DD261932A3 - Verfahren zur Herstellung einer mikrobiellen (H tief 2 O tief 2 bildenden) L-Glutaminsäure-Oxidase - Google Patents
Verfahren zur Herstellung einer mikrobiellen (H tief 2 O tief 2 bildenden) L-Glutaminsäure-OxidaseInfo
- Publication number
- DD261932A3 DD261932A3 DD261932A3 DD 261932 A3 DD261932 A3 DD 261932A3 DD 261932 A3 DD261932 A3 DD 261932A3
- Authority
- DD
- German Democratic Republic
- Prior art keywords
- glutamic acid
- acid oxidase
- zimet
- deep
- forming
- Prior art date
Links
- WHUUTDBJXJRKMK-VKHMYHEASA-N L-Glutamic acid Natural products OC(=O)[C@@H](N)CCC(O)=O WHUUTDBJXJRKMK-VKHMYHEASA-N 0.000 title claims abstract description 58
- 229960002989 Glutamic Acid Drugs 0.000 title claims abstract description 47
- 108020005203 Oxidases Proteins 0.000 title claims abstract description 39
- 238000000034 method Methods 0.000 title claims abstract description 7
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 title claims abstract 3
- 230000000813 microbial Effects 0.000 title claims description 3
- 241001147855 Streptomyces cattleya Species 0.000 claims abstract description 13
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 claims abstract description 9
- 244000005700 microbiome Species 0.000 claims abstract description 9
- 238000007374 clinical diagnostic method Methods 0.000 claims abstract 2
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 claims description 15
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 claims description 15
- 241000187747 Streptomyces Species 0.000 claims description 7
- 150000001413 amino acids Chemical class 0.000 claims description 2
- 238000004886 process control Methods 0.000 claims 1
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 abstract description 11
- 238000000855 fermentation Methods 0.000 abstract description 10
- 230000004151 fermentation Effects 0.000 abstract description 10
- 150000003839 salts Chemical class 0.000 abstract description 7
- 229910052757 nitrogen Inorganic materials 0.000 abstract description 5
- 229910052799 carbon Inorganic materials 0.000 abstract description 4
- 229910052500 inorganic mineral Inorganic materials 0.000 abstract description 3
- 239000011707 mineral Substances 0.000 abstract description 3
- 238000004255 ion exchange chromatography Methods 0.000 abstract description 2
- 238000010965 in-process control Methods 0.000 abstract 1
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 17
- 229940088598 Enzyme Drugs 0.000 description 14
- 239000002609 media Substances 0.000 description 14
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 14
- 239000000758 substrate Substances 0.000 description 12
- IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N nitrogen Chemical compound N#N IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 8
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 7
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 6
- HNDVDQJCIGZPNO-YFKPBYRVSA-N L-histidine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC1=CN=CN1 HNDVDQJCIGZPNO-YFKPBYRVSA-N 0.000 description 5
- 239000007788 liquid Substances 0.000 description 5
- 235000015097 nutrients Nutrition 0.000 description 5
- 230000001954 sterilising Effects 0.000 description 5
- 238000004659 sterilization and disinfection Methods 0.000 description 5
- 229960002743 Glutamine Drugs 0.000 description 4
- ZDXPYRJPNDTMRX-VKHMYHEASA-N L-glutamine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CCC(N)=O ZDXPYRJPNDTMRX-VKHMYHEASA-N 0.000 description 4
- 238000000746 purification Methods 0.000 description 4
- 239000000126 substance Substances 0.000 description 4
- 239000008399 tap water Substances 0.000 description 4
- 235000020679 tap water Nutrition 0.000 description 4
- WQZGKKKJIJFFOK-VFUOTHLCSA-N β-D-glucose Chemical compound OC[C@H]1O[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-VFUOTHLCSA-N 0.000 description 4
- 229920001817 Agar Polymers 0.000 description 3
- WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N D-Glucose Natural products OC[C@H]1OC(O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N 0.000 description 3
- 229960002885 Histidine Drugs 0.000 description 3
- 102000007070 L-Amino Acid Oxidase Human genes 0.000 description 3
- 108010008292 L-Amino Acid Oxidase Proteins 0.000 description 3
- COLNVLDHVKWLRT-QMMMGPOBSA-N L-phenylalanine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC1=CC=CC=C1 COLNVLDHVKWLRT-QMMMGPOBSA-N 0.000 description 3
- 235000019764 Soybean Meal Nutrition 0.000 description 3
- 238000007792 addition Methods 0.000 description 3
- 239000008272 agar Substances 0.000 description 3
- OKTJSMMVPCPJKN-UHFFFAOYSA-N carbon Chemical compound [C] OKTJSMMVPCPJKN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 239000011521 glass Substances 0.000 description 3
- 239000008103 glucose Substances 0.000 description 3
- PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N glycerine Chemical compound OCC(O)CO PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 150000002500 ions Chemical class 0.000 description 3
