DE1467840A1 - Verfahren zur Herstellung von Antibiotika - Google Patents

Description

D / Ö H U

Patentanwälte Dr. LOTTERHOS, Dr.-Ing. LOIIERHW

6000 FronWurt a. AA. AnnasH* 11.

Verfahren zur Herstellung von Antibiotika

Es wurden versohiedaie Methoden zur Förderung der Fähigkeit von Streptomyceten, Antibiotika zu erzeugen, vorgeschlagen. In erster Jiinie wurden f|ir diesen Zweck vereohiedene Irradiationsmethoden verwendet (US Patentschrift No,2,545.572, J.Bact. 56, 457 1948), jedoch wurden zur Erzielung einer Mutation auch einige chemische Verbindungen vorgeschlagen, z.B. salpetrige Säure (1,οθ7·52ο JiTf.) Aetnylenimin (Antibiotiki 6, /1961/, Io55), Rydroxylamin und Phenylisooyanat (aota Microbiol.Hting.^, 273» 1962). Diese Verbindungen können bei gewissen Strepto-

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mypeten erfolgreich angewendet werden, in anderen Fällen wird die Prodttktionsfähigkeit.lediglich um etwa 10-20 # erhöht.

Es wurde nun gefunden* dass die Antibiotikum-Produktionafähigkeit von Streptomyceten erhöht werden kann, wenn man den Stamm einem mutagenen Einfluss in Gegenwart von Verbindungen, welche das Eadikal

oder

enthalten, unterwirft»

Bs ist vorteilhaft, Verbindungen zu verwenden, welche ausser dem Nitrofuranring no&h weitere heterocykli.sche Radikale aufweisen« So kann man zum Beispiel für diesen Zweck l-(5-Nltrofurfurjliden-amino)-2-imidazolidin-thion oder 5-Nitro~2-furaldehyd-semicarbazon, oder N-(5-nitro-2-furfuryliden)-l-amino-hydantoin verwenden. Man kann jedoch auoh einfachere Verbindungen der angegebenen Formel verwenden, ζ·Β. Nitrofuraldehyddiacetat,

¹ Ba ist vorteilhaft, wenn man zur Erzielung der IJutatien das Nitrofuranderivat in einer Konzentration von 1,0 4$nl - 20,0 J7ml verwendet« Es ist ferner vorteilhaft, die Mutation in Gegenwart von Säureamiden durchzuführen» welche in einer Quantität von 0,01 * 0^5 Volumen/^ berechnet auf das Nährmedium verwendet.werden» So kann man z.B. zwöckmässig Dimethylformamid verwenden.

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Bei der Aueführung dee Verfahrens wurden die alfl mutagene Agenten verwendeten Verbindungen aweokmässig in Säureamid gelöst* worauf die so erhaltene Lösung unter itefilen Bedingungen bei etwa 6O⁰O zu dem sterilen Nährmedium gegeben wird. Ale Nährmedium kann man vorteilhaft Agar in .erstarrtem Zustand verwenden.

Di·*Sporen dee Stammes werden in einem synthetischen flüssigen Nährmedium unter submerseη Bedingungen etwa ■6-14 Stunden kultiviert, worauf die Suspension der bereits keimenden Sporen auf das in oben beschriebener Weise vorbereitete Nährmedium geimpft wird·.

Nach dem Beimpfen wird das Nährmed-iura zweckmässig bei einer Temperatur von etwa 28⁰C 12-20 Tage lang inkubiert, worauf die entwiofcalten Kulturen in bekannter Weise auf ein festes Nährmedium isoliert werden« Die antibiotisohe Aktivität der so erhaltenen Stämme kann in Sehüttelkulturen untersucht werden« .

.So wurden z.B. mit der oben beschriebenen Methode Streptomycee aureofaciens und Streptomyces rimosus Stämme als Testmikroorganismen verwendet, worauf die Mutationsfrequene aue der Zahl der Rückmutatisnen - berechnet auf die Auegangespouenzahl *- (Appl.Ilicrobiol., 6, 45, 1958) bestimmt wurde, und zu den folgenden Ergebnissen führtet

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Spontane I. Hr ' . " III*

Rüokmu-

tation 2,5 4,5 7*5 2,5 4«* 7*5 2.5 4.5 7^Sr

♦ 10

.-6

.ΙΟ

"⁶

tf/ml .10"⁶

S.aureefaoiens '■ N-4 Irret 1*

S*au*eQfacienB ΪΓ-9 met 3"

S aureofaciens Ä- xl met** am 2"

0.28

6,2 5a5 3.2 5.-5 4.5 5.2 3.5 1.0

0,041 4.2 3»0 2,5 3.0 2.8 >.5 1.5 0.5 Oil

0.083 0.3 0.2 0.1 0.2 0.2. 0.1 0,2 0.1 0**.

