DE1467840C - Verfahren zur Herstellung von Tetracyclin - Google Patents

Description

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Herstellung von Tetracyclin durch aerobes submerses Züchten von Streptomyces aureofaciens in chlorhaltigen Nährmedien üblicher Zusammensetzung, das dadurch gekennzeichnet ist, daß man als Streptomyces aureofaciens den beim staatlichen Institut für Hygiene, Budapest, unter der Nummer 640 307.26 hinterlegten Streptomyces aureofaciens-Stamm einsetzt.

Der neue Stamm Nr. 640 307.26 wurde durch Mutation aus dem Stamm mit der Hinterlegungsnummer 110.22 beim staatlichen Institut für Hygiene, Budapest, erhalten und weist folgende charakteristische Eigenschaften auf.

Morphologie:

Die Sporophoren sind monopodiai-verzweigt, gewellt, an den Enden gekrümmt. Die Sporen sind rund oder schwach oval. ■

Saccharose-nitrat-Agar:

(Zusammensetzung: Saccharose 30,0 g, Natriumnitrat 2,0 g, Dikaliumhydrophosphat 1,0 g, Magnesiumsulfat 7 · H₂O 0,5 g, Kaliumchlorid 0,5 g, FerrosLilfat 0,01 g, Agar 20,0 g, destilliertes Wasser 1000 ecm, pH = 7,0 bis 7,3.)
Schwaches Wachstum. Entwickelt lediglich vegetative Mycelien, die eine bräunliche Farbe aufweisen. Luftmycelien fehlen, Sporen werden nicht entwickelt.

Saccharose-Ammonium-Agar:

(Zusammensetzung s. Saccharose-nitrat-Agar, jedoch mit Ammoniumchlorid an Stelle von Natriumnitrat.)

Mittelstarke Wachstumintensität. Die vegetativen Mycelien sind hellbraun. Keine löslichen Pigmente. Nach langer Kultivierung schwache Luftmycelien- und Sporenentwicklung.

Glucose-Asparagin-Agar:

(Zusammensetzung: Glucose 10,0 g, Asparagin 0,5 g, Dikaliumhydrophosphat 0,5 g, Agar 20,0 g, destilliertes Wasser 1000 ecm, pH = 6,8.) Wachstum: s. bei Saccharose-nitrat-Agar.

Cilycerin-Asparagin-Agar:

(Zusammensetzung: Glycerin 10,0 g, Asparagin 1,0 g, Dikaliumhydrophosphat 1,0 g, Agar 20,0 g, destilliertes Wasser 1000 ecm, pH- 7,0, mit NaOH.)

Wachstum wie bei Saccharose-Ammonium-Agar.

Glycerin-Calcium-malat-Agar:

(Zusammensetzung: Glycerin 10,0 g, Calciummalat 10,0 g, Ammoniumchlorid 0,5 g, Dikaliumhydrophosphat 0,5 g, Agar 20,0 g, destilliertes Wasser 1000 ecm.)
Kein Wachstum.

Glucose-Pepton-Agar:

(Zusammensetzung: Glucose 40,0 g, Pept'on 10,0g, Agar 20,0 g, destilliertes Wasser 1000 ecm, pH = 5,6.)

Wachstum gut. Vegetative Mycelien braun. Lösliche Pigmente schwach braun. Schwache Entwicklung von Luftmycelien, keine Sporenentwicklung. '

Nähr-Agar:

(Zusammensetzung: Pepton 5,0 g, Fleischextrakt 5,0 g, Natriumchlorid 5,0 g, Agar 20,0 g, destilliertes Wasser 1000 ecm, pH = 7,2 bis 7,4.)
Wachstum schwach. Die vegetativen Mycelien sind hellbraun, gelblich. Keine Luftmycelien. Keine Sporenentwicklung.

Stärke-Agar:

(Zusammensetzung: lösliche Stärke 10,0 g, Natriumnitrat 1,0 g, Dikaliumhydrophosphat 0,3 g, Natriumchlorid 0,5 g, Magnesiumcarbonat 1,0 g, Agar 20,0 g, destilliertes Wasser 1000 ecm.)
Kein Wachstum.

