JPS62278981A - ポリフエノ−ルオキシダ−ゼの製造法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 ３、発明の詳細な説明 〔産業上の利用分野〕 本発明はポリフェノール　オキシダーゼの製造法に関す
る。さらに詳しくは担子菌を培養して、その液養物より
ポリフェノール　オキシダーゼを製造する方法に関する
。

〔従来の技術〕

ポリフェノール　オキシダーゼ（ＥＣ１，１０，３，２
）は、別名ラッカーゼ、フェノラーゼ、ウルシオール　
オキシダーゼ等種々の名前で呼ばれており、ベンゼンジ
オールを１，２−ベンゾキノンることか知られている。

ポリフェノール　オキシダーゼは従来より食品加工への
応用が可能な酵素として注目されていたが最近この酵素
が酸素の存在下、アミン類化合物とフェノール類化合物
を酸化縮合させ、色素を生成することが見い出されて以
来、臨床分析における新しい発色系として利用されるよ
うになった。このポリフェノール　オキシダーゼは植物
ではとくに果実、茶、カカオ豆、タバコなどにかなり大
量に存在するが、いずれの酵素も安定性に欠けており、
また、酵素の安定供給という面からもその供給源を微生
物に求めるのが適尚である。微生物起源の酵素としては
、ノイロスポラ属（ジャーナル・オブ拳バクテリオロジ
ー第１２０巻、第４５８頁、１９７４年）、アルテルナ
リア属（特開昭５４−１４０７９１号）、ミリオコツカ
ム属（特開昭６０−６２９８０号）等のカビ類、コリオ
ラス属、ポリポラス属およびプレウロタスＪｌ（発酵協
会誌、第２０巻、第２９３頁、リア属、ガノデルム属、
コプリナス属、ダエダレオプシス属およびフラムリナ属
（特開昭６０−１５６３８５号）等の担子菌が知られて
いる。

〔発明が解決しようとする問題点〕

ポリフェノール　オキシダーゼは今後食品加工および臨
床分析に繁用される酵素であり、これを高収率で有利に
工業生産するためには、さらに優れた性質をもつポリフ
ェノール　オキシダーゼを著量生産する微生物の検索が
望まれる。

従って本発明の目的は、上記現状に鑑み安定性に優れた
どりフェノール　オキシダーゼを工業的に安価に製造す
る方法を提供することにある０ 〔問題点を解決するための手段〕 本発明を概説すれば、本発明はポリフェノール　オキシ
ダーゼの製造法に関するものであって、スルメタケ属に
属し、ポリフェノール　オキシダーゼ生産能を有する担
子菌を培養し、培養物からポリフェノール　オキシダー
ゼを採取することからなる。

本発明で用いられるスルメタケ属に属する担子菌はポリ
フェノール　オキシダーゼを培養物中に著量生産するこ
とが可能で、また後述するごとく非常に精製が容易であ
り、かつ優れた性質を有している。

以下、本発明について詳細に説明する。

まず、本発明に使用される菌株としては、スルメタケ属
に属するポリフェノール　オキシダーゼ生産能を有する
菌株であればいかなる菌株でもよく、またこれらの菌株
の変異株でもよい。

そして、スルメタケ属に属し、ポリフェノールオキシダ
ーゼ生産ｉｔ有する菌株の具体例としては、例えば、ス
ルメタケ（Ｒｌｇｉｄｏｐｏｒｕｓｚｏｎａｌｉａ　）
　Ｋ　−６４が挙げられる。本菌株は群馬県Ｗ積にて広
葉樹幹上に生えていた子実体より分離された〇 本菌株の子実体および胞子の形態的特徴は以下のとおり
である。

子実体は１年生または多年生無茎で半背着あるいは全背
着している。傘は半円形で貝殻状または扁平、０．５〜
２．５×１〜５ａ１１厚さ０．２〜０、５　ＣＩ　、表
面は赤褐色で無毛、縁は初め厚く、後に薄く、乾燥時下
方に屈曲している。肉は木栓質で白色〜赤黄色で乾燥時
堅くなる。管孔は長さ１〜３臨で白色、孔口は小さく円
形で、１票間に４〜５個、胞子は球形で平滑、無色、径
２．５〜５．ｕ。以上の特徴を伊藤誠也著「日本菌類誌
第２巻第４号Ｊ　１９５５年養賢堂出版の記載と比較す
ると、本面はスルメタケであることが明瞭である。本面
はＲｌｇｉｄｏｐｏｒｕｓ　ｚｏｎａｌｉｓｘ−６４と
命名し工業技術院微生物工業技術研究所に微工研菌寄第
８７６９号（ＦＩＲＭ　Ｐ−８７６９）として寄託され
ている。

