DD240910A1 - Verfahren zur herstellung einer mikrobiellen l-glutaminsaeure-oxidase - Google Patents

Abstract

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Herstellung einer L-glutaminsaeurespezifischen L-Glutaminsaeure-Oxidase, die potentiell in der klinischen Diagnostik sowie in der technisch-mikrobiologischen Industrie und Nahrungsgueterwirtschaft von Nutzen ist. Insbesondere betrifft die Erfindung ein Verfahren zur Herstellung einer neuen extrazellulaeren L-Glutaminsaeure-Oxidase unter Verwendung eines Mikroorganismus Streptomyces endus, ZIMET 43772, der bisher nicht fuer die Herstellung von L-Glutaminsaeure-Oxidase herangezogen wurde. Ziel der Erfindung ist die Gewinnung einer neuen L-Glutaminsaeure-Oxidase mit hohem Temperatur-Optimum, deren Anwendung bei der Prozesskontrolle in der Fermentationsindustrie von besonderem potentiellem Nutzen ist. Die Aufgabe wird dadurch geloest, dass durch aerobe Submersfermentation des Mikroorganismus Streptomyces endus, ZIMET 43772, in Medien mit geeigneten C-, N-Quellen und Mineralsalzen eine extrazellulaere L-Glutaminsaeure-Oxidase (H2O2 bildend) gebildet, durch fraktionierte Ammoniumsulfatfaellung angereichert und mit Hilfe der Kationenaustauschchromatographie gereinigt wird.

Description

Hierzu 4 Seiten Zeichnungen

Anwendungsgebiet der Erfindung

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Herstellung einer extrazellulären (H₂O₂-bildend) L-Glutamin-Oxidase. Das Anwendungsgebiet der Erfindung liegt in der klinischen Diagnostik zur Bestimmung der Aktivitäten von Enzymen, insbesondere von Transaminasen sowie zur Bestimmung von L-Glutaminsäure in dertechnisch-mikrobiologischen Industrie und in der Nahrungsgüterwirtschaft zur Prozeßkontrolle.

Charakteristik der bekannten technischen Lösungen

L-Aminosäure-Oxidasen unterschiedlichster Herkunft werden beschrieben, die aus Schlangengift, Rattennieren, Spinatblättern isoliert oder mikrobieller Herkunft sind, wobei die L-Aminosäure-Oxidasen aus Schlangengift und tierischem Gewebe die L-Aminosäuren unspezifisch oxidieren.

Eine L-Aminosäure-Oxidase, die auch die Oxidation von verschiedenen D-Aminosäuren katalysiert, ist aus Membranfragmenten von Azotobacter vinelandii von JURTSHUK, P. und MC MANUS, L., 1974 (Biochim. Biophys. Acta, 368,158) isoliert worden.

Weiterhin ist bekannt, daß D-Aminösäuren von Aerobacter oder Aspergillusustusmetabolisiert werden. Verschiedene Vertreter der Gattung Streptomyces können unter geeigneten Fermentationsbedingungen L-Glutaminsäure-Oxidase produzieren, die sich in ihren Grundeigenschaften und in der Lokalisation (intra- oder/und extrazellulär) unterscheiden.

Von A. MATSUZAKI et al. (Japanese Published Unexamined Patent Application, Kokai Tokkyo Koho, 57-43685,1982) (Chem.

Pharm. Bull. 31 (4) 1 307-1 314,1983 und Chem. Pharm. Bull. 31 (10) 3609-3616,1983) ist eine extrazelluläre L-Aminosäure-Oxidase beschrieben, die aus Kulturlösungen von Streptomyces violascens H82-N-SY7 isoliert wurde und die im Vergleich mit anderen L-Aminosäuren bevorzugt L-Glutaminsäure oxidiert.

HITOSHI KUSAKABE et al. 1983 (Agric. Biol. Chem., 47(1), 179-182 und Agric. Biol. Chem. 47 (6), 1323-1 328,1983 und Agric. Biol.

