . . . . . . . . . ad 1000 ml

Einregelung mit 50°/jger KOH

auf pH ....................... 7,0

pH-Wert nach Sterilisierung . . . . . . . . 7,2

Streptomyces aureofaciens

Stamm T-219 Stamm E-504 Stamm A-377

Wachstum gut bis reichlich, tiefbraun* gut, dunkelkupferbraun* bis gut

bis dunkelbraun eichbraun

Lufthyphen spärlich bis reichlich, weiß spurenweise, weiß schlecht bis ausreichend, weiß

bis leichtgrau

Sporenbildung spärlich, reichlich werdend keine leichtgrau

beim Wachstum der Ränder;

grau

Diffundierbares leichtgelbgrün, bis tiefbern- leichtbernsteinfarben leichtgelb

Pigment Steinfarben

Rückseite tiefbraun* bis dunkelbraun* dunkelkofferbraun* bis eich- gelb* bis leichtorangegelb

braun

* Color Harmony Manual, Third Edition, Container Corp. of America.

2. Dextrin Szapek-Dox-Agar

Dextrin ........................ log

NaN03 ....................... 2g

K2HPO4 ...................... 1 g

MgS04-7H20 ................ 0,5g

KCL . . . . . . . . .. . .. . .. . . . . . . . . . 0,5 g

Fe S 04 - 7 H20 . . . . . . . . . . . . . . . . . 0,01 g

Bacto-Agar..................... 15 g

Destilliertes Wasser . . . . . . . . . . ad 1000 ml

pH-Wert nach Sterilisierung ....... 7,2

Streptomyces aureofaciens

Stamm T-219 Stamm E-504 Stamm A-377

Wachstum dünn, ganzrandig glasartig zart, glasartig bis durch- gut

weiß schimmernd weiß

Lufthyphen keine spärlich, weiß reichlich, mausgrau* bis blei-

grau* wasserweiße Ober-

flächenkügelchen

Sporenbildung keine keine überreichlich

Diffundierbares kein kein Spuren Maßgelb

Pigment

Unterseite transparent farblos glasartig bis durchscheinend pigmentlos Spur blaßrot*

weiß

* Color Harmony Manual, Third Edition, Container Corp. of America.

3 AP 4 Maisquellwasser-Agar

Maisquellflüssigkeit .. . . . . . . . . . . . . 4 g

Saccharose ..................... log

Mg S 04 - 7 H,0 . . . . . . . . . . . . . . . . 0,25 g

KHZP04 ....................... 2g

(NH4)zHP04 . . . . . . . . . . . . . . . . . . 2 g

Bacto-Agar..................... 20 g

Leitungswasser . . . . . . . . . . . . . . ad 1000 ml

pH-Wert nach Sterilisierung ....... 6,5

Streptomyces aureofaciens

Stamm T-219 Stamm E-504 Stamm A-377

Wachstum reichlich, tiefbraun* bis ausgezeichnet, tiefbraun* bis ausgezeichnet

dunkelbraun* dunkelbraun* -

Lufthyphen spärlich reichlich weiß reichlich rehbraun*

Sporenbildung spärlich, leichtgrau reichlich rehbraun* bis biber- überreichlich rehbraun*

farben*

Lösliches Pigment olivgelb bis tiefbernsteinfarben orange bis braun leichtgelb bis bernsteinfarben

Unterseite tiefbraun* bis dunkelbraun* leichtbraun* bis Schokoladen- leichtgelbbraun*

braun*

* Color Harmony ManuaI, Third Edition, Container Corp. of America.

4. Andere Medien

Streptomyces aureofaciens

Medium Stamm T-219 ( Stamm E-504 Stamm A-377

Nähragar annehmbares Wachstum, bis- dürftig bis annehmbares gutes Wachstum, keine Luft-

quitfarben*, keine Lufthy- Wachstum, keine Lufthy- hyphen, blaßgelbes lösliches

phen,keinlöslichesPigment; phen,kein lösliches Pigment; Pigment; Unterseite blaß-

Unterseite bisquitfarben* . Unterseite beige gelb

Glucose-Aspara- gutes Wachstum, tiefbraun bis gutes Wachstum, kamel- gutes Wachstum, Lufthyphen

gin-Fleisch- schokoladenbraun; reich- farben* bis dunkelmaha- weiß, zunehmend grau wer-

Extrakt-Agar liche bis überreichliche Luft- gonibraun*; Lufthyphen dend mit zunehmender

hyphen, weiß allmählich mäßig bis reichlich, weiß, Sporenbildung; spuren-

leichtrehbraun* werdend; allmählich kätzchenweiden- weise gelboranges lösliches

Sporenbildung: reichlich bis grau bis aschfarben* wer- Pigment; Unterseite leicht-

überreichlich; tiefbraunes dend; Sporenbildung mäßig gelb bis rötlichorange

lösliches Pigment; Rück- bis reichlich, leichtgelbes

Seite tiefbraun* bis schoko- lösliches Pigment; Unter-

ladenbraun seite kamelfarbig bis dun-

kelmahagonibraun

Waksman's Agar reichliches Wachstum, tief- ausgezeichnetes Wachstum, gutes Wachstum, Lufthyphen,

braun* bis Schokoladen- dunkelmahagonibraun; annehmbar und allmählich

braun; überaus reichliche überreichliche Lufthyphen, reichlich weiß bis schwach-

Lufthypen, weiß langsam weiß allmählich biber- bis braun, schwachgelbes lös-

beigebraun werdend; über- schokoladenbraun; über- - liches Pigment; Unterseite

reichliche Sporenbildung; reichliche Sporenbildung, kamelfarben bis ziegelbraun

gelbgrünes bis bernstein- orangebraunes lösliches

farbiges lösliches Pigment; Pigment; Unterseite

Unterseite ziegelbraun bis dunkelmahagonibraun*

schokoladenbraun

Kartoffel- ausgezeichnet, feucht, glatt, überreichlich feuchtes, glattes, überreichliches, feuchtes, glat-

schnitten mit Knötchen versehenes mit Knötchen versehenes tes, mit Knötchen versehe-

Wachstum, das schließlich Wachstum, dunkelmahago- nes Wachstum, leichtbraun-

gefurcht wird; olivfarben; nibraun*; Lufthyphen keine gelb bis beige bis feder-

reichliche weiße Lufthy- bis reichlichweiß, allmählich farbig, kein lösliches Pig-

phen; Sporenbildung keine, rehbraun werdend bei Spo- ment

jedoch beginnend; sattel- renbildung. Rosentopasfar-

braunes lösliches Pigment biges bis dunkelmahagoni-

farbenes lösliches Pigment

* Color Harmony Manual, Third Edition, Container Corp. of America.

4. Andere Medien (Fortsetzung)

Medium Stamm T-219 1 Stamm E-504 Stamm A-377

Purple-Milch schweres, glasartiges Wachs- ausgesprochenes Wachstums- schwachweißes bis blaßgelbes

tumspolster, senfbraun, polster, tief rotbraun bis ma- Wachstumspolster, geringe

leichtbraunes, lösliches Pig- hagonibraun, keine auffäl- signifikante pH-Änderung

ment, leicht alkalische Reak- lige Peptonisierung, keine oder anscheinende Peptoni-

tion, jedoch keine auffäl- pH-Änderung,jedochfalsche sierung innerhalb 14 Tagen

lige Peptonisierung alkalische Farbreaktion

durch Diffusion von lös-

lichem Pigment

AP 6 Maisquell- reichliches Wachstum, braun ausgezeichnetes Wachstum, ausgezeichnetes Wachstum,

flüssigkeit- bis schokoladenbraun; leichtpfefferbraun bis scho- überreichliche Lufthyphen,

