CN1894403A - 重组小鼠白血病病毒逆转录酶及其编码基因与表达方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种重组小鼠白血病病毒逆转录酶及其编码基因与表达方法。本发明所提供的重组小鼠白血病病毒逆转录酶，是将MLV－RT的自N端第84位谷氨酰胺残基取代为氨基酸残基X的蛋白质，其中X为侧链短于所述谷氨酰胺侧链的氨基酸。本发明的重组小鼠白血病病毒逆转录酶具有比Superscript更高酶活性和持续合成能力，将在生物技术领域中发挥重要作用，可以广泛用于cDNA的合成。
Description
重組小鼠白血病病毒逆转录酶及其编码基因与表达方法 技术领域
本发明涉及生物技术领域中一种重组逆转录酶及其编码基因与表达方 法， 特别涉及一种重组小鼠白血病病毒逆转录酶及其编码基因与表达方法。 背景技术
逆转录酶（Reverse Transcriptase, 简称 RT) 是由逆转录病毒编码的 DNA聚合酶， 能以 RNA或 DNA作为模板合成 DNA。逆转录酶是分子生物学研究 的常用工具酶，可以将 RNA逆转录成 cDNA，主要用于 cDNA文库的构建或与聚 合酶链式反应（PCR)合用 （RT- PCR)检测生物样品中 RNA的含量。 目前市场 上占主导地位的逆转录酶是小鼠白血病病毒 （Murine Leukemia Virus, 简称 MLV) 的逆转录酶（MLV- RT) 。
MLV-RT由两个功能域组成， 同时含有两种酶活性， 即位于 N端的 DNA聚 合酶（Pol )和位于 C端的 RNase H。 两个功旨 域可分别表达， 而不影响任何 —种酶的活性。 用于 cDNA合成的第一代重组 MLV-RT只含有 DNA聚合酶部分 而不含有 RNaseH部分， 虽然酶的活性与全长的 MLV-RT相似， 但其持续合成 能力较弱，合成的 cDNA较短。后来人们发现， RNaseH部分虽然不影响 MLV-RT 的 DNA聚合酶活性， 却影响其持续合成能力， 原因是 RNaseH结构域能结合模 板一引物复合体， 增加 MLV-RT与模板一引物的亲和力。 当利用定点突变方法 将位于 RNaseH活性中心的第 524位的天门冬氨酸（Asp) 突变为天门冬酰胺 (Asn) ， 成为 MLV-RT- D524N, 该酶不具有丽 aseH活性， 但保留了其 DNA聚 合酶的活性和对模板一底物的高亲和力， 因 Ife具有更高的持续合成能力。 该 突变酶为美国 Invitrogen公司专利产品， 商品名为 Superscript, 是目前使 用最为广泛的逆转录酶。但是， Superscript也并非完美无缺，其持续合成能 力尚不理想， 合成的 cDNA中绝大部分还是不完整的。
发明公开
本发明的目的是提供一种重组小鼠白血病病毒逆转录酶。
本发明所提供的重组小鼠白血病病毒逆转录酶， 名称为 MLV-RT-Q84X, 是将 MLV- RT的自 N端第 84位谷氨酰胺残基¾代为氨基酸残基 X的蛋白质， 其中 X为侧链短于谷氨酰胺残基侧链的氨基酸。
为了进一步提高其活性， 再将上述重组 4、鼠白血病病毒逆转录酶的自 N
端第 524位天门冬氨酸残基取代为天门冬酰胺残基， 所得到的重组小鼠白血 病病毒逆转录酶的名称为 MLV-RT- Q84X- D524N。
其中， 所述 X优选为丙氨酸、 丝氨酸、 天门冬氨酸或天门冬酰胺， 尤其 优选为丙氨酸。
上述重组小鼠白血病病毒逆转录酶的编码基因也属于本发明的保护范 围。
本发明的另一个目的是提供一种表达重组小鼠白血病病毒逆转录酶的方 法。
