DE1117261B - Verfahren zur Herstellung von Tetracyclinen auf biologischem Wege - Google Patents
Verfahren zur Herstellung von Tetracyclinen auf biologischem WegeInfo
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Description
- Verfahren zur Herstellung von Tetracyclinen auf biologischem Wege Die Erfindung betrifft die Herstellung von Tetracyclinen durch Fermentation, und insbesondere befaßt sie sich mit einem neuen Verfahren zur cosynthetischen Herstellung eines Antibiotikums der Tetracyclinreihen, z. B. Tetracyclin, Chlortetracyclin, Bromtetracyclin, Oxytetracyclin, 6-Desmethyltetracyclin, 7-Chlor-6-desmethyltetracyclin u. dgl. durch eine gemischte Fermentation, wobei zwei oder mehr Mikroorganismen der Gattung Streptomyces zum Einsatz kommen.
- Selbstverständlich ist bekannt, die Tetracyclinantibiotika durch Fermentationen mit einem einzigen reinen Stamm herzustellen. Tatsächlich ist dies der übliche Weg zur Herstellung dieser Antibiotika. Die Herstellung von Chlortetracyclin durch S.aureofaciens ist z. B. in der deutschen Patentschrift 869 679 beschrieben. Die USA.-Patentschrift 2 516 080 beschreibt die Herstellung von Oxytetracyclin durch S.rimosus. Die deutsche Auslegeschrift 1026 481 befaßt sich mit der Herstellung von Tetracyclin durch S.aureofaciens, und die deutsche Patentschrift 1041213 beschreibt die Herstellung von 6-Desmethyltetracyclin und 7-Chlor-6-desmethyltetracyclin durch S.aureofaciens. Fermentationen mit reinen Einzelstämmen wurden bisher allgemein zur Herstellung dieser Antibiotika angewandt, obgleich die Aufrechterhaltung dieser Reinstämme nur mit großen Mühen erreicht wird.
- Erfindungsgemäß wurde gefunden, daß es möglich ist, wirtschaftlich bedeutende Mengen an Tetracyclinantibiotika durch eine synergistische Fermentation mit zwei oder mehr Mikroorganismen, des Stammes Streptornyces zu erzeugen.
- Es ist ein überraschendes Kennzeichen der vorliegenden Erfindung, daß es möglich ist, eine Mischung von zwei oder mehr ausgewählten Stämmen von Mikroorganismen der Art Streptomyces einzusetzen und in vielen Fällen eine erstaunliche Steigerung oder einen synergistischen Effekt bei der Herstellung der Tetracycline zu erreichen, selbst wenn solche Stämme, wenn mit ihnen einzeln fermentiert wird, keine oder nur relativ geringe Mengen der Tetracyclinantibiotika erzeugen. Diese Erscheinung wird weiterhin als fermentative Cosynthese bezeichnet. Ebenso überraschend ist die Tatsache, daß beide Glieder des cosynthetisierenden Paars der Mikroorganismen nicht von der gleichen Art sein müssen, und in der Tat muß nur ein Glied des Paars von einer der normalerweise Tetracyclin produzierenden Arten der Gattung Streptomyces sein, ohne daß es jedoch erforderlich ist, daß sie selbst das Antibiotikum bei Einzelkultur erzeugt. Der wirksame Stamm kann selbst auf Grund etwaiger Stoffwechselblockierung unfähig zur Herstellung eines Tetracyclinantibiotikums in wesentlichen Mengen sein. Einige Stämme von S.aureofaciens zeigen cosynthetische Herstellung von Tetracyclin mit Stämmen der Arten S.albo-niger, S.albus, S.griseus u. dgl. In ähnlicher Weise kann eine cosynthetische Wirksamkeit unter Verwendung der Oxytetracyclinerzeugenden Art S.rimosus zusammen mit einer nicht Tetracyclin erzeugenden Art, wie z. B. S.lavendulae_ oder S.griseus, erreicht werden.
- Der genaue Vorgang, nach welchem die Stämme synergistisch ineinander eingreifen, ist nicht gänzlich geklärt. Es ist möglich, daß es bei jedem Paar der Stämme einen »Donator-« und einen »Akzeptor« Stamm gibt. Der Akzeptorstamm bestimmt, welches Tetracyclinantibiotikum in der Produktion gesteigert wird, und der Donatorstamm unterstützt diese Produktion. Die Wirkung eines speziellen Stammes kann in Abhängigkeit davon, mit welchem anderen Stamm er zusammen verwendet wird, variieren. Mit anderen Worten, ein Stamm kann ein Donatorstamm in einem Paar und ein Akzeptorstamm im anderen Paar sein. Wenn ein Stamm eines Paares selbst ein guter Produzent eines speziellen Antibiotikums ist, wird er üblicherweise das Akzeptorglied eines Paares, an dem der teilnimmt, bilden. Es ist jedoch zu betonen, daß diese Erklärung einzig auf Betrachtungen basiert, die nicht vollständig an experimentellen Daten überprüft wurden. Sie ist auch nicht als die einzig mögliche Erklärung der Erfindung aufzufassen. Doch abgesehen von der theoretischen Erklärung, erreicht man Synergismus, indem man nach den hier beschriebenen Maßnahmen und Verfahren arbeitet.
