DE1492137B - Verfahren zur Herstellung von Oxy tetracyclin auf biologischem Weg - Google Patents

Description

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Herstellung von Oxytetracyclin auf biologischem Weg durch Züchtung eines Stammes von Streptomyces in einem üblichen Nährmedium und Aufarbeitung des Reaktionsgemisches in an sich bekannter Weise, das dadurch gekennzeichnet ist, daß man den Stamm Streptomyces henetus nov. spec, bei dem Commonwealth Mycological Institute Ferry Lane, Kew, Surrey (England) unter I. M. I. 109 532 und bei dem Institute of Microbiology of the Rutgers University (USA) unter I. M. 3872 hinterlegt, verwendet.

Das Antibiotikum Oxytetracyclin, seine Herstellung und seine chemischen, physikalischen und. biologischen Eigenschaften sind in der Literatur (W a k s m a η S. Α., »The Actinomycetes«, Vol. Ill, 1962, S. 329) ausführlich beschrieben worden.

Man hat gefunden, daß man mit dem Verfahren der vorliegenden Erfindung Oxytetracyclin in sehr hoher Ausbeute erhalten kann.

Der neue Oxytetracyclin erzeugende Mikroorganismus, der aus einer in der Nähe von Ramera (Italien) entnommenen Bodenprobe isoliert wurde, weist die folgenden morphologischen, makroskopischen, mikroskopischen und biochemischen Eigenschaften auf.

Mikroskopisches Aussehen

Das sich auf Kartoffel-Agar und Czapek-Agar bildende vegetative Mycel besteht aus 0,8 bis 0,9 μ dicken, mehr oder weniger langen und verzweigten Hyphen. Von denselben wird das aus 1,2 bis 1,6 μ dicken und nicht sehr langen Hyphen bestehende Luftmycel gebildet. Diese Hyphen verzweigen sich reichlich und bilden geradlinige Konidiophora, welche spiralförmige Hyphen tragen, die ihrerseits in Sporen übergehen.

Die Konidien sind vorwiegend oval mit glatter Oberfläche und haben die folgenden Ausmaße: 1,2 bis 1,6 μ χ 1,4 bis 1,7 μ, zuerst sind sie kettenweise und dann frei angeordnet. Jede Kette trägt mehr als 10 Sporen. Die Sporen bildenden Hyphen sind an den Konidiophora abwechselnd oder gegenseitig angeordnet.

Die spiralförmigen Konidiophora sind zum größten Teil quirlartig eingefügt. Die Quirle können aus zwei oder mehreren Konidiophora bestehen. Die Spiralen sind geschlossen, wobei sie oft Knäuel bilden können.

Makroskopisches Aussehen

In Tabelle 1 sind die Eigenschaften entsprechend

den daneben angegebenen Kulturböden angeführt, wobei man den Mikroorganismus bei 28° C wachsen ließ und die Beobachtungen am 3., 8., 16. und 21. Tag nach der Beimpfung durchführte.

Biochemische Eigenschaften

Der Mikroorganismus reduziert Nitrate zu Nitriten, hydrolysiert Stärke und Gelatine, erzeugt kein Melanin und verwertet Tyrosin, d-Mannose, d-Arabinose, d-Glukose, Mesoinosit, d-Fruktose. Er erzeugt Säuren aus Adonit, Maltose und Ramnose, aber nicht aus d-Xylose, Sorbit, Saccharose. Der Mikroorganismus bildet keine Sklerotien und kann nicht bei 50⁰C wachsen.

Tabelle 1

Die Eigenschaften von Streptomyces henetus nov. spec, bei dem Commonwealth Mycological Institute Ferry Lane, Kew, Surrey (England) unter I. M. I. 109 532 und bei dem Institute of Microbiology

of the Rutgers University (USA) unter I. M. 3872 hinterlegt

Medium	Wachstum	Luftmycel	Vegetatives Mycel	Lösliche Pigmente	Beobachtungen
Bennet-Agar1)	reichlich, Ober fläche zeigt erhabene runzelige Falten	Schmutzigweiß, glatt, spärlich	von farblos über Strohgelb bis zu hellbräunlich	abwesend	—
Csapek-Agar1)	spärlich	Schmutzigweiß, mit geradlinigen Sporophora, welche spiral förmige Hyphen tragen, die ihrer seits in Sporen übergehen	farblos	abwesend
Asparagin- Glukose-Agar1)	mäßig	weißlich, spärlich	farblos	abwesend	—
Glycerin- Glycin-Agar1)	mäßig	Schmutzigweiß, spärlich	farblos	abwesend	—

') Wa k s m a η, S.A., The Actynomycetes. Vol. II, The Williams and Wilkins Company, 1961, S. 328 bis 334.

