DE1617815A1 - Fermentatives Verfahren zur Herstellung von Tetracyclin - Google Patents

Description

Ptäl Dr. Dr. J. Reltstdttfr

ΟΛ-Ing. W. Bilnta

MÖNCHEN IiJ, Haydnetes«* β

Fermentativem Verfahren zur Herstellung von Tetracyclin

Gegenstand der vorliegenden. -Erfindung !ist, ein ferfflentativ.es- Verfahren zur Herstellung von Tetraöyölin»

,Insbesondere bezieht sich die Erfindung auf ein mikrobiologisches Verfahren zur Herstellung von Tetracyclin imter Verwendung eines- neuen Mikroorganismus¹ Streptomyces avellaneus, welcher Straptomyees F»I 2758 genannt wird.

Streptümyce8

■."»"BAD ORIGINAL

10 9815/188 5

Streptomyaes avellaneus wurde beim Commonwealth Myeologieal Institutes- Ferry Lane, Kew, Surrey (Großbritannien) , hinterlegt und. erhielt dort die Indexnummer I₀M₀I. 12684Oj der Mikroorganismus wurde weiterhin beim Institute of Microbiology der Rutgers Chi» versity (U*S₃A₀) hinterlegt und erhielt dort die Indexnummer 39'!Io

Das Antibiotikum Tetracyclin^ dessen Herstellung and dessen chemisch? » physikalisch©, und biologische Eigenschaften sind in der Literatur hinlänglich beschrieben (laksmaa SoA₀ "The.'Actinomycetes¹¹ Band III, 1962j Seite 389).

Es wurde nun gefunden, daß durch Fermentation des neuen Mikroorganismus Sfcreptomyces F,I. 2758 große Mengen des Antibiotikums Tetracyclin gebildet werden und daß" die Anwesenheit von Chlorionen im Fermentationsraedium das Verfahren nicht in der Weise beeinflußt., daß dabei Chlortetraeyolin gebildet wird< Der neue Mikroorganismus, welcher Tetracyclin produziert, wurde aus einer Erdprobe aus Grotte dl Caudano (Cuneo - Italien) isoliert und zeigt folgende morphologische, kultur-und biochemische Eigenschaften: Morphologische Eigenschaften*

Das vegetative Mycel zeigt bei gewöhnlichen Kulturmedien Hyphen, die 0»9 bis 1,,1^u dick sindj

menr

109815/1865

mehr cder weniger lang und stark ' versteigt, Aus diesen v/erden Hyphen gebildet_? die dicker als 1„2 bis \.3p- sind i--Bd nicht sehr lang sind-,, gerade.^ im allgemeinen in-" fächerartigen Bündeln angeordnet.,'."s,ympodisch versteigtf in einem bestimmten Moment werden diese Konidien "tragenden Hyphen au Konidieft mit glatter Oberfläche, die wie ein kleines Faß aussehen oder eine etwa gylin&rische Form mit einem Durehmesser, von 1 .2 - 1.5- χ 1 Λ - 1 *Ί M besitseiio Zunächst sind diese Konidien in Ketten mit 5 ~ 15 Einheiten pro Kette ■angeordnets später trennen sie sich„ Kultur^ und biochemische Eigenschaften

In Tabelle I sind die Kultureigenschaften mit den jeweiligen Medien atigegeben_;. wobei der Mikroorganismus bei 28⁰C gesucht>st wurde und die 3eobachtimgen ein 5-j 15« und 25* Tag nach der Beimpfung in Pxobierrchren und in Petrischalen durchgeführt wurden.

Der Stamm wäehst ziemlich langsam auf synthetischen oder organischen ügarkulturmedlen uuä bildet auf synthetischen Medien e_tin vegetatives Mycel_F das immer aus einer Batina besteht_s die durch das ZusammenflieSen von einselnen^ nicht sehr erhabenen Kolonien gebildet wurde und das strohgelb biß gelb-~orange~hraun gefärbt ist. An den organischen Medien wird eine Patina gebildet,, die durch das Sussmraenfließan von siemlieh

erhabenen

109815/186 5

erhabenen* dom,artig geformten Kolonien gebildet wird, wobei die Farbe von gelb feie saiemlich dunlcel kastanienbraun schwankt * gelegentlich mit oineia rotbraunen Farbton, Das Iiuftmycel auf synthetischem Medium iet im allgemeinen spärlich oder überhaupt nicht vorhanden« Das Aussehen ist glatt und die Farbe sehwankt von weiß bis beige mit schwach kastanienbraunem Farbton_s

Auf organischen Medien wächst im allgemeinen da© Iiuftmycel ziemlich reichlich _f mit einem glatten Aussehen und einer Farbe von hell kastanienbraun bis kastanienbrauno

Streptomyces F-I, 2758 entwickelt sich nicht in Milch und diese bleibt unverändert, der Stamm hydrolysiert Gelatine nicht* reduziert nicht Nitrate au Bfitriten, produziert keinen Schwefelwasserstoff, produziert keine 2yrosinase und auch nicht Melanin«, Stärke wird gut hydrolysiert, Glukose wird verwertet, ebenso Saccharose tmd Maltose für daß Wachstum* während 1-Arabinose, d-Xylose, Mesoinosit, d-Mannosö. d-Fructose, Rhamnose und Raffinose nicht verwertet werden=,

Der Stamm bildet keine löslichen Pigmente» bildet keine Sclerotien in fester Kultur unä. wächst nicht bei 5O^QCe In flüssiger Kultur, die belüftet ist, wird das Antibiotikum Tetracyclin gebildet.