一种表达重组小鼠白血病病毒逆转录酶的方法， 是将含有重组小鼠白血 病病毒逆转录酶编码基因的表达载体转化到大肠杆菌中， 培养阳性克隆， 表 达重组小鼠白血病病毒逆转录酶； 所述重组小鼠白血病病毒逆转录酶， 是将 MLV-RT的自 N端第 84位谷氨酰胺残基取代为氨基酸残基 X的蛋白质，其中 X 为侧链短于所述谷氨酰胺侧链的氨基酸。
其中， 所述重组小鼠白血病病毒逆转录酶优选为将 MLV- RT 的自 N端第 84位谷氨酰胺残基取代为氨基酸残基 X， 自 N端第 524位天门冬氨酸残基取 代为天门冬酰胺残基的蛋白质， 其中 X为侧链短于所述谷氨酰胺侧链的氨基 酸；尤其优选为将 MLV-RT的自 N端第 84位谷氨酰胺残基取代为丙氨酸残基， 自 N端第 524位天门冬氨酸残基取代为天门冬酰胺残基的蛋白质。
所述含有重组小鼠白血病病毒逆转录酶编码基因的表达载体可以是具有 序列表中序列 1的核苷酸序列的质粒 pTacRT- Q84A-D524N或具有序列表中序 列 3的核苷酸序列的质粒 pTacRT- Q84N- D524N,所述大肠杆菌为 Escherichia coli BL21， 质粒 pTacRT- Q84A- D524N和质粒 pTacRT- Q84N- D524N所表达的重 组小鼠白血病病毒逆转录酶的氨基酸序列分别如序列表中的序列 2和序列 4 所示。 其中， 序列表中的序列 1和序列 3均由 7488个碱基组成， 它们的开放 阅读框架均自 5 ' 端第 1515位碱基 -3527位碱基， 序列表中序列 2和 4均由 671个氨基酸残基组成。
附图说明
图 1为纯化后的 MLV RT- Q84A- D524N SDS- PAGE电泳检测图
图 2为 MLV-RT- Q84A D524N与 MLV- RT- D524N酶动力学分析图 .
图 3为利用 MLV-RT- Q84A-D524N和 MLV- RT-D524N合成的 cDNA的比较图 图 4为纯化后的 MLV- RT- Q84N-D524N SDS-PAGE电泳检测图
图 5为 MLV- RT- Q84N- D524N的酶活测定图
实施发明的最佳方式
实施例 1、 MLV- RT- Q84A- D524N的制备
1、 质粒 pTacRT- Q84A- D524N的构建
本步骤中将 MLV- RT- D524N中的第 84位的谷氨酰胺突变为丙氨酸， 使之 成为 MLV- RT- Q84A- D524N0
MLV-RTH38 A-D524N的定点突变 将两段 PCR产物 Af ΠΙ EcoRI和 EcoRI- Mf el 撤掉 pTacRT-D524 iBlain, S. W. &Goff> S. P. (1995) J. Virol. 69， 4440-4452。 ) 的 Aflll- Mfel片段（nt 1467- 2058)。引物 Q84A- SP (5， CGGAATTCTGGTACCCTGCCAGTC) 包含有一个由于同义突变产生的 EcoRI酶切位点 （用下划线表示） ， 它和下游 引物（5， TGGGAGTCTGGTCCAGG) PCR扩增得到一个 300bp的 EcoRI- Mfel片段。 引物 Q84A - AP (5 ' CGGAATTCCCGCGTCCAACAGTCTCTGTA)同样包含有一个由于同 义突 ^生的 EcoRI酶切位点以及突变的丙氨酸密码子（黑体 ， 它和上游引物 (5， GTGGA TGTGAGCCGA)经 PCR扩增得到一个 300bp的 Aflll- EcoRI片段。 将 分别用 Af ΠΙ/EcoRI双酶切处理过的 Aflll- EcoRI片段（ntl467- 1770)以及 EcoRI/Mfel双切处理过的 EcoRI- Mfel (ntl770- 2058)片段与经 Aflll- Mfel双 切过的载体 PTacRT-D524N 6. 9kb片段连接，转化大肠杆菌 Τορ10。所得重组质 粒 pTacRT- Q84A-D524N通过酶切鉴定为阳性克隆， 双脱氧法测序表明其具有 序列表中序列 1所示的核苷酸序列。