Fortsetzung

Medium	Wachstum	Luftmycel	Vegetatives Mycel	Lösliche Pigmente	Beobachtungen
Emerson-Agar1)	reichlich, Ober fläche zeigt erhabene runzelige Falten	mäßig, von Schmutzigweiß bis Hellgrau bräunlich	hell	abwesend	—
Stärke-Priham- Salze-Agar2)	mäßig	mittelmäßig von schmutzigweißer Farbe, gerad linige Kondio- phora, welche spiralförmige Hyphen tragen, die ihrerseits in Sporen über gehen	farblos	abwesend
Kartoffel-Agar4)	reichlich	von Schmutzig weiß bis Hell graubraun	von Strohgelb bis Hellbraun	abwesend
Hafer-Agar3)	mäßig	spärlich, weißlich	von farblos bis gelblich	abwesend	—
Asparagin- Glycerin-Agar1)	mäßig	spärlich, weißlich	farblos gelblich	abwesend	—
Pepton- Stärke-Agar1)	mäßig	spärlich, weißlich	leicht Hellbraun	abwesend	positive Hydrolyse
Tyrosine-Agar5)	mäßig	spärlich, Schmutzigweiß	farblos	abwesend	—
Melanin-Agar1)	spärlich	sehr spärlich, Schmutzigweiß	farblos	abwesend	—
Gelatine1)	mäßig	abwesend	Strohgelb	abwesend	—
Peptone-Brühe mit KNO3 1)	mäßig	abwesend	von honigfarbig bis gelblich	abwesend	—
Milch	mäßig	abwesend	Strohgelb	abwesend	—

') Waksman, S.A., The Actynomycetes, Vol. II, The Williams and Wilkins Company, 1961, S. 328 bis 334.

²) Pr id ham T. G., An der s ο η, P., Foley, C, Li η d en f el s e r, L. A., Hes sei tine, CN. and Benedict, R. b., Antibiotics Annual 1956 und 1957, S. 947 bis 953.

³) B a 1 d a c c i, E., G i ο 1 e 11 i, G., K ü s t e r, E., S c ο 11 i, T., 1961, Giornale di microbiologia, 9, S. 39.

⁴) Zu 200 g durch Gaze gegebene Kartoffelbrühe setzt man 20 g Glukose und 20 g Agar zu. Hierauf stellt man das Volumen der Mischung durch Wasserzugabe auf 1000 cm³ ein und sterilisiert 20 Minuten bei 120⁰C.

⁵) G ο r d ο n, R. E., S m i t h, M. M., J. Bact., 69, S. 147, 1955.

Tabelle 2

Vergleich zwischen dem im vorliegenden Fall zum Einsatz kommenden Streptomyces und anderen Oxytetracyclin erzeugenden Streptomyceten

	Streptomyces gemäß Erfindung	S. rimosus	S. platensis	S. armillatus	S. vendargus- vendargensis	S. gilvus
Sporophora1)	Spiralata	spiralförmig	spiralförmig	spiralförmig	gerade	Stellung
	Sektion S*)	Sektion S*)	Sektion S*)	Sektion S*)	Sektion S*)	nicht bekannt
Sporen	Oval mit	zylinder-	Oval	nicht	nicht	nicht
	glatter Ober	förmig	0,7 bis 0,9	beschrieben	beschrieben	beschrieben
	fläche	0,6 bis 0,7	x 0,8 bis
	1,2 bis 1,6	x 0,8 bis	1,2 μ
	x 1,4 bis	1,4 μ
	1,7 μ					•

*) Nach Pr id ham und Mitarbeiter, Applied Microbiology, Bd. 6; Nr. !, 1958. S. 51.

') = Entsprechend der Klassifizierung von P r i d h a m und Mitarbeiter, Appl. Microbiol. 6, 1958, S. 52.

Fortsetzung

	Streptomyces gemäß Erfindung	S. rimosus	S. platensis	S. armillatus	S. vendargus- vendargensis	S. gilvus
Vegetatives Mycel	von Stroh gelb bis Ocker, Rückseite blaßgelb	von creme farbig über Rötlich braun bis orange farbig	aprikosen farbig oder rötlichocker- farbig, zimt- und apriko senfarbige Rückseite	von farblos bis Gelblich grau	von Blaßgelb bis	Schwarz braun
Luftmycel	Schmutzig weiß, manchmal bis Grau braun	von weiß lich über Mausgrau bis Schwarz	von weiß lich über olivfarbig oder Maus grau bis Schwarz	weißlich, fast immer sehr spärlich	Weiß	fast immer abwesend
Löslich Pigmente	abwesend	Gelblich, manchmal auch Braun	von gelblich über Gelbgrün bis Braun	manchmal anwesend von Blaß rosa bis Braun	abwesend	nicht beschrieben
Stärke	+	±	±	_	nicht beschrieben	nicht beschrieben
Gelatine	+	±	±	—	desgl.	desgl.
Nitrate	+	+	+	—	desgl.	desgl.
Tryrosin	+	nicht beschrieben	nicht beschrieben	nicht beschrieben	desgl.	desgl.
Melanin	—	desgl.	—	—	desgl.	desgl.
H2S	—	—	nicht beschrieben	nicht beschrieben	desgl.	desgl.

