DE1767129A1 - Verfahren zur Herstellung von Kasugamycin - Google Patents

Description

ZAIDAJi HOJIH BISEIBUTSÜ KAGAKTJ KENKW KAI, Tokyo, Japan

Verfahren zur Herstellung von Kasugamycin (Zusatz su Patent 1 2^6 727)

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Herstellung eines gegen Brand wirkenden Antibiotikums, und zwar Kasugamycin, durch Züchten eines neuen Mikroorganismus, der von Streptomyoes kasugaensis verschieden iatV welcher eich sur Herstellung von Kasugamycin ale geeignet erwiesen hat.

Kasugamycin ist ein Antibiotikum, das sehr virksaa sum Schute von Reis gegen Brand sowie zum Schut» gegen eine PBeudomonaeinfekticn des menschlichen Körper« ist. Ee wurde von H, Umesawa et al. gefunden (vergleiche die Deutsche Patentschrift t 856 (Patentanmeldung Z 11 248)).

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BAD ORiGINAt

In der vorstehend beschriebenen Patentschrift werden die Bigensohaften von S. kaeugaensis M538-M sowie verwandter Itatanten, die Kasugamycin erceugen» beschrieben., Die vorliegende Erfindung betrifft einen neuen Mikroorganismus, der sich von S. kasugaensi M338-ML sowie dessen Mutanten deutlich duroh die Struktur der Sporenoberflftohe unterscheidet.

Der nachfolgend beschriebene Mikroorganismus wird ale ein Strahlenpils der Art Streptomyces beschrieben. Von den Strahlenpilaen ist gut bekannt, dass sie in einfacher Velse entweder auf künstlichem oder na tür Ii ehern Wege autiert werden können, wobei jedoch die spezielle Struktur der Sporenoberfläohe, beispielsweise eine dornige oder haarige Oberfläche, nicht «ehr oft verändert werden kann. Daher wird die Struktur auf der Sporenoberfläohe ale stabiles Kriterium 2mm Unterscheiden der Spesies der Art Streptomvces verwendet. Daher unterscheidet sieh ein micro· Organismus« der sich &ur Braeugung von Kasuganycin als geeignet erwiesen hat und eine dornige Struktur auf der Sporenoberfläohe besitzt, von S. kasugaensis mit einer glatten SporsnoberflKohe. Ausserdem unterscheidet sich der Mikroorganisrnns von anderen Speslss von Streptomyoes, Dieser Kikroorganlsmus wird als neue Spesles» und swar Streptomyces kasugaspinus beeelohnet. Xasugamycin lässt sich durch Züchten dieses neuen Mikroorganismus sowie duroh Reinigen von der Garungsfluestglce.it herstellen.

Der neue Mikroorganismus vrarde exw eine? Bodenprobe isoliert,

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Ale ImI B, Ueuda-cho in der Präfektur Nagano im Juni 1965 werde, und «war unter verwendung eines Glyeerin/Kaseinu. Dem Organismus wurde die Labornuimner MA35O-C3 ver-Er beeitxt folgend· Eigenschaften:

ML35O-C3 vermehrt eioh in einem Subatratmedium sehr gut und ent-

eIn ohne Yixtelbildiing, besitzt jedooh saolreiohe

Spirmlen der verschiedensten Typen, einschliesslich offener» primtÜTer oder geechloesener Typen. Unter dem Elektronenmikroskop wird eine dornige Struktur auf der Sporenoberfläche beobachtet. ΊΆ* oJiaraktexl8tieehen Eigenschaften auf verschiedenen Medien

1. Jnf elnom Csapek-Glvserinagar, inkubiert bei 27⁰C: farbloses bis leloht gelblichee Yaohstum· Reichlich vorhandene Itaft· ■yeeln «lad veies bis leicht brätmlioh-grau (silbergrau 3 fe> b—ti—1 nach de« "Color Harmony Manual", das nachfolgend als CHH abgekftrst wird). Bas lösliche Pigment ist farblos oder leicht gelblioh.

2. A⁴Uf einem Krainaky-Gliücose/Asaparagin-Agar, inkubiert bei 27°0: fazVLoees Vaohstum. Reichlich vorhandene weisse bis leicht grame Luftayzeln, die zu leicht braun-grau überwechseln (sohattengrau, 5 lh» bestimmt nach CHM). Kein lösliches

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BAD ORIGINAL

3. Auf einem Calcium-Malat-Agar, inkubiert bei 27⁰Ot farbloses bis hell gelbliches oder hell orange gefärbtes Wachstum. Weisse luftoyzeln« Das lösliche Figment let farblos oder gelblichorangt« Das Caleium-Malat rund um das Wachstum wird gelegentlich «olubilisiert.