Tabelle I

109815/1865 _bad owginal

tabelle I KultureigeRschaften von Streptomyoea

MEDIUM

WACHSTUM OTTMYCEIi

VEGETATIVES MYCEI

Bennetts Agar
(D

guts kleine ssu- gut: wächst in sammenfließende !kurzer und spar* Kolonien in jlicher Patina, schwach erhöht eijFarbe hell cha-Patina mois-braun

Farbe al-tronengelb bis hell kastanienbraun j BilciEseite analog, nur abge» schwächtere Farbe

pek's Agar

kleine ausamraenfließende Kolonien in spärlioher Patina, fast durchsichtig fehlt

farblos i Ruckseit e fast strohgelb

Asparagin«

Glucose-Agär

gut: kleine zusammenfließende Kolonien in schwach erhöht63 Patina

fehlt

[Farbe strohgelb [bis hell kastanien« braun_t Rückseite janalog gefärbt

Glyc erin-Glycln

spärlich? in
kurzer und
spärlicher

schwach: zusammenfließende Kolonien in

schwach erhöhtei}Patina, etwas Patina >■ pulvrig, weiße

Farbe mit
schwach-chamois

-braunem Farbton

ivon farblos bis Ikastaniengelber bis hell kastanienbrauner Farbe, Rückseite strohgetlb

Emerson'sAgar

gut: kleine ausammenfließende Kolonien in gefalteter Patina fehlt

orange bis kastanienbraun mit leicht rötlichen Farbtönen

Stärke und
Salze Agär
(2)

gut; kleine zus amraenfIi eß ende Kolonien in glätter-Patina gut: in kurzer
und spärlicher

pulvriger Patina j Farbe weiß
bis chamoisbraun, mit hell
weinrosa Färbtoi

Farbe von strohgelb bis hell

kastanienbraun, Rückseit© strohgelb

Kartoffei-

109815/1865

MEDIUM

Kartoffel-Agar

Hafer-Agar
(3)

WAeHSTIiM

HIFMYGEL

VEGETATIVES MYCEL

gutχ kleine zu-!spärlich, in Farbe von orange sammenfließende !kurzer und epär-Jgelb bis hell kasta-Kolonien in ilicher Patina, bienbraun mit ana~ schwach gefal- (pulvrig* weiß- jioger, abgeschwächt teter Patina iliche Farbe mit fcer Farbe an der

[chamois-braunen

|Farbt3nen

gut; kleine zu*« (gut von weiß sammenfließende '"

Kolonien in glatter Patina

braun bis hell
cha&dla

HüGkseite

Farbe voa strohgelb bis hell ijaö t anienbraun, RUokseite analog gefärbt

Glyoerin-Aapa.
ragin Agar

spärlichi kleinespärlich, weiß

ausammenfließ en-

de Kolonien in glatter Patina

mit ohamois-

braunen Färb-

fciinen, kurzes
jund spärliches
Wachstum

von strohgelb mit leicht grtxnlichen Farbtönen, orange and hellbraune, kaa tanienbraune Farbe

Hefe-Glueoae*
extrakt-Agar

gut; kleine zusammenfließende Kolonien in schwäch gefalteter Patina

fehlt

Farbe von gelborange bis kastanienbraun

(1) Waksman S₀A₀: "The Aofcinomycetes" Band IT, The William and Wirlkins Company, t96i; S. 328 - 334

(2) Pridham T.Ge₉ Andereon P., Foley C_e. Lindenfelser LbA*, Hessöltine C.M_e5 und B.eaediet R_kB_e; ·' Antibiotie Annual 1956 ~ 1957", S„ 947 - 953

(3) Baldaoci E*, Giolitti G·, Küster E,, und Scot ei T..ι Journal of Miorobiology₅ 2, Seite 39_s 1961

(4) 200 g gekochte Kartoffeln werden durch ein Sieb filtriert und es werden 20 g Glucose und 20 g

109815/1865

BAD ORIGINAL

Agar zugesetzt| dann wird auf ein Volumen von t ·! aufgefüllt· und 20 Min« lang "bei 12O⁰C sterilisierte

Identifizierung des Stammes

Die Eigenschaften * die der geprüfte und vorher beschriebene Mikroorganismus zeigt, erlauben es_? ihn dem Stamm Streptomyces Waksman*et Henrici (Sergey's Manual of Determinative Bacteriology?7»Ausgabe., 1957$ So 744 - 745) zuzuordnen,,