Agar** spärliche Lufthyphen, weiß, koladenbraun; reichliche außerordentlich reichliche

allmählich grau im Zentrum Lufthyphen, weiß allmäh- Sporenbildung, rehbraun;

werdend; spärliche Sporen- lich rehbraun bis biberbraun leichtbernsteinfarbiges lös-

bildung, tiefbernsteinfarbe- werdend; reichliche Sporen- liches Pigment; Unterseite

nes lösliches Pigment; Un- Bildung, tieforangebraunes gelbbraun

terseite glasartig, tiefbraun lösliches Pigment; Unter-

bis schokoladenbraun seite leichtpfefferbraun bis

schokoladenbraun

Q 4 Agar*** reichliches Wachstum, tief- ausgezeichnetes Wachstum, ausgezeichnetes Wachstum,

braunbisschokoladenbraun, burgunderfarbig bis eben- blaßgelb; überreichliche

Lufthyphen spärlich, weiß holzbraun; überreichliche Lufthyphen, dunkelbraun;

bis leichtgrau bis leichthell- Lufthyphen, weiß bis rosen- überreichliche Sporenbil-

, braun, dürftige Sporenbil- topasfarbig, allmählich dung, orangebraunes lös-

dung, sehr tief Bernstein- topasbraun werdend; über- liches Pigment; Unterseite

farbenes lösliches Pigment; reichliche Sporenbildung, orange- bis orangegelb

Unterseite tiefbraun bis sehr tief rotoranges lösliches

schokoladenbraun Pigment; Unterseite bur-

gunderfarbig bis ebenholz-

braun

* Color Harmony Manual, Third Edition, Container Corp. of America.

** AP6 Agar

Saccharose . . ............. 10 g

M9S04 - 7H20.. . . . . . . . ... . 0,25 g

KH,P04 . . . . . ....... . . . ... 2 g

(NH4)aP04 . ....... . .. 2 g

Maisquellflüssigkeit . . . . . . . . . . 6 g

Bacto Agar (raffiniert) ....... 20 g

Wasser .................. ad 1000 ml

pH-Wert nach Sterilisierung ... 6,5

*** Q4-Agar

Saccharose . ............. 10 g

Mg S 04 - 7H20 . . . . . . . . . . . . . 0,25 g

KHZP04 .. . . .. . . . . . .. . .. . . . 4 g

(NH4)3P04 . ... . .. . .. . .. . . . . 2 g

Maisquellflüssigkeit . . . . . . . . . . 9 g

Rohagar ................. 30 g

Wasser .................. ad 1000 ml

pH-Wert nach Sterilisierung ... 6,5

5. Mikroskopische Beobachtungen

Streptomyces aureofaciens

Stamm T-219 Stamm E-504 Stamm A-377

Medium

Mycel I Sporen

Mycel Sporen myce1 ` Sporen

Glycerin- biegsam, fort- rund bis oval, biegsam, keine biegsam, kreisförmig

Asparagin- laufend ver- Durchmesser fortlaufend beobachtet fortlaufend bis oval,

Fleisch- zweigt, 0,5 bis 1,0 #t verzweigt, verzweigt, Durchmesser

extraktagar Durchmesser Durchmesser Durchmesser 1,2 bis 1,5 #t

0,5 bis 1,0 #t 0,7 bis 1,0 @. 1,0 bis 1,2 [.

AP 4-Mais- biegsam, fort- ' kreisförmig biegsam, kreisförmig, biegsam, kreisförmig

quellflüssig- laufend, ver- bis oval, fortlaufend oval, fortlaufend bis oval,

keitsagar zweigt, Durchmesser verzweigt, Durchmesser verzweigt, Durchmesser

Durchmesser 0,5 bis 1,0 #t Durchmesser 0,5 bis 1,0 #t Durchmesser 1,1 bis 1,5 #t

0,5 bis 1,0 #t 0,5 bis 1,0 #t 0,8 bis 1,0 &,

Waksman's biegsam, fort- kreisförmig biegsam, kreisförmig biegsam, kreisförmig

Agar laufend bis oval, fortlaufend bis oval, fortlaufend bis oval,

verzweigt, Durchmesser verzweigt, i Durchmesser verzweigt, Durchmesser

Durchmesser i 0,5 bis 1,0 #L Durchmesser 0,5 bis 1,0 #t Durchmesser 0;5 bis 1,0 @;

0,5 bis 1,0 @, 0,5 bis 1,0 #t 0,5 bis 1,0 p.

Die Morphologie von Mycel und Sporen der Streptomycesaureofaciens-Stämme T-219 und E-504 sind offensichtlich ähnlich einander und auch ähnlich dem Originalstamm A-377.

Lebensfähige Kulturen der S.aureofaciens-Stämme E-504 und T-219, welche zu der beschriebenen Cosynthese der Tetracycline in Übereinstimmung mit der vorliegenden Erfindung verwendbar sind, wurden bei der American Type Culture Collection in Washington DC niedergelegt, wo diese Stämme die ATCC-Empfangsnummer 13 191 bzw 13192 erhielten. Weiterhin können die S.aureofaciens-Stämme, die an der American Type Culture Collection unter der ATCC-Empfangsnummer l3189 bzw. 13190 niedergelegt wurden, ebenso für die Cosynthese der Tetracychne entsprechend der vorliegenden Erfindung eingesetzt werden.
Außer den oben aufgeführten Stämmen von S.aureofaciens, die am American Type Culture Collection niedergelegt wurden, zeigte es sich, daß viele andere Stämme von S.aureofaciens und von allen anderen bekannten Tetracyclin produzierenden Arten der Gattung Streptomyces, wie z. B. S.hygroskopicus, S.platensis, S.rimosus und S.viridifaciens, ebenso wie geeignet ausgewählte Mutanten von jedem dieser Stämme zu der hier beschriebenen Cosynthese der Tetracycline eingesetzt werden können.

Viele Stämme der Gattung Streptomyces sind zur fermentativen Cosynthese der Tetracycline fähig, vorausgesetzt, daß sie unter den geeigneten Bedingungen wachsen und daß sie in der richtigen Kombination mit einem oder mehreren der begleitenden Stämme, deren Auswahl vorhergehend beschrieben wurde, gemischt werden. Man läßt die Stämme von Streptomyces, die man von Kultursammelstellen erhält oder die man aus dem Boden isoliert, oder die aus diesen Stämmen durch dem Fachmann geläufige Verfahren abgeleiteten Mutanten unter den Bedingungen wachsen, wie sie normalerweise zur Kultur von Streptomyces zum Zwecke der Erzeugung von Antibiotika oder anderen Produkten angewendet werden. Die Nährmedien enthalten übliche Kohlenstoff- und Stickstoffquellen, wesentliche Mineralien und Wachstumsfaktoren und werden zusammengesetzt mit Inhaltsstoffen, wie Saccharose, Stärke, tierischen oder pflanzlichen Fetten, Maisquellflüssigkeit, Sojabohnenmehl, Baumwollsamenmehl, Hefe und verschiedenen Salzen. Man läßt die Kulturen bei Temperaturen von 20 bis 35° C wachsen unter aeroben Bedingungen, wie man sie normalerweise in Schüttelflaschen erhält, oder sie werden in bewegten Fermentationsgefäßen belüftet. Die Kulturen werden gemischt, in Kombinationen von zwei oder mehreren gleichzeitig, entweder am Anfang der Fermentationszeit oder an einem bestimmten Zeitpunkt während der Fermentation. Die Endfermentationsmaischen sind für Tetracycline durch übliche Verfahren erprobt. Es ergab sich eine Cosynthese von Tetracyclinen in solchen Kombinationen von Stämmen, bei denen sich eine gesteigerte Bildung von einem oder mehreren Tetracyclinen gegenüber den Kontrollversuchen herausstellte, die entweder einzeln fermentiert wurden oder nach Beendigung der Fermentationszeit zusammengemischt wurden. Diese Verfahren sind ausführlicher in den folgenden Beispielen beschrieben. Die folgenden spezifischen Beispiele beschreiben im einzelnen die vorliegende Erfindung.