S«rimos N-4l am

0.062

4.8 3.1 2,2 2.6 2.0 1.1 0.5 0.5

β l-(5-K'itrQ-furfuryliden-amino)-2-imidazalicLin-thion II m 5-Nitro-2-furaldehyd-semicarbazon
III - N-(5-Nitro-2-furfuryliden)-l-amino-hydantoin

Aus obiger Tabelle ist ersichtlich, dass die Verbindungexi im Falle von verschiedenen Streptomyceten eine mutagene Aktion ausüben* Für diesen Zweck können folgende Stämme verwendet werden: Streptomyces aureofaciens, S. riraosus, S. antibioticus, S· erythreus, S.fradiae, S· 'flavoalbus, S.'griseus, S. hygroscop.icue, S. noursei, S· niveus, usw., sowie auch weitere Streptomcyes Stämme^ welche Antibiotika produzieren.

Es wurde weiter gefunden, dass die neuen Mutanten, welche gemäss der Erfindung hergestellt wurden, sich bei der Fermentation auszeichnen« So wird z.B. im Falle des Stammes CDSD-314 Streptomyces aureofaciens -(siehe unsere Patentana^lung DAS 1,128.599') die neue Methode erfolg-

reich verwendet. Bs ist bekannt, dass dieser Stamm fähig iBt, auf einem chloridhaltigen Nährbodea lediglich Tetraoyklin zu synthetisieren, weil durch das Ausschalten des Ohlorierungsmechanismus die Biosyntheüe. von Chlortetraoyklin nicht eintrifft. Zur Zeit des Auffindene dieses Stammes konnte mit dem Stamm CDSD-314 ein Tetracyklingehalt von 2.000-2,500 B/ml Tetraoyklin in der Permentbrüha erzielt werden.

Nach dem Verfahren der Erfindung kann aus dem obenerwähnten Streptomyces aureofaciens CDSD-314 der neue Stamm A-802934 (deponiert bei dem ungarischen Staatlichen Institut für Gesundheitswesen in Budapest unter No. 640 3Ο7·26) gewonnen werden. Wenn man diesen Stamm bzw» Hereditäre, Varianten oder bekannterweise hergestellte Mutanten desselben fermentiert, so wird eine bedeutende Erhöhung der Antibiotioumsynthese im Vergleich mit dem Ausgangestamra beobachtet.

Der neue Stamm wurde folgendermassen hergestellt: Streptomyces aureofaciens CDSD-314 (Setracyklinproduktion 2.200 E/ml)

Behandlung mit mehreren verschiedenen mutagenen Agenten: mehrmalige Röntgen-, mehrmalige UV-Bestrahlung, Behandlung mit Aethylenimin, ENOg, sowie anhaltende, artifizielle und natürliche Selaktisa*

Θ-81305 Stamm (Tetracyklinproduktinn 3»5OO E/ml)

Inkubation der Sporensuspension 8 Stunden lang auf einem synthetischen Nährboden (Zusammensetzung: Saccharose

— 5

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2,5*, KH₂PO₄ 0,1*, (BH₄)₂SO₄.Q,3*, CaCO₃ 0,3 *, pH - 7,0), und anschließende Inkubation auf einem Agar-Nährmedium in Gegenwart von 2₇5 tf* l-(5-Nitro-furfuryliden-amino)- -2-imidazolidin-thion und 0,05* Dimethylformamid*. Isolierung nach Entwicklung der Kulturen

A-8OI5OO {Tetracyolinproduktion 4.800 E/ml)

I .

Inkubation der Sporensuspension 1O_x Stunden lang auf dem obenerwähnten synthetischen Nährboden und anschliessende Inkubation auf einem Agar-Nährboden in Gegenwart von 4,5 «T/ml l-(5-Nitro-furfuryliden-amino)-2-imidazolidinthion, Isolierung I - ·

A-802934 (letracyölinproduktion 6·200 E/ml

Natürliche Selekt ·-

A-II6OO7 (Tetracyllinproduiction 7.300 E/ml.

In Schiittelkig&turen kann erfindungsgemäas ein Tetracyolinniveau von 6-7*000 3/ml erreicht werden, während in Glasfermentoren etwa 10.500 E/ml hergestellt werden können. Der neue Stamm synthetisiert ebenso wie der Ausgangsstamm auch auf chloridhaltigem Nährmedium kein Chlortetracyclin, weist also ebenso wie der Ausgangsstamm keinen öhlorieiungsmechanismus auf. Es ist also nicht nötig, den Chloridgehalt des Nährmediums zu vermindern oder durch Zusetzung von Inhibitoren Chlorierung ctea Antibiotikums aufzuheben.

