CN110709513A - 具有热稳定性增加的突变型逆转录酶以及涉及其的产物、方法和用途 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及相对于野生型具有增加的热稳定性的突变型逆转录酶（RT），编码突变型RT的核酸，包含突变型RT或核酸的细胞，包含突变型RT的试剂盒，突变型RT用于cDNA合成的用途，使用突变型RT用于逆转录包含合成cDNA的RNA的方法，以及使用突变型RT检测样品中的RNA标记物的方法。

Description

具有热稳定性增加的突变型逆转录酶以及涉及其的产物、方 法和用途
本发明涉及相对于野生型具有增加的热稳定性的突变型逆转录酶（RT），编码突变型RT的核酸，包含所述突变型RT或所述核酸的细胞，包含所述突变型RT的试剂盒，突变型RT用于cDNA合成的用途，使用突变型RT用于逆转录包含合成cDNA 的RNA的方法，以及使用突变型RT检测样品中的RNA标记物的方法。
逆转录酶（RT）[EC 2.7.7.49]是负责病毒基因组复制的酶。它具有RNA和DNA依赖性DNA聚合酶以及RNA酶H活性。来自莫洛尼鼠白血病病毒（MMLV）和禽成髓细胞瘤病毒（AMV）的RT广泛用于cDNA合成中，因为它们具有高催化活性和保真度。对于cDNA合成，较高的反应温度是期望的，因为它减少RNA二级结构和非特异性引物结合。因此，改善RT的热稳定性是重要目的。MMLV RT的热稳定性（Kotewicz等人，1985；Gerard等人，2002；Mizuno等人，2010）已通过消除RNA酶H活性得到改善。近年来，MMLV RT的热稳定性通过以下得到进一步改善：在已牵涉与模板-引物的相互作用的位置处引入正电荷（Yasukawa等人，2010）；随机诱变（Arezi和Hogrefe，2009；Baranauskas等人，2012），以及将表面疏水性残基改变成亲水性残基（Konishi等人，2014）。因此，cDNA合成的反应温度已从37−45℃增加到50−55℃。然而，需要进一步的稳定，以改善cDNA合成的效率。
对于各种酶，已广泛执行定点诱变和/或随机突变，并且已鉴定了赋予酶期望特性如增强的催化活性或热稳定性的各种突变。如果这些突变的效应是累加的，则具有多重突变的变体酶将具有更期望的特性。然而，一般已知在各种酶的活性和稳定性之间存在妥协：增加酶活性的突变伴随着蛋白质稳定性的降低，并且增加蛋白稳定性的那些突变的确降低了酶活性（Shoichet等人，1995）。另外，目前很难预测突变组合对酶特性的作用。MM3（E286R/E302K/L435R）是热稳定的MMLV RT三重变体，其通过将旨在增加正电荷的三个突变引入野生型MMLV RT内而生成（Yasukawa等人，2010）。
然而，本发明的目的是提供衍生自MMLV的进一步的热稳定突变型逆转录酶。
为此，设计了29个突变。在大肠杆菌（Escherichia coli）中产生相应的单个变体，并且表征活性和稳定性，并且选择了六个突变（Ala32→Val、Leu41→Asp、Leu72→Arg、Ile212→Arg、Leu272→Glu和Trp388→Arg）。通过将六个突变中的一个或多个与MM3突变结合，设计了15种多重变体。产生并表征了相应的多重变体。六重变体MM3.14（A32V/L72R/E286R/E302K/W388R/L435R）显示出比野生型或突变型MM3更高的热稳定性（参见实施例2以及图4E、4F、5和6）。
相应地，在第一个方面，本发明涉及相对于SEQ ID NO：1的野生型RT具有增加的热稳定性的突变型逆转录酶（RT），所述突变型RT包含：
i）相对于SEQ ID NO：1的野生型RT具有六个氨基酸取代的氨基酸序列，其中
- 在位置32处的Ala被Val取代（A32V）；
- 在位置72处的Leu被Arg取代（L72R）；
- 在位置286处的Glu被Arg取代（E286R）；
- 在位置302处的Glu被Lys取代（E302K）；
- 在位置388处的Trp被Arg取代（W388R）；和
- 在位置435处的Leu被Arg取代（L435R），或
ii）与i）的氨基酸序列至少95%相同，且具有如i）中定义的六个氨基酸取代的氨基酸序列，
其中所述突变型RT显示出逆转录酶活性。
逆转录酶（RT）是用于从RNA模板生成互补DNA（cDNA）的酶，该过程称为逆转录。它主要与逆转录病毒相关。然而，非逆转录病毒也使用RT（例如，乙型肝炎病毒，嗜肝DNA病毒科的成员，其为dsDNA-RT病毒，而逆转录病毒是ssRNA病毒）。逆转录病毒RT具有三种序贯的生化活性：RNA依赖性DNA聚合酶活性、核糖核酸酶H和DNA依赖性DNA聚合酶活性。逆转录病毒利用这些活性将单链基因组RNA转换成双链cDNA，其可以整合到宿主基因组内，潜在地生成可能很难根除的长期感染。相同的反应序列广泛用于实验室中，以将RNA转换为DNA，用于分子克隆、RNA测序、聚合酶链反应（PCR）或基因组分析中。在该领域中通常使用的逆转录酶是来自莫洛尼鼠白血病病毒的MMLV逆转录酶。
根据本发明，突变型RT显示出逆转录酶活性。这意味着突变型RT能够在合适的条件下从RNA模板生成cDNA。用于测定转录酶活性的方法在本文中描述并且在实施例中给出（参照使用[3H]-dTTP的逆转录测定，使用荧光染料PicoGreen的逆转录测定和cDNA合成）。
此外，相对于SEQ ID NO：1的野生型RT，突变型逆转录酶（RT）具有增加的热稳定性。术语相对于野生型RT“增加的热稳定性（increased thermostability）”或“增加的热稳定性（increased thermal stability）”，意指突变型RT在高温（即高于室温或特别是高于40℃）下较不易于丧失（酶）活性。酶的稳定（包括避免变性机制，以便实现其作为催化剂的全部潜能）是生物技术的重要目标。由于酶应用的数目渐增，酶稳定具有重要意义。稳定性中的增加允许持续的可用性（例如，更长的贮存、对于更长时间的可用性等）。此外，对于cDNA合成，较高的反应温度是期望的，因为它减少RNA二级结构和非特异性引物结合。因此，改善RT的热稳定性是期望的。突变型相对于野生型的稳定性增加可以通过比较两种酶（野生型和突变型）例如在贮存或暴露于特定条件（例如高温、干燥、缓冲液或盐）后的剩余活性（绝对剩余活性）来确定。可替代地，如果突变型例如具有较高的相对剩余活性，则与野生型相比，稳定性得到改善。可以通过将在给定条件（例如时间、温度）下温育后的剩余或残余酸度与温育前的初始活性进行比较，来确定相对剩余活性。
术语酶活性及其测定是本领域技术人员众所周知的。酶活性一般定义为底物的转换量/时间。酶活性的SI单位为开特（katal）（1开特= 1 mol s−1）。更实际和常用的值是酶单位（U）= 1 μmol min−1。1 U对应于16.67纳开特，并且定义为每分钟催化1微摩尔底物转换的酶量。酶的比活性是每毫克总蛋白的酶活性（以μmol min−1mg−1表示）。
酶活性可以在测量随着时间过去的底物或辅因子消耗或产物形成的测定中确定。存在测量底物和产物的浓度的许多不同的方法，并且许多酶可以以如本领域技术人员已知的几种不同方式来测定。在本发明中，例如使所讨论的RT与RNA模板、引物和合适的dNTP混合物一起温育，并且监测cDNA的产生或dNTP的消耗。监测可以例如通过例如以下来完成：测量在260 nm处的UV吸收，标记（例如[3H]-dTTP；参见实施例）的掺入，标记物与DNA的结合（例如PicoGreen®）或PCR（参照实施例）。