- Die Auswahl der Stämme zwecks Erzielung einer fermentativen Cosynthese der Tetracycline wird leicht ausgeführt nach den klassischen Wegen der Stammauswahl, die dem Fachmann geläufig sind. Eine übliche Methode besteht darin, daß man eine Petrischale, die ein Nähragar enthält, mit Sporen einer Lagerkultur beimpft, nachdem man die Sporen mit einem Mutationen hervorrufenden Mittel behandelt hat. Nach der Inkubation der beimpften Schale ergibt sich aus der Beobachtung der gebildeten Kolonien, daß bestimmte Kolonien in auffälliger Weise von der Stammkultur unter gleichen Umständen sich unterscheiden. Typische Änderungen gegenüber der Stammkultur sind z. B. dunkelbraune Kolonien, verglichen mit den normalerweise braungelben Kolonien; Mikrokolonien, verglichen mit normalen Kolonien; Riesenkolonien im Gegensatz zu normalen Kolonien; Maßgelbe Kolonien, farblose Kolonien, dunkelgrüne Kolonien; kupferrote Kolonien im Gegensatz zu normalerweise braungelben Kolonien; rauhe oder glatte Kolonien im Gegensatz zu normalerweise geriffelten Kolonien; Kolonien mit nicht diffundierbarem Pigment im Gegensatz zu normalen Kolonien, die ein braungelbes diffundierbares Pigment besitzen; Kolonien mit einem fluoreszierenden Diffusionshof im Gegensatz zu einem nicht fluoreszierenden Hof und Kombinationen dieser und zahlreicher anderer Abänderungen. Selbst wenn keine augenscheinliche Unterscheidung der Kolonien vorliegt, zeigt sich häufig eine Veränderung bei weiterer Untersuchung von willkürlich herausgegriffenen isolierten Individuen, z. B. durch Untersuchung der Antibiotikumproduktion bei der Fermentation in Reinkulturschüttelflaschen, durch Untersuchung, welche Art Kohlehydrat verwertet wird, wobei man sich der spektrophotometrischen, der spektrofiuormetrischen, der papierchromatographischen oder irgendeiner anderen Prüfung mittels physikalischer, chemischer oder biologischer Untersuchung, wie sie gerade gegeben sind, bedient. Alle diese Methoden sind Standardmaßnahmen zur Auswahl mikrobiotischer Varianten und den Fachleuten geläufig. Mutation erzeugende Mittel, die zur Herstellung von Varianten brauchbar sind, sind Bestrahlung (Röntgenstrahlen, Ultraviolett, -x-, ß- oder y-Strahlen, Infrarotstrahlen, Mikrowellen, kosmische Strahlung, Ultraschall), reaktive Chemikalien (Stickstofflost, Schwefellost, Cobaltionen, Colchicin, polynucleare Kohlenwasserstoffe u. dgL), physikalische Maßnahmen (Verreiben). Ultraviolettstrahlen, Röntgenstrahlen und Stickstofflost sind von spezieller Brauchbarkeit als Mutation erzeugende Mittel.
- Nachdem eine Gruppe von Varianten ausgewählt ist, besteht der nächste Schritt zur Erreichung einer cosynthetischen Fermentation darin, zu bestimmen, welche dieser Varianten geeignet sind, biologisch zusammenzuwirken. Dies kann rein durch Versuch und Irrtum festgestellt werden, d. h. durch Durchführung von Fermentationen, die mit Paaren, dreifachen oder höheren Kombinationen der ausgewählten Stämme beimpft sind und indem man Menge und Art der erzeugten Tetracycline mit denen vergleicht, die durch die Varianten der Zusammensetzung erzeugt werden, wenn man sie in getrennten Fermentationen anwendet. Da jedoch cosynthetische Varianten nur selten vorliegen, obwohl es viele cosynthetische Typen gibt, und da viele Typen sehr spezifisch in ihrer biologischen Zusammenwirkung nur mit bestimmten anderen cosynthetischen Typen sind, kann diese Annäherung von Versuch und Irrtum mühevoll sein. Es ist deshalb vorzuziehen, ein Glied eines cosynthetischen Paares zu besitzen, von dem man weiß, daß es als solches wirkt, und dieses Glied als Testorganismus bei der Suche nach neuen cosynthetischen Varianten einzusetzen. Auf diesem Wege wird die Anzahl von Kombinationen, die zu untersuchen sind, von einer sehr großen Anzahl für jeden Varianten auf nur einen Versuch für jeden Varianten reduziert. Der Test besteht darin, daß- man eine gemischte Fermentation mit jeder neuen Variante und der einen bekannten cosynthetischen Variante durchführt. Auf diese Weise zeigt sich die Feststellung einer neuen cosynthetischen Variante durch einen signifikanten Anstieg in der Erzeugung von Tetracyclinen in der gemischten Fermentation, wenn man sie mit der Einzelfermentation vergleicht, die mit den Einzelkomponenten durchgeführt werden.
- Viele derartige Kulturen, von denen es sich zeigte, daß sie fähig sind, cosynthetisch zu wirken, sowohl miteinander als auch mit anderen Varianten, sind bereits bei verschiedenen Stellen hinterlegt, wie z. B. bei dem Northern Regional Research Laboratory, Peoria, Illinois und bei der American Type Culture Collection, Washington, DC. Insbesondere wurden zwei neue Varianten von S.aureofaciens gefunden, welche charakteristische biochemische und biosynthetische Eigenschaften besitzen und die als Beispiel dienen, daß Stämme von S.aureofaciens brauchbar zur Durchführung der vorliegenden Erfindung sind. Weiterhin wurden viele andere Varianten von S.aureofaciens festgestellt, die erfindungsgemäß verwendet werden können.
- Diese Stämme sind Glieder der Art S.aureofaciens, da sie direkte Abkömmlinge des Chlortetracyclin produzierenden, aus Boden isolierten S.aureofaciens A-377 sind, der in der Patentschrift 869 679 beschrieben ist und dessen Kultur beim Northern Regional Research Laboratory, Peoria, Illinois, als NRRL 2209 hinterlegt ist. Die Mutation erzeugenden Mittel und selektiven Agenzien, die zur Erlangung dieser Stämme angewandt wurden, waren Ultraviolettbestrahlung, Nicotin, Behandlungen mit Stickstofflost und Behandlung mit Phagen.
