Sposób wytwarzania antybiotyku kasugamycyny Przedmiotem wynalazku jest sposób wytwarza¬ nia antybiotyku o wzorze podanym na rysunku, zwanego kasugamycyna.Kasugamycyna jest antybiotykiem, dzialajacym hamujaco na rozwój takich mikroorganizmów, jak Pseudomonas, Salmonella, Shigella, Brucella i nie¬ których Klebsiella, a przy tym jest nietoksyczna.Przeprowadzone badania wykazaly, ze kasugamy¬ cyna nadaje sie do leczenia schorzen, wywolanych zakazeniami przez Pseudomonas i inne mikroor¬ ganizmy, a poza tym jest skuteczna w hamowaniu rozwoju mikroorganizmu Pivicularia oryzae, be¬ dacego jednym z najpowazniejszych szkodników w uprawach ryzu.Wlasciwosci fizykochemiczne i biochemiczne ka¬ sugamycyny sa podane szczególowo w opisie pa¬ tentowym nr 60212. Z opisu tego znany jest rów¬ niez sposób wytwarzania kasugamycyny, polega¬ jacy na tym, ze szczep Streptomyces kasugaensis poddaje sie w warunkach aerobowych hodowli w wodnym srodowisku, zawierajacym weglowodany i zwiazki azotowe.Stwierdzono, ze kasugamycyne, mozna równiez wytwarzac latwo i z wysoka wydajnoscia na dro¬ dze hodowli innego, nowego szczepu Streptomy¬ ces, nazwanego Streptomyces kasugaspinus, róz¬ niacego sie wyraznie od szczepu Streptomyces ka¬ sugaensis i jego mutantów. Ten nowy, nizej opi¬ sany szczep zalicza sie do gatunku Actinomycetes.Jak wiadomo, Actinomycetes latwo ulegaja mu- 10 15 25 30 tacji samorzutnej lub wywolywanej sztucznie, ale specjalna budowa powierzchni zarodników, na przyklad kolczasta lub urzesiona, jest trudna do zmiany. Z tego tez wzgledu budowa powierzchni zarodnika jest stosowana jako kryterium do roz¬ rózniania gatunków Streptomyces. Na tej tez pod¬ stawie ustalono, ze mikroorganizm, wytwarzajacy kasugamycyne sposobem wedlug wynalazku, ma¬ jacy budowe zarodników urzesiona, rózni sie od S. Kasugaensis, którego zarodniki maja powierzch¬ nie gladka, a takze od innych gatunków strepto¬ myces. Ten nowy mikroorganizm, nazwany Strep¬ tomyces kasugaspinus wyodrebniono z próbki gle¬ by, pobranej w Maruyama, Usada-cho, w okregu Nagano, Japonia, w czerwcu 1965 r., stosujac po¬ zywke z agaru z gliceryna i kazeina.Wykazuje on nastepujace cechy .charakterystycz¬ ne: rozgalezia sie bardzo dobrze na podlozu i ro¬ zwija grzybnie powietrzna bez zwojów, lecz ma¬ jaca spirale róznego typu, jak otwarte, pierwotne i zamkniete. Pod mikroskopem elektronowym za¬ obserwowano urzesiona strukture powierzchni za¬ rodnika. Cechy charakterystyczne hodowli na róz¬ nych podlozach podano ponizej.Na agarze z gliceryna wedlug Czapka w cie- plarce w temperaturze 27°C: Wzrost bezbarwny do lekkozóltawego. Obfita grzybnia- powietrznia ko¬ loru bialego do jasnobrunatnawo-szarego. (Wedlug Color Harmony Mannual, dalej oznaczonego w 69 89769 897 3 skrócie CHM, kolor srebrzysto-szary 3 fe). Barw¬ nik rozpuszczalny nieobecny lub lekkozóltawy.Na agarze z glikoza i asparagina wedlug Krain- skiego w cieplarce w temperaturze 27°C: Wzrost bezbarwny. Obfita grzybnia powietrzna koloru bia- 5 lego do jasnoszarego, zmieniajacego sie do jasno- brunatnawo-szarego (wedlug CHM kolor ciemno¬ szary 5 ih). Brak barwnika rozpuszczalnego.Na agarze z jablczanem wapnia w cieplarce w