JPS60137287A - 新規グルタチオン・オキシダ−ゼおよびその製造法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 〔産業上の利用分野〕 本発明は新規グルタチオン・オキシダーゼおよびその製
造法に関する。さらに詳しくは、還元型グルタチオン（
以下ＧＳＨと略す）のみに作用して、他のスルフヒドリ
ル化合物には全く作用しない新規グルタチオン・オキシ
ダーゼ、および担子菌によるその製造法に関する。

本発明の新規グルタチオン・オキシダーゼは酸素の存在
丁、ＧＳＩ（のみに作用して、酸化型グルタチオン（以
下Ｇ５５Ｇと略す）と過酸化水素を生成する。それ故、
過酸化水素の生成量あるいは酸素の減少量を公知の方法
で測定することによって、生体試料中または食品中のＧ
ＳＨｉｌ）を測定することが”］能である。

〔従来技術〕

従来、フラビン化合物を補酵素としてＧＳＨをＧ５５Ｇ
に酸化する酵素、スルフヒドリル・オキシダーゼがラッ
ト精のう分泌物から単離されている〔バイオケミストリ
ー（Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ　）第１９巻第２６３９
頁（１，９８０年）〕。しかし、この酵素はＧＳＨのみ
ならずシスティン、２−メルカプトエタノール、ジチオ
スレイトールなどのスルフヒドリル化合物にも作用し、
特にジチオスレイトールには最も強い親和性を示す。ま
た、微生物起源の酵素として、特開昭５７−１３２８７
９号公報にアスペルギルス属、ペニシリウム属、フザリ
ウム嘱、トリコデルマ属、バエシロミセス属またはグリ
オクラディウム属に属する微生物がＧＳＨに特異性が高
くフラビン化合物を補酵素とするグルタチオン・スルフ
ヒドリル・オキシダーゼを生産するという報告がある。

しかし、これらの菌株の生産するグルタチオン・スルフ
ヒドリル・オキシダーゼはジチオスレイトール、Ｌ−シ
スティン、２−メルカプトエタノール、その他のスルフ
ヒドリル化合物にも作用し、ＧＳＨのみに特異性がある
とはいい難い。さらに、上記酵素は主に固体培地で生産
されるから大量生産には不適当である。

〔発明の目的〕

本発明者らは、生体試料中あるいは食品中のＧＳＨを特
異的に定量する方法について鋭意検討を重ねた結果、あ
る種の担子菌が培養物中にＧＳＨのみに特異性を示し、
優れた性質を有する新規グルタチオン・オキシダーゼを
生産することを見出し、本発明を完成した。それ故、本
発明の目的は、ＯＳ、Ｈを特異的に定量できる新規グル
タチオン拳オキシダーゼおよび担子菌を培養して上記酵
素を工業的に安価に製造する方法を提供することにある
。

〔発明の構成〕

本発明を概説すれば、本発明は新規グルタチオン・オキ
シダーゼ、およびその製造法に関するものであって、詳
しくはチャフ１リタケに４およびツウセンタケ属に属し
、新規グルタチオン会オキシダーゼ生産能を有する担子
菌を培養し、培ｆｉｔ物から新規グルタチオン・オキシ
ダーゼを採取することからなる。

本発明に使用される担子菌は、イボタケ科（Ｐｈｙｌａ
ｃｔｅｒ’１ｃｅａｅ　）チャハリタケ属（Ｃａ１ｏｄ
ｏｎ　）に属する菌株、例えばニオイハリタケに一１６
７１株（Ｃａ１ｏｄｏｎ　５ｕａｖｅｏｌｅｎｓ　Ｋ−
１６７１）またはツウセンタケ科（Ｃｏｒｔｉｎａｒｉ
ａｃｅａｅ　）ツウセンタケ属（Ｃｏｒｔｉｎａｒｉｕ
ｓ　）に属する菌株、例エバ、サザナミツバフウセンタ
ケに一９４６株（Ｇｏ−ｒｔｉｎａｒｉｕｓ　ｂｏｖｉ
ｎｕｓ　Ｋ　−９４５）である。ニオイハリタケに一１
６７１株は富士山にて針葉樹林内の地上に群生していた
子実体より分離さベサザナミッパフウセンタケに−９４
６株は奈良県春日山にて松林内地上に群生していた子実
体より分離された。