在本发明的一个优选实施方案中，可以确定突变型RT相对于不含突变的各个RT的热稳定性增加，并且表示为与应激温育之前的初始活性相比，在应激温育后（例如在例如60℃下10分钟或在实施例中给出的任何其它条件下）的剩余活性（参见实施例）。为此，可以如上文或在实施例中详述的监测酶促反应，并且可以计算活性中的变化。可以将对于热温育的样品获得的值与相应的无应激样品（设定为100%活性的值）进行比较，并且以活性百分比（活性（应激样品）/活性（无应激样品）*100）进行计算。相应地，突变型的值高于由野生型酶的值表示热稳定性的改善。如果[突变型的剩余活性%] - [野生型的剩余活性%] > 0，则稳定性增加。可替代地，突变型的剩余活性也可以表示为活性%，并且可以如下计算：[突变型的剩余活性%]/[野生型的剩余活性%] * 100%。如果所得到的值 > 100%，则突变型相对于野生型的稳定性增加。实施例中描述了用于确定稳定性的特别合适的测试。用实时PCR（参见图5）的cDNA合成测试看起来提供了最灵敏的测试。
实施例中详述了用于确定增加的热稳定性的合适方法。关于应激条件的示例性条件可以是在48-65℃（特别是60℃）下预温育10分钟，然后使用[3H]-dTTP的逆转录测定、使用荧光染料PicoGreen的逆转录测定、或优选用实时PCR的cDNA合成进行测试。
本发明的RT衍生自MMLV RT，其为75-kDa单体。它由手指、手掌、拇指、连接和RNA酶H结构域组成。DNA聚合酶反应的活性位点位于手指/手掌/拇指结构域中，而RNA酶H反应的活性位点位于RNA酶H结构域中。
称为野生型RT的RT的氨基酸序列包括氨基酸的编号如下：
Figure 985439DEST_PATH_IMAGE001
相应的核酸序列如下：
Figure 89531DEST_PATH_IMAGE002
术语“突变型逆转录酶”（RT）涉及其氨基酸序列与SEQ ID NO：1的氨基酸序列相差至少六个突变的RT酶。如上文详述的，相对于SEQ ID NO：1的野生型RT，本发明的突变型RT具有六个强制性氨基酸取代，其中
- 在位置32处的Ala被Val取代（A32V）；
- 在位置72处的Leu被Arg取代（L72R）；
- 在位置286处的Glu被Arg取代（E286R）；
- 在位置302处的Glu被Lys取代（E302K）；
- 在位置388处的Trp被Arg取代（W388R）；和
- 在位置435处的Leu被Arg取代（L435R）。
与SEQ ID NO：1的野生型RT仅相差上述六个强制性突变的突变型RT的氨基酸序列，被称为SEQ ID NO：2的氨基酸序列，并且如下：
六个强制性突变由具有下划线的粗体字母指示，并且其位置由分别的氨基酸编号指定。
相应的核酸序列如下：
Figure 936581DEST_PATH_IMAGE004
然而，突变型RT可以具有一个或多个进一步的氨基酸取代、添加、缺失或其组合。根据本发明，本发明的突变型RT还可以包含与SEQ ID NO：2的氨基酸序列至少95%相同，并且具有如上文定义的六个强制性氨基酸取代（A32V/L72R/E286R/E302K/W388R/L435R）的氨基酸序列。
在本发明的一个实施方案中，根据本发明的突变型RT可以包含一个或多个氨基酸取代，特别是有限数目的取代（例如最多30、20或尤其是10个氨基酸取代），特别是保守取代。“保守氨基酸取代”指残基由具有相似侧链的不同残基的取代，并且因此通常涉及多肽中的氨基酸由相同或相似限定的氨基酸类别内的氨基酸的取代。示例性而非限制性地，具有脂肪族侧链的氨基酸可以被另一个脂肪族氨基酸，例如丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸和异亮氨酸取代；具有羟基侧链的氨基酸被具有羟基侧链的另一个氨基酸，例如丝氨酸和苏氨酸取代；具有芳香族侧链的氨基酸被具有芳香族侧链的另一个氨基酸，例如苯丙氨酸、酪氨酸、色氨酸和组氨酸取代；具有碱性侧链的氨基酸被具有碱性侧链的另一个氨基酸，例如赖氨酸和精氨酸取代；具有酸性侧链的氨基酸被具有酸性侧链的另一个氨基酸，例如天冬氨酸或谷氨酸取代；并且疏水性或亲水性氨基酸分别被另一个疏水性或亲水性氨基酸取代。保守氨基酸取代的实例包括下文列出的那些：
Figure 943763DEST_PATH_IMAGE005
在本发明的一个实施方案中，根据本发明的突变型RT可以包含一种或多种氨基酸添加，特别是小的（例如最多30、20或尤其是10个氨基酸）内部或末端氨基酸添加。
在本发明的一个实施方案中，根据本发明的突变型RT可以包含一个或多个氨基酸缺失，特别是N和/或C末端缺失。缺失可以很小（例如在每个末端处最多5、4、3、2，尤其是1个氨基酸）。在一个优选实施方案中，突变型RT与SEQ ID NO：1的氨基酸序列相差在SEQ IDNO：1的N末端处的至多五个氨基酸的缺失、和/或在SEQ ID NO：1的C末端处的至多五个氨基酸的缺失 - 除了如上定义的强制性突变之外。
在另一个实施方案中，除了强制性突变（取代）之外，根据本发明的突变型RT的序列可以包含如上定义的一个或多个缺失、取代或添加的组合。然而，突变型RT包含与SEQ IDNO：2的氨基酸序列至少95%相同的氨基酸序列。
如本文使用的，术语“至少95%相同”或“至少95%序列同一性”意指根据本发明的突变型RT的序列具有这样的氨基酸序列，其特征在于在100个氨基酸的段内，至少95个氨基酸残基与SEQ ID NO：2的相应序列的序列相同。相应地定义其它百分比的序列同一性。
根据本发明的序列同一性可以例如通过以序列比较形式的序列比对方法确定。序列比对的方法是本领域众所周知的，并且包括各种程序和比对算法。此外，NCBI碱基局部比对搜索工具（Basic Local Alignment Search Tool）（BLAST）可从几个来源获得，包括美国国家生物技术信息中心（National Center for Biotechnology Information）（NCBI，Bethesda，MD）和互联网，用于与序列分析程序blastp、blastn、blastx、tblastn和tblastx结合使用。根据本发明的突变型相对于例如SEQ ID NO：2的氨基酸序列的同一性百分比，通常使用具有标准设置的NCBI Blast blastp来表征。可替代地，可以使用具有标准设置的软件GENEious来确定序列同一性。比对结果可以例如衍生自Software Geneious（版本R8），使用具有自由末端间隙作为比对类型以及Blosum62作为成本矩阵的总体比对方案。
如上文详述的，本发明的突变型RT包含与SEQ ID NO：2的氨基酸序列至少95%相同的氨基酸序列。在一个优选实施方案中，突变型RT包含氨基酸序列或由氨基酸序列组成，所述氨基酸序列与SEQ ID NO：2的氨基酸序列至少96%、97%、98%或99%，特别是100%相同。可以如上所述确定序列同一性。