temperaturze 27°C: Wzrost bezbarwny do koloru 10 bladozóltawego lub bladopomaranczowego. Barw¬ nik rozpuszczalny nieobecny lub zóltawo-poma- ranczowy. Jablczan wapnia rozpuszczony wokól wzrostu nieregularnie, W roztworze peptonu, zawierajacym 1% NaN03, 15 w cieplarce w temperaturze 27°C: Wzrost bez¬ barwny z biala grzybnia powietrzna. Barwnik roz¬ puszczalny nieobecny lub lekkozóltawy. Silna re¬ dukcja azotanów.Na klinie z ziemniaka w cieplarce w tempera- 2o turze 27°C: Wzrost bezbarwny do bladozóltawego.Grzybnia powietrzna koloru bialego do jasnonie¬ bieskawo-szarego lub jasnoszarego" (wedlug CHM kolor popielaty 5 fe). Barwnik rozpuszczalny nie¬ obecny. 25 Na plytce agaru ze skrobia w cieplarce w tem¬ peraturze 27°C; Wzrost bezbarwny z obfita grzyb¬ nia powietrzna koloru bialego do jasnoszarego lub jasnobrunatnawo-szarego. Barwnik rozpuszczalny nieobecny lub lekkozóltawy. Hydroliza skrobii sla- 30 ba lub nie zachodzi wcale. Na pozywce agarowej w cieplarce w temperaturze 37°C; Wzrost dobry bezbarwny do bladozóltawo-brunatnego. Cienka biala grzybnia powietrzna. Barwnik rozpuszczal¬ nynieobecny. 35 Na pozywce agarowej w cieplarce w tempera¬ turze 27°C: Wzrost bezbarwny do zóltawo-brunat- nego z biala grzybnia powietrzna. Barwnik roz¬ puszczalny nieobecny.Na agarze z krwia (10% krwi ludzkiej) w cie- 4Q plarce w temperaturze 37°C. Wzrost bezbarwny bez grzybni powietrznej. Brak barwnika rozpuszczal¬ nego. Silna hamoliza.Na surowicy scietej wedlug Lofflera w cieplar-- ce w temperaturze 37°C. Wzrost bezbarwny, po- marszczony. Brak grzybni powietrznej i barwnika rozpuszczalnego. Surowica scieta nie przechodzi w stan plynny.Na podlozu zelatynowym w cieplarce w tempe¬ raturze 20°C. Wzrost bezbarwny do zóltawego.Skapa biala grzybnia powietrzna. Brak barwnika rozpuszczalnego. Silne scinanie zelatyny.Na podlozu z odtluszczonym mlekiem w cie¬ plarce w temperaturze 37°C. Wzrost bezbarwny do bladozóltawego lub bladobrunatnawego. Brak grzybni powietrznej i barwnika rozpuszczalnego.W srodowisku zachodzi silna koagulacja i pepty- zacja.Na agarze z tyrozyna w cieplarce w tempera¬ turze 27°C. Wzrost bezbarwny z grzybnia powie¬ trzna koloru bialego do jasnooliwkowo-szarego lub jasnobrunatnawo-szarego. Barwnik rozpuszczalny nieobecny i nie zachodzi reakcja tyrozynowa.Na podlozu celulozowym (bibula filtracyjna) w cieplarce w temperaturze 27°C. Lekki wzrost, ale 65 50 55 bez rozkladu papieru. Przyswajanie weglowoda¬ nów na podlozu podstawowym wedlug Pridham— Gottlieba, w cieplarce w temperaturze 27°C. Dobry wzrost daje mannoza, inozytol, skrobia, laktoza, gliceryna, galaktoza, glikoza, fruktoza i maltoza.Brak wzrostu w obecnosci ramnozy, inuliny, dul- cytu i arabinozy. Ksyloza prawdopodobnie nie jest przyswajana. D — mannit, sorbit, salicyna, rafi- noza i sacharoza daja róznorodne wyniki.Podsumowujac podane wyzej cechy charaktery¬ styczne stwierdzono, ze nowy szczep nalezy do rodzaju Streptomyces i jest typu niechromoge- nicznego. Ma on budowe spiralna, lecz nie tworzy zwojów. Powierzchnia zarodnika jest urzesiona.Na róznych podlozach wykazuje wzrost bezbarwny do zóltawego z grzybnia powietrzna koloru bialego do