DE3217908A1

DE3217908A1 - Verfahren zur herstellung von l-(alpha)-methylphenylalaninen

Info

Publication number: DE3217908A1
Application number: DE3217908A
Authority: DE
Inventors: Noritada Iwamoto; Tomio Kimura; Tetsuo Ube Yamaguchi Omata; Tokio Oshima
Original assignee: Ube Industries Ltd
Current assignee: Ube Corp
Priority date: 1981-05-14
Filing date: 1982-05-12
Publication date: 1982-12-23
Also published as: US4443548A; NL8201979A; DE3217908C2; JPS57186495A

Description

Verfahren zur Herstellung von L-cc~Methylphenylaianinen

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Herstellung von L-a-Methylphenylalaninen durch biochemische asymmetrische Hydrolyse von DL-α-Methyl phenylalaninamiden, bei dem ein mikrobiologisches Enzym, das eine Hydrolyse des L-Isomeren von DL-ct-Methylptienylalaninamiden katalysiert, verwendet wird.

Es ist bekannt, daß L-ct-Methylphenylalaüne, jedoch nicht D-a-Methy!phenylalanine phamakologische Aktivitäten aufweisen. So ist beispielsweise L-3,4-Dihydroxy-a-Methylphenylalanin, normalerweise bezeichnet als "Methyl Dopa" ein ausgezeichneter Hypotensor, wohingegen D-3,4-Dihydroxy-ct-Methylphenylalanin keine Hypotensor-Aktivitäten aufweist. Infolgedessen stellt eine wirksame optische Trennung von chemisch synthetisierten DL-a-Methylphenylalaninen ein wichtiges, zu lösendes Problem dar.

Es sind verschiedene optische Trennungsmethoden von razemischen Mischungen von ct-Methylphenylalaninen bekannt, einschließlich physikalische Methoden, wie z. B. Diastereomer—Methoden, Methoden der fraktionierten Kristallisation und biochemische Methoden unter Einsatz von Mikroorganismen.

Die bekannten Diastereomer-Methoden haben den Nachteil, daß die Ausbeute an den gewünschten Verbindungen gering ist, daß die Gewinnung der gewünschten Verbindungen vergleichsweise mühsam ist und daß ferner das Trennungsmittel teuer ist und daß die Wieder-, gewinnung des Trennungsmittels nicht einfach zu ,bewerkstelligen ist. Die bekannten Methoden der fraktionierten Kristallisation sind deshalb nachteilig, weil das razemische Gemisch oftmals vor der optisch aktiven Verbindung kristallisiert, gelegentlich selbst dann, wenn Kristalle der gewünschten optisch aktiven Verbindung als Keime verwendet werden. Nachteilig ist des weiteren, daß sowohl der Trennungsgrad (%) als auch die Kristallisation der gewünschten

-s-

optischen aktiven Verbindung langsam verläuft.

Bei den bekannten biochemischen Trennungsverfahren werden N-Succinyl- oder N-Benzoylderivate von DL-a-Methylphenylalaninen als Substrate für die asymmetrische Hydrolyse durch Mkrobielle Enzyme verwendet. Nachteilig an diesen biochemischen Trennungsverfahren ist, daß die Wiederverwendung der verbleibenden Substrate (d. h. der D-Derivate) schwierig ist und daß ferner die Ausbeute an gewünschter Verbindung niedrig ist.

Aufgabe der.Erfindung ist es, ein biochemisches Trannungsverfahren ' für DL-ct-Methylphenylalanine anzugeben, bei dem die erwähnten Nachteile der bekannten Verfahren nicht mehr auftreten, so daß die Herstellung von L-cx-Methylphenylalaninen in vorteilhaften Ausbeuten erreicht wird.

Gegenstand der Erfindung ist ein Verfahren, wie es in den Ansprüchen gekennzeichnet ist.

Das Verfahren der Erfindung ermöglicht die Herstellung von L-a-Methylphenylalaninen der folgenden allgemeinen Formel (I)':

\ / L ι

^R2°~~\ /°^Η2~~^C ^C00H C¹ ^

NH₂

worin R. und R_ einzeln und unabhängig voneinander stehen für jeweils ein Wasserstoffatom oder einen kurzkettigen Alkylrest oder gemeinsam für Alkylenreste, die gemeinsam einen-5- bis 8-gliedrigen Ring bilden.

Das erfindungsgemäße Verfahren ist dadurch gekennzeichnet, daß man: . · . ...