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- 'Der neue Stamm wird duroh folgende Eigenschaften charakterisiert;

Morphologie: Die Sporophoren aind monopodial verzweigt, gewellt, an den Enden gekrümmt. Die Sporen sind rund oder, schwach oval»

Baocharose-nitrat-Affar: (Zusammensetzung: Saccharose 30,0 g, Natriumnitrat 2,0 g, Dikalium-' hydrophosphät 1,0 g, Magnesiumsulphat 7»HpO 0,5 g> Kaliumchlorid 0,5 g» Ferrosulphat 0,01 g, Agar 20,0 g, destilliertes Wasser 1000 ml, pH « 7,0 - 7,3). Schwaches Wachstum. Entwickelt lediglich vegetative Mycelien die eine bräsriLche • Farbe aufweisen. Luftmyoelien fehlen,

Sporen werden nicht entwickelt,

Saccharose-Ammonium-Agar: Zusammensetzung: (siehe Saccha*· rose-nitrat-agar jedoch mit Ammoniumchlorid an Stelle von natriumnitrat)· Mittelstarke Wachstumintensität. Die vegetativen Myoelen sind hellbraun. Keine löslichen Pigmente. Nach langer Kultivierung schwache Luftmyoelien- und Sporenentwicklung.
Glucoae-Aaparagin-Agar: (Zusammensetzung: Glucose 10,0 g,

Asparagin 0,5 g» DikaliurJiyurophosphat 0,5 g, Agar 20,0 g, destilliertes Wasser 1000 ml, pH β 6,8)· Wachstum: siehe bei Saccharose-

nitrat-Agar.
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Glycerin-Asparagin-Agav: (Zusammensc r Glycerin 10,0 g_s Asparagin l.,0 g, Dikali' .; iosphat 1,0 g, Agar. 20,0 ,;, destilliert; γ isser 1000 ml, pH *= 7,0, nit UaOH). Wac ^; ;. λ wie im Falle von Saccharose-Ammonium- ; ■.

GIy c er in- CaI c i um-ria 1 a t - Agar {'" Jf r r ι · e t zung:' GIy c e rin 10,0 g, Calcium-maia!. g_t Ammonium chlor id 0,5 gj Dikaliumhydrophc· .: it 0,5 g» Agar 20,0 g, .deatilliertea Waseer K ' ;.'·.)· Kein Wachstum«,

Glucose-Pepton-Agar: (Zusammensetzt Glucose 40,0 g, Pepton 10,0 g, Agar 20,t d3?tilliertes Wasser 1000 ml, pH » 5_tt>* Wachstum gut. Vegetative liycelien bro .κ, Lösliche Pigmente schwach braun« Schwache f r'wicklung von Luftmycelien, keine Sporenen ;v icklungt

Nähr- Agart (Zusammensetzling: Pepton 5,0 g, Fleischextrakt 5,0 g, Natriumchlorid 5,0 g, Agar 20,0 g, destilliertes Wasser 1000 ml, pH - 7,2 ~ 7,4)» Wachptum schwache Die vegetativen Ideellen sind hellbraun, gelbich* Keine Luftmyelien. Kein^ Sprenentwicklunge

StärkerAgar: (Zusammensetzung: lösliche Stärke 10,0 g, Natriumnitrat 1,0 g, Dikaliumhydrophosphat 0,3 g, Natriumchlorid 0,5 g, Magnesiumoarbonat 1,0 5, Agar 20,0 g, destilliertes Wasser 1000 ml). Kein Wachstum.

BADORJGiNAL

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GIy oerin-Stärke-Glutamat-Agar; (Zusammensetzung* G-lycörin 10·,0 g, Natriumglut unat 1,0 g, Stärke 10,0 g, Prolin 0,25 g» Vitanin B^, Vitamin Bg, Oalciumpantothenat. 25-^5 Wi₉ Dikaliumhydrophosphat 0,25 g, Ferrosulphat 0,01 g, Age* 20,0 g, deatilliertes Wasser 1000 ml, pH » 7,2). Wachstum mittelmäBSig· Vegetative Myeelieh braun. Sehr echwache Entwicklung von brä?'· "4-chen, lösliciien Pigmenten« Seine Luftmyoelen. Keine Sporenentwioklung.

gelatines (Zusammensetzung: Gre la tine 200 g, , ieitungewasser 1000 ml, pH » 7,4). Verflüssigt die Gelatine, Auf der Oberfläche der Gelatine erscheint ein brauner Kreis, in welchem dunkelbraune lösliche Pigmente zu beobachten sind·

Gluooae«-Hefeextrakt-ffleischextrakt~Pepton--Affar:

iZußammensetzung: Glucose 10,0 g, Hefeextrakt 10,0 g,Fleischextrakt 4,0 g, Pepton 4,0 g, Natriumchlorid 2,5 g? destilliertes Wasser 1000 ml)· Wachstum intensiv· Vegetative Mycelien rotbraun» Lösliche Pigmente rotbraun» Luftmycelienentwicklung schwach, Sporenentwioklung mittelmässige Die Sporenschicht wird im Laufe einer längeren Kultivierung schwachbraun.