Streptomycee F_nI-, 2758 gehört zur Gruppe "Rsetus flexibilis" von Pridham und Mitarbeiters (Apple Microhiol· jS» 1958, .S* 52), da er gerade Sporenträger bildet« Die Gruppe ist in sechs "Serien" untergeteilt _? die durch die Farbe des luftmyoels gekenn» zeichnet einds weiß, olivbraun_; gelb_} blau, rot, grau_a

Der vorliegende Mikroorganismus aeigt ein Luftmyöel mit typisch haselnußbrauner Färbu^ag und kann offeheiohtlich keiner dieser Serien und daher auch nicht einer der angegebenen Spezies zugazählt werden·

Streptomyoes Fei» 2758 gehcirt somit auch zur Gruppe II von Baldaccit "Vegetatives Myoel gefärbt? Entwicklung auf Agar im allgemeinen reichlich, wesentlich (cremig, mit Pallets usw»); mäSiga und manch-' mal teilweise Sporenbildung" (Journal of Micröbiolügy 6, 1958» S, 10).

Diese Gruppe ist in "Serien" geteilt, die

durch 1098157 1865

duroh verschieden© Farbkombinationen des vegetativen und Luftmyoels gekennzeichnet sind» Keine dieser Kombinationen entspricht dem vorliegenden Mikroorganismus« der durch ein vegetatives,, orange-braunes Mycel und ein haselnußbraunes Luftmycel gekennzeichnet ist'₃

Außerdem gehört Streptomyees P*I« 2758 zur Gruppe der melanin-negativen Serien von Waksman (The Aetinomyeetes Band II. 1961* S« 117) _c Die Serien dieser Gruppö sind gekennzeichnet duroh verschiedene Kombinationen folgender Eigenschaften; Farbe des Luftraycelö; Farbe des vegetativen Myeels und Bildung von Spiralen« Keine dieser Korabinationen entspricht der des vorliegenden. Mikroorganismus· ·. der durch ein haselnußbraunes Luftmyeel, ein orange-braunes vegetatives Myeel und die Abwesenheit von Spiralen gekennaeichnet ist.

In Tabelle II ist ein Vergleich zwischen den Eigenschaften des Streptomyces F-I, 27158 und den Eigenschaften anderer Streptorayceten« die Tetracyolin produzieren, angegeben: aus diesem Vergleich ergibt sich offensichtlich, wartan Streptomvceö F.Io2758 mit keinem der bekannten Mikroorganismen identifizierbar ist.

Es ist anzunehmen, daß der vorliegende Mikroorganismus zu etaer von den bekannten Arten verschiedenen

10981571865 BAD ORIQINAL

denen Abart gehört} es wird daher angenommen, daß er eine neue Art darstellt und er wurde üurch den Garnen Streptomyoes avellaneus gekennzeichnet_o
Tabelle IT - Vergleich zwischen Strepeomyees -P-I-.2758 und den anderen Tetracyclin produzierenden Arten»

	Streptomyees	Streptomyces	Streptomyces cp^
Sporophoren	tf.I, 2758	aureofaeiens	3054 Mutant von S·aureofaciens
Sporen		Mutant, cp, 11843 ATGC
Vegetative» Mycel	gerade Sektion RP-	gerade Sektion RP	gerade Sektion RF
luf tmycel.	zylindrisch 1*2-1,5 x M-1.7^1	oval 0»5 - 1o6 χ Oo5 .- 1>6/U	oval oder zylindr* 1 X 1 a5 Ά
Lösliche Pigmente	Farbe von licht gelb bis licht kastanienbraun, Rückseite von strohgelb bis kastanienbraun	von gelblich Eb orange-gelb Rückseite von gelb bis braun	von weißrosa bis lacharosai Rück seite chamois- braun-olive
Stärke Gelatine Nitrate Tyrosin-\ Melanin Schwefelwasser stoff Galaktose Mannit Milch	von weiß bie , hell haselnuß braun	von weis bis grau	von weiß bis gelbj watteartig oder pulvrig
fehlt	gelegentlich anwesend von zitronengelb bis dunkelbraun	fehlt
+ ..'";■■ -■- ■. ei· - . - ■ ■ Eigenschaft fehlt αφ " ■ ■' ■ 1!TQf	Eigenschaft 1 R-/1 86 5 i	+ ■"."■"■ + - ...... -. ■ ■ ' Eigenschaft nicht festge stellt W » W. . ... *.. Il « .1» " O " ■

■f- positive leaktiea

- negative Reaktion

161781B

Streptomyces ST.υ*VSjι Muta tion vTEn faeiens

Alte Kulturen sind schwarz mit kleinen weißen Mycelflecken. Sie bestehen aus einer bestimmten Anzahl von Einheiten in kurzen Ketten mit einer Länge yon Os5 4,5/U

von farblos bis gelb

Streptomyces sT

ΊΤ652

offene Spiralen BA Sektion Streptomyces verticillätus BT.AB929 *

doppelt quirlig ohneeSpiralen BV Sektion

ßylindriseh Ο« 99-1.32 a:

O ο 66/Il

glatt, von gelb bis orange oder rot oder oliv-bräunlich zylindrisch O*6-0ο8 χ 1.9-2a5 μ

weiß mit weißei Rückseite

Streptomyoes aT

vTSTäur eoTaoi en"s

mit Sndhaken RA; Sektion

nicht bei3Chrieben

nicht beschrieben

von weißlich bis grau

von weiß bis maus- und schwarzgrau olivegrün mit weißgrauen Farbtönen

weiß

manchmal von braun bis grüa

dunkelbraun, rot oder braun= schwarz fehlt

fehlt

nicht Desohr, nicht beschrieben

If

*
H

η
η

nicht beschr.