(a) ein DL-ct-Methylphenylalaninamid der allgemeinen Formel (II):

I
R₁O '· ' /

¹X CH₃ . '' Z;

R^CL-// .vy—CH,—C CONH- (II)

Lt X / L· \ L»

worin R- und R- die angegebene Bedeutung haben, mit dem Kulturprodukt eines Mikroorganismus in Kontakt bringt oder reagieren läßt, das ein Enzym produziert, das die Hydrolyse des L-Isomeren von DL-ct-Methylphenylalaninamiden zu katalysieren vermag, unter asymmetrischer Hydrolyse eines L-a-Methylphenylalaninamides, wobei man anstatt des Kulturproduktes des Mikroorganismus auch ein Behandlungsprodukt desselben verwenden kann und

(b) Abtrennung des erhaltenen L-a-Methylphenylalanins aus dar Hydrolysemischung.

Unter dem Ausdruck "Behandlungsprodukt" sind hier die Zellen oder die von der Kultivierungsmischung oder Kultur abgetrennte Brühe zu verstehen, wie auch Enzympräparationen einschließlich zellfreier Extrakte, roher Enzyme und gereinigter Enzyme, hergestellt aus der Kultivierungsmischung oder Kultur, den Zellen oder der Brühe ,sowie ferner die immobilisierten Präparate, die ausgehend von den genannten Produkten oder Stoffen hergestellt werden können.

Typische Beispiele für DL-a-Methylphenylalaninamide der angegebene-n allgemeinen Formel (II) und für geeignete Substrate für die Durchführung des erfindungsgemäßen Verfahrens sind die folgenden Verbindungen :

(1) HO—( / \) CH.,— C — CONH₂

DL-3,4-Dihydroxy-d-methylphenylalaninamid

OiT" if

CH.

CH₀-C — CONH,
2 , 2

NH-,

DL-4-Hydroxy-3-methoxy-a-methy!phenylalaninamid

CH

DL-3,4-Dimethoxy-a-methylphenylalaninamid

(4)

CH.

Η,—C —C0NH_?
2,2

NH_n

DL-S^-Methylendiöxy-a-methylphenylalar.inamid.

Diese Substrate oder Aus gangsverbindungen lassen sich leicht herstellen, beispielsweise durch Umsetzung von Ammoniumcyanid mit Phenylacetonen unter Erzeugung der Aminonitrilderivate und Hydrolyse der N'itrilgruppe der erhaltenen Aminonitrilderivate in Gegenwart einer Säure. ■

Zur Durchführung des erfindungs gemäßen Verfahrens verwendbare Mikroorganismen sind solche, die ein Enzym zu erzeugen vermögen,, das die Hydrolyse lediglich des L-Isomarsn einer razemischen Mischung von DL-a-Methylphenylalaninamiden katalysiert, unabhängig von ihren taxpnomischen Gruppen. Beispiele der Genusnamen dieser Mikroorganismen sind in der folgenden Tabelle aufgeführt, in der des weiteren auch der typische Speciesname der Miki

.Kroorganismen

angegeben ist, der zu den entsprechenden Genusnamen gehört. Zu bemerken ist jedoch, daß nicht nur die in der folgenden Tabelle aufgeführten Mikroorganismen zur Durchführung des erfindungsgemäßen Verfahrens geeignet sind. Sämtliche der als Beispiele aufgeführten Mikroorganismen sind bekannt und erhältlich von den Niederlegungsstellen der JFCC (Japanischen Föderation von Kultursammlungen von Mikroorganismen) wie beispielsweise von dem IFO-Institut, d. h. dem Institute for Fermentation in Osaka, Japan und dem IAM-Institut, d. h. dem Institute of Applied Microbiology, University of Tokyo, Tokyo, Japan) und dem NIHJ-Institut, d. h. dem National Institute of Health Japan).

(1) Genus Rhizopus

Rhizopus chinensis IFO-4768

(2) Genus Absidia

Absidia orchidis IFO-4011

(3) Genus Aspergillus

Aspergillus niger yar fermentariusIFO-406 8

(4) Genus Penicillium

Penicillium frequentans IFO-5692

(5) Genus Pullularia

Pullularia pullulans IFO-4464

(6) Genus Fusarium

Fusarium roseum IFO-5421

(7) Genus Gibberella

Gibberella fujikuroi IFO-5268

(8) Genus Trichoderma

Trichoderma viride IFO-484 7

(9) Genus Gliocladium

Gliocladium roseum IFO-5422

(10) Genus Cunninghamella Cunninghamella elegans

(11) Genus Actinomucor Actinomucor repens

(12) Genus Geotrichura Geotrichum candidum

(13) Genus Saccharomyces Saccharomyces rouxii

(14) Genus Shizosaccharomyces Shizosaccharomyces pombe

(15) Genus Pichia Pichia polimorpha

(16) Genus Hansenula Hansenula anomal a

(17) Genus Debariomyces Debariomyces hausenii

(18) Genus Nadsonia Nadsonia elongata

(19) Genus Sporobolomyces Sporobolomyces pararoseus

(20) Genus Cryptococcus Cryptococcus albidus

(21) Genus Torulopsis Torulopsis Candida

(22) Genus Brettanomyces Brettanomyces anomalus IFO-4441 IFO-4022 IF0-6454 IFO-O5O5 IFO-0346 IFO-0195 IF0-0117 IFO-OO23 IFO-0665 IFO-0376 IFO-0378 IFO-0768 IFO-0642