Kartoffelextrakt-Pepton-Glycerin-Agar: (Zusammensetzung: Kartoffelextrakt aus 100 g Kartoffeln,

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AO

Pepton 2,0 g, Glycerin 5,0 g, Magnesiumsulphat 0,5 g, Dikaliumhydrosulphat 0,5 g, Natriumchlorid 0,5 g, IPerrosulphat 0,01 g, Agar 20,0 g, Wasserleitungawasser 1000 ml), Wachstum intensiv. Vegetative Ijfycelien dunkelbraun, fast schwarz. Eine intensive Entwicklung von dunkelbraunen löslichen Pigmenten. Luftmycelien keine. Sporenentwicklung keine» Maisquellwasser-Agar: (ZusanuHensetzung: Saccharose 10,0 g_f Maisquellwasser /bis 50 $>/ 6,5 g, Kaliumdihydrophosphat 4,0 g, Ammoniumphosphat 2,0 g, llagnesiumsulphat 5,0 g, pH = 6,6). Wachstum intensiv» Die vegetativen Mycelien sind braun und entwickeln braune, lösliche Pigmente. Iiuf tmyoelien weiss« Sporenentwicklung stark· Die Sporenschicht ist anfänglich roo^farbenhellgrau, später braun_e
.Qelluloee-AktivitUt: nicht messbar.
Mpase-Aktivität:. sehr starke

Der Stamm A,802934 Szw» die bekannterweise hergeetellten Hereditären desselben können auf einem Nährboden gezüchtet werden, welcher als Kohlenstoffquelle Saccharose, Stärke, Maismehl, Haselnussmehl, Fette oder öle, z.B. Palmenöl enthält. Als Stickstoffquellen kann man Maisquellwasser, extrahiertes Sonnenblumenmehl, Hasel-

nueaniehl, Hefenextrakt odor Maismehl verwenden. Es ist zweckmässig wenn der Nährboden auch Ammoniumsalze, zweck-

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massig Sulphat, Chlcri'. oder Nitrat, bzw« Kalium-Öalcium-, oder Magnesium Salze, Izw. Mangansalze, vorteilhaft Kaliumhydrogenphosphat, Magnrsiumsulphat, Calciumcarbonat, Mangansulphat cathält« Der pH-Wert des Nährbodens beträgt vor dem Beimpfen 6,3 - 7,0, zweckmässig 6,5· Die fermentation wird bei 25-35⁰G, zwcckmässig bei 28⁰O durchgeführt. Man kann aber auch so verfahren., dass man bei 27-28⁰O fermentiert, und am Ende der Fermentation die Temperatur auf 30~32°0 hebt* Die Zeitdauer der Fermentation beträgt im allgemeinen 70-90 Stunden, <"· listens 80 Stunden«

Die Aufarbeitung des Stammes gemäss der .Erfindung erfolgt dureh Ansäuern des Fermentmediums auf pH - 1-4 und Filtrieren der Mycelien. Es ist ein Vorteil des Stammes, dass die Aufarbeitung der Fermentbrühe kein Problem bereitet, da die liycelien leicht filtriert werden. Aus dem Filtrat kann das Tetracyclin mit den LIethoden isoliert werden, die bei den Stämmen gebraucht wV-Sden, welche weniger Tetracyclin produzieren; die grössere Einheitszahl ersohwert die Isolierung nicht, sondern wirkt vorteilhaft. Bs ist z.B. zweckmässig, das Tetracyclin in Form seiner mit Tetranol gebildeten Additionsverbindung zu isolieren· (Siehe Patentanmeldung No. C 31 459.)

Weitere Einzelheiten des Verfahrens sind in den Beispielen zu finden.