本発明において、培地に加える栄養源は使用する菌株が
利用し、ポリフェノール　オキシダーゼを生産するもの
であればよく、炭素源としては、例えばグリセロール、
グルコース、デンプン、シュクロース、マルトース、ラ
クトース、デキストリン、油脂類などが利用でき、窒素
源としては酵母エキス、ペプトン、コーンステイープリ
カー、脱脂大豆、大豆粉、肉エキスなどが適当である。

その他にリン酸塩、カリウム塩、マグネシウム塩などの
無機質および金属塩類な加えてもよい。なお、本発明の
ポリフェノールオキシダーゼは銅酵素であるため、硫酸
鋼を培地に添加すれば著しく酵素生産量が増大する。

例えば、５ｐｐｍの添加により無添加に比べて５〜１０
倍の本発明によるポリフェノール　オキシダーゼが生産
される。

ポリフェノール　オキシダーゼ生産菌を培養するにあた
り、生産量は培養条件により大きく変動するが、一般に
培ｌ！温度は２０〜３５℃、培地のｐＨは４〜７が良く
３〜１５日間の通気攪拌培養で本発明によるポリフェノ
ール　オキシダーゼの生産は最高に達する。培養条件は
使用する菌株、培地組成などに応じ、ポリフェノール　
オキシダーゼの生産量が最大になるように設定するのは
当然である。

本発明の菌によって生産されたポリフェノール　オキシ
ダーゼは主に培養液中にあるので、培養物を固液分離し
、得られた培養沖液から通常用いられる精製手段により
精製酵素標品を得ることができる。例えば、塩析、有機
溶媒沈殿、イオン交換カラムクロマトグラフィ、疎水結
合カラムクロマトグラフィ、ゲル濾過、凍結乾燥などに
より、精製を行ないポリアクリルアミドゲルディスク電
気泳動的に単一な精製ポリフェノール　オキシダーゼを
得ることができる。

本発明により得られるボリフエ／−ル　オキシダーゼの
酵素化学的および理化学的性質は次のとおりである。

（１）作用： 本発明の酵素は、酸素の存在下、４−アミノアンチピリ
ンとフェノールを定量的に簾化縮合させ、赤色色素を生
成する。

（２）基質特異性： 本酵素の各種化合物に対する相対活性を第１表に示す。

第　　１　　表 ピロガロール　　　　　　　　　１０００−アミンフェ
ノール　　　　　　８３ｐ−アミノフェノール　　　　
　　８１ｍ−アミノフェノール　　　　　　５６ビロカ
テコール　　　　　　　　　３９ｐ−フェニレンジアミ
ン　　　　　３９ハイドロキノン　　　　　　　　　３
６アスコルビン酸　　　　　　　　　３４尿酸　　　　
　　　　　　　　　１６ フエノール　　　　　　　　　　　　２チロシン　　　
　　　　　　　　　Ｏ ｐ−ニトロフェノール　　　　　　　Ｏピロガロールに
対する活性を１００とした。

（３）至適ｐＨおよ・びｐＨ安定性： 本酵素の至適ｐＨは第１図の曲線で表わされるごと（ｐ
Ｈ５，０〜５．５に極めて高い活性を有している。本酵
素を３７℃においてそれぞれのｐＨで６０分間処理した
ときのｐＨ安定性を第３図に示した。第３図より明らか
なように本酵素はｐＨ６〜１０の間で安定である。