Chem., 48(1), 181-184,1984) isolierte eine L-Glutaminsäure-Oxidase aus Streptomyces spec. X-119-6, die intra- und extrazellulär nachweisbar und durch eine hohe Temperaturstabilität gekennzeichnet ist und neben L-Glutaminsäure auch L-Glutamin und L-Histidin oxidiert.

Darüber hinaus ist bekannt, daß die Mikroorganismen Streptomyces spec. A7700 FERM P-6241 und Streptomyces spec. A8063 FERM 8-6242 eine L-Glutaminsäure-spezifische L-Glutaminsäure-Oxidase zu synthetisieren vermögen, die intrazellulär nachweisbar sind (TOYOJOZO K. K. et al. DE 3307 607 A1).

Die bekannten L-Glutaminsäure-Oxidase-Präparate schränken durch die Höhe des Temperatur-Optimismus (37°C) deren Anwendungsmöglichkeiten ein. Für bestimmte Anwendungszwecke (Prozeßkontrolle in dertechnisch-mikrobiologischen Industrie) ist wünschenswert, daß die Aktivität der L-Glutaminsäure-Oxidase bei Temperaturen zwischen 25 und 60^CC voll zur Entfaltung kommt.

Es ist nicht bekannt, daß L-Glutaminsäure-Oxidasen mikrobieller Herkunft mit einem breiten Temperatur-Optimum erhalten wurden.

Bisher können L-Glutaminsäure-Oxidasen lediglich mit Hilfe von wenigen, z.T. nicht gültig beschriebenen Streptomyceten-Arten auf mikrobiologischem Wege hergestellt werden.

Ziel der Erfindung

Die Erfindung hat das Ziel, ein Verfahren zur Herstellung einer neuen extrazellulären, H₂O₂-bildenden L-Glutaminsäure-Öxidase mit einem hohen Temperatur-Optimum und einer hohen Substratspezifität mit Hilfe eines Mikroorganismus, der aufgrund seiner mesophilen Eigenschaften vom energetischen Standpunkt thermophilen Mikroorganismen vorzuziehen ist, zu entwickeln. Damit sollen die Nachteile bisher bekannter Verfahren zur Herstellung von L-Glutaminsäure-Oxidase vermieden und die Palette derartiger Präparate durch einen Vertreter mit breitem Anwendungsgebiet erweitert werden.

Darlegung des Wesens der Erfindung

Der Erfindung liegt die Aufgabe zugrunde, ein technologisches Verfahren bereitzustellen, das es gestattet, aus leicht zugänglichen und billigen Einsatzstoffen eine spezifisch wirkende extrazelluläre L-Glutaminsäure-Oxidase mit hohem Temperatur-Optimum herzustellen, ohne auf thermophile Mikroorganismen zurückzugreifen. Erfindungsgemäß wird die Aufgabe dadurch gelöst, daß unter aeroben und sterilen Kulturbedingungen in einem flüssigen Nährmedium mit Kohlenstoffsowie Stickstoff-Quellen und Mineralsalzen ein zur Gattung Streptomyces gehörender Mikroorganismus oder seine Varianten und Mutanten gezüchtet werden. Der erfindungsgemäße Mikroorganismus wurde unter der Registriernummer ZIMET 43772 in derZIMET-Hinterlegungsstelle für Mikroorganismen hinterlegt. Er ist der Stammsammlung der Abteilung Antibiotika-Mikrobiologie des Zl M ET entnommen worden und wird auf Grund seiner Artmerkmale der Art Streptomyces endus zugeordnet (FÜGNER, R. und BRADLER, G. 1963. Zeitschrift für Allgemeine Mikrobiologie, 3,173-194). Zur Herstellung der L-Glutaminsäure-Oxidase wird der Stamm ZIMET 43772 sowie seine Mutanten und Varianten unter aeroben Bedingungen kultiviert. An Heilerde Lyophil getrocknetes bzw. in flüssigem Stickstoff aufbewahrtes Mycel des Stammes wird auf geeignete Agarnährböden und nachfolgend in flüssige, vorher sterilisierte Nährmedien geimpft und das entstehende Mycel wird in bekannter Weise bei einer Temperatur zwischen 25°C und 37°C, vorzugsweise bei 28°C, über einen Zeitraum von 2 bis 6 Tagen, vorzugsweise 4 Tagen, bei einer Acidität kultiviert, die zu Beginn des Fermentationsprozesses zwischen pH 6,8 und 7,0 undamEndedes Prozesses zwischen pH 7,5 und pH 8,5 liegt. Das Nährmedium besteht aus Kohlenstoff- und Stickstoffquellen sowie aus anorganischen Salzen. Als Kohlenstoffquellen werden Glucose, Glycerol, Lactose, Sojaöl und Sojamehle verwendet. Als Stickstoffquellen eignen sich außer den oben erwähnten stickstoffhaltigen Substraten Fleischextrakte, Maisquellwasser, Aminosäuregemische, Malzextrakt, Rohglutamin, Peptone, Weizenkleie und Trockenhefe. Gute Fermentationsergebnisse werden bei Zusatz von Mineralsalzen erzielt. In komplexen Medien, die verschiedene Mehle enthalten, haben sich Zusätze von Kaliumphpsphaten und Calziumcarbonat als vorteilhaft erwiesen.