上記菌株の子実体および胞子の形態的特徴は以下のとお
りである。

（ａ）ニオイハリタケに’−１６７１株高さは３〜５ｃ
Ｉ１１位、傘は直径５〜１２釦、肉は厚く扁平、はぼ円
形、２〜３癒着して構に運なっている。その表面は凸凹
で、あらい皺と瘤があり、最初はほとんど白く、後に淡
茶と青味をおびる。肉は革質で厚さ５咽前後、上層は軟
らかく、下層は硬く、肯藍色の輪紋を示す。針は３〜６
閣位で灰藍色、後に灰褐色になる、先端は白色、茎に垂
生じている。茎は太く短く、硬いコルク質であり、１〜
３　Ｘ　Ｏ，６〜１ｃ＋１位で濃藍色を呈し、内部には
同じ色の輪紋がある。

胞子は類球形でほとんど無色で、４〜６×４〜５μであ
る。

以上の特徴を保育社発行、今関六也および本郷次雄共著
「原色日本菌類図鑑」の記載と比較すると本菌はニオイ
ハリタケであることが明瞭である。本菌は工業技術院微
生物工業技術研究所に微生物受託番号祁・工研条寄第３
９８号として寄託されている。

（ｂ）サザナミツバフウセンタケに一９４６株傘は直径
４〜７Ｃ＋＋１で、開けばほとんど平になる、表面は粘
性がなく、汚褐色あるいはニラケイ褐色で、周辺部は最
初白色繊維状である。ヒダはやや疎で茎に上止し、灰褐
色後にニラケイ褐色となる。茎は高さ５〜８ｃｍ、根元
はふくれて直径１５〜３５σ、中央部付近に早落性の白
いツバ様のものかあり、これより上部は白色で、下部は
傘とほぼ同じ色である。胞子は７゜５〜１０．５Ｘ５〜
６．５声である。

以上の特徴を保育者発行、今関六也および本郷次雄共著
「原色日本菌類図鑑」の記載と比較すると本菌はサザナ
ミツバフウセンタケであることが明瞭である。本菌は工
業技術院微生物工業技術研究所に微生物受託番号微工研
条寄第３９９号として寄託されている。

本発明方法を更に詳しく説明すれは、培地に−加える栄
養源は使用する菌株が利用し得るものであればよく、炭
素源としては例えばグリセロール、グルコース、テンプ
ン、シュクロース、マルトース、ラクトース、デキスト
リン、油脂類などが利用でき、窒素源としては酵母エキ
ス、ペプトン、脱脂大豆、コーンステイープリカー、肉
エキスなどが適当である。その他にリン酸塩、カリウム
塩、マグネシウム塩などの無機質および金属塩類を加え
てもよく、史にはビタミン類、生長促進因子を加えても
よい。

担子菌を培養するにあたり、新規グルタチオン・オキシ
ダーゼの生産量は培養条件により大きく変動するが、一
般に培養温度は２０〜３５℃、培地のｐＨ４〜８が良く
、３〜１５日間の通気攪拌培養で新規グルタチオン拳オ
キシダーゼの生産は最高に達する。培養条件は使用する
菌株、培地組成などに応じ、新規グルタチオン・オキシ
ダーゼの生産量が最大になるように設定するのは当然で
ある。本発明の菌株によって生成された新規グルタチオ
ン［株］オキシダーゼは主に培養Ｐ液中にあり、培養Ｐ
液に可溶性塩類（例えば硫安、食塩など）を２０〜９０
″／１％加えることによりあるいは親水性有機溶媒（例
えばエタノール、アセトンなど）を５０〜８０ｖ／Ｖ％
加えるこ吉により沈殿として分離される。得られた沈殿
物を透析あるいはセファデックス処理によって脱塩し、
粗酵素液を得る。得られた粗酵素液を精製するには、あ
らかじめ０．０１Ｍ酢酸緩衝液（ｐＨ５，０）で緩衝化
したｓｐ−セファデックス（Ｃ−５０）のカラムに粗酵
素液を吸着させ、ｇ＆着物を００３Ｍ酢酸緩衝液（ｐＨ
５，０）で洸浄後、０．１Ｍ酢！Ｉ！２緩衝液（ｐＨ５
，０）で溶出して活性区分を集める。次にこの活性区分
をコロジオン膜で濃縮後、あらかじめ０．１Ｍに酸緩衝
液（ｐＨ７，０）で緩衝化したセファクリルＳ−２００
のカラムでゲル沖過を行ない、活性区分を得る。この活
性区分を再びコロジオン膜で濃縮後、あらかじめ０．１
　、Ｍ　’Ｊン酸緩衝液（ｐＨ７，０）で緩衝化したセ
ファロースＣＬ−５Ｂのカラムでゲル濾過を行ない、得
ら第１た活性区分を水で透析後、凍結乾燥し、精製酵素
粉末を得る。この酵素粉末はポリアクリルアミドゲルデ
ィスク電気泳動的に単一である。