Beispiel 1

Herstellung der Impfkultur

Das Impfkulturmedium wurde entsprechend folgen-

dem Rezept hergestellt:

Saccharose ...................... 30,0 g

Maisquellflüssigkeit . . . . . . . . . . . . . . 16,5m1

(N H4)2 S04. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 2,0 g

CaCO3 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 7,0 g

Wasser. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . ad 1(l00 ml

8 aliquote ml dieses Mediums wurden in jede einer Reihe von Versuchsröhren von 20 cm gegeben und in einem Autoklav 20 Minuten lang bei einem Druck von 1,5 kg/cm2 sterilisiert. Sporen von S.aureofaciens ATCC 13 191 wurden von einem Agarschnitt mit sterilem destilliertem Wasser heruntergewaschen und bildeten eine Suspension, die annähernd 60 # 106 Sporen je Milliliter enthielt. Jeweils 0,33 ml dieser Suspension wurden zur Beimpfung jeder der Röhren, die 8 ml des Impfkulturmediums, wie es oben aufgeführt wurde, enthielt, verwendet. Das beimpfte Schüttelrohr wurde danach für 24 Stunden bei 28' C auf einer hin- und hergehenden Schüttelmaschine, die mit 116 Bewegungen je Minute arbeitete, inkubiert. In gleicher Weise wurde die Impfkultur von sämtlichen Stämmen, die in den folgenden Beispielen verwendet werden, hergestellt. Beispiel 2 Herstellung des Fermentationsmediums Das Fermentationsmedium wurde entsprechend dem folgenden Rezept hergestellt:

(N H4)2 S04. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 5,0 g

CaCO3 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 9,0 g

NH4C1 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 1,5 g

MgC12 - 6 H20. . . . . . . . . . . . . . . . . . . 2,0 g

FeS04 - 7 H20 . . . . . . . . . . . . . . . . . . 0,04 g

Mn S 04 - 4 H2 O . . . . . . . . . . . . . . . . . . 0,05 g

Co S 04 - 6 H,0 . . . . . . . . . . . . . . . . . . 0 ) 005 g

ZnS04 - 7 H20 . . . . . . . . . . . . . . . . .. 0,1 g

Maisquellflüssigkeit . . . . . . . . . . . . . . 25,0 g

Baumwollsamenmehl . . . . . . . . . . . . . 2,0 g

Maisstärke . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 55,0 g

Wasser....................... ad 1000 ml

Mengen von 25 ml Medium wurden in 250 ml-Erlenmeyer-Kolben gegeben und zu jedem Kolben 0,5 ml Schmalzöl zugesetzt. Die Kolben, die das Fermentationsmedium und das Schmalzöl enthielten, wurden in einem Autoklav für über 20 Minuten bei 1,05 kg/cm2 Druck sterilisiert.

Beispiel 3 Herstellung eines Fermentationsmediums mit minimalem Halogengehalt Ein Fermentationsmedium mit einem minimalen Halogengehalt wurde wie folgt hergestellt:

Harzenthalogenierte Maisquell-

flüssigkeit . . . . . . . . . . . . . . . ...... 30 g/l

CaCO3 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 7 g/1

(NH4)2 S 04 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 5 g/1

Stärke mit niedrigem Chlorgehalt... 55 g/1

Mn S 04 - 4 H,0 . . . . . . . . . . . . . . . . . . 50 mg/1

HJ 04 (85 °/o) . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 200 mg/1

Das Medium wurde mit destilliertem Wasser auf das gewünschte Volumen aufgefüllt. 25 ml des Mediums wurden in 250-ml-Erlenmeyer-Kolben gegeben und dazu zu jeder Flasche 0,5 ml Schmalzöl zugesetzt. Die Kolben wurden mit Baumwolle verstopft und während 15 Minuten bei 120° C im Autoklav erhitzt und danach auf Raumtemperatur abgekühlt.

Beispiel 4 Cosynthese von 7-Chlor-6-desmethyl-tetracyclin in einer gemischten Fermentation der S.aureofaciens-Stämme ATCC 13 191 und ATCC 13 189 Die Impfkulturen von Streptomyces aureofaciens ATCC 13 191 und Streptomyces aureofaciens ATCC 13 189 wurden angesetzt, wie im Beispiel 1 beschrieben. Eine Anzahl 250-ml-Erlenmeyer-Kolben, die jeweils 25 ml Fermentationsmedium enthielten, wurden danach, wie im Beispiel 2 beschrieben, hergestellt. Drei Fermentationskolben wurden mit aliquoten Anteilen von 1,0 ml der Impfkultur von S.aureofaciens ATCC 13 191 beimpft und drei weitere Kolben mit Impfkultur von S.aureofaciens ATCC 13 189. Sämtliche beimpften Fermentationskolben wurden bei 25° C auf einer rotierenden Schüttelmaschine bei 180 Umdrehungen je Minute während eines Zeitraums von 48 Stunden inkubiert, nach welcher Zeit Mischungen von 20 ml Fermentationsmaische, die S.aureofaciens ATCC 13 191 enthielt, und 5 ml Fermentationsmaische, die S.aureofaciens ATCC 13 189 enthielt, hergestellt wurden, wobei einer der drei Kolben, der mit einem speziellen Stamm beimpft war, verwendet wurde. Die übrigen Kolben mit den Einzelstämmen und die Kolben, die die Zweistammischungen enthielten, wurden erneut bei 25° C auf einer rotierenden Schüttelmaschine für eine Zeit von weiteren 72 Stunden inkubiert, so daß die gesamte Inkubationszeit in allen Fällen 120 Stunden betrug. Die nach 120 Stunden geernteten Maischen der Kolben mit dem Einzelstamm und die Maische, die nach 120 Stunden aus den Kolben mit den beiden Stämmen geerntet wurden, wurden auf antibiotische Wirksamkeit mittels einer biologischen Versuchstechnik untersucht (turbidimetrisch, mit Staphylococcus aureus), wobei die folgenden Resultate erhalten wurden:

7-Chlor-

6-desmethyl-

Mikroorganismus tetracyclin laut

biologischem

Versuch

mcg/ml

ATCC 13 191, 120 Stunden alt.... < 0,5

ATCC 13 189, 120 Stunden alt ... < 3

ATCC 13 191 + ATCC 13 189, ge-

mischt nach 48 Stunden, bestimmt

nach 120 Stunden ............. 205

Beispiel 5 Cosynthese von Chlortetracyclin in einer gemischten Fermentation von S.aureofaciens ATCC 13 191 und S.aureofaciens ATCC 13 192 Eine AP 6-Agarschale wurde dünn mit Sporen von S.aureofaciens besät, welche einer Behandlung mit einem Mutationen erzeugenden Mittel, Stickstofflost, unterworfen worden waren. Nach der üblichen Inkubation bei 27° C während 3 Tagen wurde eine nicht übliche Kolonie beobachtet. Diese war gekennzeichnet durch ein unterschiedlich fluoreszierendes gelbgrünes ditFundierbares Pigment und eine Farbe der Kolonie, die mehr senffarben war als diejenige des ursprünglichen Stammes. Diese Kolonie wurde abgetrennt, übertragen auf einen Q 4-Agarschnitt und bei 27° C 2 Wochen lang inkubiert, um Sporen zu erzeugen. Diese Sporen wurden zur Herstellung einer Impfkultur von ATCC 13 192 verwendet, entsprechend den Anweisungen, wie sie im Beispiel 1 gegeben wurden. Diese Impfkultur hinwiederum wurde in üblicher Weise zur Herstellung einer 24-Stunden-Maische zum Test auf Cosynthese angesetzt. Dieser wurde ausgeführt, wie in dem vorhergehenden Beispiel 4 beschrieben, mit der einen Ausnahme, daß an Stelle von S.aureofaciens ATCC 13 189 der Stamm ATCC 13 192 eingesetzt wurde und daß das Verhältnis von ATCC 13 192 zu S.aureofaciens ATCC 13 191 in der Mischung 50: 50 war an Stelle von 80: 20 wie im Beispiel 4. Man erhielt die folgenden Resultate:

Chlortetracyclin-

gehalt

Mikroorganismen (biologischer

Test)

mcg/ml

ATCC 13 191, 120 Stunden alt.... 0

ATCC 13 192, 120 Stunden alt.... 0

ATCC 13 191 -I- ATCC 13 192, ge-

mischt nach 24 Stunden, bestimmt

nach 120 Stunden ............. 110

Beispiel 6 Cosynthese von Chlortetracyclin in einer gemischten Fermentation von S.aureofaciens ATCC 13 192 und S.aureofaciens S-2242 Eine dunkelziegelrote Kolonie, die kein Antibiotikum produzierte, wurde als unüblicher Typ einer Kolonie von einer AP 6-Agarschale, die mit normalem S.aureofaciens-Stamm besät war, ausgelesen. Diese Kolonie wurde auf einen Q 4-Agarschnitt übertragen und bei 27° C 17 Tage lang inkubiert zur Sporenerzeugung. Der erhaltene Stamm, als S-2242 bezeichnet, wurde auf cosynthetische Aktivität mit dem Stamm ATCC 13 192 des vorhergehenden Beispiels 5 getestet, wobei die im Beispiel 5 aufgeführte Technik angewandt wurde. Weiterhin wurden Versuche angestellt mit einer Probe, die aus einer 50: 50-Mischung der 120 Stunden alten Maischen der Einzelfermentationen beider Mikroorganismen bestand. Es ergaben sich folgende Resultate:

Chlortetracyclin-

gehalt

Mikroorganismen (biologischer

Test)

mcg/ml

ATCC 13 192, 120 Stunden alt.... 0

S-2242, 120 Stunden alt . . . . . . . . . . 20

ATCC 13 192 -I- S-2242, gemischt

nach 24 Stunden, getestet nach

120 Stunden .................. 740

ATCC 13 192 -I- S-2242, gemischt

und getestet nach 120 Stunden . . 20

Beispiel 7 Cosynthese von Chlortetracyclin in einer Mischfermentation von S.aureofaciens S-2242 und S.aureofaciens S-2895 Der Stamm S-2895 wurde aus einer mit Stickstofl#'lost behandelten Suspension von S.aureofaciens-Sporen erhalten. Dieses Individuum wurde von einer AP 4-Agarschale, die mit durch Stickstofflost behandelten Sporen von S.aureofaciens beimpft worden war, als eine große flache, leuchtendorangebraune Kolonie ausgelesen. Die Kolonie wurde auf einen Q 4-Agarschnitt übertragen. Nach Inkubation bei 27,5° C während 2 Tagen zeigte sich eine charakteristische gelbgrüneFluoreszenz in diesem Schnitt, und es wurde beobachtet, daß der fluoreszierende Stoff' in den Agar eindiffundiert war. Bei der Fermentation mit den Sporen dieses Individuums ergab sich eine grünlich braune Maische, die eine prächtige Fluoreszenz bei normalem Tageslicht aufwies. Die Maische zeigte keine antibiotische Aktivität. Eine Mischfermentation, wobei der Stamm S-2242 aus Beispiel 6 und S-2895 eine deutliche Cosynthese zeigten und wobei nach dem Verfahren wie im Beispiel 5 gearbeitet wurde, ergab die folgenden Testergebnisse

Chlortetracyclin-

gehalt

Mikroorganismen (biologischer

Test)

mcg/ml

S-2242, 120 Stunden alt.......... 33

S-2895, 120 Stunden alt . . . . . . . . . . 3

S-2242 -#- S-2895, gemischt nach

24 Stunden, getestet nach 120 Stun-

den ......................... 424

Beispiel 8 Cosynthese von Chlortetracyclin in einer Mischfermentation von S.aureofaciens S-2895 und S.aureofaciens ATCC 12750 Impfkulturen von S.aureofaciens S-2895, dessen Herkunft im Beispie17 beschrieben ist, und von S.aureofaciens ATCC 12 750 wurden entsprechend Beispiel 1 angesetzt. Eine Anzahl von 250-ml-Erlenmeyer-Kolben, die jeweils 25 ml Fermentationsmedium enthielten, wurden entsprechend Beispiel 2 hergestellt. Drei dieser Fermentationskolben wurden mit aliquoten Teilen von jeweils 1,0 ml vom Stamm S-2895 beimpft, drei weitere Kolben mit Impfkultur S.aureofaciens ATCC 12 750. Sämtliche beimpften Fermentationskolben wurden bei 25° C auf einer rotierenden Schüttelmaschine, die mit 180 Umdrehungen je Minute arbeitete, während einer Zeitdauer von 24 Stunden inkubiert. Eine 24-Stunden-Kultur von S-2895 wurde dann im Verhältnis 50: 50 mit einer 24-Stunden-Kultur von S.aureofaciens ATCC 12 750 gemischt. Sowohl die übrigen Kolben, die Einzelstämme enthielten, als auch die Kolben, die die Mischungen mit beiden Stämmen enthielten, wurden von neuem bei 25° C auf einer rotierenden Schüttelmaschine für weitere 96 Stunden inkubiert, so daß eine Gesamtinkubationszeit von 120 Stunden in sämtlichen Fällen erfolgte. Die Kolben mit den 120 Stunden alten Maischen der Einzelstämme und die Kolben mit den 120 Stunden alten Maischen von beiden Stämmen wurden untersucht, wobei sich folgende Ergebnisse zeigten:

Chlortetracyclin-

gehalt

Mikroorganismen (biologischer

Test)

mcg/ml

S-2895, 120 Stunden alt . . . . . . . . . . 3

ATCC 12 750, 120 Stunden alt.... 331

S-2895 -f- ATCC 12 750, gemischt

nach 24 Stunden, getestet nach

120 Stunden .................. 3860

Beispiel 9 Cosynthese von Chlortetracyclin in einer Mischfermentation von S.aureofaciens S-2895 und S.aureofaciens E-475 Das Material von einer reifen Maische von S.aureofaciens wurde auf AP 6-Agar nach dem Verfahren der Verdünnungsaufstrichmethode aufgestrichen und bei 27,5° C inkubiert. Eine Kolonie, die größer und blasser in der Farbe erschien als die typischen Kulturen des Ausgangsstamms, wurde ausgelesen, isoliert und auf einen Agarschnitt aufgestrichen. Nach Sporenbildung wurde dieses Individuum E-475 zur Fermentation verwendet. Die entstehende Maische war dunkelrotbraun und enthielt kein Chlortetracyclin. Wenn dieser Stamm jedoch in einer Mischfermentation mit S-2895 eingesetzt wurde, dessen Herkunft im Beispiel ? aufgeführt ist, wurde Chlortetracyclin cosynthetisiert. Es ergab sich ein Anstieg der Antibiotikumaktivität gegenüber Staphylococcus aureus, der 830 mcg Chlortetracyclin je Milliliter der 120 Stunden alten Maische entsprach. Beispiel 10 Cosynthese von Chlortetracyclin in einer Mischfermentation von S.aureofaciens S-2895 und S.viridifaciens ATCC 11989 Eine Mischfermentation von S-2895, dessen Herkunft im Beispiel 7 beschrieben ist, und S.viridifaciens ATCC 11989 wurde entsprechend Beispiel 8 durchgeführt. Weiterhin wurden Versuche mit einer Probe durchgeführt, die zusammengesetzt war aus einer Mischung 50: 50 der 120 Stunden alten Maischen der Einzelfermentationen der beiden Mikroorganismen. Es ergaben sich folgende Ergebnisse:

ChlortetracycIin-

gehalt

Mikroorganismen (fluoro-

metrischer

Test)

mcg/ml

S-2895, 120 Stunden alt . . . . . . . . . . 0

ATCC 11989, 120 Stunden alt .... 180

S-2895 + ATCC 11989, gemischt

nach 24 Stunden, getestet nach

120 Stunden ....... .....: *, 310

S-2895 -E- ATCC 11989, gemischt

und getestet nach 120 Stunden... 80

Beispiel 11 Cosynthese von Chlortetracyclin in einer Mischfermentation von S.aureofaciens S-2895 und S.aureofaciens ATCC 12 551 Nach dem Verfahren von Beispiel 8 wurde eine Mischfermentation von S-2895, dessen Herkunft im Beispiel ? beschrieben ist und S.aureofaciens ATCC 12 551 durchgeführt, wobei sich folgende Ergebnisse zeigten