- Diese Stämme besitzen die gleichen allgemeinen Charakteristika, wie sie die Stämme besitzen, die die Tetracycline produzieren, und unterscheiden sich in der gleichen allgemeinen Weise, wie die Tetracyclin produzierenden und Chlortetracyclin produzierenden Stämme von S.aureofaciens sich voneinander unterscheiden, was in einer Anzahl wissenschaftlicher Abhandlungen, die veröffentlicht wurden, beschrieben ist.
- Die unten aufgeführten Daten dienen zur Erläuterung der Charakteristika zweier dieser neuen Stämme T-219 und E-504 im Vergleich mit dem Originalstamm A-377, der unter der Bezeichnung NRRL 2209 erhältlich ist. Streptomyces-aureofaciens-Stämme T-219 und E-504 wurden unterschieden vom Streptomyces-aureofaciens-Stamm A 377 (NRRL 2209) durch Beobachtung der Wachstumscharakteristika in verschiedenen Nährmedien bei einer Inkubationstemperatur von 26,5° C.
1. Glycerin-Asparagin-Ochsenfleisch-Extrakt-Agar Glycerin ........................ 10 g 1-Asparagin ..................... 0,5 g Ochsenfleischextrakt ............. 2 g KH2P04 . . . . . . . . . . . . _ . . . . . . . . . 0,5 g Bacto-Agar...................... 15 g Destilliertes Wasser . . . . . . . . . . . ad 1000 ml Einregelung mit 50°/jger KOH auf pH ....................... 7,0 pH-Wert nach Sterilisierung . . . . . . . . 7,2 Streptomyces aureofaciens Stamm T-219 Stamm E-504 Stamm A-377 Wachstum gut bis reichlich, tiefbraun* gut, dunkelkupferbraun* bis gut bis dunkelbraun eichbraun Lufthyphen spärlich bis reichlich, weiß spurenweise, weiß schlecht bis ausreichend, weiß bis leichtgrau Sporenbildung spärlich, reichlich werdend keine leichtgrau beim Wachstum der Ränder; grau Diffundierbares leichtgelbgrün, bis tiefbern- leichtbernsteinfarben leichtgelb Pigment Steinfarben Rückseite tiefbraun* bis dunkelbraun* dunkelkofferbraun* bis eich- gelb* bis leichtorangegelb braun * Color Harmony Manual, Third Edition, Container Corp. of America. 2. Dextrin Szapek-Dox-Agar Dextrin ........................ log NaN03 ....................... 2g K2HPO4 ...................... 1 g MgS04-7H20 ................ 0,5g KCL . . . . . . . . .. . .. . .. . . . . . . . . . 0,5 g Fe S 04 - 7 H20 . . . . . . . . . . . . . . . . . 0,01 g Bacto-Agar..................... 15 g Destilliertes Wasser . . . . . . . . . . ad 1000 ml pH-Wert nach Sterilisierung ....... 7,2 Streptomyces aureofaciens Stamm T-219 Stamm E-504 Stamm A-377 Wachstum dünn, ganzrandig glasartig zart, glasartig bis durch- gut weiß schimmernd weiß Lufthyphen keine spärlich, weiß reichlich, mausgrau* bis blei- grau* wasserweiße Ober- flächenkügelchen Sporenbildung keine keine überreichlich Diffundierbares kein kein Spuren Maßgelb Pigment Unterseite transparent farblos glasartig bis durchscheinend pigmentlos Spur blaßrot* weiß * Color Harmony Manual, Third Edition, Container Corp. of America. 3 AP 4 Maisquellwasser-Agar Maisquellflüssigkeit .. . . . . . . . . . . . . 4 g Saccharose ..................... log Mg S 04 - 7 H,0 . . . . . . . . . . . . . . . . 0,25 g KHZP04 ....................... 2g (NH4)zHP04 . . . . . . . . . . . . . . . . . . 2 g Bacto-Agar..................... 20 g Leitungswasser . . . . . . . . . . . . . . ad 1000 ml pH-Wert nach Sterilisierung ....... 6,5 Streptomyces aureofaciens Stamm T-219 Stamm E-504 Stamm A-377 Wachstum reichlich, tiefbraun* bis ausgezeichnet, tiefbraun* bis ausgezeichnet dunkelbraun* dunkelbraun* - Lufthyphen spärlich reichlich weiß reichlich rehbraun* Sporenbildung spärlich, leichtgrau reichlich rehbraun* bis biber- überreichlich rehbraun* farben* Lösliches Pigment olivgelb bis tiefbernsteinfarben orange bis braun leichtgelb bis bernsteinfarben Unterseite tiefbraun* bis dunkelbraun* leichtbraun* bis Schokoladen- leichtgelbbraun* braun* * Color Harmony ManuaI, Third Edition, Container Corp. of America. 