DE2340562A1

DE2340562A1 - Verfahren zur herstellung von rifamycin b

Info

Publication number: DE2340562A1
Application number: DE19732340562
Authority: DE
Inventors: Carmine Pasqualucci; Giuseppe Wucco
Original assignee: ARCHIFAR IND CHIM TRENTINO
Current assignee: ARCHIFAR IND CHIM TRENTINO
Priority date: 1972-11-29
Filing date: 1973-08-10
Publication date: 1974-06-06
Also published as: CH606427A5; JPS5414676B2; DD107071A5; BE805923A; AR196937A1; CA983873A; ZA737275B; AU6166273A; ATA861773A; HU166347B; ES415056A1; NL7314342A; JPS4993590A; FR2207986B1; FR2207986A1; US3871966A; SU464128A3; GB1403688A; AT335595B

Description

Verfahren zur Herstellung von Rifamycin B.

Es ist bekannt, daß es sich bei dem in der US-PS 2 999 048 beschriebenen Nancimycin praktisch um ein Antibiotikum handelt, welches auch als Rifamycin B (siehe PR-PS 2 O4j5 847) bezeichnet wird. Dieses Antibiotikum läßt sich durch aerobe Fermentation des Mikroorganismus Streptomyces albovinaceous ATCC I295I in einer Nährlösung herstellen, welche eine Quelle von assimilierbarem Kohlenstoff, axximilierbarem Stickstoff und Mineralsalze enthält, wobei diese Nährlösung gerührt wird und die Fermentation bei einer gesteuerten Temperatur erfolgt, wie dies in der vorgenannten US-PS beschrieben wird.

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Andrejewski, Honke & Gesthuysen, Patentanwälte, 43CK) Essen 1, Theaterplatz 3

Die Produktivität dieses Mikroorganismus ist jedoch nicht so stark, um eine Auswertung unter Bedingungen zu erlauben, welche vom industriellen Gesichtspunkt her wirtschaftlich interessant wären.

Die Erfindung hat sich daher die Aufgabe gestellt, ein Verfahren zur Herstellung von Rifamycin B anzugeben, mittels welchem eine hohe Ausbeute an von analogen Nebenprodukten praktisch freiem Rifamycin B erzielbar ist, so daß es sich zur Herstellung von Antibiotikas, insbesondere Rifamycin B, eignet.

Dabei wurde überraschenderweise festgestellt, daß eine Mutante des Mikroorganismus Streptomyces albovinaceous, ATCC 12951, eine extrem hohe Ausbeute an Rifamycin B ergibt, wenn man diese Mutante in einer gepufferten Nährlösung unter aeroben Bedingungen züchtet, wobei diese Nährlösung assimilierbare Quellen von C,N und anorganischen Salzen enthält.

Diese von der Anmelderin isolierte Mutante, welche durch wiederholte mütange Behandlung einer Kultur der Streptomyces albovinaceous, ATCC 12951, mit UV-Strahlen und anschließender Auswahl der Kolonien hergestellt wurde, hat von der Anmelderin die Bezeichnung Streptomyces G5/A erhalten und ist in der Privat-Kollektion ARCHIFAR Industrie Chimiche del Trentino S.p.A. deponiert .

Die Tatsache, daß das erfindungsgemäße Rifamycin B praktisch frei ist von analogen Nebenprodukten, ist ein bedeutender Vorteil bezüglich der Wirkungen einer weiteren Reinigung des Endproduktes. Die erfindungsgemäßen Streptomyces G5/A besitzen Klassifizierungseigenschaften, die von denen anderer, Rifamycin produzierender Mikroorganismen abweichen, wie es die nachfolgenden Tabellen zeigen.

A09823/109_ß

Andrejewski, Honke & Gesthuysen, Patentanwälte, 4300 Essen 1, Theaterplatz

Für die KlassifizierungsStudien sowie für einige weitere Medien wurden die Verfahren und KuItürlösungen verwendet, welche von Shirling und Gottlieb (Int.system Bact., 16, 513-540, I966) beschrieben sind. 0

Pur die Beschreibung der Farben wurden die Farbtabellen von H. Prauser verwendet (Prauser H. 1964. Aptness and application of colour codes for exact description of colours of streptomycetes. Zeitschrift f. Allg. Mikrobiologie, 4, 95-98).

Aus einem Vergleich der erhaltenen Daten zeigt sich, daß die Streptomyces G5/A sich von anderen Stämmen in verschiedenen und grundlegenden Merkmalen unterscheiden.