本発明の新規グルタチオン・オキシダーゼの酵素化学的
および理化学的性質は次のとおりである。

（１）作用： 本発明の酵素は、酸素の存在下ＧＳＨのみを酸化し、Ｇ
５５Ｇと過酸化水素を生成する新規なグルタチオン・オ
キシダーゼである。本酵素は下記反応式のことく、ＧＳ
Ｈ２モルと酸素１モルからａｓｓａ　１モルと過酸化水
素１モルを生成する。

２　ＧＳＨ十〇、　−〉Ｇ５５ｃｉ−１−Ｈ，Ｏ□（２
）基質特異性： ＧＳＨのみに作用する。他のスルフヒドリル化合物、例
えばＬ−システィン、Ｎ−アセチル−Ｌ−システィン、
Ｌ−システィンメチルエステル、システアミン、２−メ
ルカプトエタノール、ジチオスレイトール、チオフェノ
ール、チオリンゴ酸、チオサリチル酸、メチルメルカプ
タン、Ｄ−システィン、ＤＬ−ホモシスティン、コエン
ザイムＡ、２−メルカプトベンズイミダゾール、６−メ
ルカプトプリンには全く作用しない（ｐＨ５６０、ｐＨ
７，０およびｐＨ９，０で測定）。

（３）至適ＰすおよびｐＨ安定性： 本酵素の至適ｐＨは第１図の曲線で表わされるごとく、
ｐＨ７，０付近に高い活性を有している。

本酵素を３７℃においてそれぞれのｐＨで６０分間処理
したときのｐＨ安定性を第３図に示した。

第３図より明らかなように本酵素はｐＨ４，０〜ｐＨ８
０の間で“安定である。

（４）至適温度および熱安定性： 本酵素の至適温度は第２図の曲線で表わされるごとく５
０℃付近に至適温度を有している。

本酵素をｐＨ７，０においてそれぞれの温度で１０分間
処理したときの熱安定性を第４図に示し九本酵素は６０
℃まで安定であった。

（５）分子量： 本酵素の分子量は、セファロースＣＬ−６Ｂ（ファルマ
シア製）によるゲル濾過法では約４５００００であり、
Ｓ、ＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動法では約５
５０００であることから、本酵素はサブユニット８個か
ら構成されている。

（６）均一性： ７．５％ポリアクリルアミドゲル（ｐＨ９，４）を用い
てディスク電気泳動を行ない、タンパク染色したところ
１本の染色帯が認められ単一であった。また、５ＤＳ−
ポリアクリルアミドゲル電気泳動でも単一バンドを示し
た。

（７）補酵素： 本酵素を熱処理あるいはトリクロロ酢酸（ＴＣＡ　）処
理し、遠心分離して得られた上澄の薄層クロマトグラフ
ィーを行なったところ、Ｒｆ値が標準フラビン・アデニ
ン・ジヌクレオチド（ＦＡＤ　）のＲｆ値と同じであっ
た。また、この上澄はＤ−アミノ酸オキシダーゼのアポ
酵素を活性化したので、ＦＡＤが本酵素の補酵素である
ことが判明した。ＦＡＤの４５０ｎｍにおける分子吸光
係数から判断すると、本酵素１分子当たり４分子のＦＡ
Ｄが含まれていた（第５図参照）。

（８）等電点： ファルマライト（ｐＨ３〜１０、ファルマシア製）を用
いた焦点電気泳動法によりめた本酵素の等電点は５．６
５土０，０５であった。

（９）阻害剤、金属イオン、金属キレート剤の影響二本
酵素はＰＣＭＢ　（ｐ−クロルメルクリ安息香釦、Ｌ−
アスコルビン酸ナトリウム、Ｈｇ”などによって阻害さ
れた（第１表）。