2、 重组逆转录酶在大肠杆菌中的诱导和表达
将 pTacRT- Q84A-D524N转化 Escherichia coli BL21,挑取单菌落接种于 含 100 y g/ml氨苄青霉素的 LB液体培养基中， 37 C培养至 0D6。。 0. 5时， 加 入 IPTG至终浓度 0. 5mM, 37°C继续培养 2-3小时，收集菌体，将菌体用预冷的 50 mM Tris-HCl (pH 7. 5)洗涤一次后备用。
3、 重组逆转录酶的纯化
将收集的菌体悬浮于缓冲液 A (20mM PBS, pH 7. 4, 0. 5M NaCl) ,冻融后， 加入溶菌酶至终浓度 0. 5mg/ml， 4°C消化 30min,超声 （功率： 190W) 破碎 3 次， 每次 20秒， 离心， 收集上清。 经过金属螯合层析柱 HiTrap chelating HP column (购自 Pharmacia)分离纯化后， 纯度即可达 80%以上， 根据 SDS-PAGE 显示分子量大小， 确定并收集活性蛋白峰。 经过离子交换层析柱 MonoS (购自 Pharmacia)进一步分离纯化后， 电泳检测考马斯亮蓝染色， 结果如图 1所示，
表明该蛋白为一分子量约为 76KD的均一条带， 未见杂质。 图 1中， M为分子 量标准； 1表示样品中含 5微克蛋白； 2表示样品中含 2微克蛋白。
4、 酶活性测定及动力学分析
50μ1反应体系中包括 10ng RT纯酶样品， 60 mM Tris. Hcl (pH 8.0)， 75 ηιΜ NaCl, 0.7 raM MnCl2, 5 rnM DTT, 12 μ g/ml Poly (rA)模板， 6 μ g/ral oligo(dT) 18 引物， 10 μ Ci/ml (lCi=37 GBq)32P标记的 dTTP以及 12 μ M未标记的 dTTP，反 应于 37DC进行。 分别于反应开始后不同时间点取样 4μ 1点于 DE81滤纸， 终 止反应。 然后将 DE81滤纸用 2 XSSC洗涤三次， 95%乙醇漂洗两次， 将滤纸 晾干后， 放射自显影。 定量分析采用液闪计数仪测定。
动力学分析釆用公知的双倒数作图法进行， 如图 2所示。 用每个样品中
"保留在 DE81滤纸的放射强度 /同一样品总的放射强度"来表示掺入到产物 中的 dTTP的量。 动力学分析显示， 在以 dTTP为底物时， MLV- RT- Q84A- D524N 和 RT- D524N具有相似的 Km (分别为 11.04 μ M和 12.94 μ Μ) ，而
MLV-RT-Q84A-D524N的最大反应速率 Vmax值则是 MLV- RT- D524N的 3.2倍（分 别为 0·41μηιο1·πΰη- l.mg- 1和 0.13μηιο1.πάη- l.mg- 1) (如表 1) 。 表 1. MLV-RT-Q84A-D524 与 MLV- RT- D524N酶动力学参数比较
5. cDNA合成
本步骤比较了 MLV- RT-Q84A- D524N与 MLV- RT- D524N在合成 cDNA能力方 面的差异。
cDNA合成采用 293T细胞的总 RNA为模板， oligo(dT) 18为引物合成第一 链 cDNA, 产物中惨有 32P作为标记。 20μ 1反应体系中包括 lyg293T细胞总 RNA, 50 raM Tris. Hcl (pH 8.3), 75raMKCl， 3 raM MgCl2, 10 raM DTT, 500 μ M dTTP, 50 μ g/ml oligo (dT) 18， 2 μ Ci 32PdTTP， 1 μ g RT纯酶样品。 42°C反应 1小时。 碱变性电泳检测实验结果。 结果如图 3所示， 表明 MLV- RT- Q84A-D524N合成 的 cDNA片段不但较 RT- D524N合成的长， 而且合成的 cDNA量也比 RT- D524N 多。