Die Fermentation des L-Glutaminsäure-Oxidase-Bildners, ZIMET43772, wird in Steilbrustflaschen verschiedenen Inhalts, in Glasfermenter sowie in V2A-Stahltanks durchgeführt. Die Bestimmung der L-Glutaminsäure-Aktivität der nativen Kulturlösung des Stammes ZIMET 43772, Streptomyces endus, und die daraus gewonnene Rohenzymlösung erfolgt mit einer von EMERSON, E. J., 1943 (Org. Chem. 8,417-428) undTRINDER, J. 1969 (Clin. Chem. Biochem. 6,24-27) beschriebenen spektrophotometrischen Methode bzw. mit Hilfe eines amperometrischen Sensors (modifizierte Sauerstoffelektrode nach CLARK) bei +600 mVvs S. C. P., indem die Konzentration des gebildeten H₂O₂ bestimmt wird. Dazu wird eine modifizierte Sauerstoffelektrode mit einer H₂O₂-Standardlösung geeicht. Die Messung erfolgt in einer thermosdatierten Meßzelle in kontinuierlich gerührter Pufferlösung (2,0 ml Citrat-Phospat-Puffer nach MC ILVAIN). Nach Vorlage von 0,2 ml Enzymlösung wird die Reaktion durch Zugabe von 0,2 ml Substratlösung gestartet. Die gemessene Strom-Zeit-Kurve gibt Auskunft übert die gebildete H₂O₂-Menge in der Meßlösung. Es kann sowohl die Anfangsgeschwindigkeit der enzymatischen Reaktion als auch ihr Verlauf verfolgt werden. Die Isolierung der L-Glutaminsäure-Oxidase wird in der Weise durchgeführt, daß nach Abtrennen des Myzels aus der Fermentationslösung mittels Separator 201 Kulturfiltrat durch Ultrafiltration (z.B. Membran vom Typ UF 150 vom VEB Zellstoffwerke Wittenberge; molekulare Ausschlußgröße um 50000D) auf ein gewünschtes Volumen konzentriertwerden. Nach fraktionierter Ammoniumsulfatfällung (40 und 60%ige Sättigung) wird das Sediment in üblicherweise gewonnen, in entsprechenden Mengen eines 0,04molaren Na-Phosphatpuffers von pH 6,0 gelöst und 2-3 Mol gegen das40fache Volumen des gleichen Puffers ca. 20 Stunden dialysiert. Anschließend wird das Dialysat auf eine Säule gegeben, die mit einem Austauscherharz WofatitCA-20 (VEB Chemisches Kombinat Bitterfeld) gefüllt und im gleichen Puffer äquilibriert wurde. Die Elution erfolgt mit 0,2 M NaCI im Startpuffer. Die erhaltenen aktiven Fraktionen werden vereinigt, konzentriert und durch Dialyse gegen einen geeigneten Puffer niedriger lonenstärke (5,5 < pH-Puffer < 8) entsalzt. Die spezifische Aktivität der so angereicherten L-Glutaminsäure-Oxidase ist gegenüber der Aktivität in der nativen Kulturlösung um das 600-800fache erhöht und beträgt 6-8 U/mg Protein in einer Ausbeute von einem Drittel.