（１■糖含幇： 本酵素は糖を含む糖蛋白であり、糖含量をフェノール・
硫酸法で測定したところ約４０％であった。

（１１）酵素活性測定法： 新規グルタチオン・オキシダーゼ活性の測定は、酸素電
極法およびＧＳＨの減少量より測定した。即ち、ｌＱｍ
ＭのＧＳＨＱ、　ｌ　ｍｅ、、、　Ｑ、　３　Ｍリン酸
緩衝液（ｐＨ７，０）　１．０　ｍｅ、水１．３　ｍｅ
および適当に希釈した酵素液０．１ｍｅ、反応液量３．
　Ｏｍｅで３７℃１．１０分間反応させ、酸素電極法で
は酸素消費速度を測定して、１分間に１マイクロモルの
酸素を消費する酵素量を１単位としシこ。また、ＯＳＨ
の減少量はエルマンの方法〔アーカイブｅオブ・バイオ
ケミストリー・アンド・バイオフィジックス（Ａｒｃｈ
、Ｂｉｏｃｈｅｍ、Ｂｉｏｐｈｙｓ、）第８２巻第７０
頁（１９５９年）〕により測定°し、１分間に２ｐＭの
ＧＳＨを減少させる酵素量を１単位とした。

〔実施例の説明〕

以下に本発明による新規グルタチオン・オキシダーゼの
製造法を実施例をもって示す。％は他に特記せぬ限りＷ
／ｖ％である。

実施例　１ グルコース２％、エビオス０．５％および寒天１．５％
（エビオス培地）の組成の斜面培地にニオイハリタケに
、１６７１株を接種し、２５℃にて１週間静置培養して
種菌とした。グルコース２．０％、酵母エキス０３％、
ペプトン１％、ＫＨ＊ＰＪ　Ｏ，３％およびＭｇ５Ｏｔ
・７Ｈ１００，１％の組成の培地１００　ｍｅを５００
　ｍｅ容の三角フラスコに分注し、１２０℃で２０分間
殺菌後、冷却し、これに上記の種菌をかきとり接種して
、２５℃で７日間、毎分１００回転で振盪培養した。培
養終了後、濾過して菌体を除き、Ｐ液を得た。

この新規グルタチオン・オキシダーゼ活性は０．２５単
位／　ｍｅであった。

実施例　２ 実施例１のエビオス培地で培養したニオイノ１リタケに
一１６７１株をグルコース２％、酵母エキス０３％、ペ
プトン１％、ＫＨ＊ＰＯ４０，３％およびＭｇＳＯ４”
　７Ｈ２ｏ　ｏ、　１　％の培地１００　ｍｅを分注し
て殺菌（１２０℃、２０分間）した５　００　ｒｎｌ！
の三角フラスコに接種し、２５℃で４日間培養して、種
培養液とした。グルコース２％、酵母エキス０１％、ペ
プトン２憾、ＫＨ２ＰＯ４０，３％、Ｍｇ！３０４・７
Ｈ，Ｏ’０．１％および消泡剤（日本油脂社製ｃＢ＝　
４４２　）　０．０２％（／、）の組成の培地２０１を
３０１容のジャーファーメンタ−に入れ、１２０℃で２
０分間殺菌した。冷却後、上記の種培養液１００＋＋＋
ｅを接種し、２７℃で３日間、毎分２０／の通気速度と
毎分２５０回転の攪拌速度の条件で培養した。培養終了
後、沢過して菌体を除き、Ｐ液を得た。この新規グルタ
チオン・オキシダーゼ活性は０４２単位／　ｍｅであっ
た。この培１液１６１を分子［１５０００の限外ｐ過膜
で濃縮後硫酸アンモニウムを９０％飽和になるように加
えた。−昼夜放置後、得た硫安沈殿物を大量の０．０１
Ｍ酢酸緩衝液（ｐＨ５，０）で、−昼夜透析した。得ら
れた粗酵素液をあらかじめ０．０１Ｍ酢酸緩衝液（ｐＨ
５，０）で緩衝化したＳＰ−セファデックス（Ｃ−５０
）のカラム（φ５．　Ｏｃｍ　Ｘ　２０　ｃｍ　）に吸
着させ、吸着物０．０３Ｍ酢酸緩衝液（ｐＨ５，０）で
洗浄後、０．１　Ｍ酢酸緩衝液（ｐＨ５，０）で溶出し
た。この活性区分をコロジオン膜で濃縮後、あらかじめ
０．１Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ７，０）で緩衝化したセフ
ァクリルｓ−２００のカラム（φ３．６　ｃｍ　Ｘ　９
０　ｃｍ　）でゲル濾過を行なった。この活性区分を再
びコロジオン膜で濃縮後、あらかじめ０．１　ｙ　リン
酸緩衝液（ｐＨ７，０）で緩衝化したセファロースＣＬ
−５Ｂのカラム（φ２．５　ａｍ　Ｘ　１０５　ｃｍ　
）でゲル沢過を行ない、得た活性区分を水で透析後凍結
乾燥し、精製酵素粉末２０ツを得た。この粉末の比活性
は９０単位／ＩＩＩｙであった。この酵素粉末はポリア
クリルアミドゲルディスク電気泳動的に単一であった。