4« In einer Peptonlösung, die 1 £ HaNC₅ enthält, inkubiert bei 27⁰O: farbloses Wache tum mit weissen Luftmyeeln. Bas löeliohe figment 1st farblos oder leicht gelblich· Die Hitratreduktion

ist positiv.

5. Auf einem Kartoffelstück, inkubiert bei 27⁰O: farbloses bis hell gelbliches Wachstum mit weisseb. bis leioht bläuliohgrauen oder leioht grauen Luftmyaeln (yerbrennungsraokstände 5 fe, bestimmt naoh OBM). Kein lösliches Pigment·

6. Auf einer Stärke-Agar-Platte, inkubiert bei 27⁰Ot farblose· Wachstum mit reichlichen weissen bis leicht grauen oder leioht bräunlioh-grauen Iruftmyseln. Das lösllohe Pigment 1st farblos oder leioht gelblich, Keine oder nur eine geringfügige Hydrolyse der Stärke.

7. Auf einem Nähr-Agar, lnkublert bei 57⁰Ot farbloses bis hellgelblioh~braunes gutes Wachstum. Dünne und weisse Xoiftmyseln. Kein lösliches Pigment.

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BAD ORIGINAL

8» Auf einem Hähr-Agar, inkubiert bei 27⁰C: farbloses bis gelblich-braunes Wachstum mit weissen luftmyzeln. Kein lösliches Pigment«

9ο Auf Blut«Agar (1Obiges menschliches Blut); inkubiert bei 37⁰Ot farbloses Wachstum ohne Luftmyzeln. Kein lösliches Pigment, starke Hämolyse.

10. Auf einem koagulieren Iioeffler-Serummedium, inkubiert bei 37⁰Ct ungleiohmäseiges farbloses Wachstum. Keine Luftmyzeln und kein löeliohes Pigment. Keine Verflüssigung des koagulierten Serums.

11. Auf einem Gelatinemedium (Versuchskultur), inkubiert bei 2O⁰Cs farbloses bis gelbliches Wachstum. Geringfügige welsse Luftmyzeln. Kein lösliches Pigment. Positive Verflüssigung von Gelatine.

12. Auf einem Milchmedium (entrahmt), inkubiert bei 37⁰O: farbloses bis hell-gelbliches oder bräunliches Wachstum* Keine IiuftmyjB#ln und kein lösliches Pigment. Mittlere bis starke Koagulierung und Peptonislerung.

13· Auf einem Tyrosin-Agar, inkubiert bei 27⁰C: farbloses Wachstum mit weissen bis leicht olivengrauen oder bräunlich-grauen luftmyzeln. Kein lösliches Pigment und keine Xyrosinase-Reaktion.

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BAD ORIGiNAt

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14. Auf Cellulose (Filterpapier), inkubiert bei 27⁰Oi leiohte· Wachstum, jedoch keine Zersetzung des Papiers.

15* Verwendung von Kohlehydraten anf einem Pridham- Gottlieb» Orundaodiua, inkubiert bei 27⁰Cs Mannose» Xooelt, StDeIa* Dextrin» Laktoee, Glyserin, Galaktose, Ginkos·» Truktose und Maltose ergeben ein gutes Wachstum. Kein Wachste» erfolgt alt Bhaxmose, Inulin, Dulolt und Arabinoee. Xylose 1st wehrsehelnlion nioht verwendbar. Mannit, Sorbit, flailein, Baffinose und Rohrzucker ergeben veohselnde Begebnisse.

Zieht man die Bilanz aus den vorstehend angegebenen oharakteri· stischen Bigensohaften τοη 1ΪΑ35Ο-03, so kosvfe man su dem Sohluss, dass der Staam au der Art Streptomycee gehurt und einen niohtohromogenen Typ darstellt. 2e vird keine Wlrtelbildung, sondern eine Spiralenstruktur beobachtet. Die Sporenoberfllohe IH dornig, inf Tsrsohledenen Medien erfolgt ein farbloses bis gelbliehes Vaohstum mit velssen bis brttunlioh-grauen Luftmyseln. Is wird •in farbloses oder ein leicht gelbliches lösliches Pigment beobaohtet· Ausserdem erfolgt keine οάβτ mir eine sohnmoh· Qydrolyee ▼on Stärke. line mittlere bis starke proteolytlsoat Vlrksng 1st festsustellen. Ausserdem erfolgt eine positive Bedaktion von BTitrat. Von den bekannten Spesies von Streptomyoes Hmslt der Stasra Streptomyoes albus (Vaksman und Henrioi, 1948), besohrleben in "Xhe Aotlnomyoetee", Band 2, Seite 172 von S.A.Waksman. Der Stamm kann von S. albus mit einer glatten Sporenoberfläche