4. Andere Medien Streptomyces aureofaciens Medium Stamm T-219 ( Stamm E-504 Stamm A-377 Nähragar annehmbares Wachstum, bis- dürftig bis annehmbares gutes Wachstum, keine Luft- quitfarben*, keine Lufthy- Wachstum, keine Lufthy- hyphen, blaßgelbes lösliches phen,keinlöslichesPigment; phen,kein lösliches Pigment; Pigment; Unterseite blaß- Unterseite bisquitfarben* . Unterseite beige gelb Glucose-Aspara- gutes Wachstum, tiefbraun bis gutes Wachstum, kamel- gutes Wachstum, Lufthyphen gin-Fleisch- schokoladenbraun; reich- farben* bis dunkelmaha- weiß, zunehmend grau wer- Extrakt-Agar liche bis überreichliche Luft- gonibraun*; Lufthyphen dend mit zunehmender hyphen, weiß allmählich mäßig bis reichlich, weiß, Sporenbildung; spuren- leichtrehbraun* werdend; allmählich kätzchenweiden- weise gelboranges lösliches Sporenbildung: reichlich bis grau bis aschfarben* wer- Pigment; Unterseite leicht- überreichlich; tiefbraunes dend; Sporenbildung mäßig gelb bis rötlichorange lösliches Pigment; Rück- bis reichlich, leichtgelbes Seite tiefbraun* bis schoko- lösliches Pigment; Unter- ladenbraun seite kamelfarbig bis dun- kelmahagonibraun Waksman's Agar reichliches Wachstum, tief- ausgezeichnetes Wachstum, gutes Wachstum, Lufthyphen, braun* bis Schokoladen- dunkelmahagonibraun; annehmbar und allmählich braun; überaus reichliche überreichliche Lufthyphen, reichlich weiß bis schwach- Lufthypen, weiß langsam weiß allmählich biber- bis braun, schwachgelbes lös- beigebraun werdend; über- schokoladenbraun; über- - liches Pigment; Unterseite reichliche Sporenbildung; reichliche Sporenbildung, kamelfarben bis ziegelbraun gelbgrünes bis bernstein- orangebraunes lösliches farbiges lösliches Pigment; Pigment; Unterseite Unterseite ziegelbraun bis dunkelmahagonibraun* schokoladenbraun Kartoffel- ausgezeichnet, feucht, glatt, überreichlich feuchtes, glattes, überreichliches, feuchtes, glat- schnitten mit Knötchen versehenes mit Knötchen versehenes tes, mit Knötchen versehe- Wachstum, das schließlich Wachstum, dunkelmahago- nes Wachstum, leichtbraun- gefurcht wird; olivfarben; nibraun*; Lufthyphen keine gelb bis beige bis feder- reichliche weiße Lufthy- bis reichlichweiß, allmählich farbig, kein lösliches Pig- phen; Sporenbildung keine, rehbraun werdend bei Spo- ment jedoch beginnend; sattel- renbildung. Rosentopasfar- braunes lösliches Pigment biges bis dunkelmahagoni- farbenes lösliches Pigment * Color Harmony Manual, Third Edition, Container Corp. of America. 4. Andere Medien (Fortsetzung) Medium Stamm T-219 1 Stamm E-504 Stamm A-377 Purple-Milch schweres, glasartiges Wachs- ausgesprochenes Wachstums- schwachweißes bis blaßgelbes tumspolster, senfbraun, polster, tief rotbraun bis ma- Wachstumspolster, geringe leichtbraunes, lösliches Pig- hagonibraun, keine auffäl- signifikante pH-Änderung ment, leicht alkalische Reak- lige Peptonisierung, keine oder anscheinende Peptoni- tion, jedoch keine auffäl- pH-Änderung,jedochfalsche sierung innerhalb 14 Tagen lige Peptonisierung alkalische Farbreaktion durch Diffusion von lös- lichem Pigment AP 6 Maisquell- reichliches Wachstum, braun ausgezeichnetes Wachstum, ausgezeichnetes Wachstum, flüssigkeit- bis schokoladenbraun; leichtpfefferbraun bis scho- überreichliche Lufthyphen, Agar** spärliche Lufthyphen, weiß, koladenbraun; reichliche außerordentlich reichliche allmählich grau im Zentrum Lufthyphen, weiß allmäh- Sporenbildung, rehbraun; werdend; spärliche Sporen- lich rehbraun bis biberbraun leichtbernsteinfarbiges lös- bildung, tiefbernsteinfarbe- werdend; reichliche Sporen- liches Pigment; Unterseite nes lösliches Pigment; Un- Bildung, tieforangebraunes gelbbraun terseite glasartig, tiefbraun lösliches Pigment; Unter- bis schokoladenbraun seite leichtpfefferbraun bis schokoladenbraun Q 4 Agar*** reichliches Wachstum, tief- ausgezeichnetes Wachstum, ausgezeichnetes Wachstum, braunbisschokoladenbraun, burgunderfarbig bis eben- blaßgelb; überreichliche Lufthyphen spärlich, weiß holzbraun; überreichliche Lufthyphen, dunkelbraun; bis leichtgrau bis leichthell- Lufthyphen, weiß bis rosen- überreichliche Sporenbil- , braun, dürftige Sporenbil- topasfarbig, allmählich dung, orangebraunes lös- dung, sehr tief Bernstein- topasbraun werdend; über- liches Pigment; Unterseite farbenes lösliches Pigment; reichliche Sporenbildung, orange- bis orangegelb Unterseite tiefbraun bis sehr tief rotoranges lösliches schokoladenbraun Pigment; Unterseite bur- gunderfarbig bis ebenholz- braun * Color Harmony Manual, Third Edition, Container Corp. of America. ** AP6 Agar Saccharose . . ............. 10 g M9S04 - 7H20.. . . . . . . . ... . 0,25 g KH,P04 . . . . . ....... . . . ... 2 g (NH4)aP04 . ....... . .. 2 g Maisquellflüssigkeit . . . . . . . . . . 6 g Bacto Agar (raffiniert) ....... 20 g Wasser .................. ad 1000 ml pH-Wert nach Sterilisierung ... 6,5 *** Q4-Agar Saccharose . ............. 10 g Mg S 04 - 7H20 . . . . . . . . . . . . . 0,25 g KHZP04 .. . . .. . . . . . .. . .. . . . 