(2 3) Genus Candida Candida utilis

(24) Genus Tricosporon Tricosporon beigelii

(25) Genus Rhodotorula Rhodotorula minuta var texensis

(26) Genus Mycobacterium Mycobacterium smegmatis Mycobacterium avium chester

■ Mycobacterium phlei

(2 7) Genus Nocardia Nocardia asteroides

(28) Genus Streptomyces Streptomyces griseus

(29) Genus Aerobacter Aerobacter aerogenes

(30) Genus Alcaligenes Alcaligenes viscolactis

(31) Genus Flavobacterium Flavobacterium arborescens

(32) Genus Bacillus Bacillus subtilis

(33) Genus Agrobacterium Agrobacterium tumefaciens

(34) Genus Micrococcus Microcoecus flavus IFO-0396 IFO-0598 IFO-0412 NIHJ-1628

IF0-3154

IFO-3158 IFO-3424 IF0-3356 IFO-3320 IAM-I517 IAM-1100 IFO-3026 IFO-13262 IFO-3242

(35) Genus Sarcina Sarcina aurantiaca

(36) Genus Arthrobacter Arthrobacter simplex

(37) Genus Bfevibacterium Brevibacterium ammoniagenes

(38) Genus Pseudomonas . Pseudomonas iodinum Pseudomonas fluorescens

(39) Genus Lactobacillus Lactobacillus casei

(40) Genus Streptococcus Streptococcus lactis

(41) Genus Clostridium Clostridium acetobutyricum

(42) Genus Enterobacter Enterobacter aerogenes

(4 3) Genus Ustil ago . Ustilago zeae

IFO-3064 IFO-3530 IFO-12071

IFO-3558 IFO-3081 IFO-3322 IFO-3434 IFO-3346 IFO-3317 IFO-5346

Von diesen Mikroorganismen haben sich Mikroorganismen der Klassen oder Genera Trichoderma, Nocardia, Mycobacterium, Bacillus, Rhizopus, Candida, Hansenula, Streptomyces _; Aerobacter, Arthobacter,: Pseudomonas, Gibberellaj'foru lops is, Enterobacter und Ustilago als besonders vorteilhaft erwiesen.

Bei Durchführung des erfindungsgemäßen Verfahrens können die Mikroorganismen mit den DL-a-Methylphenylalaninämiden in Form von Kultivierungsmischungen zur-Reaktion gebracht oder in Kontakt gebracht werden, mit den Zellen oder der Brühe, die von der Mischung abgetrennt ist oder mit Enzympräparaten, einschließlich zellfreien Extrakten, dem rohen Enzym oder einem gereinigten Enzym, hergestellt aus der KuItivierungsmischung oder Kultur, den Zellen oder der Brühe, bereitet nach üblichen bekannten Methoden. Die Zellen oder das Enzym können .ggf. auf Trägern immobilisiert werden. . '

Es besteht noch keine eindeutige Klarheit darüber, welches das Enzym ist, das die Hydrolyse des L-Isomeren der DL-ci-Methylphenylalaninamide katalysiert. Es wird jedoch angenommen, daß es das Enzym Amidase ist·.

Beispiele für Träger, die zur Durchführung des erfindungsgemäßen Verfahrens eingesetzt werden können, sind natürliche Produkte, wie beispielsweise Alginsäure, Carrageenan, Collagen, Cellulose, Acetylcellulose, Agar, Cellophan und Collodion sowie synthetische Polymere, wie beispielsweise Polyacrylamide, Polystyrole, Polyethylenglykole, Folypropylenglykole, Polyurethane und Polybutadiene. Die Immobilisierung der Zellen odes des Enzyms auf dem Träger kann nach üblichen bekannten Verfahren erfolgen unter normalen Bedingungen, so daß die Aktivität des Enzyms nicht beeinträchtigt wird.