- 229910052751 metal Inorganic materials 0.000 description 3
- 239000002184 metal Substances 0.000 description 3
- 239000008363 phosphate buffer Substances 0.000 description 3
- 239000004455 soybean meal Substances 0.000 description 3
- GHCZTIFQWKKGSB-UHFFFAOYSA-N 2-hydroxypropane-1,2,3-tricarboxylic acid;phosphoric acid Chemical compound OP(O)(O)=O.OC(=O)CC(O)(C(O)=O)CC(O)=O GHCZTIFQWKKGSB-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 229960001230 Asparagine Drugs 0.000 description 2
- 210000000481 Breast Anatomy 0.000 description 2
- 229940041514 Candida albicans extract Drugs 0.000 description 2
- 150000008574 D-amino acids Chemical class 0.000 description 2
- 150000008575 L-amino acids Chemical class 0.000 description 2
- ODKSFYDXXFIFQN-BYPYZUCNSA-N L-arginine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CCCN=C(N)N ODKSFYDXXFIFQN-BYPYZUCNSA-N 0.000 description 2
- DCXYFEDJOCDNAF-REOHCLBHSA-N L-asparagine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC(N)=O DCXYFEDJOCDNAF-REOHCLBHSA-N 0.000 description 2
- XUJNEKJLAYXESH-REOHCLBHSA-N L-cysteine Chemical compound SC[C@H](N)C(O)=O XUJNEKJLAYXESH-REOHCLBHSA-N 0.000 description 2
- ROHFNLRQFUQHCH-YFKPBYRVSA-N L-leucine Chemical compound CC(C)C[C@H](N)C(O)=O ROHFNLRQFUQHCH-YFKPBYRVSA-N 0.000 description 2
- KDXKERNSBIXSRK-YFKPBYRVSA-N L-lysine Chemical compound NCCCC[C@H](N)C(O)=O KDXKERNSBIXSRK-YFKPBYRVSA-N 0.000 description 2
- FFEARJCKVFRZRR-BYPYZUCNSA-N L-methionine Chemical compound CSCC[C@H](N)C(O)=O FFEARJCKVFRZRR-BYPYZUCNSA-N 0.000 description 2
- AYFVYJQAPQTCCC-GBXIJSLDSA-N L-threonine Chemical compound C[C@@H](O)[C@H](N)C(O)=O AYFVYJQAPQTCCC-GBXIJSLDSA-N 0.000 description 2
- QIVBCDIJIAJPQS-VIFPVBQESA-N L-tryptophane Chemical compound C1=CC=C2C(C[C@H](N)C(O)=O)=CNC2=C1 QIVBCDIJIAJPQS-VIFPVBQESA-N 0.000 description 2
- KZSNJWFQEVHDMF-BYPYZUCNSA-N L-valine Chemical compound CC(C)[C@H](N)C(O)=O KZSNJWFQEVHDMF-BYPYZUCNSA-N 0.000 description 2
- 229940045184 Malt extract Drugs 0.000 description 2
- 229960005190 Phenylalanine Drugs 0.000 description 2
- LWIHDJKSTIGBAC-UHFFFAOYSA-K Tripotassium phosphate Chemical class [K+].[K+].[K+].[O-]P([O-])([O-])=O LWIHDJKSTIGBAC-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 2
- 230000027455 binding Effects 0.000 description 2
- 230000003115 biocidal Effects 0.000 description 2
- 230000001488 breeding Effects 0.000 description 2
- 239000007853 buffer solution Substances 0.000 description 2
- VTYYLEPIZMXCLO-UHFFFAOYSA-L calcium carbonate Chemical compound [Ca+2].[O-]C([O-])=O VTYYLEPIZMXCLO-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 2
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 2
- 230000000875 corresponding Effects 0.000 description 2
- 230000001809 detectable Effects 0.000 description 2
- 238000010828 elution Methods 0.000 description 2
- 239000000706 filtrate Substances 0.000 description 2
- 238000005259 measurement Methods 0.000 description 2
- 239000012528 membrane Substances 0.000 description 2
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 2
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 description 2
- 238000000926 separation method Methods 0.000 description 2
- 239000003998 snake venom Substances 0.000 description 2
- 238000002798 spectrophotometry method Methods 0.000 description 2
- 239000007858 starting material Substances 0.000 description 2
- 239000000725 suspension Substances 0.000 description 2
- 235000015099 wheat brans Nutrition 0.000 description 2
- 239000012138 yeast extract Substances 0.000 description 2
- YFZOUMNUDGGHIW-UHFFFAOYSA-M 4-Chloromercuribenzoic acid Chemical compound OC(=O)C1=CC=C([Hg]Cl)C=C1 YFZOUMNUDGGHIW-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 229960003767 Alanine Drugs 0.000 description 1
- BFNBIHQBYMNNAN-UHFFFAOYSA-N Ammonium sulfate Chemical compound N.N.OS(O)(=O)=O BFNBIHQBYMNNAN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229940064005 Antibiotic throat preparations Drugs 0.000 description 1
- 229940083879 Antibiotics FOR TREATMENT OF HEMORRHOIDS AND ANAL FISSURES FOR TOPICAL USE Drugs 0.000 description 1
- 229940042052 Antibiotics for systemic use Drugs 0.000 description 1
- 229940042786 Antitubercular Antibiotics Drugs 0.000 description 1
- 229960005261 Aspartic Acid Drugs 0.000 description 1
- 241000122818 Aspergillus ustus Species 0.000 description 1
- 241000589149 Azotobacter vinelandii Species 0.000 description 1
- 229960003563 Calcium Carbonate Drugs 0.000 description 1
- 241001517197 Cattleya Species 0.000 description 1
- OXBLHERUFWYNTN-UHFFFAOYSA-M Copper(I) chloride Chemical compound [Cu]Cl OXBLHERUFWYNTN-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 229960002433 Cysteine Drugs 0.000 description 1
- 229940093922 Gynecological Antibiotics Drugs 0.000 description 1
- 229960000310 ISOLEUCINE Drugs 0.000 description 1
- 241001527806 Iti Species 0.000 description 1
- 210000003734 Kidney Anatomy 0.000 description 1
- QNAYBMKLOCPYGJ-UWTATZPHSA-N L-Alanine Natural products C[C@@H](N)C(O)=O QNAYBMKLOCPYGJ-UWTATZPHSA-N 0.000 description 1