4 g (NH4)3P04 . ... . .. . .. . .. . . . . 2 g Maisquellflüssigkeit . . . . . . . . . . 9 g Rohagar ................. 30 g Wasser .................. ad 1000 ml pH-Wert nach Sterilisierung ... 6,5 5. Mikroskopische Beobachtungen Streptomyces aureofaciens Stamm T-219 Stamm E-504 Stamm A-377 Medium Mycel I Sporen Mycel Sporen myce1 ` Sporen Glycerin- biegsam, fort- rund bis oval, biegsam, keine biegsam, kreisförmig Asparagin- laufend ver- Durchmesser fortlaufend beobachtet fortlaufend bis oval, Fleisch- zweigt, 0,5 bis 1,0 #t verzweigt, verzweigt, Durchmesser extraktagar Durchmesser Durchmesser Durchmesser 1,2 bis 1,5 #t 0,5 bis 1,0 #t 0,7 bis 1,0 @. 1,0 bis 1,2 [. AP 4-Mais- biegsam, fort- ' kreisförmig biegsam, kreisförmig, biegsam, kreisförmig quellflüssig- laufend, ver- bis oval, fortlaufend oval, fortlaufend bis oval, keitsagar zweigt, Durchmesser verzweigt, Durchmesser verzweigt, Durchmesser Durchmesser 0,5 bis 1,0 #t Durchmesser 0,5 bis 1,0 #t Durchmesser 1,1 bis 1,5 #t 0,5 bis 1,0 #t 0,5 bis 1,0 #t 0,8 bis 1,0 &, Waksman's biegsam, fort- kreisförmig biegsam, kreisförmig biegsam, kreisförmig Agar laufend bis oval, fortlaufend bis oval, fortlaufend bis oval, verzweigt, Durchmesser verzweigt, i Durchmesser verzweigt, Durchmesser Durchmesser i 0,5 bis 1,0 #L Durchmesser 0,5 bis 1,0 #t Durchmesser 0;5 bis 1,0 @; 0,5 bis 1,0 @, 0,5 bis 1,0 #t 0,5 bis 1,0 p. - Lebensfähige Kulturen der S.aureofaciens-Stämme E-504 und T-219, welche zu der beschriebenen Cosynthese der Tetracycline in Übereinstimmung mit der vorliegenden Erfindung verwendbar sind, wurden bei der American Type Culture Collection in Washington DC niedergelegt, wo diese Stämme die ATCC-Empfangsnummer 13 191 bzw 13192 erhielten. Weiterhin können die S.aureofaciens-Stämme, die an der American Type Culture Collection unter der ATCC-Empfangsnummer l3189 bzw. 13190 niedergelegt wurden, ebenso für die Cosynthese der Tetracychne entsprechend der vorliegenden Erfindung eingesetzt werden.
- Außer den oben aufgeführten Stämmen von S.aureofaciens, die am American Type Culture Collection niedergelegt wurden, zeigte es sich, daß viele andere Stämme von S.aureofaciens und von allen anderen bekannten Tetracyclin produzierenden Arten der Gattung Streptomyces, wie z. B. S.hygroskopicus, S.platensis, S.rimosus und S.viridifaciens, ebenso wie geeignet ausgewählte Mutanten von jedem dieser Stämme zu der hier beschriebenen Cosynthese der Tetracycline eingesetzt werden können.
- Viele Stämme der Gattung Streptomyces sind zur fermentativen Cosynthese der Tetracycline fähig, vorausgesetzt, daß sie unter den geeigneten Bedingungen wachsen und daß sie in der richtigen Kombination mit einem oder mehreren der begleitenden Stämme, deren Auswahl vorhergehend beschrieben wurde, gemischt werden. Man läßt die Stämme von Streptomyces, die man von Kultursammelstellen erhält oder die man aus dem Boden isoliert, oder die aus diesen Stämmen durch dem Fachmann geläufige Verfahren abgeleiteten Mutanten unter den Bedingungen wachsen, wie sie normalerweise zur Kultur von Streptomyces zum Zwecke der Erzeugung von Antibiotika oder anderen Produkten angewendet werden. Die Nährmedien enthalten übliche Kohlenstoff- und Stickstoffquellen, wesentliche Mineralien und Wachstumsfaktoren und werden zusammengesetzt mit Inhaltsstoffen, wie Saccharose, Stärke, tierischen oder pflanzlichen Fetten, Maisquellflüssigkeit, Sojabohnenmehl, Baumwollsamenmehl, Hefe und verschiedenen Salzen. Man läßt die Kulturen bei Temperaturen von 20 bis 35° C wachsen unter aeroben Bedingungen, wie man sie normalerweise in Schüttelflaschen erhält, oder sie werden in bewegten Fermentationsgefäßen belüftet. Die Kulturen werden gemischt, in Kombinationen von zwei oder mehreren gleichzeitig, entweder am Anfang der Fermentationszeit oder an einem bestimmten Zeitpunkt während der Fermentation. Die Endfermentationsmaischen sind für Tetracycline durch übliche Verfahren erprobt. Es ergab sich eine Cosynthese von Tetracyclinen in solchen Kombinationen von Stämmen, bei denen sich eine gesteigerte Bildung von einem oder mehreren Tetracyclinen gegenüber den Kontrollversuchen herausstellte, die entweder einzeln fermentiert wurden oder nach Beendigung der Fermentationszeit zusammengemischt wurden. Diese Verfahren sind ausführlicher in den folgenden Beispielen beschrieben. Die folgenden spezifischen Beispiele beschreiben im einzelnen die vorliegende Erfindung.