Das Rohenzym (ammoniumsulfatgefälltes Präzipitat), gewonnen aus dem Kulturfiltrat von Streptomyces endus, zeichnet sich durch nachfolgende Eigenschaften aus: pH-Optimum

Für die Ermittlung des pH-Optimums der Enzymlösung wurde Citrat-Phosphat-Puffer nach MC ILVAIN eingesetzt. Das pH-Optimum liegt zwischen pH 5,0 und 8,5 (vorzugsweise bei pH 7,0), wenn als Reaktionstemperatur 37⁰C gewählt wurde (Abb. 1). Temperatur-Optimum

Das Temperatur-Optimum der neuen L-Glutaminsäure-Oxidase liegt zwischen 25 und 6O⁰C (vorzugsweise bei 40-48°C), wenn bei pH 7,0 als Substrat L-Glutaminsäure verwendet wurde (Abb. 2)

Thermostabilität

Die Thermostabilität der L-Glutaminsäure-Oxidase des Bildners Streptomyces endus wurde bei Temperaturen von 40 bis 70⁰C bei pH 7,0 untersucht. Die Enzymlösung wird bei der entsprechenden Temperatur 15 Minuten inkubiert und in Eiswasser schnell abgekühlt. Die spektophotometrische Bestimmung der Restaktivität (%) erfolgt nach o. g. Methode. Die Ergebnisse sind in Abb.3 dargestellt. Die L-Glutaminsäure-Oxidase ist bis 6O⁰C über 1 Stunde stabil. Bei einer 15minütigen Vorinkubation der Enzymlösung bei 70⁰C beträgt die verbleibende Aktivität noch 57%.

pH-Stabilität

Die pH-Stabilität der neuen L-Glutaminsäure-Oxidase aus Streptomyces endus ZIMET 43772 liegt zwischen pH 5,0-8,0. Sie wurde ermittelt, indem die Rohenzymlösung in zwei verschiedenen Pufferlösungen (0,05 und 0,5M Phosphatpuffer nach SÖRENSEN, 0,05 und 0,5M Na-Acetat-Puffer) bei pH 3,6-8,0 und einerTemperatur von 37⁰CfUr die Dauer von 1 Stunde vorinkubiert wurde. Die bei dem jeweiligen pH-Wert verbleibenden Restaktivitäten (%} werden bei einerTemperatur von 37°C und pH 7,0 spektrophotometrisch ermittelt und sind in Abb.4 dargestellt

Substratspezifität

Die L-Glutaminsäure-Oxidase aus Streptomyces endus ZIMET 43772 wurde in seiner Wirksamkeit an verschiedenen Substraten im Vergleich mit L-Glutaminsäure untersucht. Die Ergebnisse sind in Tabelle 1 dargestellt. Die Rohenzymlösung kann durch folgendes Substratprofil charakterisiert werden: Die L-Glutaminsäure-Oxidase aus Streptomyces endus ZIMET 43772 weist eine spezifische Aktivität gegenüber L-Glutaminsäure und keinerlei Aktivität gegenüber den anderen untersuchten Substraten auf. Km-Wert

Für die L-Glutaminsäure-Oxidase aus Streptomyces endus ZIMET43722 wurde ein Km-Wert von 3,8 χ 10~³für L-Glutaminsäure ermittelt.

Wirkung von Metallionen und anderen Substanzen

Die Wirkung von Metallionen und anderen Substanzen auf die Enzymaktivität wird untersucht, indem die Rohenzymlösung mit den in Tabelle 2 aufgeführten Substanzen 15 Minuten vorinkubiert wird. Anschließend erfolgt die Bestimmung der verbleibenden Aktivität (%) mit der beschriebenen amperometrischen Bestimmungsmethode bei einer Temperatur von 37°C und einem pH-Wert von 7,0. Die L-Glutaminsäure-Oxidase aus Streptomyces endus, ZIMET 43772, wird in ihrer Wirkung von AgNO3 und HgC^ beeinträchtigt