Eine geeignete Reaktionstemperatur für die asymmetrische Hydrolyse liegt bei 20 bis 50⁰C. Um jedoch eine Abnahme der Enzymaktivität auf ein Minimum zu vermindern, hat sich die Anwendung von Reaktionstemperaturen von 25 C bis 40 C als besonders vorteilhaft erwiesen. Die Reaktionsdauer der asymmetrischen Hydrolyse kann bei 5 bis 50 Stunden liegen. Die Reaktionsdauer läßt sich jedoch durch Erhöhung der Reaktionstemperatur oder durch Erhöhung der Menge des einzusetzenden Enzymes.verkürzen. Zweckmäßig wird die Reaktion bei

pH-Werten von 5 bis 10, vorzugsweise bei pH-Wertaivon 7 bis 9 ( f.

durchgeführt. _ ' /

Die Menge an Mikroorganismus, die vorzugsweise bei Durchführung des erfindungsgemäßen Verfahrens eingesetzt wird, entspricht einem Gewichtsverhältnis von 0,01 bis 2, ausgedrückt als gefriergetrocknete Zellen, bezogen auf das Gewicht der DL-a-Methylphsnylalaninamide. In den Fällen, in' denen Kultivierungsmischungen oder Kulturen d.er Mikroorganismen, Enzympräparate ,hergestallt aus den Mischungen oder Zellen oder immobilisierte Produkte verwendat werden, läßt sich die im Einzelfalle, optimale Menge ausgehend von . ■ der Menge an gefriergetrockneten Zellen bestimmen. Vorteilhafte Substratkonzentrationen, d. h. Konzentrationen von DL-a-Methylphenylalaninamiden. in der Reaktionsmischung liegen bei 1 bis 40, vorzugsweise 5 bis 30 Gew.-%.

Die asymmetrische Hydrolysereaktion wird unterbrochen oder beendet, nachdem die Hydrolyse der L-a-Methylphenylalaninamide einen Umwandlungsgrad von fast oder praktisch 100 % erreicht hat, worauf die L-a-Methylphenylalanine und D-a-Methylphenylalaninamide getrennt aus der Reaktionsmischung isoliert werden. Die Trennung läßt sich leicht unter Anwendung üblicher Trennungsmethoden durchführen, beispielsweise durch fraktionierte Kristallisation und Lösungsmittelextraktion. D-a-Methylphenylalaninamide werden durch den Mikroorganismus, der zur asymmetrischen Hydrolyse verwendet wird, nicht angegriffen, weshalb praktisch die gesamten D-a-Methylphenylalaninamide aus der razemischen Mischung wiedergewonnen werden können. Die D-a-Methylphenylalaninamide lassen sich leicht nach üblichen bekannten Verfahren hydrolysieren, beispielsweise durch Erhitzen in Gegenwart einer wäßrigen ^äure oder einer alkalischen Lösung. Die erhaltenen D-a-Methy!phenylalanine können dann mit Natriumhypochlorid behandelt werden unter Erzeugung von " Phenylacetonen, die dann wiederum als Aus gangsverbindungen für die Synthese der beim erfindungsgemäßen Verfahren, eingesetzten Substrate dienen können. ' ' -

Das erfindungsgemäße Verfahren weist gegenüber bekannten biochemischen Verfahren insbesondere folgende Vorteile auf:

Cl) Die verwendeten Aus gangsverbindungen oder Substrate lassen sich leicht und billig herstellen;

(2) die Trennung der gewünschten Verbindungen aus dem zurückbleibenden Substrat (d. h. dem D-Isomer) in der Reaktionsmischung ist vergleichsweise einfach und das gewonnene D-Isomer läßt sich als Aus gangsverbindung für die Synthese von weiterem Substrat einsetzen und

(3) die optische Reinheit und die Ausbeute der hergestellten Verbindungen sind hoch.

Die folgenden Beispiele sollen das Verfahren der Erfindung näher veranschaulichen. In den folgenden Beispielen wurden die Ausbeuten an L-a-Methylphenylalaninen nach der folgenden Gleichung berechnet

au _t rc,\ Mole an erhaltenen L-a-Methylphenylalaninen y _1Q

Mole an L-ct-Methylphenylalaninamiden in dem Aus gangssübstrat

Beispiele 1 bis 15

100 ml eines Kulturmediums eines pH-Wertes von 7,0 mit einen; Gehalt an 5 Gew.-⁹» Glycerin, 5 Gew.-I Maisquellwasser, 0,5 Gew. -% Ammoniumsulfat und 1 ml einer Mischung von anorganischen Salzen" wurden in eine Schüttelflasche eingeführt. Die anorganische Salzmischung wurde hergestellt durch Lösen von 20g MgSO-· 7H₂O, 5g FeSO₄ · 7H₂O, 2g CaCl₂, 0,2g MnCl₂ · 4H₂O, 0,1g NaMoO₄ · 2H₂O und 0,1g NaCl in 1000ml destilliertem Wasser. Nach Sterilisierung des Flascheninhaltes wurden jeweils zwei Schiingenfüllungen der in der folgenden Tabelle 1 angegebenen Mikroorganismen aus einer Agar-Schräge inokuliert,
geschüttelt wurde.