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Der Btreptomoyee aureofaoiena A-802 934 Stamm auf einem festen Nährboden geachtet, worauf aus Her entwickelten Sporenkultur 50 ml eine β aterlleh Inokulum-Nährboden· in einem 500 ml Erlenmayer-Kolben beimpft wer* den, Zusammenseteung des festen Nährbodens* Maisauell- ^; wasser (feucht) 0,65 rf» Saooharose 1,0 K, KHgKf/ 0,4 4>t (ΗΗ₄)₂βΟ₄ O_tP>, Mg80₄ 0^5 Ii, A?ar 2,0 *, pH * 6|6.· 2«samatnsfteung ftee Xnokuluantfhrbodeniit (feuoht) 2,0 ^, Saccharose 2,0 $, OaOO, 0,2 0,1 ?(, IH₂K)₄ 0,5 <* MgSO₄ 0,25 <» pH'- 6,5. Die fcultiur wird 24 Stunden lang auf einem Sohlttteltlooh bei 2β°0 inkubiert, worauf die entwickelte Kultur in einen J.2 % Olasfermentor übertragen wird« Der Jtermentor enthält 6 1 eines Inokulum-Nährbodene folgender Zusammensetatlftfi Halsguellwasser (feuoht) 1,6 Ü, Saooharose 3,0 Ht₉ (NH₄)₂80₄ 0,7 *_t Oa0O_? 0,5 *, pH · 6,5· Be wird bsi einer Lufteinfuhr Von 6 1/min, bei Umrühren mit 440 U/min, . sei tB°B 36 Stunden lang lnkubier.t· 500 ml der entwickelten Kultur werden in 6 1 eines Permantßtions-Närhbodene übertragen (12 lJUasfermentor), worauf 8₇8 Stunden lang, wie oben beschrieben, fermentiert wird» Zueammeneetzung 4es Fermentations-Nährbodenst Maisguellwaseer (feucht) 2,5 <t Stärke 6,0 rf, Haeelnussmehl 1,5 rf, (NH₄J₂SO₄ O,θ rf, OaOO₃ 0,9 rf, MnSO₄ 0,014 rf» Pa linen öl 0,5 rf, pH - 6,5. Der Ch&ldgehalt des Nbhb'ödnes be «fet |1O #^ml· Im Laufe der Fermentation wird der Tetracyolingehalt des Mediums bestimmt; 809812/1332

Standern 40 * 64 70 88 Vml» «500 6590 655C 10450

.10 1 des so erhaltenen Fermentmediums werden durch Zueetzen von konzentrierter Salzsäure auf pH «2,2 eingestellt und filtriert. 1 1 einer 10 #-lgen MgCl₂-LO-eung werden eugesetzt, worauf mit einer 20 tf-igen NaOH-Löeung. der pH-Wert auf 10 eingestellt wird» Der ausgefallen·¹ Niederschlag wird filtriert, mit Wasser gewesohen und getrocknet. 250 g des trookenen Komplexes werden in 1Ä5 ml Waseär suspendiert, worauf in kleinen Portionen eint Ltfaung von 125 g .(NHi)gSO, unter Umrühren zugesetzt wird^ Naoh einer^vollständigen Lösung wird die wässerige Löeung tweimal (2*(0+l5O ml) mit h-Butanol je eine Stunde lang extrahiert, nie Bu-tanolphase wird mit 5 g Lignin versetzt, worauf 5Q ml Methanol zugegeben werden« Naoh während JO^Minuten wird filtriert. Hierauf wird

mit 75 ml 2nBaleeäure und 75.ml 0,1 η Salzsäure das letraoyolin in die wässerige Phase extrahiert· Duroh Zu- ' ■et^en von einer Ke/triumhydroxyd-Lösung wird der pH-Wert ' ■ auf 5,2 eingeetellt, die ausgeschiedene. Base wird filtriert, gewaichen und im Vaouum getrocknet.' 5b werden,70 g" eines

'.'-■.'.'.■■■·■■ .■■"■■, ■ ' ■■ ■ . . ■ Produkte· νορ'ββΟ 2/mg Aktivität erhalten. (Auebeute ι .39,2

>^M Aui einem festen Nährboden wer^dtn Sporen des Stammes

aureof,auiena A-116»007 gefcüohtet» mit welohe^; ulum und dann ein Inolculum-Nährboden beimpft

i ■■■-.

wird* Zusammensetzung der Nährmedien, sowie die Arbeitsweise sind dieselben wie im Beispiel 1 beschrieben wurde« Aus dem entwickelten Inokulura wird auf einen Fermeniationenährboden Übertragen, worauf 80 Stünden lang, wie im Beispiel 1 beschrieben, fermentiert wird. Der Tetradyolingehalt der Fermentbrühe beträgt Ilt250 3/ml. .