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BAD ORIGINAL

(S. Baldaoci tt al., ffiornale Ai Miorobial. I, 28 (1955), V« Haig et al«, Zent Bakt, II Abt., 106, 576 (1995)) !■ HInWlot auf Ale dornenartlge Sporenoberfläche Aieeee Stammes unterschieden werden. Der Stamm erzeugt Aureothricin und Thlolutin neben Xaeuga* KQroln, wie diee in ähnlicher Welse bei S. frarogaenaiB der KU let. Jedoch kann S. kasugaensis deutlich tsh dem Stama im Hinblick auf seine Sporenoberflftohe unterschieden «erden« und evar insofern, als der eueret genannte Stamm eine glatte Oberfläche besitst und der letztere Stam eine dornige Struktur aufweist sowie andere Sigenschaften beeitat, idle aas der Tabelle herrorgeht. Wegen der deutlichen tbterseheidung Ton bekannten Spesies Ton Streptomycea koomt man su dem Schluss, dass es sioh um eine neue Qpesies von Streptoayoes handelt, velohe atreptonyoee kasu« gasplnua genannt wird. Die Beaeiohnung Streptonyoee Itasugaspiims besieht sich nicht aussohllesslioh auf Strahlenpilse, vie sie vorstehend beschrieben wurden» sondern umfasst auch den beechriebeaxen Organismus sowie dessen Mutenten, welohe die gleichen Bigensohaften einsohlleselioh der dirnigen Sporenoberflftohe besltien und Kasugamycin erseugen· 2s 1st darauf hineuveisen, dass diese Beseiohnung Streptomyoes kasugasplnus auch die natürlichen Mutant tn von S, kaeugasplnus sowie diejenigen Mutanten umfasst, welohe unter Verwendung von Maßnahmen oder Mitteln, die eine Mutation erseugen, erhalten werden, beispielsweise durch Strahlung oder Behandlung mit toxischen Substanzen. .

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BAD OF)JGINAi.

Kasugamycin wurde nach einer 8-tägigen Inkubation in einer Menge -von 600 meg/ecm erhalten, wenn der Stamm von dem Erdboden isoliert und in einem Medium inkubiert wurde, das aus 3,0 1» Maltose/ Sojabonnamaenlpulver (ProrAch, Ajinomoto-ProdvJfct), 0,1 $ K₂HPO₄, 0,1 $> I^S0₄'7H₂0, 0_r3 JS KaC., 0.0007 $ OuSO₄^TH₂O, 0,0OC2 * ZnSO₄ ¹SE₂O, 0,5 $ Pepton, 0,35 * OaOO₅ und 0,08 * (pH 7) Sojabohnenöl besteh^ wobei das Medium mit einer Sohwi ngungsweite Ton θ om 140 ζ pro Minute bei 27⁰O hin-und hergesohttttelt wurde.

in einer Menge von 3950 mog/oom wird erzeugt, wenn der Stamm durch Sinzelsporonauswahl gesammelt wurde und in der gleichen Weise, wie vorstehend beschrieben, inkubiert wurde, mit der Ausnahme, dasa ein Medium verwendet wurde, welches aus 5,0 £ SojabohnenmehlpulTer (S3 Fleisch, Ajinomoto-Produkt) und 4,0 Jf Sojabotmenttl (Shlrashime-Öl, Ajinomoto-Produkt) (pH nicht eingestellt) besteht. Ss 1st also ersiohtlich, dass Stämme, welche In hohem MaJe Kasugamycin ereeugen, aus dem Stamm durch ein· geeignete Auswahl erhalten werden können.

Die folgenden Seispiele erläutern die Herstellung und Reinigung Ton Kasugamycin, ohne jedooh die Erfindung eu beschränken.

Beispiel 1

Sin Medium, das aus 4,0 ^ Maltose, 3,0 Jf Sojabohnenpulver (Prorioh, AJinomoto-Produkt), 0,1 Jf K₂HPC₄, 0,1 Jt MgSO₄*7H₂O, 0,3 Jf HaOl, 0,0007 i> CIuSO.'7H₉O, 0,001 Jf FeSO*, 0,0008 Jf MnOl₀'7H₀O, 0,0002 Jf ZnSO₄*5HgO, 0,5 # Pepton (Polypepton, Daigo Seiyaku-Produkt)

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0,35 $> OaOO, und 0,08 % Sojabohnenul besteht, wird in jeweils 125 com aufgeteilt und in Kolben mit einem !Fassungsvermögen von 500 ocm gegeben, vorauf dor pH vor einer 20 Minuten dauernden Behandlung bei 120⁰O im Autoklaven auf 7,4 eingestellt wird· Auf fUes'ö sterilisierten Hsdien wird der Stamm mittels einer Platin-B ohleAf e aus einer ScnrEgfcuItur auf geimpft und unter Schütteln 5 Tage lang bei 27⁰O intoibiert. Der pH erreicht am 5· Sag einen Wert von 7,6·