Schräge inokuliert., worauf die Kultur 65 Stunden lang bei 30⁰C

Daraufhin wurden 2 g-DL-3,4-Dimethoxy-a-Meth>Lphenylalaninamid in die Flasche gegeben, worauf die Kultur nochmals 48 Stunden lang bei 30 C geschüttelt wurde. Die Zellen wurden dann von der Reaktionsmischung durch Zentrifugieren oder Filtrieren abgetrennt. Das Filtrat wurde unter Verwendung einses Hochgeschwindigkeits-Flüssigkeits-Chromatographen analysiert. Auf diese Weise wurde die Ausbeute an 3,4-Dimethoxy-a-Methy!phenylalanin bestimmt.

Aus der Literatur waren keine speziellen optischen Drehungsdaten für L- oder D-3,4-Dimethoxy-a-Methy!phenylalanin bekannt. Demzufolge wurde das erhaltene 3,4-Dimethpxy-a-Methylphenylalanin nach einem Verfahren, wie es in dem folgenden Beispiel 16 beschrieben ist, in N-Acetyl-3,4-dimethoxy-a-Methy!phenylalanin überführt. Aus den speziellen optischen Drehungsdaten der N-Acetylderivate, die sich in der Literatur finden, ergab sich, daß das 3,4-Dimethoxya-Methylphenylalanin, das in jedem der Beispiele erhalten worden war, das L-Isomer war.

Die Ergebnisse der Beispiele 1 bis 15 sind in der folgenden Tabelle zusammengestellt.

COPY

Tabelle 1

Beispiel Verwendeter Mikroorganismus

Gebildetes L-3,4-Dimethoxy-a-Methyl· phenylalanin

Ausbeute (1) Spezifische optische .Drehung fäj ,

(C - 1, H₉O)⁺

Enterobacter aerogenes IFO-3317 42

Bacillus subtilis

IFO-3026 74

Candida utilis

IFO-0396 ' 36

Rhizopus chinensis

IFO-4 76 8 30

Trichoderma viride

IFO-4847 28

Nocardia asteroides IFO-3424 . 49

Mycobacterium smegmatis NIHJ-1628 86'

Streptomyces griseus IFO-3356 33

Ustilago zeae

IFO-5346 66

Aerobacter aerogenes IFO-3320 51

Arthrobacter simplex

IFO-353o " 2 3

-50¹

-49°

-51"

-47'

-46'

-52¹

-49¹

-51'

-52^V

-49'

COPY

12 Pseudomonas fluorescein

IFO-3081 - 94 Λ -53°

IFO-5268 31 -47°

13 Gibberella fujikuroi
IFO-5268

14 Torulopsis Candida ■ ^ί

IFO-0768 ' / 17 ·" -45°

15 Hansenula anomala . . .

IF0-0117 · ' 30 -44°

⁺Spezi£ische optische Drehung der N-Acetylverbindurig ·

Beispiel 16 ' -

Aus einer Kultur von Mycobaeterium avium chester (IFO-3154), hergestellt wie in Beispiel 1 beschrieben, wurden die Zellen durch Zentrifugieren abgetrennt und danach 2 χ mit destilliertem Wasser gewaschen.

Die gewaschenen Zellen wurden zu 100ml einer 0,1M-Phosphatpufferlösung zugegeben, die einen pH-Wert von 7,0 aufwies und 2g DL-3,4-Dimethoxy-a-methylphenylalaninamid enthielt. Die erhaltene Mischung wurde dann -20 Stunden läng bei einer Temperatur von 30 C inkubiert.

Nach Beendigung der Reaktion wurden die Zellen aus der Reaktionsmischung durch.Zentrifugieren abgetrennt. Die erhaltene Reaktionsmischung wurde dann mittels eines Hochgeschwindigkeits-Flüssigkeits-Chromatographen analysiert. Dabei ergab sicU, daß die erhaltene Reaktionsmischung 950mg L-3,4-Dimethoxy-a-methylphenylalanin (Ausbeute =.951,) und 1030mg D-S^-Dimethoxy-ct-methylphenylalaninamic enthielt. _; · . - '''*.'

Die Reaktionsmischung wurde mit 200ml Benzol extrahiert. Auf diese Weise wurden 9 70mg des öligen nicht umgesetzten D-3,4-Dimethoxy-a-methylphenylalaninamides mit einer spezifischen optischen Drehung Ijxl ■, von +20,5 Cc=I, Methanol) wiedergewonnen.