Isoelektrischer Punkt

Die Bestimmung des isoelektrischen Punktes (IP) der an Wofatit CA-20 gereinigten L-Glutaminsäure-Oxidase erfolgte mit Hilfe der isoelektrischen Fokusierung in 8,5%igenPAG-Gelen (analytisch) als auch in Sephadex G 100-Gelen mit einem pH-Gradienten von3-10(2%Ampholin, LKB). Bei Einsatz des Rohenzyms wird das Fokusierte Bandenspektrum sowohl einer Proteinfärbung (Silberfärbung) als auch gleichzeitig einer Aktivitätsmarkierung (mit Chromogen/Peroxydase-Meßansatz) unterzogen. Aus den genannten Untersuchungen resultiert ein isoelektrischer Punkt des höhergereinigten Enzympräparates, der zwischen pH 7 und 8 (Hauptaktivität zwischen pH 7,5 und 8,0) liegt.

Die Verwendung von Streptomyces endus als L-Glutaminsäure-Oxidase-Bildner bringt den Vorteil, eine L-Glutaminsäure-Oxidase mit einem hohen Temperatur-Optimum zu gewinnen. Der zusätzliche Vorteil besteht in der Verwendung eines mesophilen Vertreters der Gattung Streptomyces, dessen Fermentation auf Grund seiner mesophilen Eigenschaften, im Gegensatz zu thermophilen Mikroorganismen, durch ein günstigeres Verhältnis von Energieaufwand zu Enzymertrag gekennzeichnet ist.

Tabelle 1 Stubstratspezifität der L-Glutaminsäure-Oxidase aus Streptomyces endus, ZIMET 43772

Relative Aktivität (%)

Substrat	Reh
(35 μ,ηηοΙ Substrat
L-Glutaminsäure	100
L-Phenylalanin	0
L-Tyrosin	0
L-Isoleucin	0
L-Valin	0
L-Tryptophan	0
L-Glutamin	0
L-Asparaginsäure	0
L-Asparagin	0
L-Lysin	0
L-Glycin	0
L-Arginin	0
L-Histidin	0
L-Alanin	0
L-Prolin	0
L-Serin	0
L-Cystein	0
L-Methionin	0
L-Leucin	0
L-Threonin	0

Tabelle 2 Einfluß von Metallionen und anderen Substanzen auf die Aktivität der L-Glutaminsäure-Oxidase aus Streptomyces endus,ZIMET43772

Relative Aktivität%

Zusatz	Konzentration	ReN
Kontrolle	-	100
EDTA	1OmM	96
KCN	1OmM	91
NaN3	1OmM	100
ZnCI2	1mM	96
MgCI2 x 6H2O	1 mM	92
CaCI2	1mM	100
FeCI3 x 6H2O	1mM	95
CuCI2	1mM	95
HgCI2	1mM	78
AgNO3	1mM	54
BaCI2	1mM	94
MnCI2	1 mM	94
FAD	0,01 mM	96
FMN	0,01 mM	96
PCMB	0,002 %	94
K2Cr2O7	1mM	96

Ausführungsbeispiele

1. Das Impfmaterial für die Beimpfung einer Vorzucht-Kultur wird auf einem festen Agrarmedium folgender Zusammensetzung für die Dauer von 10—14 Tagen angezüchtet:

Glucose 10,00 g

Casein-Pepton 4,00 g

Walfleischextrakt 4,00 g

NaCI 2,50 g

Hefe 0,20 g

Aquadest ad 1000 ml

Sterilisation: 35 Minuten bei 115⁰C. AciditätpH 7,0. Als Vorzucht-Medium eignet sich ein flüssiges Nährmedium folgender Zusammensetzung:

Glucose 1,5%

Sojamehl 1,5%

CaCO₃ 0,1%

NaCI 0,5%

Leitungswasser ad 1000 ml

Sterilisation: 35 Minuten bei 115°C. Acidität zwischen pH 6,5 und 7,0.

Eine 500 ml-Steilbrustflasche, die 80 ml des Vorzucht-Mediums enthält, wird mit einer Mycelsuspension des L-Glutaminsäure-Oxidase-Bildners ZIMET 43772 beimpft, welche mit steriler, isotonischer Kochsalzlösung von einer im Reagenzglas auf dem beschriebenen Anzucht-Nährboden gezüchteten Kultur hergestellt wird.