+ = Positive Reaktion.

— = Negative Reaktion.

± = Sehr spärliche Reaktion.

Tabelle 2a

Vergleich zwischen dem im vorliegenden Fall zum Einsatz kommenden Streptomyces varsoviensis gemäß der französischen Patentschrift 1 279 456	Französische Patent schrift 1 279 456	Streptomyces gemäß Erfindung	und Streptomyces
S. varsoviensis	Tabelle III	Luftmycel: Schmutzigweiß, manchmal bis Graubraun	Vorliegende Beschreibung
Luftmycel = weiß	Tabelle V	verwertet Maltose und Ramnose	Tabelle 2, Seite 7
Verwertet nicht Maltose und Ramnose	Tabelle III	reduziert Nitrate zu Nitriten	Seite 3, Zeilen 1 bis 2
Reduziert nicht Nitrate zu Nitriten	Tabelle IV	Gelatine: hydrolysiert	Seite 2, Zeilen 3 von unten
Gelatine: nicht hydrolysiert	Tabelle IV	Kartoffel Medium: Luftmycel = von Schmutzig weiß bis Hellgraubraun	Seite 2, Zeile 2 von unten
Kartoffel Medium: Luftmycel = weiß *	Tabelle IV	Emerson Medium: Luftmycel = mäßig von Schmutzigweiß bis hellgrau bräunlich	Tabelle 1, Seite 4
Emerson Medium: Luftmycel = weiß	Tabelle 1, Seite 4

Identifizierung des Mikroorganismus

Nach der Beschreibung gehört der untersuchte Mikroorganismus zur Gattung Streptomyces Waksman et Henrici (Berbey's Manual of Determinative Bacteriology, 7. Auflage, 1957, S. 744 und 745). Die Prüfung der Arten läßt auf folgendes schließen.

Im Klassifizierungssystem von P r i d h a m und Mitarbeiter, (Appl. MicrobioL, 6, 1958, S. 52) gehört der Mikroorganismus zu der Abteilung »Spira«, Serie White; im Klassifizierungssystem von BaI-d a c c i (Giorn. MicrobioL, 6, 1958, S. 10), gehört der Mikroorganismus zu der Serie »Albidoflavus«; im Waksmanschen Klassifizierungssystem (The Actinomyces, Vol. II, 1961, S. 123) gehört der Mikro-Organismus der Serie »Flavus« an.

Ein Vergleich zwischen den Eigenschaften des Mikroorganismus und denen der zu den angegebenen systematischen Gruppen (Taxa) gehörenden Arten hat gezeigt, daß keine von ihnen solche Eigenschaften hat, die denen des untersuchten Mikroorganismus entsprechen.

Die Angaben dieses Vergleichs sind in Tabelle 2 wieder gegeben, .soweit sie Arten betreffen, die Substanzen erzeugen, welche den von der Anmelderin geprüften ähnlich sind. Außer den in Tabelle II angegebenen Unterschieden kann man im besonderen eine deutlich verschiedene Morphologie zwischen dem Streptomyces gemäß die Erfindung und Streptomyces rimosus nachweisen. Tatsächlich sind im ersten Fall die sich in Sporen umwandelnden Hyphen abwechselnd oder gegenseitig an langen geraden Sporophora gebunden, während im letzteren Fall die Sporen bildenden Hyphen an kurze Sporophora in mehr oder weniger kompakten Bündelsystem gebunden sind. Nachfolgend werden die Unterschiede mit den zu den angegebenen Ordnungen gehörenden Arten, die keine Substanzen des obenerwähnten Typs erzeugen, angeführt.