Des weiteren wurde die wäßrige Schicht nach der Extraktion unter Verwendung von Chlorwasserstoffsäure auf einen pH-Wert von 2,0 gebracht. Die erhaltene Lösung wurde dann zur Trockne eingedampft. Auf diese Weise wurden 980mg L-S^-Dimethoxy-a-methylphenylalaninhydrochloridkristalle mit einer spezifischen optischen Drehung /ä7, von +5,4° (c ■ 1, Methanol) erhalten. Daraufhin wurden die erhaltenen Kristalle in 20ml Iso-Propanol gelöst, worauf 2,0ml Triethylamin und 2,0ml Essigsäureanhydrid zugegeben wurden. Die erhaltene Lösung wurde übernacht stehengelassen und dann unter vermindertem Druck konzentriert. Der erhaltene Rückstand wurde in 2,0ml Wasser aufgenommen, worauf der pH-Wert der erhaltenen Lösung durch Verwendung von konzentrierter Chlorwasserstoffsäure auf 2,0 eingestellt wurde. Die erhaltene Lösung wurde dann mit Ethylacetat extrahiert, worauf die extrahierte Ethylacetatschicht getrocknet und unter vermindertem Druck destilliert wurde. Auf diese Weise wurden 800mg L-N-Acetyl-S^-dimethoxy-a-methylphenylalaninkristalle mit einem Schmelzpunkt von 182°C bis 185⁰C und einer spezifischen optischen Drehung /a7 , von -53,0 (c ^β 1, Methanol) erhalten.

Der ermittelte Wert für die spezifische optische Drehung war identisch mit dem entsprechenden Wert, der in der Literatur für L-N-Acetyl-3,4-dimethoxy-a-methylphenylalanin angegeben wird.

Demzufolge wurde bestätigt, daß die erhaltene Acetylverbindung die L-Acetylverbindung war und daß das erhaltene 3,4-Dimethoxya-methy!phenylalanin ebenfalls das L-Isomer war. Es hatte eine optische Reinheit von 96,41. Weiterhin war das wiedergewonnene 3,4-Dimethoxy-a-methylphenylalaninamid das D-Isomer.

Beispiel 17

Die gewaschenen Zellen von Mycobacterium avium ehester (IFO-3154), hergestellt wie in Beispiel 16 beschrieben, wurden mit kaltem Aceton gewaschen. Dies bedeutet, daß mit Aceton getrocknete Zellen erhalten wurden.

DL-3,4-Dimethoxy-ct-methylphenylalaninamid wurde in destilliertem Wasser gelöst, worauf Substratlösungen mit verschiedenen, in Tabelle 2 angegebenen Konzentrationen und einem pH-Wert von 7,0 hergestellt wurden.

Die erwähnten mit Aceton getrockneten Zellen wurden zu 10ml der Substratlösungen in solchen Mengen zugegeben, daß das Gewichtsverhältnis der getrockneten Zellen zum Substrat bei 0,2 lag. Dann wurde die Reaktion bei einer Temperatur von 30⁰C durchgeführt. Die Reaktionsdauer betrug 20 Stunden. Die erhaltene Reaktionsmischung wurde analysiert, um die Ausbeute an L-3,4-Dimethoxy-a-methylphenylalanin zu bestimmen. Zu der Bestimmung wurde ein Hochgeschwindigkeits-Flüssigkeits-Chromatograph verwendet.

Die erhaltenen Ergebnisse sind in der folgenden Tabele 2 zusammengestellt.

Tabelle 2

Konzentration des Substrates Ausbeute an L-3,4-Dimethoxy· (DL-S^-Dimethoxy-a-methylphenyl- a-me thy !phenylalanin (i) alaninamid) (Gew.-I)

1 100

2 100 5 100

10 100

20 86

30 72

40 49

Beispiel 18

Die gewaschenen Zellen von Mycobacterium avium ehester (IFO-3154), hergestellt wie in Beispiel 16 beschrieben, wurden gefriergetrocknet.

Die gefriergetrockneten Zellen wurden dann zu 10ml destilliertem Wasser mit einem Gehalt von 10 Gew.-i DL-3,4-Dimethoxy-a-methylphenylalaninamid und einem pH-Wert von 7,5 in einem Gewichtsverhältnis von Zellen zum Substrat,wie in der folgenden Tabelle angegeben, zugegeben. Die erhaltenen Mischungen wurden bei einer Temperatur von 30⁰C 20 Stunden lang inkubiert. Die Reaktionsmischungen wurden dann zum Zwecke der Bestimmung der Ausbeuten an L-3,4-Dimethoxy-a-methylphenylalanin mittels eines Hochgeschwindigkeits-Flüssigkeits-Chromatographen analysiert. Die erhaltenen Ergebnisse sind in der folgenden Tabelle 3 zusammengestellt.