- DCXYFEDJOCDNAF-UWTATZPHSA-N L-Asparagine Natural products OC(=O)[C@H](N)CC(N)=O DCXYFEDJOCDNAF-UWTATZPHSA-N 0.000 description 1
- CKLJMWTZIZZHCS-UWTATZPHSA-N L-Aspartic acid Natural products OC(=O)[C@H](N)CC(O)=O CKLJMWTZIZZHCS-UWTATZPHSA-N 0.000 description 1
- 235000019766 L-Lysine Nutrition 0.000 description 1
- QNAYBMKLOCPYGJ-REOHCLBHSA-N L-alanine Chemical compound C[C@H](N)C(O)=O QNAYBMKLOCPYGJ-REOHCLBHSA-N 0.000 description 1
- 235000014852 L-arginine Nutrition 0.000 description 1
- CKLJMWTZIZZHCS-REOHCLBHSA-N L-aspartic acid Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC(O)=O CKLJMWTZIZZHCS-REOHCLBHSA-N 0.000 description 1
- 239000004201 L-cysteine Substances 0.000 description 1
- 235000013878 L-cysteine Nutrition 0.000 description 1
- AGPKZVBTJJNPAG-WHFBIAKZSA-N L-isoleucine Chemical compound CC[C@H](C)[C@H](N)C(O)=O AGPKZVBTJJNPAG-WHFBIAKZSA-N 0.000 description 1
- 239000004395 L-leucine Substances 0.000 description 1
- 235000019454 L-leucine Nutrition 0.000 description 1
- ONIBWKKTOPOVIA-BYPYZUCNSA-N L-proline Chemical compound OC(=O)[C@@H]1CCCN1 ONIBWKKTOPOVIA-BYPYZUCNSA-N 0.000 description 1
- OUYCCCASQSFEME-QMMMGPOBSA-N L-tyrosine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC1=CC=C(O)C=C1 OUYCCCASQSFEME-QMMMGPOBSA-N 0.000 description 1
- GUBGYTABKSRVRQ-UUNJERMWSA-N Lactose Natural products O([C@@H]1[C@H](O)[C@H](O)[C@H](O)O[C@@H]1CO)[C@H]1[C@@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@H](CO)O1 GUBGYTABKSRVRQ-UUNJERMWSA-N 0.000 description 1
- 239000004472 Lysine Substances 0.000 description 1
- 230000035633 Metabolized Effects 0.000 description 1
- 229960004452 Methionine Drugs 0.000 description 1
- TWRXJAOTZQYOKJ-UHFFFAOYSA-L MgCl2 Chemical compound [Mg+2].[Cl-].[Cl-] TWRXJAOTZQYOKJ-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
- 239000001888 Peptone Substances 0.000 description 1
- 229940066779 Peptones Drugs 0.000 description 1
- 108010080698 Peptones Proteins 0.000 description 1
- 229960002429 Proline Drugs 0.000 description 1
- 241000700159 Rattus Species 0.000 description 1
- 240000004808 Saccharomyces cerevisiae Species 0.000 description 1
- 229920005654 Sephadex Polymers 0.000 description 1
- 229920002684 Sepharose Polymers 0.000 description 1
- 240000003453 Spinacia oleracea Species 0.000 description 1
- 235000009337 Spinacia oleracea Nutrition 0.000 description 1
- 229920002472 Starch Polymers 0.000 description 1
- 229910000831 Steel Inorganic materials 0.000 description 1
- 241000969734 Streptomyces hygroscopicus subsp. hygroscopicus Species 0.000 description 1
- 241000946749 Streptomyces violascens Species 0.000 description 1
- 239000004473 Threonine Substances 0.000 description 1
- 229940024982 Topical Antifungal Antibiotics Drugs 0.000 description 1
- 229960004799 Tryptophan Drugs 0.000 description 1
- 240000008042 Zea mays Species 0.000 description 1
- 235000002017 Zea mays subsp mays Nutrition 0.000 description 1
- 239000008351 acetate buffer Substances 0.000 description 1
- 238000001042 affinity chromatography Methods 0.000 description 1
- 101710026821 agnogene Proteins 0.000 description 1
- 235000001014 amino acid Nutrition 0.000 description 1
- QGZKDVFQNNGYKY-UHFFFAOYSA-O ammonium Chemical compound [NH4+] QGZKDVFQNNGYKY-UHFFFAOYSA-O 0.000 description 1
- 229910052921 ammonium sulfate Inorganic materials 0.000 description 1
- 235000011130 ammonium sulphate Nutrition 0.000 description 1
- 238000004082 amperometric method Methods 0.000 description 1
- 239000003242 anti bacterial agent Substances 0.000 description 1
- 239000002518 antifoaming agent Substances 0.000 description 1
- 235000009582 asparagine Nutrition 0.000 description 1
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 1
- UIIMBOGNXHQVGW-UHFFFAOYSA-M buffer Substances [Na+].OC([O-])=O UIIMBOGNXHQVGW-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- UXVMQQNJUSDDNG-UHFFFAOYSA-L cacl2 Chemical compound [Cl-].[Cl-].[Ca+2] UXVMQQNJUSDDNG-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
- 229910000019 calcium carbonate Inorganic materials 0.000 description 1
- 230000024881 catalytic activity Effects 0.000 description 1
- 238000005277 cation exchange chromatography Methods 0.000 description 1
- 229920002678 cellulose Polymers 0.000 description 1
- 235000010980 cellulose Nutrition 0.000 description 1
- RCTYPNKXASFOBE-UHFFFAOYSA-M chloromercury Chemical compound [Hg]Cl RCTYPNKXASFOBE-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 238000007796 conventional method Methods 0.000 description 1
- 235000005822 corn Nutrition 0.000 description 1
- 235000005824 corn Nutrition 0.000 description 1
- 239000008121 dextrose Substances 0.000 description 1
- 229940079919 digestives Enzyme preparations Drugs 0.000 description 1
- 239000003623 enhancer Substances 0.000 description 1
- 230000002708 enhancing Effects 0.000 description 1
- 239000000284 extract Substances 0.000 description 1
- 230000002349 favourable Effects 0.000 description 1
- 235000019162 flavin adenine dinucleotide Nutrition 0.000 description 1