Chlortetracyclin-

gehalt

Mikroorganismen (fluoro-

metrischer

Test)

mcg/ml

S-2895, 120 Stunden alt ...... . . . . 0

ATCC 12 551, 120 Stunden alt .... 60

S-2895 -f- ATCC 12 551, gemischt

nach 24 Stunden, getestet nach

120 Stunden .................. 375

Beispiel 12 Cosynthese von Chlortetracyclin in einer Mischfermentation von S.aureofaciens S-2895 und S.aureofaciens ATCC 10762 Die Stämme S-2895, dessen Herkunft im Beispiel 8 beschrieben ist, und S.aureofaciens ATCC 10762 wurden zu einer Mischfermentation entsprechend Verfahren nach Beispiel 10 eingesetzt. Man erhielt folgende Testergebnisse:

Chlortetracyclin-

gehalt

Mikroorganismen (biologischer

Test)

mcg/ml

S-2895, 120 Stunden alt . . . . . . . . . . 2

ATCC 10 762, 120 Stunden alt .... 24

S-2895 -f- ATCC 10 762, gemischt

nach 24 Stunden, getestet nach

120 Stunden .................. 181

S-2895 -I- ATCC 10 762, gemischt

und getestet nach 120 Stunden... 8

Beispiel 13 Cosynthese von Chlortetracyclin' in einer Mischfermentation von S.aureofaciens S-2895 und S.aureofaciens V-655 Eine Sporensuspension S.aureofaciens ATCC 12 748 wurde aus AP6-Agar in der Weise aufgebracht, daß die einzelnen Kolonien unterschieden werden konnten. Verschiedene Kolonien, die als typisch für den Stamm betrachtet werden konnten, wurden isoliert. Eine dieser Kolonien zeigte auf einem Q 4-Agarschnitt ein unterschiedliches Aussehen von dem Normaltyp. Sie wuchs sehr dunkel, nahezu schwarz. Entsprechend Beispiel 1 wurde eine Impfkultur hergestellt. Bei der Fermentation in dem im Beispiel 2 beschriebenen Medium ergab sich eine dunkelgrüngefärbte Maische, die kein Chlortetracyclin enthielt und auch keine andere antibiotische Aktivität aufwies. Als jedoch dieses Individuum V-655 in einer Mischfermentation mit S-2895 entsprechend dem Verfahren nach Beispiel 8 angesetzt wurde, ergaben sich folgende Resultate:

Chlortetracyclin-

gehalt

Mikroorganismen (biologischer

Test)

mcg/ml

S-2895, 120 Stunden alt . . . . . . . . . . <2

V-655, 120 Stunden alt . . . . . . . . . . <2

S-2895 + V-655, gemischt nach

24 Stunden, getestet nach 120 Stun-

den ......................... 1160

Beispiel 14 Cosynthese von Chlortetracyclin in einer Mischkultur von S.aureofaciens ATCC 13 189 und S.aureofaciens ATCC 12 749 Eine Mischfermentation von S.aureofaciens ATCC 13 189 und S.aureofaciens ATCC 12 749 wurde nach dem Verfahren von Beispiel 10 durchgeführt. Die nach 120 Stunden geernteten Maischen wurden auf antibiotische Aktivität getestet, wobei sich folgende Resultate ergaben:

Chlortetracyclin-

gehalt

Stamm Nr. (biologischer

Test)

mcg/ml

ATCC 13 189, 120 Stunden alt .... 3

ATCC 12 749, 120 Stunden alt .... 279

ATCC 13 189 + ATCC 12 749, ge-

mischt nach 48 Stunden, getestet

nach 120 Stunden ............. 4770

ATCC 13 189 '-, ATCC 12 749, ge-

mischt und getestet nach 120 Stun-

den ......................... 121

Beispiel 15 Cosynthese von Chlortetracyclin in einer Mischfermentation von S.aureofaciens ATCC 12 749 und S.aureofaciens ATCC 13 190 Eine Mischfermentation von S.aureofaciens ATCC 12 749 und S.aureofaciens ATCC 13 190 wurde entsprechend der Technik, wie sie im Beispiel 8 beschrieben ist, durchgeführt, mit den Ausnahmen, daß die Mischung nach 48 Stunden vorgenommen wurde an Stelle von 24 Stunden und daß das Verhältnis der Mischung 92 °/a S.aureofaciens ATCC 12 749 und 8 °/ö S.aureofaciens ATCC 13190 betrug an Stelle des Mischungsverhältnisses 50:50. Beim Test der 120 Stunden alten Maischen ergaben sich folgende Ergebnisse:

Chlortetracyclin-

gehslt.

Mikroorganismen (fluoro-

metrischer

Test)

mcg/ml

ATCC 12 749, 120 Stunden alt .... 160

ATCC 13 190, 120 Stunden alt .... 15

ATCC 12 749 -I- ATCC 13 190, ge-

mischt nach 24 Stunden, getestet

nach 120 Stunden ............. 4200-

Beispiel 16 Auswirkung des Mischens cosynthetischer Stämme von verschiedenem Alter Impfkulturen von Streptomyces aureofaciens ATCC 12 748 und S.aureofaciens ATCC 13 190 wurden entsprechend Beispiel l angesetzt. Das Fermentationsmedium wurde entsprechend Beispiel 2 hergestellt. Eine Anzahl von 250-ml-Erlenmeyer-Kolben, die jeweils 25 ml dieses Fermentationsmediums enthielten, wurden sterilisiert und gekühlt. Die Hälfte dieser Kolben wurde mit aliquoten Teilen von jeweils 1,0 ml Impfkultur von S.aureofaciens ATCC 12 748 und die übrigen mit aliquoten Teilen von 1,0 ml S.aureofaciens ATCC 13 190 beimpft. Eine Mischung von 50: 50, die aus 12,5 ml Fermentationsmedium mit S.aureofaciens ATCC 12 748 und 12,5 ml Fermentationsmedium mit S.aureofaciens ATCC 13190 bestand, wurde ebenfalls hergestellt. Sämtliche Flaschen mit beimpften Fermentationsmedium wurden anschließend bei 25° C inkubiert auf einer rotierenden Schüttelmaschine, die mit 180 Umdrehungen je Minute arbeitete. In Zwischenräumen von 24, 48, 72 und 96 Stunden wurden weitere 50: 50-Mischungen beider Stämme hergestellt, indem 12,5 ml Fermentationsmaische von S.aureofaciens ATCC 12 748, die zum Zeitpunkt 24, 48, 72 oder 96 Stunden entnommen wurden, mit jeweils 12,5 ml von S.aureofaciens ATCC 13 190, die im gleichen Alterszustand entnommen wurden, vereinigt wurden. Die Gesamtinkubationszeit war in beiden Fällen, sowohl bei den Kolben, die Einzelstämme, als auch bei den Kolben, die 2-Stamm-Mischungen enthielten, unter den oben aufgeführten Bedingungen 120 Stunden. Bei den 2-Stamm-Mischungen war die Inkubationszeit von 120 Stunden die Summe der Fermentationszeit der Einzelstämme vor der Mischung (24, 48, 72 und 96 Stunden) und der Fermentationszeit mit beiden Stämmen nach der Mischung (96, 72, 48 und 24 Stunden), die nach 120 Stunden geernteten Maischen wurden darauf auf ihren Chlortetracyclingehalt durch den fluorometrischen Test untersucht. DieTestresultate waren folgende