Tabelle 3

Gefriergetrocknete Zellen Ausbeute an L-3,4-Dimethoxy-

Substrat (Gew.-Verhältnis) ci-methy!phenylalanin (%)

0,01 68

0,05 89

0,1 97

0,5 100

1,0 100

Beispiel 19

50mg der gefriergetrockneten Zellen von Mycobacterium avium ehester (IFO-3154), hergestellt wie in Beispiel 18 beschrieben, wurden in 5ml einer 0,2M Phosphatpufferlösung mit einem pH-Wert von 7,0 suspendiert, worauf die Zellen unter Kühlung unter Verwendung einer sog. französischen Presse (14O6kg/cm , 20 000 psi) aufgebrochen wurden. Die erhaltene Mischung wurde dann unter 20 000 χ g 30 Minuten lang zentrifugiert. Zu 5ml der überstehenden Lösung, die erhalten wurde, wurden 100mg DL-3,4-Dimethoxy-a-methylphenylalaninamid zugegeben, worauf der pH-Wert der Mischung auf 7,5 eingestellt wurde. Daraufhin wurde die Mischung bei einer Temperatur von 3O⁰C 20 Stunden lang inkubiert.

Die erhaltene Reaktionsmischung wurde dann mittels eines Hochgeschwindigkeits-Flüssigkeits-Chromatographen analysiert. Das L-3,4-Dirne thoxy-a-me thy !phenylalanin wurde ir. einer Ausbeute von 8S% erhalten.

Beispiel 20

Zu 5ml eines zellfreien Extraktes von Mycobacterium avium ehester (IFO-3154), hergestellt wie in Beispiel 19 beschrieben, wurde Ammoniumsulfat zugegeben. Der Ammoniumsulfatniederschlag, erhalten bei einer Sättigung von 25% bis 75% Ammoniumsulfat wurde durch Zentrifugieren abgetrennt. Dann wurden 5ml einer 0,2M Phosphatpufferlösung mit 100mg DL-3,4-Dimethoxy;-a-methylphenylalaninamid mit einem pH-Wert von 7,5 zugegeben. Die Mischung wurde dann bei einer Temperatur von 3O⁰C 20 Stunden lang inkubiert.

Die auf diese Weise erhaltene Reaktionsmischung wurde mittels eines Hochgeschwindigkeits-Flüssigkeits-Chromatographen analysiert. Danich wurde L-3,4-Dimethoxy-ct-methylphenylalanin in einer Ausbeute von 5 8% erhalten.

Beispiel 21

10ml des zellfreien Extraktes von Mycobacterium aviua enoster (IFO-3154), hergestellt wie in Beispiel 19 beschrieben, wurden durch eine Kolonne eines Durchmessers von 1,5cra und einer Höhe von 65cm, gefüllt mit Sephadex G-75 geschickt. Es wurden Fraktionen mit Enzymaktivität aufgefangen. Diese Fraktionen wurden unter Verwendung einer semipermeablen Membran auf ein Volumen von 5ml konzentriert.

Daraufhin warden 100mg DL-3,4-Dimethoxy-a-methylphenylalaninamid zugegeben. Die Mischung wurde dann bei einer Temperatur von 3O⁰C 20 Stunden lang inkubiert.

Die Reaktionsmischung wurde dann mit einem Hochgeschwindigkeits-Flüssigkeits-Chromatographen analysiert. Es wurde L-3,4-Dimethoxya-methylphenylalanin in einer Ausbeute von 48% erhalten.

3217Θ08

Beispiel 22

Die gewaschenen Zellen von Mycobacterium avium ehester (IFO-3154) (entsprechend 1,Og gefriergetrockneter Zellen), hergestellt wie in Beispiel 16 beschrieben, wurden in 15ml einer 0,1M Phosphatpufferlösung mit einem pH-Wert von 7,0 suspendiert, worauf 3,75g Acrylamidmonomer, 0,2g N,N¹-Methylenbis acrylamid (d. h.-ein Quervernetzungsmittel), 2,5ml einer Sligen wäßrigen 3-Dimethylaminopropionitrillösung (d. h. die Lösung eines Polymerisationspromotors) und 2,-5ml einer wäßrigen Kaliumpersulfatlösung (d. h. die Lösung eines Polymerisationsinitiators) zugegeben wurden. Die erhaltene Mischung wurde dann eine Stunden lang bei einer Temperatur von 25⁰C stehengelassen. Danach war die Gelierung der Mischung beendet.

Das erhaltene Gel wurde zerkleinert und mit Wasser gewaschen. Das erhaltene immobilisierte Produkt (die Gelpartikel hatten einen Partikeldurchmesser von 0,2 bis 0,5mm) wurde in eine Kolonne eines Durchmessers von 2cm und einer Höhe von 50cm eingefüllt. Daraufhin wurde destilliertes Wasser mit 10 Gew.-% DL-3,4-Dimethoxy-a-methylphenylalaninamid mit einem pH-Wert von 7,5 bei einer Temperatur von 3O⁰C mit einer Raumgeschwindigkeit (SV) von 0,2/Stunde auf die Kolonne aufgegeben.

Bei dieser kontinuierlichen Reaktion wurde eine Ausbeute an. L-3,4-Dimethoxy-a-methylphenylalanin von 85$ oder darüber erhalten, : bis die Reaktionszeit auf 200 Stunden angestiegen war. !