- FVTCRASFADXXNN-SCRDCRAPSA-N flavin mononucleotide Chemical compound OP(=O)(O)OC[C@@H](O)[C@@H](O)[C@@H](O)CN1C=2C=C(C)C(C)=CC=2N=C2C1=NC(=O)NC2=O FVTCRASFADXXNN-SCRDCRAPSA-N 0.000 description 1
- 235000013312 flour Nutrition 0.000 description 1
- 238000005187 foaming Methods 0.000 description 1
- 238000005755 formation reaction Methods 0.000 description 1
- 238000004108 freeze drying Methods 0.000 description 1
- 239000000499 gel Substances 0.000 description 1
- 235000004554 glutamine Nutrition 0.000 description 1
- DHMQDGOQFOQNFH-UHFFFAOYSA-N glycine Chemical compound NCC(O)=O DHMQDGOQFOQNFH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000001963 growth media Substances 0.000 description 1
- 239000005457 ice water Substances 0.000 description 1
- 238000011081 inoculation Methods 0.000 description 1
- 239000002054 inoculum Substances 0.000 description 1
- 229940079866 intestinal antibiotics Drugs 0.000 description 1
- 239000008101 lactose Substances 0.000 description 1
- GUBGYTABKSRVRQ-XLOQQCSPSA-N lactose Chemical compound O[C@@H]1[C@@H](O)[C@@H](O)[C@@H](CO)O[C@H]1O[C@@H]1[C@@H](CO)O[C@H](O)[C@H](O)[C@H]1O GUBGYTABKSRVRQ-XLOQQCSPSA-N 0.000 description 1
- 229960003136 leucine Drugs 0.000 description 1
- 239000003446 ligand Substances 0.000 description 1
- 230000004807 localization Effects 0.000 description 1
- 229960003646 lysine Drugs 0.000 description 1
- 239000011159 matrix material Substances 0.000 description 1
- 235000013372 meat Nutrition 0.000 description 1
- 230000002906 microbiologic Effects 0.000 description 1
- 230000001264 neutralization Effects 0.000 description 1
- QJGQUHMNIGDVPM-UHFFFAOYSA-N nitrogen group Chemical group [N] QJGQUHMNIGDVPM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229940005935 ophthalmologic Antibiotics Drugs 0.000 description 1
- 239000003960 organic solvent Substances 0.000 description 1
- 230000003647 oxidation Effects 0.000 description 1
- 238000007254 oxidation reaction Methods 0.000 description 1
- 230000001590 oxidative Effects 0.000 description 1
- 150000002926 oxygen Chemical class 0.000 description 1
- 239000001301 oxygen Substances 0.000 description 1
- MYMOFIZGZYHOMD-UHFFFAOYSA-N oxygen Chemical compound O=O MYMOFIZGZYHOMD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229910052760 oxygen Inorganic materials 0.000 description 1
- 235000019319 peptone Nutrition 0.000 description 1
- 229920001296 polysiloxane Polymers 0.000 description 1
- 239000011148 porous material Substances 0.000 description 1
- 235000011009 potassium phosphates Nutrition 0.000 description 1
- 239000002244 precipitate Substances 0.000 description 1
- 238000001556 precipitation Methods 0.000 description 1
- 235000018102 proteins Nutrition 0.000 description 1
- 238000011084 recovery Methods 0.000 description 1
- 235000019231 riboflavin-5'-phosphate Nutrition 0.000 description 1
- 239000007787 solid Substances 0.000 description 1
- 235000012424 soybean oil Nutrition 0.000 description 1
- 239000003549 soybean oil Substances 0.000 description 1
- 241000894007 species Species 0.000 description 1
- 239000012086 standard solution Substances 0.000 description 1
- 239000008107 starch Substances 0.000 description 1
- 235000019698 starch Nutrition 0.000 description 1
- 239000010959 steel Substances 0.000 description 1
- 238000003756 stirring Methods 0.000 description 1
- 230000002194 synthesizing Effects 0.000 description 1
- 229960002898 threonine Drugs 0.000 description 1
- 210000001519 tissues Anatomy 0.000 description 1
- 238000000108 ultra-filtration Methods 0.000 description 1
- 229960004295 valine Drugs 0.000 description 1
Abstract
Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Herstellung einer L-Glutaminsaeure-Oxidase, die potentiell in der klinischen Diagnostik sowie in der technisch-mikrobiologischen Industrie und Nahrungsgueterwirtschaft von Nutzen ist. Insbesondere betrifft die Erfindung ein Verfahren zur Herstellung einer neuen extrazellulaeren L-Glutaminsaeure-Oxidase unter Verwendung eines Mikroorganismus Streptomyces cattleya, ZIMET 43785, der bisher nicht fuer die Herstellung von L-Glutaminsaeure-Oxidase herangezogen wurde. Ziel der Erfindung ist die Gewinnung einer neuen L-Glutaminsaeure-Oxidase mit hohem Temperatur-Optimum, deren Anwendung bei der Prozesskontrolle in der Fermentationsindustrie von besonderem potentiellen Nutzen ist. Die Aufgabe wird dadurch geloest, dass durch aerobe Submersfermentation des Mikroorganismus Streptomyces cattleya, ZIMET 43785 in Medien mit geeigneten C-, N-Quellen und Mineralsalzen eine extrazellulaere L-Glutaminsaeure-Oxidase (H2O2 bildend) gebildet, durch fraktionierte Ammoniumsulfatfaellung angereichert und mit Hilfe der Ionenaustauschchromatografie gereinigt wird.
Description
L-Aminosäure-Oxidasen unterschiedlichster Herkunft werden beschrieben, die aus Schlangengift, Rattennieren, Spinatblättern isoliert oder mikrobieller Herkunft sind, wobei die L-Aminosäure-Oxidasen aus Schlangengift und tierischem Gewebe die L-Aminosäuren unspezifisch oxidieren.