Der erfindungsgemäß zur Verwendung gelangende Mikroorganismus unterscheidet sich von der Art • S. flavus, weil diese Art im allgemeinen keine Spiralen erzeugt, unterscheidet sich in der Farbe des vegetativen Mycels und des Luftmycels und reduziert nicht die Nitrate (S. A. W a k s m a n, The Actinomycetes, Vol. II, 1961, S. 210); er unterscheidet sich von der Art S. flavovirens, weil diese Art im allgemeinen keine Spiralen erzeugt, lösliche Pigmente bildet, Milch peptonisiert oder gerinnen läßt (W a k s man, The Actinomycetes, Vol. II, 1961, S. 210); von der Art S. flavogriseus, weil diese Art keine Spiralen erzeugt und ein mausgraues Luftmycel bildet (W a k s m a n, The Actinomycetes, Vol. II, 1961, S. 209); von der Art S. chrysomallus, weil diese Art keine Spiralen formt und weil sie lösliche Pigmente bildet (Waksman, The Actinomycetes, Vol. II, 1961, S. 193); von der Art S. celluloflavus, weil diese Art lösliche Pigemnte erzeugt und eine verschiedene Farbe des Luftmycels zeigt (Waksman, The Actinomycetes, Vol. II, 1961, S. 191); von der Art S. viridans, weil diese Art lösliche Pigmente bildet und weil sie eine andere Farbe des Luftmycels hat (Waksman, The Actinomycetes, Vol. II, 1961, S. 286); von der Art S. albidoflavus, weil diese lösliche Pigmente bildet und eine verschiedene Farbe des Luftmycels zeigt (Waksman, The Actinomycetes, Vol. II, 1961, S. 168); von der Art S. citreus, weil diese eine verschiedene Farbe sowohl des vegetativen Mycels als auch des Luftmycels aufweist (W a k s man, The Actinomycetes, Vol. II, S. 196); von der Art S. parvus, weil diese lösliche Pigmente bildet und eine verschiedene Farbe sowohl des vegetativen Mycels als auch des Luftmycels aufweist (Waksman, The Actinomycetes, Vol. II, 1961, S. 255); von der Art S. griseoflavus, weil diese eine verschiedene Farbe sowohl des vegetativen Mycels als auch des Luftmycels aufweist und außerdem lösliche Pigmente bildet (W a k s m a n, The Actinomycetes, Vol. II, 1961, S. 222); von der Art S. flavochromogenes, weil diese lösliche Pigmente und sich in der Farbe des vegetativen Mycels und Luftmycels unterscheidet (Waksman, The Actinomycetes, Vol. II, 1961, S. 209); von der Art S. alboflavus, weil diese Art nicht dazu neigt, Spiralen zu bilden und weil sie sich in der Farbe des vegetativen Mycels unterscheidet (Waksman, The Actinomycetes, Vol. II, 1961, S. 169); von der Art S. hygroscopicus, weil diese lösliche Pigmente bildet und sich in der Farbe des vegetativen Mycels unterscheidet (Waksman, The Actinomycetes, Vol. II, 1961, S. 230); von der Art S. fimicarius, weil diese lösliche Pigmente bildet und sich in der Farbe des vegetativen Mycels und des Luftmycels unterscheidet (Waksman, The Actinomycetes, Vol. II, 1961, S. 208); von der Art S. abikoeneum, weil diese melanin-positiv ist, keine Spiralen bildet und lösliche Pigmente erzeugt (Waksman, The Actinomycetes, Vol. II, 1961, S. 165); von der Art S. alboniger, weil diese keine Spiralen bildet und eine verschiedene Farbe des Luftmycels aufweist (Waksman, The Actinomycetes, Vol. II, 1961, S. 170); von der Art S. hachijoenais, weil diese keine Spiralen bildet und sich in der Farbe des Luftmycels unterscheidet (W a k s m a n, The Actinomycetes, Vol. II, 1961, S. 226); von der Art S. eurocidicus, weil diese keine Spiralen bildet und lösliche Pigmente erzeugt (Waksman, The Actinomycetes, Vol. II, 1961, S. 205); von der Art S. mediocidicus, weil diese keine Spiralen bildet, melanin-positiv ist und Nitrate nicht reduziert (Waksman, The Actinomycetes, Vol. II, 1961, S. 242); von der Art S. albidus, v. invertens, weil diese zu der Art S. griseus (Waksman, The Actinomycetes, Vol. II, 1961, S. 169) gehört; von der Art S. albus, weil diese ein schneeweißes Luftmycel erzeugt, Milch peptonisiert und verschiedene Sporophora zeigt (W a k s m a n, The Actinomycetes, Vol. II, 1961, S. 172); von der Art S. cacaoi, weil diese lange und offene Spiralen erzeugt, ein hellgraues bis mausgraues Luftmycel bildet und Nitrate schwach reduziert (Waksman, The Actinomycetes, Vol. II, 1961, S. 183); von der Art S. erythreus, weil diese ein cremefarbiges bis purpurrotes Luftmycel und weinrote lösliche Pigmente bildet (Waksman, The Actinomycetes, Vol. II, 1961, S. 204); von der Art S. galtieri, weil diese ein cremefarbiges Luftmycel und ein braunes lösliches Pigment bildet und Gelatine schwach verflüssigt (Waksman, The Actinomycetes, Vol. II, 1961, S. 215); von der Art S. longisporoflavus, weil diese lange, offene Spiralen ein weißes bis zitronengelbes Luftmycel bildet, Milch gerinnen läßt und peptonisiert und Stärke schwach hydrolysiert (Waksman, The Actinomycetes, Vol. II, 1961, S. 37).