R Il

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η η

nicht beschr.

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nicht beschr.

B I»

η η η η » ι? η η

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BAD ORiGtNAL

-108815/186-5

StrejJtqmyces- s3?	Streptomyees	Streptomgpes psammiölleüs	Streptomyees si
*fFionia	Τ20δί ÄTGC		*Γ$5Π50 Atöö
gerade RF Sektion.	nieht beschrΐ	gerade RF Sektion
nicht besehr-	nicht beschr.	nicht beschr*	gerade RF Sektion
nicht- beschrc	ven farblos bis braun« Rückseite bräun lieh mit Rot·. tönen	von hellgelb bis hellbraun	sphärisch oder oval 1 *4 i1»4 -
rötlich oder . orange	fehlt fast, weißlich«grau	von hellbraun bis dunkel braun mit grün lichen Farb tönen	von farblos bis gelb. Rückseite von gelb bis sohwarjs
von braun-grün - bis .goldgelb orange	von grau bis jotbraun oder auch bis tief- echwarz	von hellbraun bis dunkelbraun kräftig braun grün	von weißlich bis braun-grau
-j- nicht beschr- ff Ii η tr w « «κ -Γ-	nicht beschr> κ η η β « . . . If .,.,... ....-- ff tr	nicht beschr*. η η ca - " nicht beschr <.- η it «η - - -	fehlt
nicht besehrieben η η B U H ., » -f - ■■ -

1098 15/1865

161781b

£t^p5£
jaersxSiTxs

nicht b es ehr,

nicht beeehr,

hellgelb bis braun

von schneeweiß bis hellgrau bis dunkel grau.

von hellgelb bis gelbbraun

nicht besehr.

(t η η η

ti

ι»

η ι*

■Streptomycea aureöfaeiens

leäiolanum BT_β462840

nicht besehr,

nicht besohr<

von creme-gelb bis gelb-orange bis braun

von weißgelb

bis Weißgrau biß blau

von gelb-fluoreszierend bis gelbbraun

nicht

«t η.

» η

η η η η

Streptomycea aiireoraeiens

ιStreptorayces -Viriairaclens

10762

ATCC.11980

biegsam mit Tendenz zur Spiralenbildg, RA. Sektion

ioffene Spiralen RA Sektion

glattj rund bis Kugeln

nicht beschrieben

ψοά gelblich j von hellbraun bis gelb-orangej bis braun bis purpur-bicauli

von weißlich bis aschgrau bis intensiv grau

manchmal vorhanden 5 von hellgelb bl3 lichtbraus.

nicht besehr.

tf Il

nicht besehr4

mausgrau

nicht beschrieben

It It If If H ti

15/1865

BAD ORIGINAL

.■■■'■ .' ..■ . ν.-:-;-13 - ... ■:..■.*■■ -

Straptomyoes arellaneue kann durchGefrier» trocknung* wobei Miloh als Suepensionsmedlum verwendet wird, gelagert werden*

Die Produktion von Antibiotikum wird nach den üblichen bekannten Methoden durchgeführt und besteht darin j daß der neue Mikroorganismus in einem vorher sterilisierten flüssigen Kulturmedium unter aeroben Bedingungen bei einer Temperatur von 22 Ms 35⁰C₁J vorzugsweise bei 28⁰C₅ während eines Zeitraumes von 72 bis 168 Stunden, vorsugsweisβ 120 Stunden* >©i einem pH-Wert_? der iirsprunglieli bei 6*0 bis T₀O liegt und gegen Ende des Fermehtationeprozesses bei 6*5 bis 7*2 liegt, gezüchtet wirdo

Das Kulturmedium enthält Köhlenstoff stoffquellen und^^ Salze» Als Kohlenstoffquelle Stärke_s Dextrin. Glycerin* Maltose, Maisquellflüssigkeit 9 Trebern,^ Sojaböhnenöls Schmalaöl und andere für diesen Zweck gewöhnlich verwendete Sub stanzen benützt werden_&

können

Als Stickstof fquelle /,, außer den ob erwähnten komplexen Substanzen auch Fleisohextraktj,

-mehl Trookenhefe, Pep ton oder Baumwöllsamen*^; , KaseiM oder Kaseinhydrolyßatt und ibnmonium-^alzs, wie: Ammoniumsulfate, Biamraoniumphosphate und Aistimoniumnitrat und andere für rllesen Zweck gewöhnlich

■;"."■-■ v/endete

109815/1865

wendete Substanzen benutzt werden»