Diese vergorene Brühe wird zur Entfernung der Myaelnmasse filtriert und mit 1jd HOl sur Ausfällung von unlöslichen Materialien bei einem pH von 5_f0 vorsetzt. Das liltrat wird filtriert, wobei eine klare Lösung in einer Menge von 450 con erhalten wird. Diese ?iltrat enthält ingeeamt 360 mg Kasugamycin· Das filtrat wird durch eine Säule mit einem Durchmesser von 1,2 cm, die mit 35 com eines sauren Ionenaustauscherharses (Amberlite XB-100, Amberlite-Produkt, Simoniek-Typ) gefüllt ist, geleitet. Das an dem Bars adsorbierte Kasugamycin wird mit 0,5 η Ammoniak eluiert. Das aktive Staat enthält insgesamt 300 mg Kasugamycin. Das aktive Staat (90 oca) wird auf eine mit j g Aktivkohle (Wako-Produkt) gefüllte Säule ait einem Durchmesser von 0,8 cm gegeben. Haoh dem Waschen mit entionisiertem Wasser (50 ocm) wird Kasugamycin mit 0,5 η HOl in !form seines HOl-Salzes eluiert. Das aus 30,2 oom bestehende Staat enthält insgesamt 180 mg Kasugamycin· Das Staat wird in einem notations verdampf er unter vermindertem Druck sowie unterhalb von 40⁰O verdampft. Das aus. 5 oom bestehende Konzentrat

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BAD ORlGlNAt

wird adt der 10-fachen Volumemienge ithanol m Ausfällen des I&Bugamyoins versetzt. Das ausgefallene Easugaaqroin wird getrooknot. Dabei erhält man 140 ng Rohkristalle, welche 132 Bg Kasuga-»: mycin enthalten. Diese Rohkristalle werden in 8 com Vaaser gelttst, vorauf 12 ocm ithano.l sugeeetst: werden. 2feoh den Stallen bei Ziamertemperatur werden 96 ag Kaeugaayoin-Kristalle erhalten. Diese Kristalle sind hinelohtlloh des Infrarot-Spektrums, der Papierohromatographie» der DünnechiohtohroiBatographle, der Hochspannungselektrophorese sowie der ELementaranalyee ait Kamagnmyoin^Hydroohlorid identisch.

Beispiel 2

Der Stamm wird auf jeweils 80 ooa/Medina in 500 oom-SohtttteUoolben aufgeinpft. Das Medium besteht ans 5 % Sojabohneimehl und 4,0 H Sodabonnenöl (der pH wird nloht eingestellt)· Xr wird bei 27⁰O unter SohÜtteln (144 χ pro Minute bei einer Amplitude von 8 om) inkubiert. Vaoh einer e-täfigen Inkubation erreioht der pH einen Wert Ton 7» 5» wobei sich 3570 mog/oom Kasugamycin angesemaelt haben. Die vergorene Brühe (920 oom) wird bot ftitfermmg der Wür»elnmaese zentrifugiert. Die auf diese Weise erhaltene Klare Iiöeung enthält 3570 mog/oom des Antibiotikums. Zu dieser Lösung werden 400 oom Xthyläther mir Entfernung des restlichen Öls Bugegeben· Die untere Schicht wird mir Entfernung von Xthyläther eingeiaapft, wobei 750 oom einer ?lÜBsigkeit erhalten werden, welche 4250 meg/ oom des Antibiotikums enthält. Diese XLttssigkelt wird auf eine Chromatographiesäule, welche mit Aktivkohle gefüllt ist und einen

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Durchmesser von 3.2 aa besitzt, gegeben* Hach dem Väschen alt Weseer erfolgt die Eluierung mittels 0,05n HOl, wobei die aktiven ]?rels:tionen gesammelt werden. Kaoh einer Ifeutralisierung der aktiven Prektion wird sie auf 20 com konzentriert und mit Äthyl·* alkohol eur Ausfällung einoe üo&pulvei's vorsetat. Dieses Boll·· pulver wird in 20 com tiaattor gelöst, worauf 35 com Äthylalkohol zugesetzt werden uud das Ganze über Kaoht stenengelaeeen wird. Kaon dom Stehen werden 2,65 g einer kristallinen Substanz erhalten, die hinsichtlich Schmtlsfonkt, optischer Drehung, Infrarotepektrum sowie anderer Eigenschaften mit Kasugamyoin-Hyärochlorid Identisch ist.

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Claims (1)

1. Patentanspruch

   t'aU:?ea sur Hera teilung von Kasugamycin,, dadurch gekennzeioh- mtt öae:i stsop^oa^rooo mit οίηετ äorai^öii Struktur auf der Sporenobarflächs aorob gcstichtei; v?erdon.

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