Der pH-Wert des Fermentmediams wird mit 10 η Schwefolsäure auf 2,2 eingestellt, worauf filtriert wird. Das iiltrat wird mit einer ITaOH-Lösung auf pH - 5»5 eingestellt, worauf 50 g OaOO, und 50 g OaOLj zugesetzt'werden· Naoh , Einstellung des pH-Wertes auf 8 mittels Ammoniumhydroxyd wird der ausgeschiedene !Eetraayolin-Oaloiumkomplex filtriert und getrocknet. 3a werden 240 g des Produktes erhalten, welche in 300 ml Wasser suspendiert werden. Nach üünsteilung des pH-Wertes auf 1,8 und anschliessendem filtrieren werden 50 g JToÖl äugesatzt und es wird dreimal mit je 100 ml n-Butanal extrr.hiert* Aus den vereinigten Extrakten wird das Tetracyclin i«. 150 ml 2 η Salzsäure und 150 ml 0,1 η Salzsäure extrahiert, worauf mit einer NaOH-Iüeung der pH-Wert vorerst auf 2,5 und ansohliessend mit Aethanolamin auf 5,2 eingestellt wird. Die ausgeschiedene TstraCyolinbase (70,4 g) besitzt nach Filtrieren, Wasohen, undTrocknen eine Aktivität von 990 E/mg. Ausbeute: 62 96. ^:

Beispiel 3

Naöh Beispiel I wird ein Färajentaticn&raediui]? herge- «teilt, welches 10.450 S/ml Ietreoy^in enthalt. Der pH-

• - 14, -

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• ■ ■ ' ■ ■. · . ·'

Wert wird mit Oxalsäure auf 2,0 eingestellt, worauf von den Nyoelen filtriert wird. Der pH-Wert des Filtrates wird mit konzentriertem Ammoniumhydroxyd auf 3,0 eingestellt, worauf eine 10 <«-ige wässerige Lösung von 85 β Dodeoylaoetat-Pyfidinlumchlorid unier ständigem Umrühren zu^ -•etst werden. ,Nun wird der pH-Wert mit konzentriertem Ammoni&GüSydroxyd auf 7»5 gestellt· Der entstandene Niedtreehlag wird filtriert, in 300 ml n-Butanol aufgenommen und mit 300 al n-Butanol, Welohea 10 £ Oxalsäure enthält, -versetzt· Der pH-Wert der fcösuhg beträgt nun etwa 2,0 und es ersoheint ein Niederschlag welcher abgenutsoht wird· Das Tetraoyolin wird aus der Butahollösüng in 0,01 h~Salesäure extrahiert, per pH-Wert des Brtraktes wird auf 5,2 eingestellt, dureh Eusetzen ron einer 10 $-lgen Natrium- * hydroxyd-LÖBunc. Θ3 g Tetraoyolihhydrat fallen aus der LUeung, Aktivgehalt 690 S/mg. Ausbeute 68,5 #·

Beispiel 4

Die Sporen des Streptomyoee aureofaolens 0-81305 Stammes (siehe Seite 5 der Beschreibung, Sporeneahl 10 /ml) werden auf einem Schütteltisch β Stunden lang bei 28⁰C (320 U/tain·) geeohUttelt. PUr diesen Zweok wird der folgende Nährboden verwendett ySaooharbse 2»5 ^t ^H₂PO, 0,1 H, (lfH₄)₂SO₄' 3A₁ OaOO₃ 0,5 *_t pH - 7,0. (100 ml in einem 500 al 3rXena&er-Koiben)· Ntt6h einef Inkubation von 8 Stunden wird die keimende Sporennuspenaion mit einer 100-faohen Verdünnung auf einen Nährboden übertragen, welcher mutagene Ageatlen enthält· Zusammensetzung des Nährbodens} • . - 15 -

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JL <

Maiequellw&aeer (feuoht) 0,65 ^i Saccharose 1,0 95, KH₂PO₄ 0,4 i_f (NH₄)^SO₄ 0,2 &, MgSO₄ 0,'5 #, Agar 2,0 pH - 6,6. Bs wird "bei 28⁰C 16 Stunden lang inkuBlert, nfichdem bei 6O⁰C unter sterilen Bedingungen soviel

tn^Tv' in. einer Lösung von Dime thy If orpiamid zugesetzt wenden, dass die Konseiitration dieser beiden Stoffe auf den Nährboden