Die für die Herstellung des Antibiotikums verwendeten Mineralsalze können je naoii dem verwendeten Medium verschieden sein. In einein Medium, welches komplexe Substanzen enthält, wie verschiedene Mehle und Fermentat ions rückstände ₅ hat sich der Zusatz von Kalziumkarbonat und Na tr ium-ο der Kaliumphosphaten ale zweckmäflig erwiesen* In Medien, die Dextrin, Kasein oder Ammoniumsalze enthalten,, ist der Zusatz von Mineralsalzen wie Kalium^ Magnesium-, Eisen-« Kupfer-, Zink-., Mangan- oder Kobalt salzen notwendige

Die Fermentation kann in Erlenmeyerkolben ca er in laboratofiums=· oder industriellen Fermentern verschiedener Kapazität durchgeführt werden,,

Das in der Fermentationsbrühe gebildete Tstracyolin wird durch chemische oder biologische Verfahren quantitativ bestimmt»

TJm das Tetracyclin aus den Brühen zu extrahieren* werden die auf diesem Gebiet bekannten Verfahren eingesetzt, wie Extraktionen mit üblichen läeungBraittöln., wenn gewünscht in Anwesenheit von Koadjuvantien oder Adsorbentien. Eines dieser Verfahren gestattet eine besonders gute Extraktion und Reinigung des TetraoycXine aus der Fermentafcioiisbriihe» worin es nach dem erfindungsgemäSen. Verfahren gebildet worden iac*

Dieses

10 9 815/1885 ^eAD

!Dieses VDx-raJiren "besteht im wesentlichen in einer lxtrektiqn..mi-fc_r^4.5-er,Mischung von iDrioresol. .und Tetraohiorlr.ohleiistoff "bei .aUmiischem pH_u . » . BiQ, vorzugsweise verwendete Hisohung yon Sri · C3;e3cl (weiche aus des. drei Isomeren von Cr es öl "besteht wil4- eine Dichte . von_;.1o030_- 1 ,.038 "besitzt)

usd Tetra.chloxlcQhlenstoff-. die fUi* die Extraktion wendet wird;, .weist ein Misohungsverhältnis von 5!rieresoiyiEetraehlGrckohleiisrtoif von 1:1 bis Ii3. au:?^. Insbesondere wird die Sxtralction ?<rie folgt durchgeführt j der KülturbrUhe? welolie das Tetraejeliii enthält.« wird Oxalsäure augesetzt, hierauf \ filtriert uiicl dem Eiltrat wird ein chelatbildendes Mittel xür liiehrwertigs Metaliionen wie .tatriuiaä diatais.· tatraaeetat. zugesetsto Jimi. \clrd Biit einer Miachimg von Tricresol und Tetrachlorkohlenstoff eatw trahiert^ bei einem pH-Wert* der durch-Zusatz von Alkali auf., 8 -*■ 8.-5 eingestellt vrordea ,ist»

Die organischen. Phasen werden abgetre»Titρ vordurch Zentrlf agier en _r und es--t?l'rd Aceton

und ein© τ/ässrige I_?ösung einer ^organischen oder

"■'-.."'"' : ■'""■-■"". dieeen organischen Saure» vorzugsweise Zitronensäure«/^ auge

aetst« Die^Mischung wird geschüttelt imfi die P werden getrennt;* . -:_'" Der aö erhaltene wa&srige t eis-thalt öas _AB-öibiotiimia sip.samtaßn mit einer ■ - oeäti*2i^:

109815/186S

■bestimmten Uengo gefärbter Verunreinigungen .und 'StI--cresolj.er wird durch Schütteln mit einem mit fasser nicht mischbaren Lösungsmittel wie Butanolj Methylisobutylketon und dergleichen gereinigt. Um die Trennung der "beiden Phasen und den Übergang der oberwähnten gefärbten Verunreinigungen in die organische Phase au erleichtern, hat es sieh als sweckmäßig herausgestellt t vor Durchführung der Extraktion eine gewisse Menge oberflächenaktive Substanzen wie Alkali-alkylsuifonat- oder quaternär^ Ammoniumsalarexudgl. zuzusetzenc Dann werden die teilen Phasen getrennt und die organische Phase wird verworfen«

Die wässrige Phase wird dann abgetrennt« durch Zusatz von Alkali auf einen pH-Wert von 5-7 gebracht? beispielsweise durch Zusatz von Alkalihydroxyden oder Karbonateu* Das .Antibiotikum Tetracyclin fällt aus. wird dann als solches isoliert und durch Tftnkristallisierung gereinigt oder aber nach bekannten Verfahren in seine Salze mit organischen oder anorganischen Säuren Übergeführt*

Die folgenden Beispiele sollen den Gegenstand der vorliegenden Erfindung erläutern? ohne daß diese

jedoch- darauf beschränkt werden soll*

.Beispiel 1

109815/1865 bad

1-6178Ϊ&

Beispiel 1 ■■■■■ ".. . - ν ' . / :

Ε» werden zwei 50fr ml SrionmeyearkoOfeea mit 60 mi dee folgenden vegetötivea Myoela Iseßchtioktt