以上の精製工程を第２表に示す。

実施例　３ 実施例１のエビオス培地にサザナミツバフウセンタケに
−９４６株を接種し、２５℃にて１週間静置培養して種
菌とした。グルコース２．０−％、酵母エキスｏ、ａ（
ｆｏ、ペプトン１％、ＫＷ、Ｐｏ。

０３％およびＭｇＳＯ４・７　ＨｔＯ，、０，１％の組
成の培地１００　ｍｅを分注して殺菌（１２０℃、２０
分間）した５　００　ｍｅの三角フラスコに上記の種菌
をかきとり接種して、実施例１と同様に２５℃で７日間
振盪培養した。この培養炉液中の新規グルタチオン・オ
キシダーゼ活性は０．１５単位／　ｍｅであった。

【図面の簡単な説明】

紀１図は本発明により得られる新規グルタチオン・オキ
シダーゼのｐＨと活性の関係を表わし、第２図は温度と
活性の関係を表わし、第３図は本発明による酵素を３７
℃においでそれぞれのｐＨで６０分間処理した後のｐＨ
と活性の関係を表わし、第４図はｐＨ，７，０において
それぞれの温度で１０分間処理した後の温度と活性の関
係を表わす。第５図は本発明による酵素の可視部吸収ス
ペクトル（酵素濃度０．４５％、ｐＨ７，０）を表わす
。 特許出願人　壺酒造株式会社 同　安　達　智　ご預 １占モ 第１図　第２図 第３図　第４図 ｐＨ＠Ｃ 第５図 波長（ｎｍ） 手、続補正書（自覚） （ 昭和５９年２月１７日 １、事件の表示　隋相５８年特許願第２５０４０１、発
明の名称 新規グルタチオン・オキシダーゼおよびその裂貨法３、
補正をする者 事件との関係　特許出願人 Ｎ訴挑触 ７　リ　ガナ　効２シュゾウ 孤客名称　翳酒造体式会社 ４、代理人 ５、補正の対象 ６、補正の内容 １）明細書第９頁第１９行「０．１　Ｍに酸」を「０．
１ＭリンＩ酸」と訂正する。 ２）同第１１頁第１６行「安定である。」の次に「第１
川および第３図において、ｐＨ３ではグリシン−塩酸緩
衝液、ｐＨ４〜５では酢酸緩衝液、ｐＨ６〜８ではリン
酸緩衝液、ｐＨ９〜１０ではホウ酸緩衝液を使用した。 」を挿入する。 １３）同第１５頁第１２行「１マイクロモル」を「１μ
Ｍ」と訂正する。 （４）同第１５頁第１４行「アーカイブ」を「アーカイ
ブズ」と訂正する。 以　上

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １、　次の理化学的性質を有する新規グルタチオン・オ
   キシダーゼ。 （１）作用：酸素の存在下、還元型グルタチオンに作用
   し、酸化型グルタチオンと過酸化水素を生成する。 （２）基質特異性二速元型グルタチオンのみに作用し、
   他のスルフヒドリル化合物には全く作用しない。 （３）至適ｐＨおよびｐＨ安定性：至適ｐＨが７．０付
   近であり、３７℃、６０分間処理ではｐＨ４，０〜８．
   ０の間で安定である。 （４）至適温度′および熱安定性：至適温度が５０℃付
   近であり、ｐＨ７，０，１０分間処理では６０℃まで安
   定である。 （５）分子′＠ニゲルｐ過法で測定した分子量が約４５
   ００００で、ドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ　）−ポ
   リアクリルアミドゲル電気泳動で測定した分子量が約５
   ５０００で、サブユニット８個から構成されている。 （６）補酵素：補酵素であるフラビンアデニン・ジヌク
   レオチド（ＦＡＤ　）か酵素１分子当り４分子存在する
   。 （′７）等電点：５．６５±０．０５゜（８）阻害剤二
   Ｈｇ”＋、Ｐ−クロルメルクリ安息香酸、Ｌ−アスコル
   ビン酸ナトリウムなどによって阻害される。 （９）糖含針：約４０％の糖を含む。 ２、　チャハリタケ属またはツウセンタケ属に属する新
   規グルタチオン・オキシダーゼ生産菌を培養し、培養物
   より新規グルタチオン・オキシダーゼを採取することを
   特徴とする新規グルタチオン・オキシダーゼの製造法。