• · ■' ■ ■· ,<>■■■

berechnet 2,5 ff/ml bzw. 0,05 ^ betrügt. Nach erfolgter, Inkubation wird mit der entstandenen Sporenkultur ein fester Nährboden otiger Zusammenseteung und ebenfalls die mutagenen Agentien enthaltend, beimpft, wobei der Stamm. A-801500 erhalten wird· Die antibiotisehe Aktivität dieses Stammes kann a.B. üolgendermaseen bestimmt werdeni Hit der Sporenkultur wird ein 50 ml steriler Vorinokulum-Fährboden in einem 500 ml · Erlonmeyer-Kolben beimpft. Zusammensetzung des Nährbod<?nöJ Aiaisguellwaeser (feuoht) 2,0 fS, Saccharose 2,0 ^, CaOO, 0,2 ^, (NH₄)PSO₄ 0,1 Ü\ KH₂PO₄ 0,5 9b, MgSO₄ 0,25 96, pH - 6,5» Die Ettltur wird 24 Stunden.lang bei 28⁰O auf einem Sohütteltisoh (320 ü/iäin) inkubiert, worauf 5 ml der entwickelten KuI-. tür in einem 500 ml Srlenmeyer-Kölben auf 50 ml sterilen Inokulum-N&irboden folgender Zusammensetzung tibertragen Werdens Maisquellwasser .(feucht) 1,6 i»_% Saccharose 3,0 Ü_t (NH₄)₂S0₄ 0,7 #, OaOO₃ 0,5 5i, Palmenöl 0,5 i»_t pH - 6,5. Nach einer 24 ständigen Züchtung bei 28⁰C auf einem Schütteltisch werden 5 ml der Kultur in 50 ml elnee sterilen Fermentations-Hährbodens Übertragen (500 ml Erlenmeyer-

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Zusammensetzung des Nährbodens» llaisciueHwasaer (feuoht) 8,5 it, (NH₄)JjSO₄ 0,8■*.*,- Stärke 6,0 *, Haselnuetmthj, 1,5 i»% OaCO^ 0,9 #» MnSO₄ 0,014 #, Palmenöl 0,3 ^t₁ pH - 6,5· Der beimpfte, Nährboden wird bei 28⁰O ' auf einem Schütteltisch inkubiert. Nach 96 Stunden wird - , der Tetraoyolingehalt dee Ferraentationsmediums bestimmt· , Aktivität* 4800 E/ml,

Sporendes Stammes Streptomyces aureofaoien» A-801500

(BporenzahJ. 10 /*ai, berechnet auf den Nährboden) werden

■ ■. ■ ■ ·

auf dem im ereten Absatz beschriebenen flüssigen Nährboden ίο Stunden lang bei -28⁰C auf einem Schütteltiseh inkubiert. . Naoh einer iiundertfaohen Verdünnung wird auf den oben an-. gegebenen festen Nährboden übertragen, wobei der Nährboden 4,5 e^ml l-(5~Nitro-furfuryliden-amino)-2-imida!5olidin- ^thton und 0,1 1> dimethylformamid enthält. Naoh 18 Tagen wird auf dem oben beschriebenen Agar-Nährboden der Stamm A-8O2934 isoliert· AntibiotisQhe Aktivität 6200 E/ml·

Der Streptomyoes aureofaoiens Ar802934 w^rd auf den im ersten Abeata angegebenen festen Nährboden geimpft, / wofür die entsprechend verdünnte Sporensuspenaion verwendet wird» Aus dieser Kultur wird durch natürliche Selektion der Stamm A-Il 6007 isoliert, dessen antibiotic ehe Akti*> vität 7300 3/ml beträgt·

Beispiel 5 -

Die Sporen des atreptomoyea aureofaciens G-8I305 Stamme« werden wi» im 3eiepiel 4 beschrieben, einer mutagenen Behandlung unterworfen, jedooh werden in den festen Nährboden 2,5 i^ml 5-Hitro-2-furaldehyd-aemioarbae5on und

SO 98 U/1332

0,09 £ Dimethylformamid gegeben« Aus der 16 tagigeη Kultur • Wird durch Übertragung der Stamm A*801700 isoliert! deeeen antibiotisohe Aktivität 4600 B/ml beträgt. (Bestimmung wie im Beispiel 4)· Wenn men das mutagene Verfahren wieder-* holt, steigt die äntibiotieohe Aktivität ähnlioh wie in Beispiel 4 angegeben wurde·

Beispiel 6 ■_; ■ _Λ ■

Sporen des Stammes Streptomyoes aureofaoiene 0-81305 werden, wie in Beispiel 4 beschrieben, einer Mutation unterworfen, wobei im festen Nährtfoden 2,5 «#ml 'N~(5-Nitro- *2-furfuryliden)-l-«aminohydantoin und 0,05 # Dimethylformamid verwendet werden. Aus der 16 tägigen Kultur wird, duroh Übertragung der Stamm A-801300 erhalten, depsen antibiotisohe Aktivität 4050 E/ml betragt. Wenn mart die Mutation wiederholt,' steigt die antibiotisohe Aktivität wie im Beispiel 4 beschrieben wurde.