MaiffqjiellfliiSE^glEeit T*5' .^

Ammoniumeiilfstt .'':.- Q_e4 5^

Kalaii2BäEaa?bonat 0*6 ?6

löeliohe StSrite 2»0 ^

Maiamehl 0*1

Leitungswasser auf t000 ml

Die Sterilisation wird duroh Erhitzen in einem Autoklaven bei 120⁰C während 20 Minuten durohgefüiirt. Der pEMtfert betrug nach der Sterilisierung S₆So

Jeder Kolben wurde etwa mit einem Drittel der Myoelpberfläone von 10 Tage alten Streifenkulturen: von Streptomyoes avelianeug beimpft _t wobei die Kultur, die zum Animpf en verwendet wurde» bei 28⁰C auf folgendem festen Medium beschichtet worden wart

Hefeextrakt 0·4 β

Glukose Oo4 $>

Agar ..."_■■' · 1o8 ^ _:;.-_r Destilliertes Wasser auf 1000 ml n&eh des Sterilisierungt 6»2 Die Kolben werden 27 Stunden lang bii gS^C

109815/1805

auf einem Drehschüttler bei 240 TF.p.lE· mit einer Sxaentrissitat von 3*5 em bebrütet·

3 ml einer so erhaltenen Kultur werden verwendet» um einen 300ml Erlenmeyerlco2Ibea_f welcher 30 ml des folgenden Mediums enthielt* anzuimpfens Stärfc© - 6 β Kaliumcarbonat 0*4 fi

Sojamehl ohne Fett 5 i* Kae«iaE;* 1 $

Magnesiumsulfat C

Sehmalzöl 1 *ß

Iieitungswasser auf 1000 ml

Der pH-Wert betrug nach Sterilisierung während 20 Minuten bei 120⁰C 6.B*

Die Kultur wird bei 28°C auf einem Brehschüttler mit einer Exzentrizität von 3« 5 cm bei 220 TJ.p_tM_M wie für die vegetative Phase beschrieben, bebrütst.

Wach i20stÜndiger Fermentation war sine Maximalaktivität» entsprechend einer Konzentration von 600Qpg/ml Tetracyclin erhalten.

Beispiel 2

Es wird wie in Beispiel 1 gearbeitet, Jedoch wird für die vegetative Phase folgendes Medium ver-

109815Y1885

■ 19 - ■ "

wendet« . ■ '

MaisquellflUssiglteit 5„ 5 $

Kaliumcarbonat 1 _ύ8 fc

Saccharose Oa 5 $

XeitteEgswasser auf 1000 asl

Sterilisierungj 20 Minstteß lang bei 1 20^GG pH-Wert nach,Sterilisiöruiig 6*5

und für die Frodu3r.tiGasphase wird folgeades Medium eißgesetati

Stärfee 12 ?&

Maisqueilf111ssigkeit 2_e6 ^

15^' 14o5 /^ Kchaltehlcrld ' 0_β7β ^

Oo45: i>

- - . . 2,5 36 ;: JCiaitungstmsser auf 1000 ml

J)ex pH-Wert mrd iait ^atriuiaiiydroxyil vor der Sterilisierung j die 20 Minuten lang l>ei 120^cC durchgeführt wird $ auf 6<»2 gebracht«

SFäcia 120stündigsr BebrUtung unter den in Beispiel 1 liesehriebenen Bediagurfgen wird eine Aktivität erhalten« die einer Konzentration von 10<.500yUg/al ;Xiii eatsprißiit-:

109815/1865 6ADoRIGINAL

Beispiel 3

Es wird wie in Beispiel 1 gearbeitet, ^edooh

wird die vegetative Phase in folgendem Medium durchgeführtϊ

Maisquellfltissigkeit 1*5$

Amraoniumsmlfat 0*4 #

Kalziumkarbonat Oo6 ^

Monokaliumphosphat Oo 05 $>

Stärke 2 .$

Glukose 0*5 fi

.Maismehl . Od $>

Sojamehl O₀ A %

Sohmalzöl 0,25 $>

Iieitungswasser auf 1000 ml Der pH-Wert wird durch Susatz von Natriumhydroxyd auf βοβ gebracht;.

Die produktive Phase wird in folgendem Medium durchgeführt%

Stärke 6 #

Glukose 0*5 1°

Maisquellflüssigkeit 2„5 1°

Sojamehl O»5 ^

Maismehl 1 $

Aramoniumsulfat O «6 $>

Ämmoniumchlorid ■ ■ 0*1 $>

MgKgansulfat

109815/1865

1817815

Kobaltehlorid ';..,_. Q₀QOOS $

Sahmalab:! , 5 5$

Iiaeh 1 20sttindiger Fermentation wird eine maximale Produlrfeion von"ΎΐΟΟjag/ki fetraoyGlin