Eine L-Glutaminsäure-Oxidase, die auch die Oxidation von verschiedenen D-Aminosäuren katalysiert, ist aus Membranfragmenten von Azotobacter vinelandii von Jurtshuk, P. und McManus, L. 1974(Biochem. Biophys. Acta, 368,158) isoliert worden.
Weiterhin ist bekannt, daß D-Aminosäuren von Aerobacter oder Aspergillus ustus metabolisiert werden. Verschiedene Vertreter der Gattung Streptomyces können unter geeigneten Fermentationsbedingungen L-Glutaminsäure-Oxidase produzieren, die sich in ihren Grundeigenschaften und in der Lokalisation (intra- oder/und extrazellulär) unterscheiden.
Von A. Matsuzaki et al. (Japanese Published Unexamined Patent Application, KokaiTokkyo Koho, 57-43685,1982), (Chem.
Pharm. Bull. 31 [4] 1307-1314,1983 und Chem. Pharm. Bull. 31 [10] 3609-3616,1983) ist eine extrazelluläre L-Aminosäure-Oxidase beschrieben, die aus Kulturlösungen von Streptomyces violascens H82-N-SY7 isoliert wurde und die im Vergleich mit anderen L-Aminosäuren bevorzugt L-Glutaminsäure oxidiert.
Hitoshi Kusakabe et al. 1983 (Agric. Biol. Chem., 47 [1], 179-182 und Agric. Biol. Chem., 47 [6], 1323-1328,1983 und Agric. Biol.
Chem., 48 [1], 181-184,1984) isolierte eine L-Glutaminsäure-Oxidase aus Streptomyces spec. X-119-6, die intra- und extrazellulär nachweisbar und durch eine hohe Temperaturstabilität gekennzeichnet ist und neben L-Glutaminsäure auch L-Glutamin und L-Histidin oxidiert.
Darüber hinaus ist bekannt, daß die Mikroorganismen Streptomyces spec. A7700 FERM P-6241 und Streptomyces spec. A8063 FERM P-6242 eine L-Glutaminsäure-spezifische Oxidasezu synthetisieren vermögen, die intrazellulär nachweisbar sind (Toyo Jozo K. K. et al. DE 3307607 A1).
Von M. Passarge et al. ist eine extrazelluläre H2O2-bildende L-Glutaminsäure-Oxidase mit einem Temperatur-Optimum zwischen 40°Cund48°C, einer hohen Substratspezifität und einer Aktivität von nur 10mU/mg Protein aus Streptomyces endus beschrieben worden.
Die bisher bekannten L-Glutaminsäure-Oxidase-Bildner zeichnen sich dadurch aus, daß sie entweder ein niedriges Temperaturoptimum oder eine geringe Bildungsleistung für das Enzym aufweisen.
Die Erfindung hat das Ziel, ein Verfahren zur Herstellung einer neuen extrazellulären H2O2-bildenden L-Glutaminsäure-Oxidase mit einem Temperaturoptimum oberhalb von 480C und mit überraschend hohen Ausbeuten auf mikrobiologischem Wege zu entwickeln, um die Palette derartiger Enzympräparate zu erweitern unter Verwendung von billigen Einsatzstoffen und einer bis dahin nicht als L-Glutaminsäure-Oxidase-Bildner' ekannten Mikroorganismenart.
Der Erfindung liegt die Aufgabe zugrunde, ein Verfahren zu entwickeln, das es gestattet, aus leicht zugänglichen und billigen Einsatzstoffen eine extrazelluläre L-Glutaminsäure-Oxidase herzustellen.
Erfindungsgemäß wird die Aufgabe dadurch gelöst, daß unter aeroben und sterilen Kulturbedingungen in einem flüssigen Nährmedium mit Kohlenstoff- sowie Stickstoffquellen und Mineralsalzen ein zur Gattung Streptomyces gehörender Mikroorganismus oder seine Varianten und Mutanten gezüchtet werden.
Der erfindungsgemäße Mikroorganismus wurde unter der Registriernummer ZIMET 43785 in der ZIMET-Hinterlegungsstelle für Mikroorganismen hinterlegt. Er ist der Stammsammlung der Abteilung Antibiotika-Mikrobiologie des ZIMET entnommen ' worden und wird auf Grund seiner Artmerkmale der Art Streptomyces cattleya zugeordnet (J. of Antibiotics, 1979, Vol.XXXII NoL, 1-12 ).
Zur Herstellung der L-Glutaminsäure-Oxidase wird der Stamm ZIMET 43785 sowie seine Mutanten und Varianten unter aeroben Bedingungen kultiviert.
An Heilerde lyophil getrocknetes bzw. in flüssigem Stickstoff aufbewahrtes Mycel des Stammes wird auf geeignete Agamährböden und nachfolgend in flüssige, vorher sterilisierte Nährmedien geimpft. Das entsprechende Mycel wird in bekannter Weise bei einer Temperatur zwischen 25°C und 37 °C, vorzugsweise bei 28°C, über einen Zeitraum von 2 bis 6 Tagen, vorzugsweise 4 Tagen, bei einer Acidität kultiviert, die zu Beginn des Fermentationsprozesses zwischen pH 6,5 und 7,5 und am Ende des Prozesses zwischen pH 5,0 und 5,5 liegt. Das Nährmedium besteht aus Kohlenstoff- und Stickstoffquellen sowie aus anorganischen Salzen. Als Kohlenstoffquellen werden Glucose, Glyzerol, Lactose, Sojaöl und Sojamehle verwendet. Als Stickstoffquellen eignen sich außer den oben erwähnten stickstoffhaltigen Substraten Fleischextrakte, Maisquellwasser, Aminosäuregemische, Malzextrakt, Rohglutamin, Peptone, Weizenkleie und Trockenhefe.