Glycerin-Stärke-Glutamat-Agar:

(Zusammensetzung: Glycerin 10,0 g, Natriumglutamat 1,0 g, Stärke 10,0 g, Prolin 0,25 g, Vitamin B₁, Vitamin B₆, Calciumpantothenat 25 bis 35 mg, Dikaliumhydrophosphat 0,25 g, Ferrosulfat 0,01 g, Agar 20,0 g, destilliertes Wasser 1000 ecm, pH = 7,2.)

Wachstum mittelmäßig. Vegetative Mycelien braun. Sehr schwache Entwicklung von bräunlichen, löslichen Pigmenten. Keine Luftmycelien. Keine Sporenentwicklung.

Gelatine:

(Zusammensetzung: Gelatine 200 g, Leitungswasser 1000 ecm, pH = 7,4.)
Verflüssigt Gelatine. Auf der Oberfläche der Gelatine erscheint ein brauner Kreis, in welchem dunkelbraune lösliche Pigmente zu beobachten sind.

Glucose-Hefeextrakt-Fleischextrakt-Pepton-Agar:

(Zusammensetzung: Glucose 10,0 g,.Hefeextrakt 10,0 g, Fleischextrakt 4,0 g, Pepton 4,0 g, Natriumchlorid 2,5 g, destilliertes Wasser 1000 ecm.) Wachstum intensiv. Vegetative Mycelien rotbraun. Lösliche Pigmente rotbraun. Luftmycelienentwicklung schwach. Sporenentwicklung mittelmäßig. Die Sporenschicht wird im Laufe einer längeren Kultivierung schwachbraun.

Kartoffelextrakt-Pepton-Glycerin-Agar:

(Zusammensetzung: Kartoffelextrakt aus 100 g Kartoffeln, Pepton 2,0 g, Glycerin 5,0 g, Magnesiumsulfat 0,5 g, Dikaliumhydrosulfat 0,5 g, Natriumchlorid 0,5 g, Ferrosulfat 0,01 g, Agar 20,0 g, Leitungswasser 1000 ecm.)

3 4

Wachstum intensiv. Vegetative Mycelien dunkel- B ' ' 1 1

braun, fast schwarz. Eine intensive Entwicklung ^ '

von dunkelbraunen löslichen Pigmenten. Luft- DerStreptomycesaureofaciens-Stamm Nr. 640 307.26

mycelien keine. Sporenentwicklung keine. wird auf einem festen Nährboden gezüchtet und aus

...,,. 5 der entwickelten Sporenkultur 50ecm eines sterilen

Maisque wasser-Agar: , , , _XI... . , ■ ■ _cnn ^ ,

^{M 6} Inokulum-Nahrbodens in einem 500-ccm-Erlenmayer-

(Zusammensetzung: Saccharose 10,0 g, Mais- Kolben eingeimpft. Zusammensetzung des festen Nährquellwasser [bis 50%] 6,5 g, Kaliumdihydro- bodens: Maisquellwasser (feucht) 0,65%, Saccharose phosphat 4,0 g, Ammoniumphosphat 2,0 g, Ma- 1,0%, KH₂PO₄ 0,4%, (NH₄)₂SO₄ 0,2%, MgSO₄ gnesiumsulfat 5,0 g, pH = 6,6.) io 0,5%, Agar 2,0%, pH = 6,6.

Wachstum intensiv. Die vegetativen Mycelien sind Zusammensetzung des Inokulumnährbodens: Maisbraun und entwickeln braune, lösliche Pigmente. quell wasser (feucht) 2,0%, Saccharose 2,0%, CaCO₃ Luftmycelien weiß. Sporenentwicklung stark. Die 0,2%, (NH₄)₂SO₄ 0,1%, KH₂PO₄ 0,5%, MgSO₄ Sporenschicht ist anfänglich rosa-hellgrau, später 0,25%, pH = 6,5.

braun. 15 Die Kultur wird 24 Stunden auf einem Schüttel-

PIi 1 Atf Vt tisch bei 28°C der Inkubation unterworfen und danach

ueiiuiose-AKtivitat: _{die entwickelte} Kultur in einen 12-1-Glasfermenter

Nicht meßbar. übertragen, der 6 1 eines Inokulumnährbodens folgen-

1· Ai,t· -ft ^er Zusammensetzung enthält: Maisquellwasser

Lipase-Aktivitat: _{ao (feucht) 1>6}<γ_β> Saccharose 3,0%, (NHJ₂SO₄ 0,7%,

Sehr stark. CaCO₃ 0,5%, pH = 6,5.