Es zeigen:

Tabelle 1 die allgemeinen Merkmale der Kulturen des erfindungsgemäßen Stammes und der üblichen Rifamycin-erzeugenden Stämme;

Tabelle 2 die Assimilierungsfähigkeit von C-Verbindungen durch die vorgenannten Stämme;

Tabelle 3 die biochemischen Merkmale der verschiedenen Stämme;' und

Tabelle 4 die Merkmale der auf verschiedenen Standardmedien gezüchtete Kultur.

409823/109_e

Andreiewski, Honke & Gesthuysen, Patentanwälte, 4300 Essen 1, Theaterplatz 3

In den nachfolgenden Tabellen bedeuten:

I = Str. G5/A = Erfindungsgemäße Mutation;

II = Str. Albovinaceus,

bekannt aus US-PS 2 999 048j

III = Str. Mediterranei ATCC 21271,

bekannt aus CH-PS 477 551;

IV = Str. Mediterranei ATCC I3685,

bekannt aus US-PS 2 988 490;

V = 4107/A₂,

bekannt aus Journal Antibiotic XVII 29, 1964;

VI = B 2847,

bekannt aus Journal Antibiotic XXIV, 810, I97I,

409823/109

Sporen

Mycelium atm.

ohne

Tabelle 1
Allgemeine Merkmale der Kulturen

II

III

IV

VI

Mycelium veget.

Dunkelbis hellbraun, mit Spuren von Orange

elliptisch oder oval

weiß bis violett, Sporophoren m.Sporen in Ketten, keine Spiralen

Leicht blaßrosa bis braun

ohne

GeIb-

bis
s tar L
dunkel

stabförmig

mehlig,

blaßrosa-

weiß,

Sporophoren

m. Sporen in

Ketten, keine

Spiralen

bis

zylindrisch
mit glatter
Oberfläche

blaßrosa
bis weiß,
Sporophoren

Rot bis
orange

orange

elliptisch mit glatter Oberfläche

weiß mit einfachen

feraden sten, Sporen in Ketten

Farblos bis

gelblich

α.

es:

Ul ■ I

Lösliche Pigmente

Dunkeibis hellbraun bis gelb mit grünem Schimmer

meist ohne. Falls vorhanden, dunkelrote Färbung

gelblichgrün bis
stark
gelbbraun

ohne oder gelblich

Braun bis
Purpur

GeIborange

bis gelbbraun

^&

C-Quelle

Glucose Arabinose Rhamnose Xylose Galactose Fructose Mannose Lactose Maltose Rohrzucker Raffinose Dextrin Inulin Dulcitol Glycerin Mannitol Inositol Sorbitol Na-Succinat Na-Citrat Na-Acetat Glicolia Salicin Stärke (löslich) Cellulose

Tabelle Assimilation der C-Verbindungen

II

III

VI

N.B.

N.B. +

+ΗΝ.Β.

—	B.	Η	++
N.	B. ■	Ν.	B.
N.		++

N.B.

+++ = Ausgezeichnet verwertbar,

++ = sehr gut -"- ,

+ = gut -"-

+ = zweifelhaft -"- ,

= nicht -"-

N.B. = nicht verwendet (siehe Anm. Tabelle 5)

f.

- See. Sensi, P., Thiemann J.E.
Progress in Industrial Microbiology, Vol. 6, 21-60/ 19β7
(D.J.D. Hockenhull, Ed.)
London Heywood Books, London.

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Andrejewski, Honke & Gesthuysen, Patentanwälte, 4300 Essen 1, Theaterplatz 3

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CQ

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II

Tabelle J5 (Fortsetzung)

III

IV

	Medium 6 von	H₂S-Bildung keine
	Shirling	Pigment
	& Gottlieb	bildung
	(Pb-Azetat-
	Indikator)

O	Dextrin	hydroly
CO OO		siert
NJ
""«*.	Stärke	hydroly
	löslich	siert
O
CO
CD

N.B.

Positive Hydrolyse

HpS-Bildung,

keine Pigmentbildung

nicht hydrolysiert

Positive
Hydrolyse

HpS-Bildung, N.B.

keine
Pigmentbildung

VI

N.B.

N.B. N.B.

Keine N.B. Hydrolyse

OO

Q.