Beispiel 1 Herstellung der Impfkultur Das Impfkulturmedium wurde entsprechend folgen- dem Rezept hergestellt: Saccharose ...................... 30,0 g Maisquellflüssigkeit . . . . . . . . . . . . . . 16,5m1 (N H4)2 S04. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 2,0 g CaCO3 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 7,0 g Wasser. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . ad 1(l00 ml (N H4)2 S04. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 5,0 g CaCO3 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 9,0 g NH4C1 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 1,5 g MgC12 - 6 H20. . . . . . . . . . . . . . . . . . . 2,0 g FeS04 - 7 H20 . . . . . . . . . . . . . . . . . . 0,04 g Mn S 04 - 4 H2 O . . . . . . . . . . . . . . . . . . 0,05 g Co S 04 - 6 H,0 . . . . . . . . . . . . . . . . . . 0 ) 005 g ZnS04 - 7 H20 . . . . . . . . . . . . . . . . .. 0,1 g Maisquellflüssigkeit . . . . . . . . . . . . . . 25,0 g Baumwollsamenmehl . . . . . . . . . . . . . 2,0 g Maisstärke . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 55,0 g Wasser....................... ad 1000 ml - Beispiel 3 Herstellung eines Fermentationsmediums mit minimalem Halogengehalt Ein Fermentationsmedium mit einem minimalen Halogengehalt wurde wie folgt hergestellt:
Harzenthalogenierte Maisquell- flüssigkeit . . . . . . . . . . . . . . . ...... 30 g/l CaCO3 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 7 g/1 (NH4)2 S 04 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 5 g/1 Stärke mit niedrigem Chlorgehalt... 55 g/1 Mn S 04 - 4 H,0 . . . . . . . . . . . . . . . . . . 50 mg/1 HJ 04 (85 °/o) . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 200 mg/1 - Beispiel 4 Cosynthese von 7-Chlor-6-desmethyl-tetracyclin in einer gemischten Fermentation der S.aureofaciens-Stämme ATCC 13 191 und ATCC 13 189 Die Impfkulturen von Streptomyces aureofaciens ATCC 13 191 und Streptomyces aureofaciens ATCC 13 189 wurden angesetzt, wie im Beispiel 1 beschrieben. Eine Anzahl 250-ml-Erlenmeyer-Kolben, die jeweils 25 ml Fermentationsmedium enthielten, wurden danach, wie im Beispiel 2 beschrieben, hergestellt. Drei Fermentationskolben wurden mit aliquoten Anteilen von 1,0 ml der Impfkultur von S.aureofaciens ATCC 13 191 beimpft und drei weitere Kolben mit Impfkultur von S.aureofaciens ATCC 13 189. Sämtliche beimpften Fermentationskolben wurden bei 25° C auf einer rotierenden Schüttelmaschine bei 180 Umdrehungen je Minute während eines Zeitraums von 48 Stunden inkubiert, nach welcher Zeit Mischungen von 20 ml Fermentationsmaische, die S.aureofaciens ATCC 13 191 enthielt, und 5 ml Fermentationsmaische, die S.aureofaciens ATCC 13 189 enthielt, hergestellt wurden, wobei einer der drei Kolben, der mit einem speziellen Stamm beimpft war, verwendet wurde. Die übrigen Kolben mit den Einzelstämmen und die Kolben, die die Zweistammischungen enthielten, wurden erneut bei 25° C auf einer rotierenden Schüttelmaschine für eine Zeit von weiteren 72 Stunden inkubiert, so daß die gesamte Inkubationszeit in allen Fällen 120 Stunden betrug. Die nach 120 Stunden geernteten Maischen der Kolben mit dem Einzelstamm und die Maische, die nach 120 Stunden aus den Kolben mit den beiden Stämmen geerntet wurden, wurden auf antibiotische Wirksamkeit mittels einer biologischen Versuchstechnik untersucht (turbidimetrisch, mit Staphylococcus aureus), wobei die folgenden Resultate erhalten wurden:
7-Chlor- 6-desmethyl- Mikroorganismus tetracyclin laut biologischem Versuch mcg/ml ATCC 13 191, 120 Stunden alt.... < 0,5 ATCC 13 189, 120 Stunden alt ... < 3 ATCC 13 191 + ATCC 13 189, ge- mischt nach 48 Stunden, bestimmt nach 120 Stunden ............. 205 Chlortetracyclin- gehalt Mikroorganismen (biologischer Test) mcg/ml ATCC 13 191, 120 Stunden alt.... 0 ATCC 13 192, 120 Stunden alt.... 0 ATCC 13 191 -I- ATCC 13 192, ge- mischt nach 24 Stunden, bestimmt nach 120 Stunden ............. 110 Chlortetracyclin- gehalt Mikroorganismen (biologischer Test) mcg/ml ATCC 13 192, 120 Stunden alt.... 0 S-2242, 120 Stunden alt . . . . . . . . . . 20 ATCC 13 192 -I- S-2242, gemischt nach 24 Stunden, getestet nach 120 Stunden .................. 740 ATCC 13 192 -I- S-2242, gemischt und getestet nach 120 Stunden . . 20 Chlortetracyclin- gehalt Mikroorganismen (biologischer Test) mcg/ml S-2242, 120 Stunden alt.......... 33 S-2895, 120 Stunden alt . . . . . . . . . . 3 S-2242 -#- S-2895, gemischt nach 24 Stunden, getestet nach 120 Stun- den ......................... 424 Chlortetracyclin- gehalt Mikroorganismen (biologischer Test) mcg/ml S-2895, 120 Stunden alt . . . . . . . . . . 3 ATCC 12 750, 120 Stunden alt.... 331 S-2895 -f- ATCC 12 750, gemischt nach 24 Stunden, getestet nach 120 Stunden .................. 3860 ChlortetracycIin- gehalt Mikroorganismen (fluoro- metrischer Test) mcg/ml S-2895, 120 Stunden alt . . . . . . . . . . 0 ATCC 11989, 120 Stunden alt .... 