brunatnawoszarego. Barwnik rozpuszczalny nie¬ obecny lub lekkozóltawy. Hydroliza skrobi slaba lub nie zachodzi wcale. Silny rozklad bialek w srodowisku. Silna redukcja azotanów. Sposród znanych rodzajów streptomyces szczep ten podob¬ ny jest do Streptomyces albus, odkrytego przez S. A. Waksmana w The Actinomycetes tom 2, stro¬ na 172. Ze wzgledu na urzesiona strukture po¬ wierzchni zarodnika szczep ten mozna latwo od¬ róznic od S. albus, majacego gladka powierzchnie zarodnika. [E. Baldacci i inni, Giornale di Micro- bial I, 28 (1955), W. Flaig i inni Zent. Bakt. II Abt, 108, 376 (1955)].Stwierdzono, ze poza wytwarzaniem kasugamy- cyny szczep ten wytwarza takze aureotrycyne i tiolutyne, podobnie jak S. kasugaensis. Jednakze S. kasugaensis mozna wyraznie odróznic od S. ka¬ sugaspinus, ze wzgledu na róznice w powierzchni zarodnika, poniewaz pierwszy ma powierzchnie gladka, a drugi urzesiona. Okreslenie Streptomy¬ ces kasugaspinus nie obejmuje wylacznie actino¬ mycetes, które niezmiennie i dokladnie odpowia¬ daja powyzszemu opisowi, lecz obejmuje takze opi¬ sane ustroje i ich mutanty, które posiadaja w pelni takie same wlasnosci, wlaczajac w to urze¬ siona powierzchnie zarodnika i wytwarzanie kasu- gamycyny. Zrozumialym jest, ze okreslenie Strep¬ tomyces kasugaspinus obejmuje takze mutanty na¬ turalne S. kasugaspinus oraz takie, które mozna: z nich otrzymac za pomoca czynników lub sub¬ stancji, powodujacych mutacje takich, jak naswie¬ tlanie lub poddanie dzialaniu toksyn.Gdy szczep wyodrebniono z gleby i hodowano na pozywce, skladajacej sie z maltozy, maczki so¬ jowej 3,0% K2HP04 0,l°/o; HgS04-7H20 0,1%; NaCl 0,3%; CuS04-7H20 0,0007%; ZuSO4-5H20 0,0002%; peptonu 0,5%; CaC03 0,35%; i oleju so¬ jowego 0,08% przy pH = 7,0, na wytrzasarce po¬ suwisto-zwrotnej (o amplitudzie 8 cm; 140 obro¬ tów na minute), w temperaturze 27°C — w ósmym dniu hodowli w 1 ml brzeczki otrzymano 600 mcg kasugamycyny. Gdy szczep dobrano na drodze se¬ lekcji poszczególnych zarodników i hodowano w taki sam sposób, jak opisano powyzej, ale stosujac pozywke, skladajaca sie z 5% maczki sojowej i 4,0% oleju sojowego przy nie korygowanej war¬ tosci pH, wówczas wytwarzalo sie 3950 mcg/ml kasugamycyny. Tak wiec oczywistym jest, ze69 81 5 szczepy wytwarzajace duze ilosci kasugamycyny mozna otrzymac przez wlasciwy ich dobór.Sposób wedlug wynalazku polega na tym, ze Streptomyces Kasugaspinus poddaje sie wglebnej hodowli aerobowej w temperaturze 27°C w srodo- 5 wisku, zawierajacym jako zródlo azotu nieorga¬ niczne lub organiczne zwiazki azotowe, a jako srodek wegla weglowodany lub tluszcze. Wytwo¬ rzona kasugamycyne wyosabnia sie nastepnie dro¬ ga adsorpcji za pomoca wegla aktywowanego lub 10 zywicznych wymieniaczy jonowych i nastepnie eluuje w znany sposób.Przyklad I. W kolbach o pojemnosci 500ml umieszcza sie po 125 ml pozywki, zawierajacej 4% maltozy, 3,0% maczki sojowej, 0,1% K2HP04, 0,l%MgSO4-7H2O, 0,3%NaCl, 0,0007% CuS04-7H20, 0,001% FeS04, 0,0008% MnCl2-7H20, 0,0002% ZnS04- •5H20; 0,5% peptonu; 0,35% CaCOa i 0,08% oleju sojowego. Wartosc pH doprowadza sie do 7,4 i na- 20 stepnie kolby umieszcza w autoklawie i utrzymuje • w temperaturze 120°C w ciagu 