Q:

Anm.:

N.B. = das betreffende Medium wurde nicht zur Bestimmung der

biochemischen Merkmale verwendet. Seine Verwendung erfolgte jedoch, wie die folgenden Tabellen zeigen, zur Bestimmung anderer Merkmale.

cn cn κ»

Andrejewski, Honke & Gesthuysen, Patentanwälte, 4300 Essen Ί, Theaterplatz 3

In nachstehender Tabelle H- bedeuten;

Ml = Nähr-Agar (n. Waksman)'

M2 = Benett's Agar (n. Waksman)

M3 = Medium 2 von Shirling & Gottlieb

M4 = Medium 3 von Shirling & Gottlieb

M5 = Medium 4 von Shirling & Gottlieb

M6 = Medium 5 von Shirling & Gottlieb

M7 = Medium 6 von Shirling & Gottlieb

MS = Medium 7 von Shirling & Gottlieb

My - Ca-Malat, agariert.

G = Wachstum,

AM = Mycelium, atm.,

R = Gegenteil,

VM = Mycelium, veget.,

Rdg = R. Ridgwa;· ·· Color Standard;; anä color nomenclature,

Washington, D. C. 1912..

SP = Lösliche Pigment3.

A09823/1096

Tabelle 4
Merkmale der Kulturen auf einigen Standardmedien

II

III

IV

VI

Ml

gut hoch, sehr faltige Oberfläche;

VM grau (Oc4s)

AM oKne,

SP Dunkelbraun mit rötlichen Schimmer (Oc5r)

gut, rauhe

Oberfläche,

hart und

krustig;

VM-

Hellbraun mit orangem Schimmer

AM

mattrosa

(Oc7a)

SP Hell

gelblichbraun, (Coo2a) bis mattrosabraun

mäßig flach,

leicht rauhe

Oberfläche;

Hellbraun
mit leichtem
orangen
Schimmer

AM ohne

SP ohne

mäßig glatte

Oberfläche;

VM

gelb bis

orange,

AM
rosa-weiß

SP
ohne

mäßig,

VM
Gelb
orange,

mehlig,

weiß,

SP
ohne

schwach bis

mäßig,

farblos;

AM

Schwach weiß bis fahlgrau (rdg^Ll

SP
ohne

O cn CJ) ro

II

Tabelle 4 (Fortsetzung)

III IV

VI

	M2	G	G	G	SP	G	G	Nicht
		gut, hoch	gut, hoch	gut, hoch	Hellbraun	gut;	gut;	be
		sehr faltige	Oberfläche	sehr rauhe	mit Spuren			schrie
		Oberfläche;	rauh, hart,	Oberfläche;	von orange			ben.
			krustig;		(0c3r)
		VM	VM ■	VM		VM	VM
		dunkel	kräftig rot	kräftig rot		gelblich	dunkel-
•Ρ»		braun mit	(Or^r)	oder braun	tendierend	orange bis
O		Spuren von		(04r)	zu organge-	geIb-orange
CD		hellrot bis			gelb	oder um
OO		graubraun				gekehrt;
ro Ca>		(O5r-Oc4s)
		AM	AM	AM	AM	AM
σ		oEhe	gelblich weiß _λΚμω	rosa	mehlig,
co			mit hell		überreich,
CD					blaßrosa
			rotem Schimmer
		SP	(Coo7a) '	SP	SP
		dunkelbraun	SP	helle	braun;
		mit Spuren	Eräftig rot	Ber,nstein-	Reste
		von rötlich	(0r4r)	farbe
		bis hell
		grün-braun
		(Oc5r-Coo4r)

O CD CD

I

G

II

G

Tabelle

G.

4 (Portsetzung)

G

V

G

VI

G

gut, hoch,

gut, flach,

III

gut, hoch,

IV

Tiberreich,

gut rauh

Tiberreich

M3

sehr faltige

gleich

Oberfläche

grob,

aufgerollt,

und einge

mäßige, harte

sehr rauh,

rollte Ober

Oberfläche

fläche

VM

A

braun mit

Rot mit

kräftig

farblos bis

rötlich

weiß am

Spuren von

orange

gelblich

braun bis

Rande

Lavendel bis

Schimmer

(0c2r)

orange

Orange

(Oc5s-Ocj5r)

AM

R

ohne

weiß (Wl)

weißlich

mehlig,

farblos

mehlig,

fein,

fahl

orange,

SP

SP_

SP

S -

dunkelbraun

kräftig rot

intensiv

braun

mit hell

(0r4r)

bis braun

bernstein

rotem

(04r)