Die Inkubation wird bei einer Luftzufuhr von 61/

Der neue, gemäß Erfindung eingesetzte Stamm kann Min. unter Rühren von 440 Umdr./Min. bei 28° C

in Schüttelkulturen eine Tetracyclinkonzentration von 36 Stunden durchgeführt, danach 300 ecm der ent-

6000 bis 7000y/ccm und in Glasfermentern eine von 25 wickelten Kultur in 6 1 eines Fermentationsnährbodens

etwa 10 500 y/ccm erreichen. übertragen (12 1 Glasfermenter) und 88 Stunden, wie

Der neue Stamm produziert auch auf chloridhalti- oben angegeben, fermentiert. Zusammensetzung des

gern Nährmedium kein Chlortetracyclin, weist also Fermentationsnährbodens: Maisquellwasser (feucht)

— ebenso wie der Ausgangsstamm — keinen Chlorie- 2,5%, Stärke 6,0 %> Haselnußmehl 1,5%, (NH)₄SO₄

rungsmechanismus auf. Es ist somit nicht nötig, den 30 0,8%, CaCO₃ 0,9%, MnSO₄ 0,014%, Palmöl 0,5%,

Chloridgehalt des Nährmediums zu vermindern oder pH = 6,5. Der Chloridgehalt des Nährbodens beträgt

durch Zusatz von Inhibitoren die Chlorierung des 310y/ccm.

Antibioticums zu verhindern. Im Laufe der Fermentation wird der Tetracyclin-

Der Stamm Nr. 640 307.26 kann auf einem Nähr- gehalt des Mediums bestimmt:

boden gezüchtet werden, der als Kohlenstofflieferant 35 c_t . ₄₀ ^ ^₀ „o

Saccharose, Stärke Maismehl Haselnußmehl, Fette _; ";;; _{25QQ 63QQ} ^₅₅₀ ^₄₅₀

oder öle, z. B. Palmol, enthalt. Als Stickstoffheferanten ^r'

kann man Maisquellwasser, extrahiertes Sonnen- 101 des so erhaltenen Fermentmediums werden

blumenmehl, Haselnußmehl, Hefenextrakt oder Mais- durch Zusatz von konzentrierter Salzsäure auf

mehl verwenden. Es ist zweckmäßig, wenn der Nähr- 40 pH = 2,2 eingestellt und filtriert, 11 einer 10%igen

boden auch Ammoniumsalze, zweckmäßig Sulfat, MgO₂-Lösung zugesetzt, mit 20%iger NaOH-Lösung

Chlorid oder Nitrat bzw. Kalium-, Calcium- oder der pH-Wert auf 10 eingestellt, der ausgefallene Nieder-

Magnesiumsalze bzw. Mangansalze, vorteilhaft Ka- schlag abfiltriert, mit Wasser gewaschen und getrock-

liumhydrogenphosphat, Magnesiumsulfat, Calcium- net. 250 g des trocknen Komplexes werden in 125 ecm

carbonat, Mangansulfat enthält. Der pH-Wert des 45 Wasser suspendiert und in kleinen Portionen eine

Nährbodens beträgt vor dem Beimpfen 6,3 bis 7,0, Lösung von 125 g (NH₄)₂SO₄ unter Rühren zugesetzt,

zweckmäßig 6,5. Die Fermentation wird bei 28° & Nach vollständiger Lösung wird die wäßrige Lösung

durchgeführt. Man kann aber auch so verfahren, daß zweimal (250 + 150 ecm) mit n-Butanol je 1 Stunde

man bei 27 bis 28° C fermentiert und am Ende der extrahiert, die Butanolphase mit 5 g Lignin versetzt,

Fermentation die Temperatur auf 30 bis 32° C erhöht. 50 danach 50 ecm Methanol zugegeben, 30 Minuten ge-

Die Dauer der Fermentation beträgt im allgemeinen rührt und filtriert, mit 75 ecm 2 η-Salzsäure und 75 ecm