20 minut. Na tak wyjalowiona pozywke posiewa sie szczep z kul¬ tury skosnej za pomoca uszka platynowego. Pro¬ wadzi sie hodowle na wytrzasarce posuwisto- -zwrotnej w temperaturze 27°C w ciagu 5 dni. 25 Piatego dnia wartosc pH dochodzi do 7,6.Sfermentowana brzeczke filtruje sie, aby usunac grzybnie, po czym dodaje sie 1 n roztworu kwasu solnego, w celu wytracenia czesci nierozpuszczal¬ nych przy wartosci pH = 0,5 i filtruje ponownie, uzyskujac 450 ml klarownego roztworu. Przesacz ten zawiera ogólem 360 mg kasugamycyny. Prze¬ sacz przepuszcza sie przez kolumne o srednicy 1,2 cm, wypelniona 35 ml kationitu (Amberlite XE — 1 00, produkcji Amberlite, typu amonowego).Zaadsorbowana na jonicie kasugamycyne wymywa sie 0,5 n roztworem wodorotlenku amonu. Czynny eluat o objetosci 90 ml zawiera ogólem 300 mg kasugamycyny. Przepuszcza sie go przez kolumne o srednicy 0,8 cm, wypelniona 1 g wegla aktyw¬ nego. Po przemyciu kolumny 50 ml wody demi- neralizowanej wymywa sie kasugamycyna 0,5 n HC1, otrzymujac chlorowodorek kasugamycyny. 30,2 ml czynnego eluatu zawiera ogólem 180 mg kasugamycyny. Odparowuje sie go na wyparce ob¬ rotowej pod zmniejszonym cisnieniem i w tempe¬ raturze ponizej 40°C. Do 5 ml koncentratu dodaje sie 10-ciokrotna objetosc etanolu w celu wytrace¬ nia kasugamycyny. Wytracona kasugamycyne su¬ szy sie i otrzymuje 140 mg surowych krysztalów, 5 zawierajacych 132 mg kasugamycyny. Surowe kry- 6 sztaly rozpuszcza sie w 8 ml wody, dodaje 12 ml etanolu i pozostawia w temperaturze pokojowej, otrzymujac 96 mg krystalicznej kasugamycyny. Na podstawie widma w podczerwieni, chromatografii bibulowej, chromatografii, cienkowarstwowej, elek¬ troforezy wysokonapieciowej i analizy elementar¬ nej stwierdzono, ze produkt ten jest identyczny z chlorowodorkiem kasagamycyny.Przyklad II. W kolbach z doszlifowanym korkiem o pojemnosci 500 ml umieszcza sie po 80 ml pozywki, zawierajacej 5% maczki sojowej i 4% oleju sojowego, po czym, nie korygujac war¬ tosci pH, kazda pozywke posiewa sie szczepem.Prowadzi sie hodowle w temperaturze 27°C na wytrzasarce posuwisto-zwrotnej o amplitudzie 8 cm i 144 obrotach na minute. W ósmym dniu hodowli wartosc pH dochodzi do 7,5 i otrzymuje sie 3570 mcg/ml kasugamycyny. W celu usuniecia grzybni 920 ml sfermentowanej brzeczki odwirowuje sie.Otrzymana klarowna ciecz zawiera 3570 mcg/ml antybiotyku. Dodaje sie do niej 400 ml eteru ety¬ lowego w celu usuniecia pozostalego oleju. Dolna warstwe oddziela sie i odparowuje z niej eter etylowy, uzyskujac 4250 mcg/ml antybiotyku. Ciecz te przepuszcza sie przez kolumne chromatogra¬ ficzna o srednicy 3,2 cm, wypelniona weglem ak¬ tywnym. Po przemyciu kolumny woda wymywa sie ja 0,05 n roztworem kwasu solnego i zbiera frakcje czynne. Po zobojetnieniu frakcje czynne steza sie do objetosci 20 ml i dodaje sie alkoholu etylowego w celu wytracenia surowego produktu.Surowy produkt rozpuszcza sie w 20 ml wody, dodaje 35 ml alkoholu etylowego i odstawia na noc. Otrzymuje sie 2,65 g krystalicznej substancji, identycznej z chlorowodorkiem kasugamycyny pod wzgledem temperatury topnienia, skrecalnosci op¬ tycznej, widma w podczerwieni i innych wlasci¬ wosci. PL PL