farbig

Schimmer

cn cn ro

II

Tabelle 4 (Portsetzung)
III IV

VI

	[4 G	G	G	G	G	AM
	mäßig bis	gut, hoch,	mäßig, flach;	mäßig, Ober	mäßig, Ober	mehlig
	gut, flach	Oberfläche		fläche glatt;	fläche Nlßht-	überreich
	mit hohen	hart, rauh,			glatt; Nicht	rosa-weiß
	Rändern	krustig;			De — schrie
	VM	VM	VM	VM	ben
	Hellbrau:.	Pahl mit	Gelb-braun	Kristallin
■Ρ*	mit orangem	leicht	(Coo2r)	bis gelblich;
ο	Schimmer	gelbem
co	(Mitte der	Schimmer
00	Kolonie)	(Co6a)
CO	bis orange
	mit rotem
—ϊ	Schimmer
O	(Ränder der
CO	Kolonie)
σ>	(OcJr-OJr)
	AM	AM	AM	¹ iV?
	\ ohne	Weiß (Wl),	Reste weif³'	reiflich mit
		mehlig;	am Rande	ro,¹-...·''
			der Kolonie	Schimmer
			(Wl)
	SP	SP	SP	SP
	aschgrau mit	Farblos bis	Gelb-braun	weich,
	leichtem	blaßrosa	(Coo2r)	gelblich
	Brauns chimmer	(0r2a)
	(Coo6t)

CD CO OD NJ CO

σ co cn

	II	Tabelle 4	(Portsetzung)	V	VI
I	G mäßig bis gut;	III	IV	G weiß, ge Ib orange;	G mäßig, farblos;
mäßig, leicht erhöht, Oberfläche faltig;	VM fahl bis leichter Grau schimmer;	G gut, flach, glatte Oberfläche;	G .Sunn;	A- überreich, mehlig, fahl orange;	A arm weiß an den Rändern
VM Hellbraun mit orangen Spuren bis intensiv orange (0c3r-0c-2r)	AM Weiß (Wl)	VM lachsfarbig rosa	VM farblos bis hellorange- rot;		R farblos;
AM ohne	SP ohne	AM Reste weiß (Wl)	AM dünn, weiß;	SP orange, Reste	S ohne
SP Hellbraun Lavendel (0c5m)	SP fahl orange (0c2a)'	SP öHne

Andrejewski, Honke & Gesthuysen, Patentanwälte, 4300 Essen 1, Theaterpiaiz 3

- 15 -

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Andrejewski, Honke & Gesfhuysen, Patentanwälte,4300 Essen !,Theaterplatz3

- 16 -

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409823/1096

m8

CD OO NJ CO

mäßig, flach, rauhe Oberfläche

VM

Hellbraun orange (0c2r)

AM ohne

SP

Gelb mit

leichtem

Grünton

(Coojm)

II

Tabelle 4 (Portsetzung) III IV

VI

gut, hoch, harte, rauhe Oberfläche

gut hoch,

rauhe

Oberfläche

schlecht

VM	VM
hellbraun	intens
mit orange	orange (02r)
bis braunen
Spuren
(Ocj5r bis
0c4r)	AM
AM	ohne
dünn hell-
rosa mit
Braun
schimmer
(Oo5a)	SP
SP	KeIl-
rFtlich	orange
braun	(0c2a)
(04r)

nicht beschrieben

AM
nicht

nich;·

beeeü ben

mäßig
dunkel von
gelborange

weich,
mehlig
weiß bis
weiß-rosa

mäßig
farblos
bis gelb

schwach

weiß

farblos

SP
ohne

S
ohne

'S) CO

23A0562

Andrejewski, Honke & Gesthuysen, Paientanwä!ie, +300 Essen \, Theaterplatz 3

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Ρη|Ο ·Η φ U O O

colJL, ,α &0Χ1--Ό

- 19 -

Die Erfindung wird nachstehend anhand einiger Beispiele des weiteren erläutert.

Beispiel 1:

100 ml einer Nährlösung nachstehender Zusammensetzung in einem 500 ml-Erlenmeyer-Kolben wurde mit einer Kultur Streptomyces G5/A beimpft:

Fleischextrakt	5 g
Hefeextrakt	5 g
Pepton	5 g
Cas e in-Hy dr oly sa t	3 g
Glucose	20 g
NaCl	15 g
Aqua dest. ad 1,000 ml
PH	7,3

Nach einem Wachstum von 48 h in einem.hin und hergehenden Shaker bei 28°C wurden 10# (v/v) der vegetativen Züchtung in 500 ml-Erlenmyer-Kolben mit Stauscheibe eingegeben, welche Jeweils 100 ml nachstehender Lösung enthielten:

Glucose 70 g

Sojabohnenmehl 5 g

Erdnußmehl 20 g

Ammoniumsulfat 7 g

KH₂PO₄ . 2g

CaCO, 6 g

409823/1096

- 20 -

MgSO₄-	1	g
CuSO₄*		.3 mg
ZnSO₄-	50	mg
MnSO₄-	4	mg
FeSO₄-	10	mg
CoCl₂-	2	mg
-7H₂O	1	mg
•5H₂o
'7H₂O
-4H₂O
• 7H₂o
•6HpO
Ammoniummolybdat
Aqua c
lest, ad 1,000 ml

pH (eingestellt mit Puffern)

Die beimpften Kolben wurden bei 28°C auf einem sich mit 250U/min bei einem Hub von 5 cm drehenden Shaker für 148-156 h bebrütet. Die Ausbeute an Rifamycin B betrug 4000 bis 4500 meg/ml.