geispiel 7

Sporen des Stammes Streptomyces rimosus D-I (antibiotisohe Aktivität» 3400 S/ml) werden 12.Stunden lang bei 28⁰O auf einem Schütteltisch gezüchtet, wobei ein Nährboden folgendfer Zusammensetzung verwendet wirdi Stärke 4 #» Sojamehl 1 <%, CaCO, 0,5 ^, NH₄NO, 0,4 #, NaCl 0,3 ^_t KCl 0,3 #, KgSO₄-O₁Ol Si, (N0₅)₂ 0,004 9fi, H₅BO₃ 0,$ U, pH - 7,0. Nach ,einer hundertfachen Verdünnung wird die Sp^rensuspension auf einen festen Nährboden folgender . Zusammensetzung übertragen: Maisq.uellwasser (feucht) 2,0 #, Stärke 1,3 *, KH₂ ^P°4 °'² *^f (^m^2^S0A °^>4 ^^f

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^λ.Ί

14Έ7840

OaOO₅ 0,5 *_t Agar 2,5 *, pH - 6,8, 7,5 furf\ii^lideh-amtno)-2-Jtoidazolidin-ilon, 0,15 # !Dimethyl-, formamid. Die mutagenen Agentien werden unter itörilön Bedingungen bei 6O⁰C in Löaung zum Nährboden gegeben. N&öh 12-tagiger Züöhtung bei 2B⁰C wird die Kultur auf den festen Nährboden obiger Zusammensetzung Übertragen» Bb wird Α%τ Stamm Streptomyoes rimobus DF-14 erhalten, delae*n antibiotlache -Aktivität 4150 mog/ml beträgt i (Beetimmung auf flüssigem Nährboden duroh Fermentation mit Sohttttelmethode). .

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Claims (1)

1. PAIPENTAHSPRJCHE

   1. . Verfahren zur Herstellung von Antibiotika durch Fermentation von Streptomyoes Stämmen auf Nährboden welche assimilierbare Kohlenstoff- und Stickstoffquellen enthalten, dadurch gekennzeichnet, dass Streptomyoes Stämme einem motagenen Einfluss in Gegenwart von Verbindungen unterworfen werden, welehe das Radikal der Formel

   ,-O

   oder der Funnel

   N'\

   enthalten, die so erhaltenen Stamme unter gelüfte.ten Bedingungen ta? an sich bekannter Weise auf einem Nährboden gezüchtet werden und gegebenenfalls die so erhaltenen Antibiotika aus dem Fermentationsmedium isoliert werden·

   2-, Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet., dass die nutation in Gegenwart von l-(5-Nitro-furfurylidenamino)-2-imidazolidin-thJbn_f 5*Nitro-2-furaldehyd'-semicarbazo»" oder N-(5-nitro-2-furfuryliden)-l-amino-hydantoin durchgeführt wird.

   3» Verfahren nach Anspruch 1 und 2, dadurch gekenzeichnet, dass die Nitrofuranderivate in einer Konzentration von 1,0 - 20 ₁0 jfvml verwendet werden·

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   4· Verfahren nach Ansprüchen 1 - 3» dadurch gekennzeichnet, dass die Mutation in Gegenwart von Säureamiden, zweckmässig Dimethylformamid, die in einer Menge von 0,Ql bis 0,5 i»-berechnet auf das Volumen des Nährbodens verwendet werden, durchgeführt wird.

   5. Verfahren nach Ansprüchen 1-4» dadurch gekennzeiohnet, dass für die Mutation eine Sporensuspension verwendet wird, welche vor der Mutation auf einem flüssigen Nähriaedium 4 - 20 Stunden lang inkubiert wurde.

   6. Verfahren naoh Ansprüehen 1-5, daduroh gekennzeiohnet, dass der neue Stamm Streptomyces aureofaoiens A-802934 '(deponiert bei dem Staatlichen Institut für Hygiene in Budapest, unter Nr.6403Ο7·26) oder Hereditäre, oder Varianten, oder Mutanten dieses Stammes unter submersen gelüfteten Bedingungen fermentiert werden, und gegebenenfalls aus dem erhaltenen Fermentationsmedium Tetracyclin isoliert wird.

   7· Verfahren nach Anspruch 6, dadurch gekennzeichnet, dass die Fermentation auf einem Nährboden durchgeführt wird, welohjer Stärke, Maisquellwaaser, anorganische Salze und mehr al« 100 ^mI Chlorid-Iöhe enthält.

   Θ. Verfahren nach Anspruch 6-7» dadurch gekennzeichnet, dass die Mycelen von dem Permentationsmedium in einem pH-Bereioh von 1-4 isoliert werdön·

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