Chlortetracyclin-

gehalt

Mikroorganismen (fluorometrischer

Test bei einem Alter

von 120 Stunden)

mcg/nA

ATCC 12 748 . . . . . . . . . . . . . 110

ATCC 13190 ............. 10

ATCC 12 748 + ATCC 13190

gemischt nach

0 Stunden ............ 1390

24 Stunden ............ 700

48 Stunden ............ 1470

72 Stunden ............ 1100

96 Stunden ............ 280

Beispiel 17 Auswirkung des unterschiedlichen Prozentgehalts von Mischungen cosynthetischer Stämme Impfkulturen von Streptomyces aureofaciens ATCC 12 748 und S.aureofaciens ATCC 13 190 wurden angesetzt, wie im Beispiel 1 beschrieben. Das Fermentationsmedium wurde hergestellt wie im Beispiel 2. Eine Anzahl 250-ml-Erlenmeyer-Kolben mit jeweils 25 ml Fermentationsmedium wurden sterilisiert und gekühlt. Die Hälfte dieser Flaschen wurde mit aliquoten Teilen von jeweils 1,0 ml S.aureofaciens ATCC 12 748-Impfkultur und die übrigen mit aliquoten Mengen von jeweils 1,0 ml Impfkultur S.aureofaciens ATCC 13 190 beimpft. Sämtliche Kolben mit beimpften Medium wurden danach 48 Stunden lang bei 25° C auf einer rotierenden Schüttelmaschine, die mit 180 Umdrehungen je Minute lief, inkubiert. Nach Beendigung der Inkubationszeit von 48 Stunden wurden verschiedene Mengen der Fermentationsmaische von S.aureofaciens ATCC 12 748 und S.aureofaciens ATCC 13 190 in der Weise vereinigt, daß sich ein Gesamtvolumen von jeweils 25 ml ergab, so daß die Mischungen der beiden Stämme verschiedene relative Verhältnisse der beiden Fermentationsmaischen enthielten. Sämtliche Kolben, sowohl die mit Einzelstämmen als auch die mit 2-Stamm-Mischungen, wurden erneut bei 25° C auf einer rotierenden Schüttelmaschine für weitere 72 Stunden inkubiert, so daß die gesamte Inkubationszeit in allen Fällen 120 Stunden betrug. Die nach 120 Stunden geernteten Maischen wurden anschließend auf ihren Chlortetracyclingehalt mittels fluorometrischem und biologischem Test (turbidimetrisch mit S.aureus) untersucht. Die Ultraviolettabsorptionsspektren der verschiedenen 2-Stamm-Mischfermentationsmaischen zeigten Gipfel bei 368 m#L, was Chlortetracyclin entspricht. Die Ergebnisse waren die folgenden:

Chlortetracyclin-
gehalt (fluoro-
metrischer
Test beim Alter
von 120Stunden)
mcg/ml
S.aureofaciens ATCC 12 748 allein 110
S.aureofaciens ATCC 13 190 allein 10
Kombination (gewachsen als cosyn-
thetisierendes Paar)
S.aureofaciens S.aureofaciens
ATCC 12748 ATCC 13190
100 0 110
96 4 2450
92 8 2280
84 16 2960
68 32 2180
60 40 2140
40 60 820
32 68 330
16 84 100
8 92 100
4 96 20
0 100 10

Beispiel 18 Cosynthese von Chlortetracyclin in einer Mischfermentation von S.aureofaciens ATCC 12749 und S.aureofaciens V-655 Eine Mischfermentation wurde nach dem Verfahren von Beispiel 8 durchgeführt, wobei S.aureofaciens ATCC 12 749 mit dem Individuum V-655, dessen Herkunft im Beispiel 13 beschrieben ist, kombiniert wurde. Es ergaben sich folgende Ergebnisse:

Chlortetracyclin-

gehalt

Mikroorganismen (biologischer

Test)

mcg/ml

ATCC 12 749, 120 Stunden alt .... 463

V-655, 120 Stunden alt . . . . . . . . . . <2

ATCC 12 749 -f- V-655, gemischt

nach 24 Stunden, getestet nach

120 Stunden .................. 1810

Beispiel 19 Cosynthese von Chlortetracyclin in einer Mischfermentation von S.aureofaciens V-655 und S.aureofaciens S-2242 Die Herkunft von V-655 ist im Beispiel 13 beschrieben. S-2242 wurde nach dem Verfahren von Beispiel 6 erhalten. Die Mischfermentation mit diesen beiden Individuen wurde durchgeführt unter Anwendung der Technik, wie sie im Beispiel 8 beschrieben ist. Es ergaben sich folgende Resultate:

ChIortetracyclin-

gehalt

Mikroorganismen (biologischer

Test)

mcg/ml

V-655, 120 Stunden alt . . . . . . . . . . <2

S-2242, 120 Stunden alt . . . . . . . . . . <2

V-655 -f- S-2242, gemischt nach

24Stunden, getestet nach 120 Stun-

den ......................... 124

Beispiel 20 Cosynthese von Chlortetracyclin in einer Mischfermentation von S.aureofaciens V-655 und S.aureofaciens ATCC 13 192 Entsprechend dem Verfahren von Beispiel 8 wurde die Cosynthese von Chlortetracyclin durch Mischfermentation durchgeführt von V-655, dessen Herkunft im Beispiel 13 beschrieben ist, und S.aureofaciens ATCC 13 192. Die Ergebnisse sind folgende:

Chlortetracyclin-

gehalt

Mikroorganismen (biologischer

Test)

mcg/ml

V-655, 120 Stunden alt . . . . . . . . . . <2

ATCC 13 192, 120 Stunden alt .... <2

V-655 -f-- ATCC 13 192, gemischt

nach 24 Stunden, getestet nach

120 Stunden .................. 416

Beispiel 21 Cosynthese von Tetracyclin in einer Mischfermentation von S.aureofaciens ATCC 13 192 und S.hygroscopicus (A-9538-1) Eine Mischfermentation von S.aureofaciens ATCC 13 192 und S.hygroscopicus wurde entsprechend dem Verfahren nach Beispiel 10 durchgeführt. Es ergaben sich folgende Resultate:

Mikroorganismen Test mcg/ml

ATCC 13 192, 120 Stunden alt 0

S.hygroscopicus (A-9538-1),

120 Stunden alt . . . . . . . . . . 640

(Oxytetracyclin)

ATCC 13192 -f- S.hygroscopi-

cus, gemischt nach 24 Stun-

den, getestet nach 120 Stun-

den .................... 530

(Oxytetracyclin)

-i-- 250

. (Tetracyclin)

ATCC 13192 -f- S.hygroscopi-

cus, gemischt und getestet

nach 120 Stunden ........ 350

(Oxytetracyclin)

Beispiel 22 Cosynthese von Chlortetracyclin in einer Mischfermentation von S.aureofaciens ATCC 12 749 und S.aureofaciens V-15 Dieses Individuum S.aureofaciens V-15 wurde von einer AP4-Agarschale als orangebraune Kolonie ausgelesen, wie sie typisch für ihren S.aureofaciens-Ausgangsstamm, der sich wiederum von einem Chlortetracyclin erzeugenden, mit Mutationen hervorrufenden Mitteln behandelten Stamm ableitet, sind. Dieses Individuum erzeugte eine rote Maische und ergab keine antibiotische Aktivität. Bei einer Mischfermentation von V-15 mit S.aureofaciens ATCC 12 749 entsprechend dem Verfahren nach Beispiel 8, ausgenommen, daß die Mischung nach 48 Stunden an Stelle von 24 Stunden hergestellt wurde, ergaben sich folgende Resultate:

Chlortetracyclin

Mikroorganismen fluorometrischer biologischer

Test Test

mcg/ml mcg/ml

ATCC 12 749,

120 Stunden alt . . 170 182

V-15, 120 Stunden

alt ....... « ..... 20 <2

ATCC 12749 + V-15,

gemischt nach

48 Stundengetestet,

nach 120 Stunden 2250 2738

Beispiel 23 Cosynthese von 7-Chlor-6-desmethyltetracyclin in einer Mischfermentation von V-15 und S.aureofaciens ATCC 13 191 Wie im Beispiel 22 ausgeführt, ergibt das Individuum V-15 eine rote Maische, die nur eine sehr geringe antibiotische Aktivität besitzt. Falls S.aureofaciens ATCC 13 191 in dem Fermentationsmedium nach Beispiel 2 -wächst, erzeugt er kein Tetracyclinantibiotikum und ergibt keine antibakterielle Aktivität (turbidimetrischer Test mit S.aureus). Bei einer Mischfermentation mit V-15 und S.aureofaciens ATCC 13 191 (3 ml V-15, 48 Stunden alte Maische zugefügt zu 25 ml 48 Stunden alter Maische von S.aureofaciens ATCC 13 191, geerntet nach 120 Stunden) enthielt die resultierende Maische etwa 200 mcg/ml 7-Chlor-6-desmethyltetracyclin.