实施例 2、 MLV-RT-Q84N-D524 的制备
1、 质.粒 pTacRT- Q84N- D524N的构建
本步骤中将 MLV- RT- D524N中的第 84位的谷氨酰胺突变为天门冬酰胺， 使之成为 MLV- RT- Q84N- D524N。
MLV-RTH384N-D524N的定点突^ 将两段 PCR产物 Α ΙΙ- BamHI和 BamHI- Mfel ^ pTacRT- D52 ain, S. W. &Goff, S. P. (1995) J. Virol. 69, 4440-4452。 ) 的 Af III- Mfel片段（nt 1467- 2058) 0引物 Q84N- SP (5， CGGGATCCTGGTACCCTGCCAGTC) 包含有一个由于同义突变产生的 BamHI酶切位点 （用下划线表示）， 它和下游引物 (5， TGGGAGTCTGGTCCAGG)PCR扩增得到一个 300bp的 BamHI- Mfel片段。引物 Q8 N-AP (5' CGGGATCCCGnGTCCAACAGTCTCTGTA)同样包含有一个由于同义突 ^生的 BamHI 酶切位点以及突变的天门冬酰胺密码子 （黑体表示） ， 它和上游引物
(5' GTGGAATTGTGAGCCGA)经 PCR扩增得到一个 300bp的 Afl II- BamHI片段。 将分别用 Af ΙΠ/BamHI双酶切处理过的 Af III- BamHI片段 (ntl467- 1770)以及 BamHI/Mfel双切处理过的 BamHI- Mfel (ntl770- 2058)片段与经 Af III- Mfel双 切过的载体 pTacRT- D524N 6. 9kb片段连接,转化大肠杆菌 Τορ10。所得重组质 粒 pTacRT- Q84N- D524N通过酶切鉴定为阳性克隆， 双脱氧法测序表明其具有 序列表中序列 3所示的核苷酸序列。
2、 重组逆转录酶在大肠杆菌中的诱导和表达
将 pTacRT-Q84N-D524N转化 Escherichia coli BL21，挑取单菌落接种于 含 100 y g/ml氨苄青霉素的 LB液体培养基中， 37°C培养至 0D6Q。 0. 5时， 加 入 IPTG至终浓度 0. 5mM， 37°C继续培养 2-3小时，收集菌体，将菌体用预冷的 50 mM Tris-HCl (ρΗ Ί· 5)洗涤一次后备用。
3、 重组逆转录酶的纯化
将收集的菌体悬浮于缓冲液 A (20mM PBS, pH 7. 4, 0. 5M NaCl)，冻融后， 加入溶菌酶至终浓度 0. 5mg/ml， 4°C消化 30min，超声 (功率: 190W) 破碎 3 次， 每次 20秒， 离心， 收集上清。 经过金属螯合层析柱 HiTrap chelating HP column (购自 Pharmacia)分离纯化后， 纯度即可达 80%以上， 根据 SDS- PAGE 显示分子量大小， 确定并收集活性蛋白峰。 经过离子交换层析柱 MonoS (购自 Pharmacia)进一步分离纯化后， 电泳检测考马斯亮蓝染色， 结果如图 4所示， 表明该蛋白为一分子量约为 76KD的均一条带， 未见杂质。 图 4中， M为分子 量标准； 1表示样品中含 1微克蛋白； 2表示样品中含 2微克蛋白； 3表示样 品中含 5微克蛋白。
4、 酶活性测定及动力学分析