Beispiele 23 bis 25 \

100mg gefriergetrockneter Zellen von Pseudomcnas ipdinum (IFO-3558), hergestellt nach dem in Beispiel 18 beschriebenen Verfahren, wurden;! in 50ml einer 0,1M Phosphatpufferlösung mit einem pH-Wert von . -\ 7,5 suspendiert. Zu der erhaltenen Suspension wurden verschiedene DL-3,4-Dihydroxy-a-methylphenylalaninamide zugegeben. Die- Inkubationdauer betrug 20 Stunden bei einer Temperatur von 30°C.

COPY

- 24 -

Nach der Entfernung der Zellen wurde die Ausbeute an L-3,4-Dihydroxyct-methylphenyl al aninen mittels eines Hochgeschwindigkeits-Flüssigkeits-Chromatographen bestimmt.

Die nicht umgesetzten D-3,4-Dihydroxy-a-methylphenylalaninamide wurden aus der Reaktionsmischung nach dem in Beispiel 16 beschriebenen Verfahren zurückgewonnen. Die erhaltenen 3,4-Dihydroxy-a-methylphenylalanine wurden isoliert.

Die erzielten Ergebnisse sind in der folgenden Tabelle 4 zusammengestellt.

Tabelle Beispiel

Nr.

Substrat

Chemischer Name

Produkt Ausbeute

Spezifische optische Drehung

23

24

25

DL-3,4-Dihydroxy- L-3,4-Dihydroxya-methylphenyla-methylphenylalaninamid alanin

DL-4-Hydroxy-3-methoxy-ctmethylphenylalanin

DL-3,4-Methylendioxy-a-methylphenylalaninamid

L-4-Hydroxy-3-methoxy-amethylphenylalanin

L-3,4-Methylendioxy-a-methylphenyl alanin

/ä7_d -4,5°

Cc - 2, O,1N HCl)

/ä7_d +159° Cc = 0,5, O,25M CuSO₄)

/ä7_d +22,0° Cc -Ί , 0,1N HCl)

Claims

Reg. Nr. 82 008 UBE INDUSTRIES, LfD. 12-32, Nishihonmachi 1-chome, Ube-shi, Yamaguchi-k'en, Japan Ii: paYtels, , 3217908 Dr.-Ing. ilßld, ,. -- nipl.-Phys. WpI££ Lange Str. 51 . 7000 Stuttgart 1 '10. Mai 1982 .-25/28 Verfahren zur Herstellung von L-q-Methylphenylalaninen Patentansprüche

1., Verfahren zur Herstellung von L-a-Methylphenylalaninen der allgemeinen Formel (I):

R₂O

CH

CH--C-COOH

² I

(I)

in der R^ und R^ einzeln und unabhängig voneinander jeweils j

stehen für ein Wasserstoffatom oder einen kurzkettigen Alkylrest j oder gemeinsam für einen Alkylenrest,der einen 5- bis 8-filiedriger.

Ring bildet, dadurch gekennzeichnet, daß man " ·' " j

(a) ein DL-a-Methylpheny 1 alaninamid der folgenden allgemeinen" j Formel (II): . - . . .? ,

COPY

3217903

CH₇

I ³

CH₂-C-CONH₂ (II)

NH₂

in der EL und R- die angegebene Bedeutung haben^mit dem Kulturprodukt eines Mikroorganismus, der ein Enzym zu produzieren vermag, das die Hydrolyse des L-Isomeren von D]>a-Methylphenyl al aninamiden katalysiert oder einem Behandlungsprodukt hiervon in Kontakt bringt unter asymmetrischer Hydrolyse des L-a-Methylphenylalaninamides und daß man

(b) das erhaltene L-ct-Methylphenylalanin aus der Hydrolysemischung isoliert.

2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß man als Mikroorganismus mindestens einen Mikroorganismus aus der Gruppe Trichoderma, Rhodotorula, Nocardia, Mycobacterium, Bacillus, Rhizopus, Candida, Hansenula, Streptomyces, Aerobacter, Arthrobacter, Pseudomonas, Gibberella, Torulopsis, Enterobacter oder Ustilago verwendet.

3. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß man die asymmetrische Hydrolyse der L-a-Methylphenylalaninamide bei einer Temperatur von 2O⁰C bis 5O⁰C durchführt.

4. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß die Reaktionsdauer der asymmetrischen Hydrolyse der L-a-Methylphenylalaninamide bei 5 bis 50 Stunden liegt.

5. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß man den Mikroorganismus in einem Gewichtsverhältnis von 0,01 bis 2, bezogen auf gefriergetrocknete Zellen und bezogen auf das Gewicht der DL-a-Methylphenylalaninamide,einsetzt.