在另外一个优选实施方案中，突变型RT具有相对于突变型MM3相等或甚至增加的热稳定性，其中MM3具有与SEQ ID NO：1的氨基酸序列仅相差三个氨基酸取代的氨基酸序列，其中在位置286处的Glu被Arg取代（E286R），在位置302处的Glu被Lys取代（E302K），并且在位置435处的Leu被Arg取代（L435R）。MM3（E286R/E302K/L435R）是热稳定的MMLV RT三重变体，其通过将旨在增加正电荷的三个突变引入野生型MMLV RT内而生成（Yasukawa等人，2010）。
优选地，通过测量在热处理后，特别是在60℃下温育10分钟后测量的突变型的逆转录酶活性来测定热稳定性。另外地或可替代地，相对于野生型RT或突变型MM3，热稳定性增加至少10%、20%、30%或40%，优选至少50%。关于这些实施方案的细节在上文给出。
另外优选地，突变型RT（未应激的）的逆转录酶活性是野生型的逆转录酶活性的至少50%，特别是至少60%，更特别是至少70%，尤其是至少80%。另外地或可替代地，逆转录酶活性通过在37℃下RT介导的dTTP掺入来确定（参见实施例）。关于酶活性测定的细节在上文给出。
在另一个实施方案中，突变型RT可以与进一步的蛋白质融合。融合蛋白是通过将两种或更多种最初分开的蛋白质或肽连接而产生的蛋白。该程序导致具有衍生自每种原始蛋白质的功能特性的多肽。相应地，取决于RT的预期用途，它可以与进一步的肽或蛋白质组合成融合蛋白。蛋白质可以经由接头或间隔物融合，这增加了蛋白质独立地折叠并且如预期的表现的可能性。尤其是在其中接头允许蛋白质纯化的情况下，有时用关于蛋白酶或化学试剂的切割位点来改造蛋白质或肽融合物中的接头，所述蛋白酶或化学试剂允许两种分开蛋白质的释放。可以通过与诱导人工蛋白质二聚化或多聚化的肽结构域的原始蛋白质（例如，链霉抗生物素蛋白或亮氨酸拉链）融合的遗传改造，来制造二聚体或多聚体融合蛋白。融合蛋白也可以用附着至其的毒素或抗体制造。其它融合物包括添加信号序列，例如脂化信号序列、分泌信号序列、糖基化信号序列、易位信号肽等。
优选地，本发明的融合蛋白包含标签。标签出于各种目的而附着在蛋白质，例如以便容易纯化，帮助蛋白质的正确折叠，防止蛋白质沉淀，改变层析特性，修饰蛋白质或者标记蛋白质或给蛋白质贴标签。标签的实例包括Arg标签、His标签、Strep标签、Flag标签、T7标签、V5-肽标签、GST标签和c-Myc标签。本发明中的优选标签是由六个组氨酸残基组成的His标签。
在一个进一步方面，本发明涉及编码本发明的突变型RT的核酸。
如本文使用的，术语“核酸”一般涉及任何核苷酸分子，其编码本发明的突变型RT并且可以具有可变长度。本发明的核酸的实例包括但不限于质粒、载体或任何种类的DNA和/或RNA片段，其可以通过标准分子生物学程序包括例如离子交换层析进行分离。本发明的核酸可以用于特定细胞或生物的转染或转导。
本发明的核酸分子可以以RNA的形式，例如mRNA或cRNA，或者可以以DNA的形式，包括例如cDNA和基因组DNA，其例如通过克隆获得或通过化学合成技术或其组合产生。DNA可以是三链、双链或单链的。单链DNA可以是编码链，也称为有义链，或者它可以是非编码链，也称为反义链。如本文使用的，核酸分子还尤其指单链和双链DNA、其为单链和双链RNA的混合物的DNA、以及其为单链和双链区域的混合物的RNA、包含可以是单链的或更通常是双链或三链的、或者单链和双链区域的混合物的DNA和RNA的杂合分子。另外，如本文使用的，核酸分子指包含RNA或DNA或RNA和DNA两者的三链区域。
另外地，核酸可以含有一种或多种修饰的碱基。此类核酸还可以含有例如核糖磷酸主链中的修饰，以增加此类分子在生理环境中的稳定性和半衰期。因此，具有出于稳定性或出于其它原因而修饰的主链的DNA或RNA是如本文预期特点的“核酸分子”。此外，仅举两个例子，包含稀有碱基例如肌苷或修饰的碱基例如三苯甲基化碱基的DNA或RNA是在本发明的背景下的核酸分子。应了解，已对DNA和RNA作出各种各样的修饰，其发挥本领域技术人员已知的许多有用目的。如它在本文中采用的，术语核酸分子包括核酸分子的此类化学、酶促或代谢修饰的形式，以及病毒和细胞（尤其包括简单和复杂细胞）特有的DNA和RNA的化学形式。
此外，可以使用标准技术，例如标准克隆技术，将编码本发明的突变型RT的核酸分子功能性连接至任何所需序列，例如调控序列、前导序列、异源标记物序列或异源编码序列，以产生融合蛋白。
一般而言，通过核酸内切酶和/或核酸外切酶和/或聚合酶和/或连接酶和/或重组酶或技术人员已知产生核酸的其它方法来操纵核酸，可以最初在体外或在培养的细胞中形成本发明的核酸。
本发明的核酸可以包含在表达载体中，其中所述核酸可操作地连接至能够促进所述核酸在宿主细胞中的表达的启动子序列。
如本文使用的，术语“表达载体”一般指可以用于在细胞中表达目标蛋白的任何种类的核酸分子（也参见上文关于本发明核酸的细节）。特别地，本发明的表达载体可以是本领域技术人员已知的任何质粒或载体，其适合于在特定宿主细胞中表达蛋白质，所述宿主细胞包括但不限于哺乳动物细胞、细菌细胞和酵母细胞。本发明的表达构建体也可以是这样的核酸，其编码本发明的RT，并且用于随后克隆到分别的载体内，以确保表达。合适的载体在实施例中描述，并且在图2中示出。用于蛋白质表达的质粒和载体是本领域众所周知的，并且可以从不同供应商包括例如Promega（Madison，WI，USA）、Qiagen（Hilden，德国）、Invitrogen（Carlsbad，CA，USA）或MoBiTec（德国）商业购买。蛋白质表达的方法是本领域技术人员众所周知的，并且例如在Sambrook等人，2000（Molecular Cloning: A laboratorymanual，第三版）中描述。
载体可以另外包括允许其在宿主细胞中复制的核酸序列，例如复制起点，一种或多种治疗基因和/或可选择标记物基因以及本领域已知的其它遗传元件，例如指导编码蛋白质的转录、翻译和/或分泌的调控元件。载体可以用于转导、转化或感染细胞，从而促使细胞表达不同于细胞天然那些的核酸和/或蛋白质。载体任选地包括帮助实现核酸进入细胞内的材料，例如病毒颗粒、脂质体、蛋白质外壳等等。通过标准分子生物学技术，用于蛋白质表达的众多类型的适当表达载体是本领域已知的。此类载体选自常规载体类型，包括昆虫例如杆状病毒表达，或者酵母、真菌、细菌或病毒表达系统。其中众多类型是本领域已知的其它适当的表达载体也可以用于此目的。用于获得此类表达载体的方法是众所周知的（参见例如，Sambrook等人，同上）。
如上文详述的，将编码本发明的突变型RT的核酸可操作地连接至适合于在宿主细胞中驱动蛋白质表达的序列，以便确保蛋白质的表达。然而，在本发明中涵盖的是请求保护的表达构建体可以代表中间产物，其随后被克隆到合适的表达载体内，以确保蛋白质的表达。本发明的表达载体可以进一步包含所有种类的核酸序列，包括但不限于聚腺苷酸化信号、剪接供体和剪接受体信号、插入序列、转录增强子序列、翻译增强子序列、药物抗性基因或类似物。任选地，药物抗性基因可以可操作地连接至内部核糖体进入位点（IRES），其可以是细胞周期特异性或细胞周期非依赖性的。
如本文使用的，术语“可操作地连接的”一般意指基因元件这样排列，使得它们按其预定目的协同作用，例如转录由启动子起始，并且进行通过编码本发明的蛋白质的DNA序列。即，RNA聚合酶将编码融合蛋白的序列转录成mRNA，然后将其剪接并翻译成蛋白质。