Beispiel 2;

Der Mikroorganismus Streptomyces G5/A wurde bezüglich der vegetativen Phase unter den gleichen Bedingungen wie im Beispiel 1 gezüchtet.

In der Endphase wurde nachstehende Fermentationsbrühe verwendet:

Erdnußmehl

Sojamehl Glucose Propylen-Glycol Glycerol Schweres CaCO-*

25	5	g
10		g
100,		g
5	VJl	g
40	S
9,	S

4098 2.3/1096

(NH₄	h	4"	SO	4	0	4*	4H	2	0	1,000 ml
KH₂PO₄			AmmoniummOlybdat	• 2	6h	2	0
MgSO	7H	2	MnSO	4*	7H	2	0
	CoCl	4*	5H	2	0
	ZnSO	4*	7H	2	0
CuSO	Wasser	ad
FeSO

- 21 -

4,9 g 2 g

0,85 g

0,001 g

0,004 g

0,002 g

0,05 g

0,0033 g 0,01

pH (eingestellt mit Puffern) 6,6 - 6.,7 nach Sterlisierung.

Die Fermentierung wurde in der gleichen Weise wie im Beispiel 1 durchgeführt. Es ergab sich eine maximale Stärke von 5400 meg/ml an Rifamycin B. Chromatographische Untersuchungen ergaben keine wahrnehmbaren Mengen an Rifamycin-ännlichan Produkten.

Beispiel 3·'

Der Mikroorganismus Streptomyces G5/A wurde unter den gleichen Bedingungen wie im Beispiel 1 gezüchtet, wobei jedoch 2000 ml-Erlenmeyer-Kolben verwendet wurden, welche jeweils" 500 ml an Nährlösung enthielten. Nach 48 h wurden drei Kolben zur Beimpfung von 90 1 der gleichen Nährlösung in einem Gärbehälter aus rostfreiem Stahl verwendet. Die vegetative Züchtung erfolgt unter Rühren (500 U/min) und Belüftung (1 v/v/m) bei 28°C.

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Andrejewski, Honke & Gesthuysen, Patentanwälte. 4300 Essen 1, Theaterplatz 3

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Nach 35 h erhielt man etwa 7 Volumen-^ an Mycelium. Diese zweite vegetative Phase wurde zur Beimpfung von 900 1 einer Fermentationslb'sung gemäß Beispiel 2 in einem Gärbehälter aus rostfreiem Stahl mit einem Passungsvermögen von l^OO 1 verwendet.

Die Züchtung des Organismus erfolgte bei 28°C unter Rühren (170 U/min) und Belüftung ( 1 v/v/min) und einem Überdruck

von 0,2 kp/cm .

Nach einer Gärung für 15Oh ergab der spektrometrische Titer 5200/5500 ml. Die chromatographische Analyse ergab, daß praktisch nur Rifamycin B vorhanden war.

Ansprüche;

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Claims

Andrejewski, Hpnke & Gesthuysen, Patentanwälte, 4300 Essen 1, Theaterplatz 3

- 23 Patentansprüche :

Verfahren zur Herstellung von Rifamycin B, dadurch gekennzeichnet, daß man eine Mutante des Mikroorganismus Streptomyces albovinaceous, ATCC 12951, welche imstande ist, ein von analogen Nebenprodukten praktisch freies Rifamycin B zu ergeben, in einer gepufferten Nährlösung unter aeroben Bedingungen züchtet, wobei diese Nährlösung· assimilierbare Quellen von C,N und anorganischen Salzen enthält.
2) Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß als Mutante des Streptomyees albovinaceous, ATCC 12.951 Streptomyces GL)/A verwendet wird.
3) Mikroorganismus, welcher imstande ist. eine hohe Ausbeute an Rifamycin B zu ergeben, dadurch gekennzeichnet, daß es sich um Streptomyces G 5/A handelt, viel ehe s durch wiederholte mutagene Behandlung mit UV-Strahlen und anschließende Auswahl der Kolonien einer Kultur der Streptomyces albovinaceous, ATCC 12951, isoliert hergestellt ist.

Patentanwalt.

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