Beispiel 4

In einem 10 1 Glaefermenter wearden 6 1 des in

■ vegetativen
Beispiel 2 tiescihriebenen/Mediums} eingefrracnt und durch 30 Minuten langes Erhitzen auf 120⁰C steriliaierto Eäeh Abkühlen wird mit 200 ml einer vegetativen Kulturj dleV wie in Beispiel 1 besehriefeen. iii einem SJrXenmeyerkolben hergestellt worden war, geimpf tv" Die Mischung wird 24 Stunden lang bei 28⁰C unter Durch" leiten eines Euftstromes entsprechend 6 1 pro Minute und unter Eühren mit einem 4-Schaufelrührsehiittley bei 350 TJep.M, bebrütet, Da3 so erhaltene ,vegetative Medium dient ;?um Anirapf en in einem Verhältnis von 5 ^ von 6 1 ProdulctionsmediumjWie in Beispiel 2 besehriebena das sich in einem 10 1 Ferment er befindet , und 30 Minuten lang bei 120⁰C Sterilisiert worden warv

Die Mischung wird bei 28⁰C mit einem Luftstrom von 6 1 pro Minute und unter Rühren mit einem 4-Schaufel lührraischer bei 450 üopoM* bebrütet, Haoh 5«ä

Beb;gütung

109815/1885

~ 22 - ■ .

Bebrütung wurde tetracyclin in einer Menge von 7500/ag/ml gebildetο

Beispiel 5

Zu 7*23« kg einer Kulturfcrühe» hergestellt w±e in Beispiel 4 beschrieben und enthaltend 55 g Tetracyclin in Form dee Hydrochloride_s werden 87 g Oxalsäure augesetzt» Pie Mischung wird 1 Stunde lang gerührt» dann werden IQQ g Infusorienerde sugesetst und das ganze wird filtriert,

Der Kuchen wird mit 2« 5 3. einer wässrigen ITdsung. enthaltend 1 $> Oxalsäure, gewaschen« Eb werden i8 1 dee Filtrates erhalten, zu welchem 55 g Äthylendi«iDin«natrium-tetraacetat und jeine Mischung, bestehand aus 500 ml Trieresol und 1000 inl lEetraehlorkohlenatoff. iugeaetzt werden_o -

Die Mischung wird während Zugatsj von 275 ψΐ einer 20^igen wässrigen Hatron3.augelösvtng starfe ge» rührti der pH-Wert erreicht den Wert von 8»

Die Phasen werden dann durch Zentrifugieren getrennt * die organische phase wird mit einer geringen Menge Wasser gewaschen» mit 5 g Kntfarftungsaohle geschüttelt und über Filterpapier mit einer lage Infusorienerde filtriert» Dem Filtrat werden 500 ml Aaefcon und 500 ml wässriger, 1Obiger Zitronensäure-

lösung

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lösung zTAgesetstö Das (tanze wird geschüttelt, die Phasen werden getrennt und die organische Phase dann mit 2 Anteilen von j© 200 ml und 100 ml einer 1Obigen wässrigen Zitronensäurelösung extrahiert» Die wässrig-azetonischen Extrakte werden zusammengekracht-_s. es werden 1.0-ml einer 10bigen wässrigen Stearyl-trimethylammoniumsulfatlösung zugesetzt und es wird mit 520 ml Butanol geschüttelt_ö Das Butanole das nach dem Schütteln gelbbraun gefärbt ist* wird abgetrennt und verworfene

Der S--'einigte wässrige Extrakt wird geschüttelt und es wird eine 2Q$ige wässrige Kaliumhydroxydlbsung bis ssu einem pH-Wert von 5»8 zugesetzt, Hierauf wird auf einem Eisbad gekühlt und nach 20 Stunden wird der erhaltene Niederschlag abfiltriert_s mit Wasser gewaschen und bei 50⁰C unter Vakuum getrocknet«, Es werden 35*21 g des Produktes mit einer Wirksamkeit von 102o2 Mg/mg*, entsprechend 55*21 g Tetracyclinhydro-Chlorid, erhaltene Buch .Alkalisch-maiDhen der Mutterlaugen auf einen pH-Wert von T wird eine weitere Menge des Antibiotikums abgeschiedeni das bei 50⁰C unter Vakuum getrocknet. 6*69 g Tetracyclin mit einer Wirksamkeit von 855yag/mg₅ entsprechend 5»72 g Tetracyelinhydrcchlorid, zeigt» .