如在本发明的上下文中使用的，术语“启动子序列”一般指可操作地连接至下游编码序列的任何种类的调控DNA序列，其中所述启动子能够结合RNA聚合酶，并且起始所编码的开放读码框在细胞中的转录，从而驱动所述下游编码序列的表达。本发明的启动子序列可以是本领域技术人员已知的任何种类的启动子序列，包括但不限于组成型启动子、诱导型启动子、细胞周期特异性启动子和细胞类型特异性启动子。
在另外一个方面，本发明涉及包含本发明的突变型RT或本发明的核酸的细胞。该细胞优选是宿主细胞。本发明的“宿主细胞”可以是适合应用于重组DNA技术中的任何种类的生物，并且包括但不限于适合于表达一种或多种重组蛋白的所有类别的细菌和酵母菌株。宿主细胞的实例包括例如各种枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）或大肠杆菌菌株。各种大肠杆菌细菌宿主细胞是本领域技术人员已知的，并且包括但不限于菌株如DH5-α、HB101、MV1190、JM109、JM101或XL-1 blue，其可以从不同供应商包括例如Stratagene（CA，USA）、Promega（WI，USA）或Qiagen（Hilden，德国）商业购买。实施例中也描述了特别合适的宿主细胞，即大肠杆菌BL21（DE3）细胞。可以用作宿主细胞的枯草芽孢杆菌菌株是商购可得的。
根据本发明的宿主细胞的培养是技术人员已知的常规程序。即，可以通过重组手段将编码本发明的突变型RT的核酸引入合适的宿主细胞内，以产生相应的蛋白质。这些宿主细胞可以通过任何种类的合适细胞，优选细菌细胞，例如大肠杆菌，其可以是容易培养的。在第一步时，这种方法可以包括将分别的基因克隆到合适的质粒载体内。质粒载体广泛用于基因克隆，并且可以容易地引入，即转化到已制备为感受态的细菌细胞内。在蛋白质已在分别的宿主细胞中表达后，可以借助于化学或机械细胞裂解来破碎细胞，所述化学或机械细胞裂解是本领域技术人员众所周知的，并且包括但不限于例如低渗盐处理、去污剂处理、均质化或超声处理。
本发明还提供了用于执行逆转录的试剂盒，其包含本发明的突变型RT。逆转录是由RNA模板合成DNA，其通常由逆转录酶介导，并且产生互补DNA（cDNA）。逆转录酶使用RNA模板以及与RNA的3'末端互补的短引物，以指导第一链cDNA的合成，所述第一链cDNA可以直接用作用于聚合酶链反应（PCR）的模板。逆转录和PCR的这种组合（RT-PCR）允许检测样品中的低丰度RNA，以及相应cDNA的产生，从而促进低拷贝基因的克隆。可替代地，可以使用DNA聚合酶I和DNA连接酶，将第一链cDNA制备为双链的。这些反应产物可以无需扩增直接用于克隆。在这种情况下，需要来自RT或外源供应的RNA酶H活性。取决于预期的用途，除了本发明的突变型RT之外，该试剂盒还可以包含进一步组分，例如缓冲液、一种或多种引物和dNTP混合物。该试剂盒还可以包含进一步反应所需的试剂，例如PCR、第二DNA链的合成或扩增所需的试剂（例如引物、探针、聚合酶或标记物）。另外，该试剂盒可以包含指导手册。
在一个进一步方面，本发明涉及本发明的突变型RT用于cDNA合成的用途。用于研究例如活细胞中的基因表达的常见技术是产生RNA的细胞互补体的DNA拷贝（cDNA）。该技术提供了研究来自活细胞的RNA的手段，其避免了固有不稳定的RNA的直接分析。在任选的mRNA分离后（使用例如方法，如利用寡聚dT的亲和层析），通常将寡核苷酸序列对mRNA分子退火，并且利用RNA/DNA引物作为模板，具有逆转录酶活性的酶可以用于产生RNA序列的cDNA拷贝。因此，mRNA的逆转录是许多形式的基因表达分析中的关键步骤。通常，mRNA被逆转录成cDNA，用于通过引物延伸或聚合酶链反应的后续分析。在本发明的用途中，使RNA与本发明的突变型RT以及通常的引物序列接触，所述引物序列对RNA模板退火，以便使DNA合成从引物的3' OH起始。引物可以选择为与序列互补或基本上互补，所述序列存在于目标核酸序列的每条链的3'末端处。在一个示例性实施方案中，使用通常在约42至65℃的逆转录酶反应中的退火温度进行逆转录反应。逆转录反应优选在约50℃至60℃或60℃至65℃下进行。
本发明进一步提供了用于RNA的逆转录的方法，该方法包括使用本发明的突变型RT，从RNA合成cDNA。该方法可以如关于本发明的突变型RT用于cDNA合成的用途详述的进行。
此外，本发明还提供了用于检测样品中的RNA标记物的方法，
a）在有助于突变型RT活性的条件下，使样品与本发明的突变型RT接触；
b）使用本发明的突变型RT，从RNA标记物合成cDNA；和
c）检测步骤b）中合成的cDNA的存在，从而检测样品中的RNA标记物。
RNA可以在各种应用中用作标记物。检测到的RNA可以指示本身，或者它可以指示DNA的存在或目标基因的表达，其继而指示疾病、病原体的存在等。RNA本身可以指示病毒RNA，特别是逆转录病毒RNA的存在。逆转录病毒引起各种疾病，例如癌症、AIDS、自身免疫性以及中枢神经系统、骨骼和关节疾病，例如髓样白血病、红细胞系白血病、淋巴样白血病、淋巴瘤、肉瘤、乳腺癌、肾癌、再生障碍性贫血、溶血性贫血、自身免疫性疾病、免疫缺陷、骨硬化病、关节炎（arthritiy）、周围神经病（peripheral neuropathy）、脑病、神经变性、痴呆、肺炎和腺瘤病。诱导此类疾病的病毒包括人类免疫缺陷病毒（HIV）、人T淋巴病毒（HTLV）、劳斯肉瘤病毒（RSV）和鼠乳腺肿瘤病毒（MMTV）。然而，RNA标记物可以指示基因表达。许多基因仅在特定条件（包括疾病条件）下或由特定物种表达。相应地，蛋白质（或相应mRNA）的存在可以指示疾病状态、细胞或病原体 - 仅提及其中一些。例如，癌细胞的特征在于特定标记物，其核酸可以用于其检测和定量。可以提及的实例是：尤其是癌基因和肿瘤抑制基因，例如p53，ras家族的基因erb-B2、c-myc、mdm2、c-fos、DPC4、FAP、nm23、RET、WT1等等，例如关于p53、DCC、APC、Rb等等的LOH，以及遗传性肿瘤中的BRCA1和BRCA2，MSH2、MLH1、WT1等等的微卫星不稳定性；以及肿瘤RNA，例如CEA，细胞角蛋白例如CK20、BCL-2、MUC1，特别是其肿瘤特异性剪接变体、MAGE3、Muc18、酪氨酸酶、PSA、PSM、BA46、Mage-1等等，或其它形态发生RNA，例如乳腺丝抑蛋白、hCG、GIP、胃动素、hTG、SCCA-1、AR、ER、PR、各种激素等等；--此外，尤其是影响转移概况的RNA和蛋白质，即涉及血管生成、运动、粘附和基质降解的分子的表达，例如bFGF、bFGF-R、VEGF、VEGF-Rs例如VEGF-R1或VEGF-R2、E-钙粘蛋白、整联蛋白、选择素、MMP、TIMP、SF、SF-R等等、细胞周期概况或增殖概况例如细胞周期蛋白（例如，细胞周期蛋白D、E和B的表达比）、Ki67、p120、p21、PCNA等等，或凋亡概况例如FAS（L+R）、TNF（L+R）、穿孔素、颗粒酶B、BAX、bcl-2、半胱天冬酶3等等。可替代地，RNA可以指示除逆转录病毒外的病原体的DNA。
在该方法的第一步中，在有助于突变型RT的活性的条件下，使样品与本发明的突变型RT接触。合适的条件在本文中详述，并且是本领域技术人员众所周知的。接触的样品可以是怀疑含有所讨论的RNA的任何样品，包括来自受试者的样品。样品是有限数量的材料，其预期与较大量的该材料相同并且代表较大量的该材料。获得样品的行动可以由个人或自动完成。样品可以获取或提供用于测试、分析、检查、调查、演示或试验用途。有时，采样可以持续进行。样品可以包含固体、液体或气体或者由其组成；它可能是具有某些中间特征的材料，例如凝胶或痰、组织、生物体或这些的组合。优选地，样品是允许容易分配的液体或悬浮液。