Beispiel 24 Cosynthese von 6-Desmethyltetracyclin in einer Mischfermentation von S.aureofaciens ATCC 13 191 und S.aureofaciens A-8291 Eine Bodenprobe wurde mit sterilem destilliertem Wasser ausgelaugt. Dieses Auslaugewasser wurde anschließend mit einem großen Volumen sterilen destillierten Wassers verdünnt und aliquote Mengen dieser verdünnten Lösung auf AP 6-Nähragar gebracht. Die erhaltenen Kolonien zeigen einen charakteristischen kräftigen und erdigen Geruch. Eine Kolonie, die blaßgrüngelb und durchschimmernd war und einen farblosen Rand aufwies, wurde ausgelesen und erwies sich nach taxonomischer Untersuchung als S.aureofaciens. Die Kultur wurde in üblicher Weise entwickelt; die Fermentationsmaische zeigte eine dunkelgrüne Farbe. Diese Kultur erhielt die Bezeichnung A-8291. Impfkulturen von S.aureofaciens ATCC 13 191 und A-8291 wurden, wie im Beispiel l beschrieben, angesetzt. Es wurde eine Anzahl Kolben, die das Fermentationsmedium nach Beispiel 2 enthielten, angesetzt. Die eine Hälfte dieser Flaschen wurde mit S.aureofaciens ATCC 13 191 und die andere Hälfte mit A-8291 beimpft. Sämtliche Flaschen wurden 30 Tage lang bei 25' C inkubiert. Nach dieser Zeit wurden gleiche Volumina der beiden Einzelfermentationen vereinigt und 10 Teile je Million 2,5-Dimercapto-1,3,4-thiadiazol (DMTD) zu der Mischung zugesetzt. Die Fermentation wurde 120 Stunden lang fortgesetzt. Gleichzeitig wurden 10 Teile je Million DMTD zu den Einzelfermentationen zugesetzt, welche ebenfalls 120 weitere Stunden fortgesetzt wurden. Nach der Ernte ergaben sich foleende Ereebnisse:

6-Desmethyl-

tetracyclin-

Mikroorganismen Behalt (biolo-

gischer Test)

mcg/ml

ATCC 13 191J20 Stunden alt ... .. <5

A-8291, 120 Stunden alt . . . .. . . . . <5

ATCC 13 191 -1- A-8291, gemischt , - _

nach 30 Stunden, getestet nach

120 Stunden .................. = 100

Beispiel 25 -Cosynthese von Bromtetracyclin in einer Mischfermentation von S.aureofaciens-A-8291 und S.aureofaciens ATCC 12751 Ein Medium mit niedrigem Halogengehalt wurde hergestellt wie im Beispiel 3 und dazu 200 mg/1 Kaliumbromid (chloridfrei) zugefügt. Einzelkolben mit diesem Medium wurden mit A-8291, dessen Herkunft im Beispiel 24 beschrieben ist, beimpft und mit S.aureofaciens ATCC 12751. Nach 24 Stunden wurden gleiche Volumina gemischt und die Fermentation der einzelnen und der gemischten Proben für weitere 96 Stunden fortgesetzt. Es ergaben sich folgende Resultate:

Bromtetra-

cyclingehalt

Mikroorganismen (fluoro-

metrischer Test)

mcg/ml

A-8291, 120 Stunden alt . . . . . . . . . < 25

ATCC 12751, 120 Stunden alt .... < 5

A-8291 + ATCC 12751, gemischt

nach 24 Stunden, getestet nach

120 Stunden ............ » ....... 550

Beispiel 26 Cosynthese von Oxytetracyclin in einer Mischfermentation von S.aureofaciens ATCC 13192 und S.rimosus ATCC 10 970, Mutante O-1066 Eine Stammsporensuspension von S.rimosus ATCC 10 970 wurde der Mutierung hervorrufenden Wirkung von Röntgenstrahlen ausgesetzt, worauf die behandelten Sporen zur Beimpfung einer AP6-Nähragar-Schale verwendet wurden. Eine ungewöhnlich pigmentierte Kolonie wurde ausgelesen und erhielt die Bezeichnung O-1066. Sie wurde verwendet zur Erzeugung von Stammsporen in üblicher Weise. Es zeigte sich, daß, nachdem eine 24 Stunden alte Schüttelflaschenkultur dieses Individuums mit einem entsprechenden Präparat von ATCC 13192 gemischt wurde, die reife Maische, nachdem die erhaltene Mischfermentation weitere 96 Stunden fermentiert worden war, Cosynthese von Oxytetracyclin ergab. Die Ergebnisse sind die folgenden:

Oxytetracyclin-

Mikroorganismen Behalt (biolo-

gischer Test)

mcg/ml

ATCC 13192, 120 Stunden alt .... < 10

O-1066, 120 Stunden alt . . . . . . . . . < 2

ATCC 13192 -f- O-1066, gemischt

nach 24 Stunden, getestet nach

120 Stunden .................... 187

Beispiel 27 Cosynthese von Tetracyclin in einer Mischfermentation von S.aureofaciens ATCC 13192 und S.aureofaciens E-1018 Ein typisches Individuum von E-475 nach Beispiel 9 wurde Stickstofflost ausgesetzt. Mit der behandelten Sporensuspension wurden AP 6-Agar-Schalen beimpft. Nach der Beimpfung wurde eine dunkelglänzende Kolonie, Individuum E-1018, welches sich im Aussehen von den übrigen Kolonien der Schale unter.. schied, auf einen Q4-Sporenbildungsägar übertragen und dem Wachstum überlassen, bis sich Sporen gebildet hatten. Bei der Fermentation in dem Medium nach Beispiel 2 ergab - sich eine dunkelrotbraune Maische, welche kein Chlortetracyclin enthielt, welche sich von derjenigen von E-475 durch das Papierchromatogramm und durch ihre spektrophotometrischen Daten unterschied. Eine Mischfermentation von ATCC 13192, deren Herkunft im Beispiel 5 beschrieben ist, und E-1018 wurde nach Beispiel 8 hergestellt und ergab Cosynthese von Tetracyclin. Es ergaben sich folgende Resultate:

Tetracyclin-

Behalt (spektro-

Mikroorganismen photometrischer

Test)

mcg!ml

ATCC 13192, 120 Stunden alt .... 0

E-1018, 120 Stunden alt ......... 0

ATCC 13192 -I- E-1018, gemischt

nach 48 Stunden, getestet nach -

120 Stunden ......... . .......... 425

Beispiel 28 Cosynthese von 7-Chlor-6-desmethyltetracyclin in einer Mischfermentation von S.aureofaciens E-1018 und S.auredfaciens V-15 Zu einem Verfahren der Mischfermentation nach Beispiel 8 wurde E-1018, dessen Herkunft im Beispiel 27 beschrieben ist, in Kombination mit S.aureofaciens V-15, dessen Herkunft im Beispiel 22 beschrieben ist, verwendet. Es ergaben sich folgende Resultate:

7-Chlor-6-des-

methyltetra-

Mikreorganismen cyclingehalt

(spektrophoto-

metrischer Test)

mcg/ml

E-1018, 120 Stunden alt . . . . . . . . . < 10

V-15, 120 Stunden alt . . . . . . . . . < 5

E-1018 + V-15, gemischt nach

24 Stunden, getestet nach 120 Stun-

den ........................... 45

Beispiel 29 Cosynthese von Chlortetracyclin in einer Mischfermentation von S.aureofaciens V-15 und S.aureofaciens ATCC 12751 Das Individuum V-15 wurde entsprechend Beispiel 22 erhalten. Eine Mischfermentation dieses Individuums mit S.aureofaciens ATCC 12751 nach dem Verfahren von Beispiel 8 ergab folgende Resultate

Chlortetra-

cyclingehalt

Mikroorganismen (flüoro-

metrischer Test)

mcg/ml

V-15, 120 Stunden alt . . . . . . . . . . . 20

ATCC 12751, 120 Stunden alt .... 190

V-15 + ATCC 12751, gemischt

nach 24 Stunden, getestet nach

120 Stunden .................... 2700

Beispiel 30 Cosynthese von Chlortetracyclin in einer Mischfermentation von S.aureofaciens ATCC 12751 und S.albus Eine Mischfermentation, die entsprechend Beispiel 8 hergestellt wurde und wobei S.aureofaciens ATCC 12751 und Streptomyces albus verwendet wurden, zeigte die folgenden Ergebnisse:

Chlortetra-

cyclingehalt

Mikroorganismen (biologischer

Test)

mcg; ml

ATCC 12751, 120 Stunden alt . . . . 279

S.albus, 120 Stunden alt . . . . . . . . . 0

ATCC 12751 + S.albus, gemischt

nach 24 Stunden, getestet nach

120 Stunden .................... 1390

Beispiel 31 Cosynthese von Chlortetracyclin in einer Mischfermentation von S.aureofaciens ATCC 12751 und S.platensis NRRL 2364. - _ Unter Verwendung- der Verfahren nach Beispiel 10 wurde eine Mischfermentation von S.aureofaciens ATCC 12751 mit S.platensis NRRL 2364 angesetzt, wobei sich folgende Resultate ergaben:

Chlortetra-

cyclingehalt

Mikroorganismen (biologischer

- Test)

mcgiml -

ATCC 12751, 120 Stunden alt .... 279

NRRL 2364, 120 Stunden alt ..... < 2

ATCC 12751 -i- NRRL 2364,. ge-

mischt nach 24 Stunden, getestet

nach 120 Stunden ........:.... 234 - _

ATCC 12751 + NRRL 2364,

gemischt und getestet nach 120 Stun-

den .. ....... ............. 141e

Beispiel 32 Cosynthese von Chlortetracyclin in einer Mischfermentation von S.aureofaciens O-1830 und S.aureofaciens ATCC 13192 Eine Stammsporensuspension von S.aureofaciens NRRL 2209 wurde zur Erzeugung von Mutationen ultravioletter Strahlung ausgesetzt und danach zur schwachen Beimpfung einer AP 6-Nähragar-Schale verwendet. Nach der Inkubation entwickelte sich eine große Vielzahl verschiedener Kolönientypen, insgesamt 109 Kolonien. Jede dieser Kolonien wurde auf einen Agarschnitt übertragen, um Sporen zu erzeugen, welche wiederum zur Beimpfung von Fermentationsmedien in Schüttelkolben verwendet wurden. Nach einer Inkubationszeit von 24 Stunden wurden die Maischen, deren jede einer Originalkolonie entsprach, einzeln. gemischt mit gleichen Teilen einer 24 Stunden alten Maische von S.aureofaciens ATCC 13192. Nach einer weiteren Inkubationszeit von 96 Stunden wurde jede Mischfermentation mit den 120 Stunden alten Reinkulturfermentationen der einzelnen Bestandteile-verglichen. 87 der Individuen von den ursprünglich 109 Kolonien waren noch mäßig gute Erzeuger von Chlortetracyclin in Reinkultur und wurden verworfen. Von den verbleibenden 22 Individuen zeigten 20, die dunkleren, helleren, größeren, kleineren und verschieden gefärbten Originalkolonien entsprachen, keine Cosynthese mit S.aureofaciens ATCC 13192. Eines der beiden verbleibenden Individuen, das die Bezeichnung O-1830 erhielt, zeigte die folgenden Testwerte:

Chlortetra-

cyclingehalt

Mikroorganismen (fluoro-

metrischer Test)

mcg/ml

ATCC 13192, 120 Stunden alt .... < 2

0-1830, 120 Stunden alt . . . . . . . . . < 2

ATCC 12193 -I- O-1830, gemischt

nach 24 Stunden, getestet nach

120 Stunden .................... 1050

Beispiel 33 Cosynthese von Oxytetracyclin in einer Mischfermentation von S.aureofaciens ATCC 13192 und S.rimosus AB-115 Ein Streptomyces-Stamm, der die Bezeichnung AB-115 erhielt, wurde von einer Bodenprobe isoliert durch eine Behandlung, wie sie im Beispiel 24 beschrieben ist, und als ein Stamm von S.rimosus identifiziert. Eine Mischfermentation von ATCC 13192 und S.rimosus AB-115 wurde nach dem Verfahren von Beispiel 6 durchgeführt und ergab eine synergistische Cosynthese von Oxytetracyclin. Die Ergebnisse waren die folgenden:

Mikroorganismen Oxytetracyclin

mcg/ml

ATCC 13192, 120 Stunden alt . . . < 9

S.rimosus AB-115, 120 Stunden alt 2250

ATCC 13192 -f- S.rimosus AB-115,

gemischt nach 24 Stunden, getestet

nach 120 Stunden ............... 3080

ATCC 13192 -f- S.rimosus AB-115,

gemischt und getestet nach 120 Stun-

den ........................... 1180

Beispiel 34 Cosynthese von Oxytetracyclin in einer Mischfermentation von S.rimosus und S.aureofaciens E-475 Eine Mischfermentation von S.rimosus AB-115 und S.aureofaciens E-475 wurde entsprechend Beispiel 6 durchgeführt. Die Ergebnisse der Analyse sind folgende: "

Mikroorganismen Test

mcg/ml

AB-115 . . . . . . . . . . . . . . . 1800 (Oxytetracyclin)

E-475 ................ 1780 (7-Chlor-6-des-

methyltetracyclin)

AB-115 -f- E-475, ge-

mischt nach 24 Stunden,

getestet nach 120 Stunden 3200 (Oxytetracyclin)

100 (7-Chlor-6-des-

methyltetracyclin)

AB-115 + E-475, ge-

mischt und getestet nach

120 Stunden . . . . . . . . . . . 900 (Oxytetracyclin)

850 (7-Chlor-6-des-

methyltetracyclin)

Claims

PATENTANSPRÜCHE; 1. Verfahren zur synergistischen fermentativen cosynthetischen Erzeugung eines Antibiotikums der Tetracyclinreihe, dadurch gekennzeichnet, daß man mindestens zwei Mikroorganismenstämme der Gattung Streptomyces in einem wässerigen Nährmedium, das assimilierbare Kohlehydrat-und Stickstoffquellen und anorganische Salze enthält, unter aeroben Submersbedingungen kultiviert, wobei man die Mikroorganismenstämme und Fermentationsbedingungen so wählt, daß diese das gewünschte Antibiotikum der Tetracyclinreihe synergistisch in einer größeren Menge erzeugen, als es jeder der Stämme für sich allein erzeugt.
2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß die verwendeten Mikroorganismen, falls mit ihnen Einzelfermentationen durchgeführt werden, das gewünschte Antibiotikum der Tetracychnreihe nicht oder nicht in wesentlichen Mengen produzieren.
3. Verfahren nach Anspruch 1 und 2, dadurch gekennzeichnet, daß einer der Mikroorganismen von einer Art ist, welche normalerweise ein Antibiotikum der Tetracyclinreihe erzeugt.
4. Verfahren nach Anspruch 1 bis 3, dadurch gekennzeichnet, daß jeder der Mikroorganismen getrennt in einem wässerigen Nährmedium zum Beginn des Fermentationsverfahrens kultiviert wird.