（４）至適温度および熱安定性： 本酵素の至適温度は第２図の曲線で表わされるごと＜８
０℃付近に至適温度な有している。

本酵素をｐＨ７，０においてそれぞれの温度で１０分間
処理したときの熱安定性を第４図に示した。

本酵素は６０℃まで安定であった。

（５）分子、ｉｔ　： 本酵素の分子量はセファクリル５−２００（ファルマシ
ア製）によるゲル濾過法では約２７０００であった。

（６）均一性： ７．５％ポリアクリルアミドゲル（ｐＨ９，４）を用い
てディスク電気泳動を行ないタンパク染色したところ、
一本の染色体が認められ単一であった。

（′７）等′酸点： ファルマライト（ｐＨ２，５〜５、ファルンシア製）を
用いた等電点電気泳動法により求めた本酵素の等電点は
３，７５±０．１であった。

（８）阻害剤、金属イオン、金属キレート剤の影響：本
酵素は第２表に示すように、シアン化カリウム、ナトリ
ウムアジド、Ｈｇ　　により強く阻害された。

第　　２　　表 無添加　　　　　　　　１００ シアン化カリウム　　　　　　　　　０ナトリウムアジ
ド　　　　　　　　０ ヒドロキシルアミン　　　　　　４７ ＰＭＳＩＦ”　　　　　　　　　　　　　　８２チオウ
レア　　　　　　　　　　９４ ヨード酢酸　　　　　　　　　　　　９８ＥＤＴＡ　　
　　　　　　　　　　　　　９８Ｎ−エチルマレイミド
　　　　　　９９Ｋｇ０１ｘ　　　　　　　　　　　　
　　　３０ａＯ４ｓ　　　　　　　　　　　　　　７９
Ｍｎ（ｌｔｇ　　　　　　　　　　　　　　７９ＮｉＳ
（ｌａ　　　　　　　　　　　　　　８２ＮａＯ６８４ ＣｏＯ２１８６ Ｍｇ５Ｏｓ　　　　　　　　　　　　　　８７Ｆｏｏｌ
ｓ　　　　　　　　　　　　　　９５ＺｎＯｔ＊　　　
　　　　　　　　　　　９８０（ＬＳＯ４９８ ０ｕＳＯａ　　　　　　　　　　　　　　９９（ＯＨ３
０００）ｎＰｂ　　　　　　　　１００＄フエニルメチ
ルスルホニルフルオリド（９）可視部吸収スペクトル： 本酵素溶液の可視部吸収スペクトルを測定したところ、
６１０Ｂｍに吸収極大が認められブルータンパクであっ
た。

（１０）糖含量： 本酵素は糖を含む糖タンパクであり、糖含量を７エノー
ル硫酸法で測定したところ、約０．６７％であった。

（１１）銅含量： 原子吸光分析機を用いて、本酵素中の銅の定量を行なっ
たところ、酵素１モルに対して１モルの銅が含まれてい
た。

（１２）酵素活性測定法： ポリフェノール　オキシダーゼによって４＝アミノアン
チピリンとフェノールが酸化縮合し定量的に発色する作
用を利用して、本酵素活性を求めた。即ち、２４．６ｍ
Ｍの４−アミノアンチピリン０．１−１０．４２　Ｍの
７エノール０．１　ｒｎｅ　。

０．３Ｍのリン酸緩衝液（ｐＨ７，０）１．０Ｔｄ！蒸
留水１．７−および適当に稀釈した酵素液Ｑ、ｌ　ｍｅ
　、反応液量３．０　ｍｅで３７℃、１０分間反応させ
５０Ｃｎｍにおける吸光度の増加を測定した。ポリフェ
ノール　オキシダーゼ１単位は上記条件で１分間に５０
０Ｂｍにおける吸光度を１．００増加させる酵素量とし
て表示した。

〔実施例〕

以下に本発明によるポリフェノール　オキシダーゼの製
造方法を実施例をもって示すが、浮発明が以下の実施例
の範囲のみに限定されるものではない。なお、％は他に
特記せぬ限りｗ／ｖ％である。

実施例　１ グルコース２％、エビオス０．５％および寒天１．５％
（エビオス培地）の組成の斜面信地にスルメタケに−６
４（微工研菌寄第８７６９号）を接種し、２５℃にて１
週間静置培養して種菌とした。グリセロール２．０％、
酵母エキス０．３％、へ７　）　ン１．０％、ＫＨｍＰ
Ｏａ　　０．３％、ＭｇＳ　Ｏ＊・７　Ｈ寞０　０．１
％およびＱｕＳ０４　＠　５　Ｈｘ　Ｏ５ｐｐの組成の
培地１００ｄＥ５００ｒｎ！容の三角７ラスフに分注し
、１２０℃で２０分間殺菌後冷却し、これに上記の種菌
を接種して、２５℃で１０日間、毎分１００回転で振盪
培養した。培養終了後、沖過し、菌体を除き、沖液を得
た。このポリフェノール　オキシダーゼ活性は２１．０
単位／−であった。