即使材料样品不能计数为各个项目，样品的数量仍可以按照其体积、质量、大小或其它此类尺寸来描述。固体样品可以分成一个或几个不连续的片，或者可以是碎片、颗粒或粉末状的。
在本上下文中，样品是一定数量的材料，其怀疑含有待检测或测量且定量的一种或多种核酸。如本文使用的，该术语包括但不限于样本（例如，活组织检查或医学样本）、培养物（例如，微生物培养物）、或环境样品例如水或土壤。样品可以来自受试者，例如动物或人，它们可以是流体、固体（例如粪便）、悬浮液或组织。术语“来自受试者的样品”包括从任何给定受试者分离的所有生物流体、排泄物和组织。优选地，受试者是动物，更优选哺乳动物，或再更优选人。样品可以得自驯养动物的所有各种科以及未驯服或野生动物，包括但不限于此类动物如有蹄类动物、熊、鱼类、啮齿类动物等。
如上文详述的，“样品”意指一定数量的材料，其怀疑含有待定量的目标核酸。如本文使用的，该术语包括样本（例如，活组织检查或医学样本）或培养物（例如，微生物培养物）。样品可以来自植物或动物，包括人，它可以是流体、固体（例如粪便）或组织。样品可以包括从患者获取的材料，包括但不限于培养物、血液、唾液、脑脊髓液、胸膜液、乳、淋巴、痰、精子、针抽吸物等等。样品可以得自驯养动物的所有各种科以及未驯服或野生动物，包括但不限于此类动物如有蹄类动物、熊、鱼类、啮齿类动物等。关于人样品或“组织样品”或“患者样品”或“患者细胞或组织样品”或“样本”，各自意指从受试者或患者的组织中获得的相似细胞或者生物或生化化合物的集合。组织样品的来源可以是如来自新鲜、冷冻和/或保存的器官或组织样品或活组织检查或抽吸物的固体组织；血液或任何血液组成成分；体液，例如脑脊髓液、羊水、腹膜液或间质液；或者来自受试者妊娠或发育的任何时候的细胞。组织样品可以含有在自然界中并非天然与组织混杂的化合物，例如防腐剂、抗凝剂、缓冲液、固定剂、营养物、抗生素等等。
样品的实例包括但不限于细胞或组织培养物、血液、血清、血浆、针抽吸物、尿、精子、精液、精浆、前列腺液、排泄物、眼泪、唾液、汗、活组织检查、腹水、脑脊髓液、胸膜液、羊水、腹膜液、间质液、痰、乳、淋巴、支气管及其它灌洗液样品、或组织提取物样品。样品的来源可以是如来自新鲜、冷冻和/或保存的器官或组织样品或活组织检查或抽吸物的固体组织；或者来自受试者妊娠或发育的任何时候的细胞。在该方法的一个优选实施方案中，样品选自体液、血液、血浆、血清、尿、胆汁、脑脊髓液、拭子、临床样本、器官样品和组织样品，特别是人、动物或植物，尤其是人。可替代地或另外地，样品已得自细胞培养物、怀疑被污染的来源或受试者，特别地其中所述受试者选自人、动物和植物，尤其是人。
在步骤a）后，使用本发明的突变型RT，从RNA标记物合成cDNA。上文给出了关于这个步骤的详细信息。其后，检测合成的cDNA的存在，从而检测样品中的RNA标记物。用于检测DNA的方法是本领域众所周知的，并且包括PCR方法、具有标记（例如放射性或荧光）的特异性探针或嵌入剂的使用。在一个优选实施方案中，与实时PCR组合的逆转录酶用于RNA标记物的检测。
本发明的方法和用途在医学领域例如诊断或治疗监测中是特别有利的，并且可以用于检测和/或定量指示特定微生物、细胞、病毒、细菌、真菌、哺乳动物物种、遗传状况或疾病的目标核酸。据此，该方法可以用于病原体的检测。病原体具有引起疾病的潜力。通常，病原体用于描述传染剂，例如病毒、细菌、朊病毒、真菌或甚至另一种微生物。当然，本发明的方法也可以用于检测非致病性微生物。相应地，在该方法的另一个优选实施方案中，RNA标记物指示微生物、细胞、病毒、细菌、真菌、哺乳动物物种、遗传状况或疾病。
示例性病原体包括但不限于：
- 细菌：链球菌属（Streptococcus）、葡萄球菌属（Staphylococcus）、假单胞菌属（Pseudomonas）、伯克霍尔德氏菌属（Burkholderia）、分枝杆菌属（Mycobacterium）、衣原体属（Chlamydophila）、埃立克体属（Ehrlichia）、立克次氏体属（Rickettsia）、沙门氏菌属（Salmonella）、奈瑟菌属（Neisseria）、布鲁氏菌属（Brucella）、分枝杆菌属、诺卡氏菌属（Nocardia）、李斯特菌属（Listeria）、弗朗西斯氏菌属（Francisella）、军团菌属（Legionella）和耶尔森氏菌属（Yersinia）
- 病毒：腺病毒、单纯疱疹病毒、水痘带状疱疹病毒、巨细胞病毒、乳头状瘤病毒、乙型肝炎病毒、丙型肝炎病毒、戊型肝炎病毒、脊髓灰质炎病毒、黄热病病毒、登革热病毒、西尼罗河病毒、TBE病毒、HIV、流感病毒、拉沙病毒、轮状病毒和埃博拉病毒
- 真菌：假丝酵母属（Candida）、曲霉菌属（Aspergillus）、隐球菌属（Cryptococcus）、组织胞浆菌属（Histoplasma）、肺孢子虫属（Pneumocystis）和葡萄穗霉属（Stachybotrys）
- 寄生虫：原生动物寄生虫、蠕虫寄生虫和节肢动物寄生虫
显而易见的是病原体的可靠检测和任选的定量在诊断疾病的存在和严重性方面可能具有高度相关性。
除非另有定义，否则本文中使用的所有技术和科学术语以及任何首字母缩略词具有与本发明领域的普通技术人员通常理解相同的含义。分子生物学中的常见术语的定义可以在以下中找到：由Oxford University Press，1994（ISBN 0-19-854287-9）出版的Benjamin Lewin，Genes V；由Blackwell Science Ltd.，1994（ISBN 0-632-02182-9）出版的Kendrew等人（编辑），The Encyclopedia of Molecular Biology；以及由VCHPublishers，Inc.，1995（ISBN 1 -56081 -569-8）出版的Robert A. Meyers（编辑），Molecular Biology and Biotechnology: a Comprehensive Desk Reference。
本发明并不限于本文描述的特定方法、方案和试剂，因为它们可以变化。尽管本文描述了优选的方法和材料，但与本文描述的那些类似或等价的任何方法和材料都可以用于本发明的实践中。进一步地，本文使用的术语仅用于描述特定实施方案的目的，并不预期限制本发明的范围。
如本文和所附权利要求中使用的，除非上下文另有明确说明，否则单数形式“一个”、“一种”和“该/所述”包括复数指示物。类似地，单词“包含”、“含有”和“涵盖”被解释为包括在内而不是排他。类似地，除非上下文另有明确说明，否则单词“或”预期包括“和”。术语“多个”指两个或更多个。
下述附图和实施例预期示出本发明的各种实施方案。就其本身而言，所讨论的具体修改不应解释为对本发明范围的限制。对于本领域技术人员将显而易见的是，可以作出各种等价方案、改变和修改，而不背离本发明的范围，并且因此应理解，此类等价实施方案包括在本文中。
附图
图1：突变型RT MM3.14的核苷酸序列（SEQ ID NO：3）和氨基酸序列（SEQ ID NO：2）。指出了关于野生型的六个强制性突变（取代A32V、L72R、E286R、E302K、W388R和L435R）。