Gute Fermentationsergebnisse werden bei Zusatz von Mineralsalzen erzielt. In komplexen Medien, die verschiedene Mehle enthalten, haben sich Zusätze von Kaliumphosphaten und Calciumcarbonat als vorteilhaft erwiesen. Die Fermentation des L-Glutaminsäure-Oxidase-Bildners, ZIMET 43785, wird in Steilbrustflaschen verschiedenen Inhalts, in Glasfermenter sowie in V2A-Stahltanks durchgeführt. Die Bestimmung der L-Glutaminsäure-Oxidase-Aktivität der nativen Kulturlösung des Stammes ZIMET 43785, Streptomycescattleya, und die daraus gewonnene Rohenzymlösung erfolgt mit einer von Emerson, E. J., 1943 (Org. Chem. 8, 417-428) und Trinder, J., 1969 (Clin. Chem. Biochem. 6, 24-27) beschriebenen spektrophotometrischen Methode bzw. mit Hilfe eines amperometrischen Sensors (modifizierte Sauerstoffelektrode nach Clark) bei +600mVvs S. C. P., indem die Konzentration des gebildeten H2O2 bestimmt wird. Dazu wird eine modifizierte Sauerstoffelektrode mit einer H2O2-Standardlösung geeicht. Die Messung erfolgt iTi einer thermostatierten Meßzelle in kontinuierlich gerührter geeigneter Pufferlösung (z.B. 2,0ml Citrat-Phosphat-Puffer nach Mcllvain). Nach Vorlage von 0,2ml Enzymlösung wird die Reaktion durch Zugabe von 0,2 ml Substratlösung gestartet. Die gemessene Strom-Zeit-Kurve gibt Auskunft über die gebildete H2O2-Menge in der Meßlösung.
Die Gewinnung der L-Glutaminsäure-Oxidase wird in der Weise durchgeführt, daß nach Abtrennen des Mycels aus der Fermentationslösung mittels Separator (u. a. Verfahren) 201 Kulturfiltrat durch Ultrafiltration über geeignete Membranfilter auf ein gewünschtes Volumen konzentriert werden.
Zur weiteren Reinigung der L-Glutaminsäure-Oxidase schließen sich übliche Verfahren der Proteintrennung und Enzymreinigung an.
Zunächst erfolgt eine deutliche Konzentrierung der Aktivität durch Fällung mit Neutralsalzen (z.B. Ammoniumsulfat) oder mit geeigneten organischen Lösungsmitteln. Auf diese Weise erhält man ein aktives und für Enzymelektroden einsatzfähiges Rohenzympräparat. Mittels anschließender üblicher chromatografischer Methoden ist eine Weiterreinigung möglich. Zu bevorzugen ist zunächst eine lonenaustauschchromatografie im Säulenverfahren an geeigneten Trägern (z. B. Wofatit CA20, CM- oder DEAE-Cellulosen). Die Elution kann entweder bei einer günstigen Salzkonzentration, einem geeigneten pH (Salzgradient, pH-Gradient) oder spezifischer durch Affinitätselution (im Falle der Kationenaustauschchromatografie durch Zugabe des Substrates L-Glutamat im geeigneten Puffer) erfolgen. Danach können auch gelchromatografische Methoden den an verschiedenen Matrizes (z. B. Dextrangelen) unterschiedlicher Porengröße und Trennbereiche zur Anwendung kommen. Als spezifisches Reinigungsverfahren bietet sich eine Affinitätschromatografie der L-Glutaminsäure-Oxidase durch Bindung an den Substratliganden (L-Glutaminsäure), der an eine entsprechende Matrix z. B. Percellulose oder Sepharose (kovalent) gebunden ist, angereinigte, pulverförmige L-Glutaminsäure-Oxidase kann durch eine geeignete Kombination der oben angeführten Methoden und Lyophilisation der vereinigten, aktiven Enzymfraktionen hergestellt werden. Das Rohenzym (ammoniumsulfatgefälltesPräzipitat), gewonnen aus dem Kulturfiltrat von Streptomycescattleya ZIMET 43785, zeichnet sich durch nachfolgende Eigenschaften aus: pH-Optimum
Für die Ermittlung des pH-Optimums der Enzymlösung wurde Citrat-Phosphat-Puffer nach McILVAIN eingesetzt. Das pH-Optimum liegt bei 5,5 bei einer Reaktionstemperatur von 370C (Abb. 1)
Temperatur-Optimum
Das Temperatur-Optimum der neuen L-Glutaminsäure-Oxidase liegt zwischen 400C und 50°C (vorzugsweise bei 48°C), wenn bei pH 5,5 als Substrat L-Glutaminsäure verwendet wurde (Abb. 2)
Thermostabilität
Die Thermostabilität der L-Glutaminsäure-Oxidase des Bildners Streptomyces cattleya, ZIMET 43785 wurde bei Temperaturen von 40°C bis 6O0C bei pH 5,5 untersucht. Die Enzymlösung wird bei der entsprechenden Temperatur 15 Minuten inkubiert und in Eiswasser schnell abgekühlt. Die spektrophotometrische Bestimmung der Restaktivität (in %) erfolgt nach o.g. Methode. Die Ergebnisse sind in Abb.3 dargestellt. Die L-Glutaminsäure-Oxidase ist bis 500C stabil. Bei einer 15minütigen Vorinkubation der Enzymlösung bei 500C beträgt die verbleibende Aktivität 91 %
pH-Stabilität
Die pH-Stabilität der neuen L-Glutaminsäure-Oxidase aus Streptomyces cattleya, ZIMET 43785 liegt zwischen pH 4,0 und 8,5. Sie wurde ermittelt, indem die Rohenzymlösung in zwei verschiedenen Pufferlösungen (m/15 Phosphatpuffer nach Sörensen und 0,5 M Na-Acetat-Puffer) bei pH 3,6-8,5 und einer Temperatur von 37°C für die Dauer von 1 Stunde vorinkubiert wurde. Die bei dem jeweiligen pH-Wert verbleibende Restaktivitäten (in %) werden bei einer Temperaturvon 370C und pH 5,5 "spektrophotometrisch ermittelt und sind in Abb.4 dargestellt
Substratspezifität .