70 bis 90 Stunden, meistens 80 Stunden. 0,1 η-Salzsäure das Tetracyclin in die wäßrige Phase

Zur Aufarbeitung des gemäß der Erfindung erhalte- extrahiert, mit Natronlauge der pH-Wert auf 5,2 ein-

nen Fermentationsmediums säuert man das Fermenta- gestellt, die ausgeschiedene Base abfiltriert, gewaschen

tionsmedium auf pH = 1 bis 4 an und filtriert die 55 und im Vakuum getrocknet. Man erhält 70 g eines

Mycelien ab. Es ist ein Vorteil des Stammes, daß die Produktes mit 880y/mg Aktivität. Ausbeute: 59,2%.

Aufarbeitung der Fermentbrühe unproblematisch ist, ...

da die Mycelien sich leicht filtrieren lassen. Zur Isolie- B e 1 s ρ 1 e l 2

rung des Tetracyclins aus dem Filtrat kann man In der im Beispiel 1 angegebenen Weise wird ein

Methoden benutzen, die bei Stämmen mit geringerer 60 Fermentationsmedium hergestellt, das 10 450y/ccm

Tetracyclinproduktion benutzt werden. Die größere Tetracyclin enthält, der pH-Wert mit Oxalsäure auf 2,0

Einheitszahl erschwert die Isolierung nicht, sondern eingestellt und von den Mycelien abfiltriert. Der pH-

wirkt vorteilhaft. Es ist z. B. zweckmäßig, das Tetra- Wert des Filtrats wird mit konzentriertem Ammonium-

cyclin in Form seiner mit Tetranol gebildeten Addi- hydroxyd auf 3,0 eingestellt, darauf eine 10%ige wäß-

tionsverbindung zu isolieren (vgl. österreichische 65 rige Lösung von 85 g Dodecylacetat-Pyridiniumchlorid

Patentschrift 247 519). unter ständigem Umrühren zugesetzt, der pH-Wert mit

Weitere Einzelheiten des Verfahrens sind in den Bei- konzentriertem Ammoniumhydroxyd auf 7,5 einge-

spielen zu finden. stellt, der ausgefallene Niederschlag abfiltriert, in

300 ecm n-ButanoI aufgenommen und mit 300 ecm n-Butanol, das 10°/₀ Oxalsäure enthält, versetzt. Der pH-Wert der Lösung beträgt nun etwa 2,0, und es bildet sich ein Niederschlag, der abgenutscht wird. Das Tetracyclin wird aus der Butanollösung in 0,01 n-Salzsäure extrahiert, der pH-Wert des Extraktes mit 10%-iger Natronlauge auf 5,2 eingestellt, wobei 83 g Tetracyclin-Hydrat aus der Lösung ausfallen. Aktivgehalt 890 y/mg. Ausbeute 68,5 °/₀.

Aus der USA.-Patentschrift 3 092 556 ist es bereits bekannt, mit dem Streptomyces aureofaciens-Stamm ATCC 13 908 bei aerobem submersem Züchten in chloridhaltigen Nährmedien üblicher Zusammensetzung Tetracyclin zu produzieren. Bei Einsatz dieses Stammes wird jedoch nach 146stündiger Fermentation nur eine Antibiotikum-Ausbeute von insgesamt

6580 y/cem (vgl. Beispiel 4),
6080 y/cem (vgl. Beispiel 5),
8770 y/cem (vgl. Beispiel 6)

erreicht, mit dem gemäß Erfindung eingesetzten Stamm dagegen nach 88stündiger Fermentation eine Antibiotikum-Ausbeute ypn

10 450 y/cem (vgl.. Beispiel 1).'■■

Der gemäß Erfindung erzielte Fortschritt liegt in der mit dem Stamm der Erfindung erzielten höheren Tetracyclinausbeute.

Claims (1)

1. Patentanspruch:

   Verfahren zur Herstellung von Tetracyclin durch aerobes submerses Züchten von Streptomyces aureofaciens in chlorhaltigen Nährmedien üblicher Zusammensetzung, dadurch gekennzeichnet, daß man als Streptomyces aureofaciens den beim staatlichen Institut für Hygiene, Budapest, unter der Nummer 640 307.26 hinterlegten Streptomyces aureofaciens-Stamm einsetzt.