图2：用于MMLV-RT的表达质粒。星号指示终止密码子。
图3：单个变体的活性和稳定性。（A）比活性。dTTP掺入反应在37℃下进行。一个单位定义为在10分钟内将1 nmol的dTTP掺入聚（rA）-p（dT）15内的量。相对比活性定义为变体的比活性与WT的比活性的比率。（B、C）热稳定性。在聚（rA）-p（dT）15（28 µM）的存在下，使以100 nM的RT在46℃（B）或49℃（C）下温育10分钟。然后，在37℃下进行dTTP掺入反应。相对活性定义为具有在46或49℃下的10分钟温育的RT的初始反应速率与不含温育的初始反应速率的比率。
图4：多重变体的活性和稳定性。（A、B）比活性。（A）dTTP掺入反应以5 nM RT在37℃下进行。一个单位定义为在10分钟内将1 nmol的dTTP掺入聚（rA）-p（dT）15内的量。相对比活性定义为变体的比活性与WT的比活性的比率。（B）PicoGreen掺入反应以5 nM RT在37℃下进行。计算初始反应速率（ΔFI/分钟），并且用作为1.0的WT的初始反应速率进行标准化。（C−F）热稳定性。在聚（rA）-p（dT）15（28 µM）的存在下，使以100 nM的RT在49或51℃下温育10分钟。然后，dTTP掺入反应（C、E）或PicoGreen掺入反应（D、F）以10 nM RT在37℃下进行。相对活性定义为具有10分钟热处理的RT的初始反应速率与不含10分钟热处理的RT的的比率。
图5：通过WT、MM3或MM3.14的cDNA合成的温度依赖性。cDNA合成反应在50（A）、55（B、C）、60（D）或65℃（E）下进行10分钟，使用已接受在55℃下5分钟的热温育的RT（B）或不含热温育的RT（A、C-E）。然后，进行PCR。显示了使用cDNA合成产物的实时PCR的荧光。交叉点（CP）对于WT、MM3和MM3.14分别为28.01、25.22和25.67分钟（A），对于MM3和MM3.14分别为24.95和26.74分钟（B），对于MM3.14为30.52分钟（C），对于MM3和MM3.14分别为28.48和29.14分钟（D），且对于MM3.14为32.51分钟（E）。
图6：如通过cDNA合成评价的WT、MM3或MM3.14的稳定性。在聚（rA）-p（dT）15（28 µM）的存在下，使以100 nM的RT在48、54、57、60或63℃下温育10分钟。然后，cDNA合成用16 pgcesA RNA、0.5 µM RV-R26引物在45℃下进行30分钟。用RV和F5的引物组合进行PCR。将扩增产物施加到1%琼脂糖凝胶上，随后为用溴化乙锭（1 µg/ml）的染色。
实施例
方法
RT浓度和标准RNA
如根据Bradford的方法（Bradford，1976），使用Protein Assay CBB Solution（Nacalai Tesque，Kyoto，日本），用牛血清白蛋白（Nacalai Tesque）作为标准，确定RT浓度。通过体外转录制备标准RNA，其为1014个核苷酸的RNA，对应于蜡样芽孢杆菌（Bacillus cereus）的cesA基因的DNA序列8353-9366（GenBank登录号DQ360825）。
质粒的构建
MMLV RT变体的表达质粒通过定点诱变进行构建，使用用于野生型MMLV RT的表达质粒pET-MRTHis（图2）、或用于热稳定变体MM3的表达质粒pET-MM3作为模板，以及大肠杆菌BL21（DE3）[F -，ompT，hsdS B（ r B - m B -）gal dcm（DE3）]作为宿主。验证了突变的MMLV RT基因的核苷酸序列。
单个MMLV RT变体的表达和纯化
用转化的BL21（DE3）的甘油原液接种3 ml含有50 μg/ml氨苄青霉素的L肉汤培养基，并且在30℃下伴随振荡温育16小时。RT基因的表达通过自动诱导系统（Novagen，Darmstadt，德国）诱导。使用HisLink Spin Protein Purification System（Promega，Madison，WI），从培养基中纯化MMLV RT。简言之，通过FastBreak Cell Lysis Reagent破坏细菌细胞，随后为将HisLink Protein Purification Resin加入培养物中。然后将样品转移到HisLinkSpin Column，在其中冲洗掉未结合的蛋白质。通过用0.2 ml 100 mM HEPES-NaOH缓冲液（pH 7.5）、500 mM咪唑的洗脱，来回收MMLV RT。使用预填充的PD-10凝胶过滤柱（GEHealthcare），使活性级分脱盐，所述柱用50 mM Tris-HCl缓冲液（pH 8.3）、200 mM KCl、50%甘油平衡，并且贮存于-80℃下。
多重MMLV RT变体的表达和纯化
将转化体的过夜培养物（5 mL）加入500 mL含有氨苄青霉素（50 μg/ml）的L肉汤培养基中，并且在37℃下伴随振荡温育。当OD 660达到0.6–0.8时，添加0.15 mL 0.5 M IPTG，并且在30℃下继续生长3小时。在以10,000 × g离心5分钟后，收获细胞，用含有10 mM苯甲基磺酰氟（PMSF）的10 mL 0.02 M磷酸钾缓冲液（pH 7.2）、2.0 mM二硫苏糖醇（DTT）、10%甘油（缓冲液A），pH 7.5悬浮，并且通过超声处理破坏。在以20,000 × g离心40分钟后，收集上清液，并且施加于用缓冲液A平衡的用Toyopearl DEAE-650M凝胶（Tosoh，Tokyo，日本）填充的柱[25 mm（内径）× 120 mm]。在用含有120 mM NaCl的缓冲液A洗涤后，用含有300 mM NaCl的缓冲液A洗脱结合的RT。将固体（NH4）2SO4加入洗脱液（30 mL）中至40%饱和的最终浓度。将溶液搅拌5分钟，并且在冰上静置30分钟。在4℃下以20,000 × g离心30分钟后，将团块收集并且溶解于10 mL含有100 mM NaCl的缓冲液A中。将该溶液施加于用Ni2+-琼脂糖（HisTrapHP 1 mL，GE Healthcare，Buckinghamshire，UK）填充的柱，所述柱用50 mM Tris-HCl缓冲液（pH 8.3）、200 mM KCl、2 mM DTT、10%甘油（缓冲液B）平衡。在用含有50 mM咪唑的缓冲液B洗涤后，用含有500 mM咪唑的缓冲液B洗脱结合的RT。使用预填充的PD-10凝胶过滤柱，使活性级分脱盐，所述柱用50 mM Tris-HCl缓冲液（pH 8.3）、200 mM KCl、50%甘油平衡，并且贮存于-80℃下。
SDS-PAGE
在还原条件下，在10%聚丙烯酰胺凝胶中执行SDS-PAGE。蛋白质通过在100℃下用2.5%的2-巯基乙醇处理10分钟来还原，然后施加到凝胶上。施加40 mA的恒定电流40分钟。在电泳后，蛋白用考马斯亮蓝R-250染色。由兔肌肉磷酸化酶B（97.2 kDa）、牛血清白蛋白（66.4kDa）、鸡蛋清卵白蛋白（44.3 kDa）和牛碳酸酐酶（29.0 kDa）组成的分子量标记物试剂盒是Takara Bio Inc（Otsu，日本）的产品。
使用[3H]-dTTP的逆转录测定