Die L-Glutaminsäure-Oxidase aus Streptomyces cattleya, ZIMET 43785 wurde in seiner Wirksamkeit an verschiedenen Substraten im Vergleich mit L-Glutaminsäure untersucht. Die Ergebnisse sind in Tabelle 1 dargestellt. Die Rohenzymlösung kann durch folgendes Substratprofil charakterisiert werden: Die L-Glutaminsäure-Oxidase aus Streptomyces cattleya, ZIMET 43785 weist die höchste Aktivität gegenüber L-Glutaminsäure und geringe Aktivität gegenüber Histidin, Asparagin, Phenylalanin und Glutamin auf
Km-Wert
Für die L-Glutaminsäure-Oxidase aus Streptomyces cattleya, ZIMET 43785 wurde amperometrisch ein Km-Wert von 2,2 x 10"3M für L-Glutaminsäure ermittelt.
Die Wirkung von Metallionen und anderen Substanzen auf die Enzymaktivität wurde untersucht, indem die Rohenzymlösung mit den in Tabelle 2 aufgeführten Substanzen 15 Minuten vorinkubiert wurde. Anschließend erfolgte die Bestimmung der verbleibenden Aktivität (%) mit der beschriebenen amperometrischen Bestimmungsmethode bei einer Temperatur von 370C und einem pH-Wert von 5,5. Die L-Glutaminsäure-Oxidase aus Streptomyces cattleya wird in ihrer Wirkung VOnAgNO3 hemmend beeinflußt
Das erfindungsgemäße Verfahren wird nachfolgend an Ausführungsbeispielen erläutert.
1. Das Impfmaterial für die Beimpfung einer Vorzuchtkultur wird auf einem festen Agarmedium folgender Zusammensetzung für die Dauer von 10-14 Tagen angezüchtet:
Hefeextrakt 2,0 g
Malzextrakt 5,0 g
Dextrose 2,0 g
Agar 20,0 g
Aquadest. ad 1000 ml
Sterilisation: 35 Minuten bei 1200C. AciditätpH 6,8-7,0. Als Vorzucht-Medium eignet sich ein flüssiges Nährmedium folgender Zusammensetzung:
Glucose 1,5%
Sojamehl 1,5%
CaCO3 0,1%
NaCI 0,5%
Leitungswasser ad 1 000 ml Sterilisation: 35 Minuten bei 1150C. Acidität zwischen pH 6,5 und 7,0.
Eine 500-ml-Steilbrustflasche, die 80 ml des Vorzuchtmediums enthält, wird mit einer Mycelsuspension des L-Glutaminsäure-Oxidase-Bildners ZIMET 43785 beimpft, welche mit steriler physiologischer Kochsalzlösung von einer im Reagenzglas auf dem beschriebenen Anzuchtnährboden gezüchteten Kultur hergestellt wird. Nach 2tägiger Vorzuchtkultur bei 280C auf einem Schütteltisch mit einer Schwingfrequenz von 180 U/min werden 80 ml einer Produktionskulturin 500-ml-Steilbrustflaschen mit 8 ml der Vorzuchtkultur beimpft. Als Produktionsmedium eignet sich einflüssiges Nährmedium folgender Zusammensetzung:
lösliche Stärke 1,5%
Glucose 1,0%
Sojabohnenmehl 1,5%
Hefeextrakt 0,5 %
NaCI 0,25%
CaCO3 0,3%
K2HPO4 0,1 %
Leitungswasser ad 1000 ml Sterilisation: 20 Minuten bei 120°C, AciditätpH 7,6. Leitungswasser ad 1000 ml.
Sterilisation: 20 Minuten bei 1200C. Acidität bei pH 6,5.
Die Fermentationsdauer beträgt 2—6 Tage bei 280C auf einem Schütteltisch mit einer Schwingfrequenz von 180 U/min, ehe die maximale L-Glutaminsäure-Oxidase-Aktivität erreicht wird.
2. Man geht wie im Beispiel 1 vor mit dem Unterschied, daß das Produktions-Medium folgende Zusammensetzung hat:
Weizenkleie 3,0%
NaNO3 1,0%
NaCI 0,5%
Leitungswasser ad 1 000 ml. Sterilisation: 20 Minuten bei 12O0C. AciditätpH 6,5.
3. Das Verfahren unterscheidet sich von demjenigen des Beispiels 1 dadurch, daß eine 1. Vorkultur, wie im Beispiel 1 beschrieben, angelegt wird, nachfolgend jedoch eine 2. Vorkultur durch Beimpfen von 400 ml des Vorzucht-Mediums in 2-l-Glasflaschen mit 10 ml Suspension aus der 1. Vorkultur für die Dauer von 24 Stunden gezüchtet wird. 400 ml derauf diese Weise erhaltenen 2. Vorkultur dienen zur Beimpfung von 2Ol des im Beispiel 1 beschriebenen Produktions-Mediums, das in einem 20-l-Glasfermenter enthalten ist. Während der Fermentation, die bei 28°C mit einer Rührgeschwindigkeit von 400 U/ min und einer Luftzufuhr von 15 l/min ausgeführt wird, kann die Schaumbildung durch Zusatz kleiner Mengen von Antrafron oder silikonhaltiger Schaumschutzmittel kontrolliert werden. Die nach ca. 96stündiger Fermentationsdauer erhaltene Aktivität der L-Glutaminsäure-Oxidase entspricht einer 20fach höheren spezifischen Aktivität der L-Glutaminsäure-Oxidase im Vergleich zu dem bereits bekannten Enzym mit hohem Temperaturoptimum.