Nach 2tägiger Vorzucht-Kultur bei 28°C auf einem Schütteltisch mit einer Schwingfrequenz von 180/Min. werden 50 ml einer Produktions-Kulturin 500ml-Steilbrustflaschen mit 8 ml der Vorzucht-Kultur beimpft. Als Produktions-Medium eignet sich ein flüssiges Nährmedium folgender Zusammensetzung:

Pepton 0,5 %

Fleischextrakt 0,3%

Hefeextrakt 0,1 %

Malzextrakt 0,5%

NaCI 0,25%

CaCO₃ 0,30%

K₂HPO₄ 0,1%

Leitungswasser ad 1000 ml.

Sterilisation: 20 Min. bei 120⁰C. Acidität bei pH 7,0. Die Fermentationsdauer beträgt 2-7 Tage bei 28°C auf einem Schütteltisch mit einer Schwingfrequenz von 180/Min., ehe die maximale L-Glutaminsäure-Oxidase-Aktivität erreicht wird.

2. Man geht wie im Beispiel 1 vor mit dem Unterschied, daß das Produktions-Medium folgende Zusammensetzung hat:

Weizenkleie 2,0%

Glucose 2,0%

CaCO₃ ' 0,3%

NaCI 0,5%

Leitungswasser ad 1 000 ml.

Sterilisation: 20min. bei 12O⁰C. AciditätpH 7,0.

3. Das Verfahren unterscheidet sich von demjenigen des Beispiels 1 dadurch, daß eine 1. Vorkultur, wie im Beispiel 1 beschrieben, angelegt wird, nachfolgend jedoch eine 2. Vorkultur durch Beimpfen von 400 ml des Vorzucht-Mediums in 21-Glasf laschen mit 10 ml Suspension aus der 1. Vorkultur für die Dauer von 24 Stunden gezüchtet wird.

400 ml der auf diese Weise erhaltenen 2. Vorkultur dienen zur Beimpfung von 201 des im Beispiel 1 beschriebenen Produktions-Mediums, das in einem 201-Glasfermenter enthalten ist. Während der Fermentation, die bei 28°C mit einer Rührgeschwindigkeit von 400 U/min, und einer Luftzufuhr von 15 l/min, ausgeführt wird, kann die Schaumbildung durch Zusatz kleiner Mengen von Antrafron oder silikonhaltiger Schaumschutzmittel kontrolliert werden. Die nach ca. 96stündiger Fermentationsdauer erhaltene Aktivität der L-Glutaminsäure-Oxidase entspricht einer spezifischen Aktivität von durchschnittlich 10mU/mg Protein im Überstand des Kulturfiltrates des Wildstammes.

Claims (2)

1. Erfindungsanspruch:

   1. Verfahren zur Herstellung einer L-glutaminsäurespezifischen, H₂O2-bildenden L-Glutaminsäure-Oxidase auf mikrobiologischem Wege, dadurch gekennzeichnet, daß man einen Mikroorganismus der Gattung Streptomyces unter aeroben Bedingungen in flüssigen Nährmedien, die eine Kohlenstoff- und eine Stickstoffquelle sowie Mineralsalze enthalten, bei einer Temperatur zwischen 25°C und 37°C während eines Zeitraumes von 2 bis 6 Tagen kultiviert und die gebildete neue extrazelluläre L-Glutaminsäure-Oxidase mit einem hohen Temperatur-Optimum aus dem konzentrierten Kulturfiltrat durch fraktionierte Fällung mit Ammoniumsulfat und anschließender Dialyse, Bindung an handelsübliche poröse Polystyrolaustauscherharze, bevorzugt Wofatit CA-20, Desorption mit Hilfe von Salzen anreichert und gegebenenfalls mittels weiterer chromatographischer Methoden isoliert und nachfolgend lyophilisiert.
2. 2. Verfahren nach Punkt 1, dadurch gekennzeichnet, daß man als Mikroorganismus Streptomyes endus, ZIMET 43772 einsetzt.