通过使（dT）15（Fasmac，Tokyo，日本）和聚（rA）（GE Healthcare，Buckinghamshire，UK）退火制备聚（rA）-p（dT）15。反应在25 mM Tris-HCl缓冲液（pH 8.3）、50 mM KCl、2 mM DTT、5mM MgCl2、25 µM聚（rA）-p（dT）15（这个浓度基于p（dT）15表示）、0.2 mM [3H]dTTP（1.85 Bq/pmol）（GE Healthcare）和5或10 nM MMLV RT中在37℃下进行。在3和6分钟时，从反应混合物中取出等分试样（20 μl），并且立即点样到玻璃过滤器上。通过各10分钟的冷5%（w/v）三氯乙酸（TCA）的三次洗涤，随后为冷95%乙醇的一次洗涤，来去除未掺入的[3H]dTTP。在2.5ml Ecoscint H（National Diagnostics，Yorkshire，UK）中计数保留在干燥过滤器上的放射性。由掺入[3H]dTTP的时间过程估计初始反应速率。
使用荧光染料PicoGreen的逆转录测定
使用EnzChek Reverse Transcriptase Assay Kit（Thermo Fisher Scientific，Waltham，MA）。通过添加19 ml水稀释20×TE缓冲液（1 ml），以制备1×TE缓冲液。通过添加17.5 ml 1×TE缓冲液稀释PicoGreen dsDNA定量试剂（50 µl），以制备PicoGreen溶液。用于热灭活的聚（rA）-p（dT）16如下制备：将聚（rA）（3 µl，在100 mM Tris-HCl缓冲液（pH8.1）、0.5 mM EDTA中1 mg/ml；约350个碱基）和p（dT）16（3 µl，在100 mM Tris-HCl缓冲液（pH 8.1）、0.5 mM EDTA中50 µg/ml）混合，并且在室温下静置1小时，随后为用114 µl PDGT（0.01 M磷酸钾缓冲液（pH 7.6）、2 mM DTT、10%甘油、0.2% Triton X-100）的稀释。将MMLVRT（8 µl 500 nM）、聚（rA）-p（dT）16（8 µl）和PDGT（64 µl）混合，以制备50 nM的MMLV RT浓度。使所得到的溶液（80 µl中的40 µl）在49或51℃下温育10分钟，随后为在冰上温育30分钟。
用于逆转录测定的聚（rA）-p（dT）16如下制备：将聚（rA）（5 µl）和p（dT）16（5 µl）混合，并且在室温下静置1小时，随后为用2 ml聚合缓冲液（60 mM Tris-HCl缓冲液（burrer）（pH 8.1）、60 mM KCl、8 mM MgCl2、13 mM DTT和100 µM dTTP）的稀释。使暴露于或未暴露于热处理的聚（rA）-p（dT）16（96 µl）和40 µl 25或50 nM MMLV RT在37℃下温育10分钟。通过将预温育的MMLV RT溶液（24 µl）加入预温育的聚（rA）-p（dT）16溶液（96 µl）中，来起始反应。在2.5、5.0、7.5和10分钟时，从反应混合物中取出等分试样（25 µl），立即向其中加入2µl 200 mM EDTA，随后为在冰上温育30分钟或更长时间。通过混合聚（rA）-p（dT）16溶液（20µl）和200 mM EDTA（2 µl），随后为添加MMLV RT溶液（5 µl），来制备空白溶液。向每种溶液（27 µl）中加入PicoGreen溶液（173 µl）。用铝箔包裹试管，并且在室温下静置10分钟。用EnSight（Perkin Elmer）以502 nm的激发波长，测量在523 nm下的荧光。
cDNA合成
通过体外转录制备标准RNA，其为1,014个核苷酸的RNA，对应于蜡样芽孢杆菌的cesA基因的DNA序列8,353-9,366（GenBank登录号DQ360825）。通过混合水（12 µl）、10×RT缓冲液（250 mM Tris-HCl缓冲液（pH 8.3）、500 mM KCl、20 mM DTT、50 mM MgCl2）（2 μl）、2.0 mMdNTP（1 μl）、160 pg/μl cesA RNA（2 μl）、10 μM RV-R26引物5'-TGTGGAATTGTGAGCGGTGTCGCAATCACCGTAACACGACGTAG-3'（SEQ ID NO：4）（1 μl）和10 nM MMLV RT WT（2 µl），来制备用于cDNA合成的反应混合物（20 μl）。反应在45℃下运行30分钟且在65℃下运行5分钟。通过将cDNA合成的反应产物（2 µl）、水（17.7 µl）、10×PCR缓冲液（2.5 µl）、2 mM dNTP（1.5µl）、10 µM F5引物5'-TGCGCGCAAAATGGGTATCAC-3'（SEQ ID NO：5）（0.5 µl）和10 µM RV引物5'-TGTGGAATTGTGAGCGG-3'（SEQ ID NO：6）（0.5 µl）和Taq聚合酶（0.3 µl）混合，来制备用于PCR的反应混合物（25 µl）。反应在95℃下30秒、55℃下30秒和72℃下60秒的30个循环下运行。扩增的产物在1.0% w/v琼脂糖凝胶上分开，并且用溴化乙锭（1 µg/ml）染色。
实施例1：突变的设计和单个变体的表征
我们先前通过在已牵涉与模板-引物的相互作用的位置处引入正电荷，来生成热稳定的三重MMLV RT变体MM3（E286R/E302K/L435R）（Yasukawa等人，2010）。为了进一步稳定MMLVRT，我们设计了29个突变（表1）。它们是旨在稳定疏水核心的8个突变，旨在引入盐桥的8个突变，旨在引入表面电荷的10个突变以及旨在避免二硫键的三个突变。
Figure 235067DEST_PATH_IMAGE006
野生型MMLV RT（WT）、29种单个变体和一种双重变体Y146F/D361L在3-ml培养物中表达，并且从细胞中纯化。还制备了热稳定的四重变体MM4（E286R/E302K/L435R/D524A）（Yasukawa等人，2010）。MM4缺乏RNA酶H活性，因为Asp524是关于RNA酶H活性的催化残基。在还原条件下的SDS-PAGE后，纯化的WT和变体产生分子量为75 kDa的单个条带。
图3A显示了关于WT和30种变体的逆转录反应的比活性。WT的比活性为14,000单位/mg。所有变体可以分为三组。组1包含其比活性小于WT的比活性的10%的V43E、A154I、I261F、L357D、L368R和V370E。组2包含其比活性是WT的比活性的60−140%的L41D、Q63E、L72R、L272E、W388R和L410R。组3包含其比活性是WT的比活性的10−60%的其它18种变体。
图3B和C显示了WT、MM4和属于组2或组3的24种变体分别在49和51℃下的稳定性。相对活性定义为在T/P的存在下，关于在49或51℃下的10分钟温育的初始反应速率与不含温育的速率的比率。WT和D524A在49℃下的相对活性分别为66和120%，并且在51℃下的相对活性分别为18和100%。在49或51℃下，没有变体显示出比MM4更高的相对活性。然而，在49和51℃两者下，A32V、L72R、I212R、L272E、W388R和C409R显示出比WT更高的相对活性。
实施例2：突变组合的设计和多重变体的表征