Tabelle 1 Substratspezifität der L-Glutaminsäure-Oxidase aus Streptomyces cattleya, ZIMET 43785 Substrat Relative Aktivität
(35 μιηοΙ Substrat/ml) (%)
L-Glutaminsäure 100
L-Phenylalanin 2,5
L-Ty rosin 0
L-Isoleucin 0
L-Valin 0
L-Tryptophan 0
L-Glutamin 0,9
L-Asparaginsäure 0
L-Asparagin 3,2
L-Lysin 0
L-Glycin 0
L-Arginin 0
L-Histidin 23,9
L-Alanin 0
L-Prolin 0
L-Se ri η 0
L-Cystein 0
L-Methionin 0
L-Leucin 0
L-Threonin 0
Tabelle 2: Einfluß von Metallionen und anderen Substanzen auf die Aktivität der L-Glutaminsäure-Oxidase aus Streptomyces
cattleya, ZIMET 43785 Zusatz Konzentration Relative Aktivität (%)
100
96
93
96
95
96 100
96
96
80
62
95
98
97
97
95
95
| Kontrolle | — |
| EDTA | 1OmM |
| KCN | 1OmM |
| NaN3 | 1OmM |
| ZnCI2 | 1mM |
| MgCI2 x 6 H2O | 1mM |
| CaCI2 | 1 mM |
| FeCI3 x 6 H2O | 1mM |
| CuCI2 | 1mM |
| HgCl2 | 1mM |
| AgNO3 | 1mM |
| BaCI2 | 1 mM |
| MnCI2 | 1mM |
| FAD | 0,01 mM |
| FMN | 0,01 mM |
| PCMB | 0,002 % |
| K2Cr2O7 | 1 mM |
Claims (1)
- Verfahren zur Herstellung einer mikrobiellen (H2O2-bildenden) L-Glutaminsäure-Oxidase unter Verwendung eines Mikroorganismus der Gattung Streptomyces, der kultiviert wird, dadurch gekennzeichnet, daß man als Mikroorganismus Streptomyces cattleya, ZIMET 43785 einsetzt und die L-Glutaminsäure-Oxidase nach an sich bekannten Verfahren gewinnt.Hierzu 4 Seiten ZeichnungenAnwendungsgebiet der ErfindungDie Erfindung betrifft ein Verfahren zur Herstellung einer extrazellulären (H2O2-bildenden) L-Glutaminsäure-Oxidase. Das Anwendungsgebiet der Erfindung liegt in Nutzung des Enzyms für analytische Zwecke, z.B. in der klinischen Diagnostik sowie zur Prozeßkontrolle in der technischen Mikrobiologie, der Nahrungsgüterwirtschaft und Lebensmittelindustrie und weiteren Bereichen der Volkswirtschaft, in denen Aminosäuren zur Analyse gelangen.
Family
ID=
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| DE69629489T2 (de) | Fructosylaminosäuren oxidase, verfahren zu ihrer herstellung und zum testen von amadori-verbindungen unter zuhilfenahme des enzyms | |
| DE69635503T2 (de) | Fructosyl-Aminosäureoxidase und Verfahren zu deren Herstellung | |
| EP0599159B1 (de) | Heterogenes Proteingemisch mit alpha-L-rhamnosidase Aktivität, Verfahren zu ihrer Herstellung und ihre Verwendung. | |
| DE2614114B2 (de) | Verfahren zur Herstellung von Kreatininamidohydrolase | |
| DE3307607C2 (de) | ||
| EP0120208B1 (de) | Mikrobiologisch hergestellte L-Phenylalanin-Dehydrogenase, Verfahren zu ihrer Gewinnung und ihre Verwendung | |
| EP0416282B1 (de) | Mikrobiologisch hergestellte N-Acyl-L-prolin-Acylase, Verfahren zu ihrer Gewinnung und ihre Verwendung | |
| DE2167078C2 (en) | Amylase prepn - for prodn of maltose from starch | |
| DE3600563C2 (de) | ||
| EP0248400A2 (de) | Enzym und Verfahren zu seiner Herstellung | |
| DE69133494T2 (de) | Microbiologische Herstellung von L-Ascorbinsäure | |
| DE3541242C2 (de) | ||
| DE2637671C3 (de) | Verfahren zur Herstellung von Kreatinin-Desimidase auf mikrobiologischem Wege | |
| US4569912A (en) | Production of bilirubin oxidase | |
| EP0501292A1 (de) | Eine L-Carnitin-Amidase produzierender Mikroorganismus, L-Carnitin-Amidase, Verfahren zu deren Gewinnung und deren Verwendung | |
| DE3116856C2 (de) | ||
| EP0584104A1 (de) | Verfahren zur gewinnung von dimethylamin- bzw. trimethylamin-dehydrogenase, danach erhaltene dehydrogenasen und ihre verwendung | |
| DD261932A3 (de) | Verfahren zur Herstellung einer mikrobiellen (H tief 2 O tief 2 bildenden) L-Glutaminsäure-Oxidase | |
| DE3931377C2 (de) | L-Fucose-Dehydrogenase, Verfahren zu ihrer Herstellung, quantitative Bestimmung von L-Fucose unter Verwendung des genannten Enzyms, sowie Kit für die quantitative Bestimmung | |
| JPH01117800A (ja) | グリセロール定量法 | |
| DE3741198C2 (de) | ||
| DE2659878C3 (de) | Verfahren zur Herstellung von Kreatinamidinohydrolase | |
| DE3041744C2 (de) | ||
| DE2906737C2 (de) | L-Lysin-α-oxidase, Verfahren zu ihrer Gewinnung und ihre Verwendung | |
| DD240910A1 (de) | Verfahren zur herstellung einer mikrobiellen l-glutaminsaeure-oxidase |