180 S-2895 + ATCC 11989, gemischt nach 24 Stunden, getestet nach 120 Stunden ....... .....: *, 310 S-2895 -E- ATCC 11989, gemischt und getestet nach 120 Stunden... 80 Chlortetracyclin- gehalt Mikroorganismen (fluoro- metrischer Test) mcg/ml S-2895, 120 Stunden alt ...... . . . . 0 ATCC 12 551, 120 Stunden alt .... 60 S-2895 -f- ATCC 12 551, gemischt nach 24 Stunden, getestet nach 120 Stunden .................. 375 Chlortetracyclin- gehalt Mikroorganismen (biologischer Test) mcg/ml S-2895, 120 Stunden alt . . . . . . . . . . 2 ATCC 10 762, 120 Stunden alt .... 24 S-2895 -f- ATCC 10 762, gemischt nach 24 Stunden, getestet nach 120 Stunden .................. 181 S-2895 -I- ATCC 10 762, gemischt und getestet nach 120 Stunden... 8 Chlortetracyclin- gehalt Mikroorganismen (biologischer Test) mcg/ml S-2895, 120 Stunden alt . . . . . . . . . . <2 V-655, 120 Stunden alt . . . . . . . . . . <2 S-2895 + V-655, gemischt nach 24 Stunden, getestet nach 120 Stun- den ......................... 1160 Chlortetracyclin- gehalt Stamm Nr. (biologischer Test) mcg/ml ATCC 13 189, 120 Stunden alt .... 3 ATCC 12 749, 120 Stunden alt .... 279 ATCC 13 189 + ATCC 12 749, ge- mischt nach 48 Stunden, getestet nach 120 Stunden ............. 4770 ATCC 13 189 '-, ATCC 12 749, ge- mischt und getestet nach 120 Stun- den ......................... 121 Chlortetracyclin- gehslt. Mikroorganismen (fluoro- metrischer Test) mcg/ml ATCC 12 749, 120 Stunden alt .... 160 ATCC 13 190, 120 Stunden alt .... 15 ATCC 12 749 -I- ATCC 13 190, ge- mischt nach 24 Stunden, getestet nach 120 Stunden ............. 4200- Chlortetracyclin- gehalt Mikroorganismen (fluorometrischer Test bei einem Alter von 120 Stunden) mcg/nA ATCC 12 748 . . . . . . . . . . . . . 110 ATCC 13190 ............. 10 ATCC 12 748 + ATCC 13190 gemischt nach 0 Stunden ............ 1390 24 Stunden ............ 700 48 Stunden ............ 1470 72 Stunden ............ 1100 96 Stunden ............ 280 Chlortetracyclin- gehalt (fluoro- metrischer Test beim Alter von 120Stunden) mcg/ml S.aureofaciens ATCC 12 748 allein 110 S.aureofaciens ATCC 13 190 allein 10 Kombination (gewachsen als cosyn- thetisierendes Paar) S.aureofaciens S.aureofaciens ATCC 12748 ATCC 13190 100 0 110 96 4 2450 92 8 2280 84 16 2960 68 32 2180 60 40 2140 40 60 820 32 68 330 16 84 100 8 92 100 4 96 20 0 100 10 Chlortetracyclin- gehalt Mikroorganismen (biologischer Test) mcg/ml ATCC 12 749, 120 Stunden alt .... 463 V-655, 120 Stunden alt . . . . . . . . . . <2 ATCC 12 749 -f- V-655, gemischt nach 24 Stunden, getestet nach 120 Stunden .................. 1810 ChIortetracyclin- gehalt Mikroorganismen (biologischer Test) mcg/ml V-655, 120 Stunden alt . . . . . . . . . . <2 S-2242, 120 Stunden alt . . . . . . . . . . <2 V-655 -f- S-2242, gemischt nach 24Stunden, getestet nach 120 Stun- den ......................... 124 Chlortetracyclin- gehalt Mikroorganismen (biologischer Test) mcg/ml V-655, 120 Stunden alt . . . . . . . . . . <2 ATCC 13 192, 120 Stunden alt .... <2 V-655 -f-- ATCC 13 192, gemischt nach 24 Stunden, getestet nach 120 Stunden .................. 416 Mikroorganismen Test mcg/ml ATCC 13 192, 120 Stunden alt 0 S.hygroscopicus (A-9538-1), 120 Stunden alt . . . . . . . . . . 640 (Oxytetracyclin) ATCC 13192 -f- S.hygroscopi- cus, gemischt nach 24 Stun- den, getestet nach 120 Stun- den .................... 530 (Oxytetracyclin) -i-- 250 . (Tetracyclin) ATCC 13192 -f- S.hygroscopi- cus, gemischt und getestet nach 120 Stunden ........ 350 (Oxytetracyclin) Chlortetracyclin Mikroorganismen fluorometrischer biologischer Test Test mcg/ml mcg/ml ATCC 12 749, 120 Stunden alt . . 170 182 V-15, 120 Stunden alt ....... « ..... 20 <2 ATCC 12749 + V-15, gemischt nach 48 Stundengetestet, nach 120 Stunden 2250 2738 - Beispiel 24 Cosynthese von 6-Desmethyltetracyclin in einer Mischfermentation von S.aureofaciens ATCC 13 191 und S.aureofaciens A-8291 Eine Bodenprobe wurde mit sterilem destilliertem Wasser ausgelaugt. Dieses Auslaugewasser wurde anschließend mit einem großen Volumen sterilen destillierten Wassers verdünnt und aliquote Mengen dieser verdünnten Lösung auf AP 6-Nähragar gebracht. Die erhaltenen Kolonien zeigen einen charakteristischen kräftigen und erdigen Geruch. Eine Kolonie, die blaßgrüngelb und durchschimmernd war und einen farblosen Rand aufwies, wurde ausgelesen und erwies sich nach taxonomischer Untersuchung als S.aureofaciens. Die Kultur wurde in üblicher Weise entwickelt; die Fermentationsmaische zeigte eine dunkelgrüne Farbe. Diese Kultur erhielt die Bezeichnung A-8291. Impfkulturen von S.aureofaciens ATCC 13 191 und A-8291 wurden, wie im Beispiel l beschrieben, angesetzt. Es wurde eine Anzahl Kolben, die das Fermentationsmedium nach Beispiel 2 enthielten, angesetzt. Die eine Hälfte dieser Flaschen wurde mit S.aureofaciens ATCC 13 191 und die andere Hälfte mit A-8291 beimpft. Sämtliche Flaschen wurden 30 Tage lang bei 25' C inkubiert. Nach dieser Zeit wurden gleiche Volumina der beiden Einzelfermentationen vereinigt und 10 Teile je Million 2,5-Dimercapto-1,3,4-thiadiazol (DMTD) zu der Mischung zugesetzt. Die Fermentation wurde 120 Stunden lang fortgesetzt. Gleichzeitig wurden 10 Teile je Million DMTD zu den Einzelfermentationen zugesetzt, welche ebenfalls 120 weitere Stunden fortgesetzt wurden. Nach der Ernte ergaben sich foleende Ereebnisse:
6-Desmethyl- tetracyclin- Mikroorganismen Behalt (biolo- gischer Test) mcg/ml ATCC 13 191J20 Stunden alt ... .. <5 A-8291, 120 Stunden alt . . . .. . . . . <5 ATCC 13 191 -1- A-8291, gemischt , - _ nach 30 Stunden, getestet nach 120 Stunden .................. = 100 Bromtetra- cyclingehalt Mikroorganismen (fluoro- metrischer Test) mcg/ml A-8291, 120 Stunden alt . . . . . . . . . < 25 ATCC 12751, 120 Stunden alt .... < 5 A-8291 + ATCC 12751, gemischt nach 24 Stunden, getestet nach 120 Stunden ............ » ....... 550 Oxytetracyclin- Mikroorganismen Behalt (biolo- gischer Test) mcg/ml ATCC 13192, 120 Stunden alt .... < 10 O-1066, 120 Stunden alt . . . . . . . . . < 2 ATCC 13192 -f- O-1066, gemischt nach 24 Stunden, getestet nach 120 Stunden .................... 187 Tetracyclin- Behalt (spektro- Mikroorganismen photometrischer Test) mcg!ml ATCC 13192, 120 Stunden alt .... 0 E-1018, 120 Stunden alt ......... 0 ATCC 13192 -I- E-1018, gemischt nach 48 Stunden, getestet nach - 120 Stunden ......... . .......... 425 7-Chlor-6-des- methyltetra- Mikreorganismen cyclingehalt (spektrophoto- metrischer Test) mcg/ml E-1018, 120 Stunden alt . . . . . . . . . < 10 V-15, 120 Stunden alt . . . . . . . . . < 5 E-1018 + V-15, gemischt nach 24 Stunden, getestet nach 120 Stun- den ........................... 45 Chlortetra- cyclingehalt Mikroorganismen (flüoro- metrischer Test) mcg/ml V-15, 120 Stunden alt . . . . . . . . . . . 20 ATCC 12751, 120 Stunden alt .... 190 V-15 + ATCC 12751, gemischt nach 24 Stunden, getestet nach 120 Stunden .................... 2700 Chlortetra- cyclingehalt Mikroorganismen (biologischer Test) mcg; ml ATCC 12751, 120 Stunden alt . . . . 279 S.albus, 120 Stunden alt . . . . . . . . . 0 ATCC 12751 + S.albus, gemischt nach 24 Stunden, getestet nach 120 Stunden .................... 1390 Chlortetra- cyclingehalt Mikroorganismen (biologischer - Test) mcgiml - ATCC 12751, 120 Stunden alt .... 279 NRRL 2364, 120 Stunden alt ..... < 2 ATCC 12751 -i- NRRL 2364,. ge- mischt nach 24 Stunden, getestet nach 120 Stunden ........:.... 234 - _ ATCC 12751 + NRRL 2364, gemischt und getestet nach 120 Stun- den .. ....... ............. 141e Chlortetra- cyclingehalt Mikroorganismen (fluoro- metrischer Test) mcg/ml ATCC 13192, 120 Stunden alt .... < 2 0-1830, 120 Stunden alt . . . . . . . . . < 2 ATCC 12193 -I- O-1830, gemischt nach 24 Stunden, getestet nach 120 Stunden .................... 1050 Mikroorganismen Oxytetracyclin mcg/ml ATCC 13192, 120 Stunden alt . . . < 9 S.rimosus AB-115, 120 Stunden alt 2250 ATCC 13192 -f- S.rimosus AB-115, gemischt nach 24 Stunden, getestet nach 120 Stunden ............... 3080 ATCC 13192 -f- S.rimosus AB-115, gemischt und getestet nach 120 Stun- den ........................... 1180 Mikroorganismen Test mcg/ml AB-115 . . . . . . . . . . . . . . . 1800 (Oxytetracyclin) E-475 ................ 1780 (7-Chlor-6-des- methyltetracyclin) AB-115 -f- E-475, ge- mischt nach 24 Stunden, getestet nach 120 Stunden 3200 (Oxytetracyclin) 100 (7-Chlor-6-des- methyltetracyclin) AB-115 + E-475, ge- mischt und getestet nach 120 Stunden . . . . . . . . . . . 900 (Oxytetracyclin) 850 (7-Chlor-6-des- methyltetracyclin)
Claims (4)
- PATENTANSPRÜCHE; 1. Verfahren zur synergistischen fermentativen cosynthetischen Erzeugung eines Antibiotikums der Tetracyclinreihe, dadurch gekennzeichnet, daß man mindestens zwei Mikroorganismenstämme der Gattung Streptomyces in einem wässerigen Nährmedium, das assimilierbare Kohlehydrat-und Stickstoffquellen und anorganische Salze enthält, unter aeroben Submersbedingungen kultiviert, wobei man die Mikroorganismenstämme und Fermentationsbedingungen so wählt, daß diese das gewünschte Antibiotikum der Tetracyclinreihe synergistisch in einer größeren Menge erzeugen, als es jeder der Stämme für sich allein erzeugt.
- 2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß die verwendeten Mikroorganismen, falls mit ihnen Einzelfermentationen durchgeführt werden, das gewünschte Antibiotikum der Tetracychnreihe nicht oder nicht in wesentlichen Mengen produzieren.
- 3. Verfahren nach Anspruch 1 und 2, dadurch gekennzeichnet, daß einer der Mikroorganismen von einer Art ist, welche normalerweise ein Antibiotikum der Tetracyclinreihe erzeugt.
- 4. Verfahren nach Anspruch 1 bis 3, dadurch gekennzeichnet, daß jeder der Mikroorganismen getrennt in einem wässerigen Nährmedium zum Beginn des Fermentationsverfahrens kultiviert wird.
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