Daraus kann geschlossen werden, daß der untersuchte Mikroorganismus von den bisher bekannten Arten verschieden ist; deshalb wird er als ein neuer Stamm angesehen und ist als Streptomyccs henetus

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nov. spec, bei dem Commonwealth Mycological triumcarbonat, Harnstoff, N^-Malonylharnstoff,

Institute Ferry Lane, Kew, Surrey (England) unter Sulfon- oder Sulfatderivate. Daraufhin kann das so

I. M. I. 109 532 und bei dem Institute of Microbiology erhaltene Oxytetracyclin durch Umkristallisieren ge-

of the Rutgers University (USA) unter I. M. 3872 reinigt oder in seine Salze mit einer anorganischen

hinterlegt. _ 5 oder organischen Säure, wie Salzsäure, Schwefelsäure,

Der Streptomyces gemäß der Erfindung kann Zitronensäure oder Weinsäure, übergeführt werden,

sowohl durch wiederholte Züchtung auf einem festen Weiterhin umfaßt die vorliegende Erfindung ein

Nährboden (Kartoffel-Agar, Sabouraud-Agar) als auch neues Verfahren zur Extrahierung und Reinigung

durch Gefriertrocknung unter Anwendung von Milch des Antibiotikums, welche hierfolgend beschrieben

oder Milchserum als Aufschlämmungsmittel aufbe- io und mit Beispielen erläutert wird,

wahrt werden. Die Herstellung des Antibiotikums Die auf pH 2 bis 2,5 mit einer anorganischen Säure,

nach dem erfindungsgemäßen Verfahren wird nach wie Salzsäure, Schwefelsäure oder Phosphorsäure, an-

den üblichen Methoden durchgeführt und besteht gesäuerte Kulturbrühe wird filtriert, und das erhaltene

darin, daß der Streptomyces gemäß der Erfindung Filtrat wird zuerst mit Oxalsäure versetzt, nochmals

in einem flüssigen Nährboden unter aeroben Bedin- 15 zum Entfernen des Kalziumoxalats filtriert; hierauf

gungen bei einer Temperatur zwischen 24 und 37° C, wird der pH-Wert des Filtrats durch Alkalizusatz auf

vorzugsweise 28° C, über eine Zeitspanne von 72 bis 8,0 bis 8,5 eingestellt, und dieses Filtrat mit einer

144 Stunden gezüchtet wird. Das pH kann ent- Mischung von Trikresol und Tetrachlorkohlenstoff

sprechend den angewandten Fermentationsnährböden extrahiert,

von 6,1 bis 6,5 bis 8 variieren. 20 Das angewandte Trikresol ist die allgemein be-

Der Nährboden besteht aus einer Kohlenstoff- und kannte und für industrielle Zwecke angewandte Ver-

Stickstoffquelle und anorganischen Salzen. Als Koh- bindung mit spezifischem Gewicht 1,030 bis 1,038;

lenstoffquelle können Sacharose, Glukose, Dextrin, es besteht aus der Mischung dreier Kresolisomere.

. Stärke, Soyamehl, Erdnußmehl, Baumwollsaatmehl, Es wurde gefunden, daß man vorzugsweise eine

Maisquellwasser, lösliche Destillationsrückstände, So- 25 Mischung von Trikresol und Tetrachlorkohlenstoff

yaöl und Schweinefett verwendet werden. Als Stick- im Volumenverhältnis von 2:1 bis 1: 2 anwenden soll,

stoffquelle kommen außer einigen der obenerwähnten Die erhaltenen Schichten werden durch Zentri-

stickstoffhaltigen Substanzen auch Fleischextrakt, fugieren voneinander getrennt, und zu der orga-

Pepton, Kasein, Kaseinhydrolysate und Ammonium- nischen, das Antibiotikum enthaltenden Phase fügt

salze, wie Ammoniumsulfat oder Diammoniumphos- 30 man eine Mischung von Aceton und wäßriger SaIz-

phat, in Frage. Die für die Erzeugung des Antibio- säure, vorzugsweise 1 N-Salzsäure, im gleichen Vo-

tikums nützlichen Mineralsalze variieren je nach lumenverhältnis zu. Die erhaltene wäßrige Schicht

dem angewandten Nährboden. Kalziumkarbonat ist wird durch Zusatz einer alkalischen Base, wie Alkali-

fast immer anwesend, und außerdem können Na- hydroxyd oder Alkalikarbonat, auf pH 7 eingestellt,

trium- und Kalium-, Magnesium-, Mangan-, Eisen-, 35 wobei das Antibiotikum Oxytetracyclin ausfällt, wel-