実施例　２ 実施例１に記載した種菌を、グルコース２，０％、酵母
エキス０３％、ペプトン１．０％、ＫＭ意Ｆ０゜０．３
％およびＭｇ５Ｏｔ・７　ＨｍＯｏ、　１％の培地７５
〇−を分注して、１２０℃、２０分間殺菌した２を容の
三角フラスコに接種し、２７℃で７日間培養して種培養
液とした。グリセロール２．０％、酵母エキス０．３％
、ペプトン１．０％、ＫＭ　Ｉ　ＰＯ４０，３％、Ｍｇ
５Ｏｔ　”　７　ＨｍＯＯ，１％、０ｕＳＯ４会５　Ｈ
ｘ０　５　ｐｐｍおよび消泡剤（日本油脂社製、０Ｂ−
４４２）　０．０３　ｖ／ｖ％の組成の培地１５０ｔを
２００を容のジャーファーメンタ−に入れ、ｎ　　１２
０℃で２０分間殺菌した。冷却後、上記の種培養液７５
０−な接種し、２６℃で７日間、毎分７５１の通気量と
毎分２００回転の攪拌速度の条件で培養した。培養終了
後フィルタープレス濾過により菌体を除き、沖液を得た
。このポリフェノール　オキシダーゼ活性は２２．２単
位／ｒｒｉであった。この培養戸液１４０ｔに硫酸アン
モニウムを６０％飽和になるように加えて、−昼夜放置
後得た硫安沈殿物を大量の３　Ｑ　ｍＭリン酸緩衝液（
ｐＨ７，０）に対して一昼夜透析した。この酵素液を予
め３０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７，０）で緩衝化したＤ
ＩＡＩ−セファロースＯｌ、　−６Ｂ（ファルマシア製
〕のカラム（直！１１．０α×長さ４０　ｃ＋ｉ　）に
吸着させ、吸着物を５ＱｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７，０
）で洗浄後、１１００ｆｆ１リン醇緩衝液（ｐＨ７，０
）で溶出して活性画分を集めた。次にこの活性画分を限
外濾過で濃縮し、さらにコロジオン膜で濃縮後予め１０
０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７，０）で緩衝化したセファ
クリル５−２００（ファルマシア製）のカラム（直径３
、６０Ｉ　Ｘ長さ９０１）でゲル濾過を行ない得た活性
画分に塩化す）　ＩＪウムを添加し４Ｍ濃度とした。こ
れを予め４Ｍ塩化ナトリウム含有１０ｍＭリン酸緩衝液
（ｐＨ７，０）で緩衝化したフェニルセファロースｏｂ
−４Ｂ（ファルマシア製）のカラム（直径５．００１　
Ｘ長さ３０Ｃ１１）に吸着させ、吸着物ｔ−３Ｍ塩化す
）　ＩＪウム含有１０ｍＭ！Ｊン酸緩衝液（１）Ｈ７，
Ｏ）で洗浄後、１Ｍ塩化す）　ＩＪウム含有１０ｆ１０
ｆｆ１ン酸緩衝液（ｐＨ７，０）で溶出し、活性画分を
集めた。この活性画分を１０ｍＭＩＪン酸緩衝液（ｐＨ
７，０）に透析後、安定剤としてシュクロースを最終濃
度０．１％になるように加えて凍結乾燥し、精製酵素粉
末２５．２　ｆを得た。

この酵素粉末の比活性は７３単位／岬であった。

また、この酵素粉末はポリアクリルアミドゲルディスク
電気泳動的に単一であった。以上の精製工程を第３表に
示す。

〔発明の効果〕

本発明によりポリフェノール　オキシダーゼの新たな工
業的生産に適した製造法が提供された０

【図面の簡単な説明】

第１図は本発明により得られるポリフェノール　オキシ
ダーゼのｐＨと活性の関係を表わすグラフであり、第２
図は温度と活性の関係を表わすグラフであり、第３図は
ポリフェノール　オキシダーゼを３７℃において、それ
ぞれのｐＨで６０分間処理した後の−ｐＨと活性の関係
を表わすグラフであり、第４図はｐｉ（７，０において
それぞれの温度で１０分間処理した後の温度と活性の関
係を表わすグラフである０

Claims (1)

【特許請求の範囲】
1. １、スルメタケ属に属するポリフェノール　オキシダー
   ゼ生産菌を培養し、培養物よりポリフェノール　オキシ
   ダーゼを採取することを特徴とするポリフェノール　オ
   キシダーゼの製造法。