50μ1反应体系中包括 10ng RT纯酶样品， 60 mM Tris. Hcl (pH 8. 0) , 75 mM NaCl, 0. 7 mM MnCl2， 5 mM DTT, 12 μ g/ml Poly (rA)模板， 6 μ g/ml oligo (dT) 18 引物， 10 μ Ci/ml (lCi=37 GBq) 32P标记的 dTTP以及 12 μ M未标记的 dTTP,反 应于 37°C进行。 分别于反应开始后不同时间点取样 4 μ 1点于 DE81滤纸， 终 止反应。 然后将 DE81滤纸用 2 X SSC洗涤三次， 95%乙醇漂洗两次， 将滤纸 晾干后， 放射自显影。 结果如图 5所示， 图中黑点颜色的深浅代表酶活力的 高低。 结果显示 MLV- RT- Q84N- D524N的酶活力较 MLV- RT- D524N高， 跟
MLV-RT-Q84A-D524N的活力相当。
工业应用
本发明通过分析 MLV- RT的晶体结构模型， 发现该酶第 84位的谷氨酰胺 (Q84)位于酶的活性中心附近， 参与调控酶的催化能力， 其较长的侧链妨碍 合成产物的延伸， 影响 DNA聚合酶的活性和持续合成能力。 本发明将 MLV- RT 基因进行突变， 使 Q84残基突变成侧链较短的残基， 产生了新的突变酶 MLV-RT-Q84X, 其中 X为侧链短于谷氨酰胺侧链的氨基酸， 如丙氨酸（Ala)、 丝氨酸（Ser) 、 天门冬酰胺 （Asn) 、 或天门冬氨酸 （Asp) 等。 同时， 本发 明将 Q84X突变引入 MLV- RT- D524N中，使之成为 MLV-RT- Q84X- D524N。本发明 的重组小鼠白血病病毒逆转录酶具有比 Superscript更高酶活性和持续合成 能力， 将在生物技术领域中发挥重要作用， 可以广泛用于 cDNA的合成。
Claims (10)
- 权利要求书1、 一种重组小鼠白血病病毒逆转录酶， 是将 MLV- RT的自 N端第 84位谷 氨酰胺残基取代为氨基酸残基 X的蛋白质， 其中 X为侧链短于所述谷氨酰胺 残基侧链的氨基酸。
- 2、 根据权利要求 1所述的重组小鼠白血病病毒逆转录酶， 其特征在于： 所述重组小鼠白血病病毒逆转录酶的自 N端第 524位天门冬氨酸残基取代为 天门冬酰胺残基。
- 3、根据权利要求 1或 2所述的重组小鼠白血病病毒逆转录酶，其特征在 于： 所述 X为丙氨酸、 丝氨酸、 天门冬氨酸或天门冬酰胺。
- 4、 根据权利要求 3所述的重组小鼠白血病病毒逆转录酶， 其特征在于： 所述 X为丙氨酸。
- 5、 编码权利要求 1所述重组小鼠白血病病毒逆转录酶的基因。
- 6、一种表达重组小鼠白血病病毒逆转录酶的方法， 是将含有重组小鼠白 血病病毒逆转录酶编码基因的表达载体转化到大肠杆菌中， 培养阳性克隆， 表达重组小鼠白血病病毒逆转录酶； 所述重组小鼠白血病病毒逆转录酶， 是 将 MLV- RT的自 N端第 84位谷氨酰胺残基取代为氨基酸残基 X的蛋白质， 其 中， X为侧链短于所述谷氨酰胺残基侧链的氨基酸。
- 7、 根据权利要求 6所述的方法， 其特征在于： 所述重组小鼠白血病病毒 逆转录酶的自 N端第 524位天门冬氨酸残基取代为天门冬酰胺残基。
- 8、 根据权利要求 7所述的方法， 其特征在于： 所述 X为丙氨酸。
- 9、 根据权利要求 8所述的方法， 其特征在于： 所述含有重组小鼠白血病 病毒逆转录酶编码基因的表达载体是具有序列表中序列 1 的核苷酸序列的质 粒 pTacRT- Q84A- D524N。
- 10、 根据权利要求 6、 7、 8或 9所述的方法， 其特征在于： 所述大肠杆 菌为 Escherichia coli BL21。
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