Beispiel 6

Zn 16 kg einer EulturbrüiiSi enthaltend 160 g

!Tetracyclin 10 9 8 15 / 1 8 6 5 BAD ORIGINAL

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Tetracyclin als Hydroclilorid* werden 200 g Oxalsäure augesetzt_? es wird 1 Stunde lang geschüttelt_s dann wird 1 kg Infusorienerde sugesetzt und es wird filtriert* Der Kuchen wird mit 5*5 1 einer I^igen wässrigen ÖxalsäurelÖsung gewaschen* Dem so erhaltenen Filtrat werden 160 g Äthylendiamin-natrium-tetraazetat sugesetzt* der pH-tert wird auf 8*4 eingestellt und die Mischung wird mit einer Mischung von I₄OT 1 Tetrachlorkohlenstoff und 1„07 1 Trieresol extrahiert* Die organisohe Phase wird mit 1050 ml Azeton uM T50 ml lO^iger wässriger Zitronensäurelösuiig extrahierte Ss wird geschüttelt*, die Ehasen werden getrennt und die orgaölBohe Phase wird aufeinanderfolgend mit awei Anteilen von 400 und 350 ml einer 1 öligen wäesrig en Sitroaensaurelösung extrahiert. Die geeanaiielter. wässrigen aiaetoniöGhen Extrakte werden duröh Schütteln mit 500 ml MethylißOi3Utylketon und 1 g Hatriumlauryläulfonat gereinigte Das Extrakt im organischen LÖsungsmittel wird verworfen und der wässrige Extrakt wird mit 5 g Entfärkungskohle liehandelt? zum filtrierten Extrakt wird eine 20$ige wässrige Kaliumhydroscyd" lösung zugesetzt« bis ein pH-Wert von 5»5»erreicht istο"Nach 30 Stunden langem Kühlen der Lösung auf Sie wird der ausgefallene Niederschlag abfiltriert, mit 'Wasser gewaschen und bei 50^GC unter Vakuum

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trocknete

Is werden 30 9 β „7 g Tetracyclin mit einer-Wirksamkeit von 106/ug/mg? entsprechend 104 g Tetracyclinhydrochlorid erhalten»

Aus der Mutterlauge *_s welche 17g Tetracyclin*· hydrochlorid enthält, werden durch Extraktion mit Tricresol-tetraehlorkuhlenstoff nach der oben beschriebenen Verfahrensweise 11₀5 g des Antibiotikums mit einer Wirksamkeit von 951yUg/mg, entsprechend 10^93 g Tetracyclinhydrochlorid erhaltenο

Beispiel 1

Zu 11^25 kg einer KuIturbrühe_? enthaltend ti3»6 S Tetracyclin als Hy&toehlorid, werden SOO g Oxalsäure

Die Mischung wird 1 Stundelang geschüttelt _$ es wird ©in Kilogramm Infusorienerde zugesetzt und hierauf wird filtrierte Der Kuchen wird mit 7 1 einer I^igen wässrigen OxaleäurelOsung gewaschen^

Zu dem FiItrat (14*18 l) werden 100 g Äthylendiatain-natriumtiefcraazetat, 700 ml Trieresol und 1400 ml Tetr^ohlorkohlenstoff augesetsst=, Der pH-Wert wird mit einer SQ^igen wässrigen Natronlauge auf 8_O'4

es wird
gebracht und/15 Minuten lang geschüttelt« Die beiden Phasen werden durch Zentrifugieren getrennt und die

wässrige

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wässrige Phase wird nechmalB mit 100 ml !Erieresol und 300 ml Tetrachlorkohlenstoff extrahiert und dann verworfen.

Die organischen Extrakte werden vereinigt und Über ein Papierfilter mitetner I>aga Infusorienerde filtriert*

Dem Filtrat (1240 ml) werden hintereinander 300 ml Azeton, 980 ml 1Obiger wässriger Zitronensäurelösung sugesetzt, dann wird geschüttelt und es werden 150 ml einer 20$igen wässrigen Schwefelsäurelösung zugesetzt« um eine leichte Trübung au entfernen.

Die Mischung wird nochmals geschüttelt und die Phasen werden getrennt» Die organische Phase wird zweimal mit je 200 ml einer 10bigen wässrigen Zitronen» säurelösung extrahiert«, Zu den gesammelten azetonischwässrigen Extrakten werden 600 ml n.Butanol zugesetzt und es wird geschüttelt, dann wird nochmals 20#ige wässrige Kalilauge zugesetzt, fels ein pH-Wert von 5-5 erreicht ist.

Das Rühren wird 63 Stunden lang bei Raumtemperatur fortgesetaSo Der Niederschlag wird abfiltriert, mit n^Butanol gewaschen und dann mit Wasser gewaschen..

Die Mischung wird bei 50⁰G untsr Vakuum getrocknet und es werden 90.6 g Tetracyclin mit einer

Wirksamkeit

181.781S-

Wirksamkeit ύοώ. 991 ^:& i79^ige Ausbeute) erhalten

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Claims (1)

1. Patent -a η spruch:

   Fermentativee Verfahren zwc Herstellung von Tetracyclin; dadurch gekennzeichnet.? da8 der neue Stamm Streptomyeee avellaneus unter aeroben Bedingungen in einem Kahrmediunu welches Kohlenstoff- und Stickstoffquellen und Mineralsalze enthält, bei einer Temperatur von 22° bis 35⁰C wahrend einss Zeitraumes ν on 72 bis 168 Stunden bei einem pH-Wert von 6*0 Ms f_c2 gesuchtet wird und daß das so erhaltene Tetrae^clin aus der Nährbrüfes abgetrennt land als solches gereinigt oder auf an sieh bekannte Weise mittels irngiftiger« pharmazeut-iseli verwendbarer anorganischer oder organische?· Säuren in Salze übergeführt wird.

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