Kupfer-, Kobalt-, Zinkchloride und die Sulfate, Phos- ches als solches isoliert und durch Umkristallisieren

phate derselben zugefügt werden. gereinigt oder in die Salze mit einer anorganischen

Die Fermentation kann in Erlenmeyerkolben oder oder organischen Säure nach den bekannten Techin Laborfermentern verschiedenen Inhaltes durch- niken übergeführt wird.

geführt werden. Der Gehalt an Antibiotikum in den 40 Die folgenden Beispiele erläutern die Erfindung:

Brühen wird qualitativ mittels Papierchromatographie _ . . .

im Vergleich zu einer Eichprobe von Oxytetracyclin e 1 s ρ 1 e l

und quantitativ mittels spektralphotometrischer Ab- Zwei 300-ml-Erlenmeyerkolben enthalten je 60 ml

lesung oder durch die in der Literatur bekannten bio- des folgenden Nährbodens:

logischen Methoden bestimmt. 45 Destrin 3°/

Mit der erfindungsgemäßen Verbindung sind Aus- Kaliumcarbonat 0 4°%

beuten an Oxytetracyclin von mehr als 11 000 _y/ml ulSaSassT ' 0 3%

zu erzielen. Dies bedeutet einen beträchtlichen tech- „ r¹ n's⁰/

nischen Fortschritt, wenn man bedenkt, daß man . .''"' \V ' _n\ _0/°

unter Berücksichtigung der Literatur, soweit diese 50 Ammoniumsuiiat u,i/o

Ausbeute-Angaben enthält, bei Verwendung de. Strep- Lekungswasser".".'.'.'.'.'.".'.".'.".' .'ad 1000 ml

tomyces nmosus eine Ausbeute von nur 1000 y/ml ⁵

erreicht. Die Sterilisation wird durch Erhitzen im Autoklav

Nach Beendigung der Fermentation wird die Kultur- bei 12O⁰C während 20 Minuten durchgeführt. Nach

brühe auf einen pH-Wert von 2 bis 2,5 eingestellt und 55 Sterilisierung liegt der pH-Wert bei 6,8 bis 7,0.

das Mycel durch Filtrieren oder Zentrifugieren ab- Jeder Kolben wird mit 1,5 ml einer Sporensuspen-

getrennt. Das in der abgeklärten Flüssigkeit enthaltene sion beimpft, die man durch Aufschlämmen einer

Oxytetracyclin wird nach den bekannten Methoden 20 Tage alten auf dem folgenden festen Nährboden

isoliert und gereinigt. Die für diesen Zweck nützlichen aufgezüchteten Schrägagarkultur des Streptomyces

Methoden sind Extrahierung mit einem geeigneten 60 gemäß der Erfindung mit 5 ml sterilem destilliertem

organischen Lösungsmittel, wie Butanol, Pentanol, Wasser enthält.

Hexanol, Amylalkohol, Methylethylketon, Methyl- 200 g geschälte Kartoffeln werden etwa 20 Minuten

Isobutylketon oder Butylacetat; Adsorbieren auf festen in 500 ml Wasser gekocht. Man stellt das Volumen

Substanzen, wie Aktivkohle und darauffolgendes EIu- des Kartoffelbreis auf seinen ursprünglichen Wert ein

ieren mit Wasser oder einem organischen Lösungs- 65 und filtriert ihn durch Gaze. Dann werden 2%

mittel; Ausfällen des Antibiotikums in Form eines Glukose und 2% Agar hinzugefügt. Man stellt das

seiner Derivate oder komplexen Salze mittels ge- Volumen der Mischung auf 1000 ml ein und steri-

eigneter Substanzen wie Amine, Ammoniak und Na- lisiert sie im Autoklav bei 12O⁰C während 20 Minuten.

Der pH-Wert des Nährbodens liegt bei 6,8 bis 7,0. Die Kolben werden 24 Stunden bei 28° C auf einem Schüttelgerät mit 220 U/min und einer Exzentrizität von 60 mm bebrütet; 1 ml einer so gewonnenen Kultur wird zur Beimpfung von 300 ml Erlenmeyerkolben benutzt, die je 60 ml des folgenden Produktiv-Nährbodens enthalten:

Stärke

Maisquellwasser .
Kalziumcarbonat

Kasein

Ammoniumsulfat
K₂HPO₄

Stärke

Maisquellwasser ..
Kalziumcarbonat .
Ammoniumsulfat .
Mangansulfat

Kobaltnitrat

Baumwollsaatmehl
Schweinefett

2,5%

1%

1%

0.015%

0,00075%

0,5%

3%

duktion wird in 300-ml-Kolben, die 35 ml des folgenden Nährbodens enthalten, durchgeführt:

3%

0,3%

0,4%

0,5%

0,1%

0,01%

Leitungswasser ad 1000 ml

Sterilisation: 20 Minuten bei 120°C. Das pH liegt bei 6,7 bis 7,0. Man züchtet bei 28° C unter den schon für den vegetativen Nährboden beschriebenen Bedingungen.

Nach 96stündiger Fermentation erreicht man eine Produktion von 4000 y/ml Oxytetracyclin.

B e i s ρ i e 1 2

Man verfährt wie im Beispiel 1 mit dem Unterschied, daß die zu beimpfende Kultur 10 Tage alt ist und auf dem folgenden Nährboden gezüchtet wurde:

Pepton 0,8%

Glukose 4%

Difoo Agar 2%

Leitungswasser ad 1000 ml

Man sterilisiert im Autoklav 1 Minute bei 120° C. Das pH liegt bei 6,8 bis 7,0. Außerdem unterscheidet sich die produktive Phase in der Zusammensetzung des folgenden Nährbodens:

Leitungswasser ad 1000 ml

Man sterilisiert 20 Minuten im Autoklav bei 120⁰C. Nach der Sterilisation liegt der pH-Wert bei 6,5 bis 6,8. Es wird bei 28° C unter den im Beispiel i angegebenen Bedingungen bebrütet. Nach 144stündiger Fermentierung erreicht man eine Produktion von 8500 γ/ ml Oxytetracyclin.

Beispiel 3

Man verfährt wie im Beispiel 2 mit dem Unterschied, daß die Kultur 20 Tage alt ist und daß der vegetative Nährboden die folgende Zusammensetzung hat:

Maisquellwasser 3,5%

Kalziumcarbonat 1,8%

Saccharose 0.5%

Leitungswasser ad 1000 ml

Sterilisation: 20 Minuten bei 120°C

Nach der Sterilisation liegt der pH-Wert bei 6.2 bis 6,3. Die Bebrütung wird während 26 Stunden bei 28° C auf einem Schüttelgerät mit 220 U/min und einer Exzentrizität von 60 mm ausgeführt. Die Pro-

Stärke

Maisquellwasser ..
Kalziumcarbonat .
Ammoniumsulfat .
Mangansulfat
Kobaltchlorid
Baumwollsaatmehl

8%

2,6%

1%

1%

0,014%

0,00078%

0,43%

Schweinefett 1 ml je 35 ml Nährboden

Nach Sterilisation (20 Minuten bei 12O⁰C) liegt der pH-Wert bei 6,5 bis 6,7.

Die zum Beimpfen des Produktiv-Nährbodens dienende Menge der vegetativen Kultur beträgt 4,3% des ersten. Die Bebrütung des Produktiv-Nährbodens wird 24 Stunden bei 28° C und bei 24° C bis zu insgesamt 120 Stunden durchgeführt. Der Gehalt an Oxytetracyclin beträgt 7600 y/ml.

B e i s ρ i e 1 4

Man verfährt wie im Beispiel 2 mit dem Unterschied, daß die Produktion durchwegs bei einer Temperatur von 24° C erfolgt.

Nach 96stündiger Fermentation erreicht man eine Produktion von 6400 y/ml Oxytetracyclin.

B e i s ρ i e 1 5

Mit einer 20 Tage alten Kultur des erfindungsgemäß einzusetzenden Streptomyces beimpft man 60 ml des im Beispiel 1 beschriebenen Nährbodens, der in 300-ml-Kolben enthalten ist. Man bebrütet 24 Stunden bei 28° C unter den im Beispiel 1 beschriebenen Bedingungen; 20 ml der so erhaltenen Kulturbrühe dienen zur Beimpfung von 3000 ml desselben flüssigen Nährbodens, der sich in einem 5-1-Fermenter aus Neutralglas befindet. Dieser Fermenter ist mit einem Schraubenrührer, einem Lufteinleitungsrohr, das unter dem besagten Rührer endet, einem Wellenbrecher, einem Beimpfungsrohr, einem Luftauslaßrohr und einer Vorrichtung zur Kontrolle der Temperatur versehen. Man fermentiert bei 28° C mit einer Luftzufuhr von 3 1 in der Minute und einer Rührgeschwindigkeit von 400 U/min. Nach 24 Stunden verwendet man 150 ml der so erhaltenen Kulturbrühe zum Beimpfen von 1 des folgenden Produktiv-Nährbodens:

Entfettetes Soyamehl 3%

Lösliche Destillationsrückstände 0,5%

Glukose 2%

Natriumchlorid 0,25%

Leitungswasser ad 1000 ml

Sterilisation: 20 Minuten bei 120°C; nach Sterilisation liegt der pH-Wert bei 6,5. Die Fermentation wird in einem ähnlichen, wie oben beschriebenen 5-1-Fermenter aus Neutralglas bei einer Rührgeschwindigkeit von 500 U/min und mit einer Luftzufuhr von 3 1 in der Minute ausgeführt, wobei man die Schaumbildung durch Zusatz kleiner Mengen an silikonhaltigem Antischaummittel kontrolliert. Nach 88stündiger Fermentation erhält man eine Höchstproduktion von 5800 y/ml Oxytetracyclin. ·

Beispiel 6

Der pH-Wert von 33,3 1 Kulturbrühe mit einer Konzentration an Antibiotikum von 4500 y/ml, welches nach einem der vorigen Beispiels erhalten wurde, wird mit 25% Schwefelsäure auf 2 eingestellt. Man

filtriert mit Hilfe von 1 kg Kieselgur und wäscht den Filtrationskuchen mit so viel wäßriger verdünnter Schwefelsäure, deren pH-Wert nicht unter 2 liegt, bis daß das Volumen des Filtrats 45 1 beträgt, worauf man 2,2 kg Oxalsäure zufügt. Man rührt 30 Minuten, filtriert und wäscht den Filter mit so viel Wasser, bis daß das Volumen des Filtrats 50 1 beträgt. 50 1 dieser filtrierten und kalziumfreien Brühe, welche 150 g Oxytetracyclin enthält, werden mit einer Mischung von 2,5 1 Trikresol und 2,5 1 Tetrachlorkohlenstoff geschüttelt, wobei der pH-Wert mit einer wäßrigen Natriumhydroxydlösung auf 8,3 eingestellt wird. Durch Zentrifugieren werden die zwei Schichten getrennt. Die wäßrige Phase wird nochmals mit einer Mischung von 11 Trikresol und 1 1 Tetrachlorkohlenstoff extrahiert.

Die unteren organischen Schichten werden vereinigt, in eine Mischung von 51 Aceton und 5 1 wäßriger 1 N-Salzsäure gegossen und gründlich geschüttelt, die zwei Schichten durch Zentrifugieren getrennt. Die untere Schicht wird noch zweimal mit 3 1 Aceton und 2 1 wäßriger 1 N-Salzsäure extrahiert. Der pH-Wert der vereinigten wäßrigen Schichten wird mit 20%iger Natronlauge auf 7 eingestellt, wobei ein Niederschlag ausfällt, der abfiltriert, mit Äther gewaschen und im Vakuum bei 4O⁰C getrocknet wird; das Produkt wird dann gemahlen, nochmals mit Äther gewaschen und bei 40° C getrocknet.

Man erhält 150 g rohes Oxytetracyclin.

150 g des so erhaltenen Produktes werden in 1,5 1 Metharipf äufgeschlämmt'^: und durch Zusatz von 200 ml einer 13%igen Lösung von trockenem Chlorwasserstoff in wasserfreiem Methanol gelöst. Zu der Lösung fügt man 14 g Tierkohle, man rührt 30 Minuten, filtriert durch Kieselgur und wäscht mit Methanol. · ·. ■ ■ .

Das Filtrat wird im Vakuum bis auf ein Volumen von etwa 400 ml konzentriert, worauf noch 30 ml 13%ige Lösung von trockenem Chlorwasserstoff in wasserfreiem Methanol zugesetzt werden.

Durch Reibung an den Wänden des Behälters wird die Kristallisation des Produktes eingeleitet, die sich über Nacht bei Raumtemperatur vollzieht. Hierauf wird das auskristallisierte Produkt abfiltriert, mit Methanol und dann mit Äther gewaschen und schließlich bei 40° C im Vakuum getrocknet. Man erhält 95 g Oxytetracyclin-hydrochlorid.

Beispiel 7

Man verfährt wie im Beispiel 3 mit dem Unterschied, daß die vegetative Phase und praktische Phase des Verfahrens bei 27° C durchgeführt werden und daß die in jedem Behälter enthaltene Durchschnittsmenge bei der produktiven Phase 50 ml beträgt.

Nach 6-bis 7tägiger Fermentation erhält man eine Produktion von 11 000 y/ml Oxytetracyclin.

Claims (1)

1. Patentanspruch:

   Verfahren zur Herstellung von Oxytetracyclin auf biologischem Weg durch Züchtung eines Stammes von Streptomyces in einem üblichen Nährmedium und Aufarbeitung des Reaktionsgemisches in an sich bekannter Weise, dadurch gekennzeichnet, daß man den Stamm Streptomyces henetus nov. spec, bei dem Commonwealth Mycological Institute Ferry Lane, Kew, Surrey (England) unter I. M. L, 109 532 und bei dem Institute of Microbiology of the Rutgers University (USA) unter I. M. 3872 hinterlegt, verwendet.