基于图3中呈现的结果，选择四个突变（Ala32→Val、Leu72→Arg、Ile212→Arg、Leu272→Glu和Trp388→Arg）作为稳定突变，并且选择一个突变（Leu41→Asp）作为激活突变。通过组合六个突变中的一个、两个或三个和MM3突变（Glu286→Arg、Glu302→Lys和Leu435→Arg）来设计十种变体（MM3.1−MM3.10）（表2）。
Figure 236521DEST_PATH_IMAGE007
它们在大肠杆菌中表达并纯化。在还原条件下的SDS-PAGE后，纯化的变体产生分子量为75 kDa的单个条带。从500 ml培养物中纯化的酶的产率在0.38−4.26 mg的范围内，其与WT的产率（2.27 mg）相当（表3）。
表3. 通过使用[3H]-dTTP的测定的MMLV RT变体的产率、活性和稳定性
Figure 622372DEST_PATH_IMAGE008
a反应在5 nM RT、25 mM Tris-HCl缓冲液（pH 8.3）、50 mM KCl、2 mM DTT、5 mMMgCl2、25 μM聚（rA）-p（dT）15（这个浓度基于p（dT）15表示）和0.2 mM [3H]dTTP中在37℃下进行。一个单位定义为在10分钟内将1 nmol的dTTP掺入聚（rA）-p（dT）15内的量。
b括号中的数字指示相对于WT（野生型）的值。
图4A和表3显示了通过使用[3H]-dTTP的逆转录测定的活性。通过使用荧光染料PicoGreen的测定来评价稳定性。MM3.2（L272E/E286R/E302K/L435R）缺乏活性，指示Leu272→Glu突变与MM3突变不相容。其它九种变体（MM3.1和MM3.3−MM3.10）的比活性是WT的比活性的30−100%。
表4. 通过使用[3H]-dTTP测定的MMLV RT变体的稳定性。
Figure 760092DEST_PATH_IMAGE009
a反应在10 nM RT、25 mM Tris-HCl缓冲液（pH 8.3）、50 mM KCl、2 mM DTT、5 mMMgCl2、25 μM聚（rA）-p（dT）15（这个浓度基于p（dT）15表示）和0.2 mM [3H]dTTP中在37℃下进行。一个单位定义为在10分钟内将1 nmol的dTTP掺入聚（rA）-p（dT）15内的量。
b在聚（rA）-p（dT）15（28 µM）的不存在或存在下，使以100 nM的RT在49或51℃下温育10分钟。然后，在37℃下进行dTTP掺入反应。
c括号中的数字指示相对活性，其定义为具有温育的初始反应速率与不含温育的的初始反应速率的比率。
d未测试。
图4C和表4显示了如通过使用[3H]-dTTP的测定评价的稳定性，并且图4D显示了如通过使用PicoGreen的测定评价的稳定性。MM3.3、MM3.5、MM3.7、MM3.8、MM3.9和MM3.10的相对活性与MM3的相对活性相当，而MM3.1、MM3.4和MM3.6的相对活性低于MM3。MM3.6（L41D/E286R/E302K/L435R）的相对活性与WT的相对活性几乎相同，指示Leu41→Asp突变与MM3突变不相容。
另外，通过组合四个突变（Ala32→Val、Leu72→Arg、Ile212→Arg和Trp388→Arg）中的两个或更多个设计了五种变体（MM3.11−MM3.15；参见表2）。MM3.11未表达，但其它四种变体（MM3.12−MM3.15）在大肠杆菌中表达并纯化。图4E和4F分别显示了如通过使用[3H]-dTTP和PicoGreen的分析评价的稳定性。MM3.14的相对活性优于MM3的相对活性，而MM3.12、MM3.13和MM3.15的相对活性低于MM3。
进一步评估MM3.14。图5显示了通过WT、MM3或MM3.14对cDNA合成的温度依赖性。在cDNA合成反应后，进行实时PCR。当在55、60或65℃下用MM3.14进行cDNA合成反应10分钟时，PCR中的荧光增加。另一方面，当用WT或MM3进行cDNA合成反应时，则并非如此。这指示MM3.14比MM3更热稳定，且更适合用于cDNA合成中。
图6显示了WT、MM3和MM3.14的热稳定性的比较。cDNA合成反应用暴露于48–63℃共10分钟的WT、MM3或MM3.14在45℃下进行30分钟。使反应产物进行PCR，随后为琼脂糖凝胶电泳。合成cDNA的最高温度对于MM3为60℃。
在进一步的实验中，证明了cDNA在使用MM3.14（A32V/L72R/E286R/E302K/W388R/L435R）的反应中，在60和65℃下合成，而它在使用MM3（E286R/E302K/L435R）的反应中，在60℃下合成很少且在65℃下不合成，指示MM3.14在反应中比MM3更热稳定。
总之，可以证明MM3.14比MM3更热稳定。
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Claims (15)

1.一种相对于SEQ ID NO：1的野生型逆转录酶（RT）具有增加的热稳定性的突变型RT，所述突变型RT包含
i）相对于SEQ ID NO：1的野生型RT具有六个氨基酸取代的氨基酸序列，其中
- 在位置32处的Ala被Val取代（A32V）；
- 在位置72处的Leu被Arg取代（L72R）；
- 在位置286处的Glu被Arg取代（E286R）；
- 在位置302处的Glu被Lys取代（E302K）；
- 在位置388处的Trp被Arg取代（W388R）；和
- 在位置435处的Leu被Arg取代（L435R），或
ii）与i）的氨基酸序列至少95%相同，且具有如i）中定义的六个氨基酸取代的氨基酸序列，
其中所述突变型RT显示出逆转录酶活性。
2.权利要求1的突变型RT，其中所述突变型RT与SEQ ID NO：1的氨基酸序列另外相差在SEQ ID NO：1的N末端处的至多五个氨基酸的缺失、和/或在SEQ ID NO：1的C末端处的至多五个氨基酸的缺失。
3.权利要求1或2的突变型RT，其中所述突变型RT包含氨基酸序列或由氨基酸序列组成，所述氨基酸序列与SEQ ID NO：2的氨基酸序列至少96%、97%、98%或99%，特别是100%相同。
4.权利要求1至3中任一项的突变型RT，其中所述突变型RT具有相对于突变型MM3增加的热稳定性，其中MM3具有与SEQ ID NO：1的氨基酸序列仅相差三个氨基酸取代的氨基酸序列，其中在位置286处的Glu被Arg取代（E286R），在位置302处的Glu被Lys取代（E302K），并且在位置435处的Leu被Arg取代（L435R）。
5.权利要求1-4中任一项的突变型，其中通过测量在热处理后，特别是在60℃下温育10分钟后测量的突变型的逆转录酶活性来测定热稳定性，和/或其中相对于野生型或突变型MM3，热稳定性增加至少10%、20%、30%或40%，优选至少50%。
6.权利要求1-5中任一项的突变型，其中所述突变型RT的逆转录酶活性是野生型的逆转录酶活性的至少50%，特别是至少60%，更特别是至少70%，尤其是至少80%，和/或其中所述逆转录酶活性通过在37℃下RT介导的dTTP掺入来确定。
7.权利要求1至6中任一项的突变型RT，其与另外的蛋白质融合。
8.一种核酸，其编码权利要求1至7中任一项的突变型RT。
9.一种细胞，其包含权利要求1至7中任一项的突变型RT或权利要求8的核酸。
10.一种用于执行逆转录的试剂盒，其包含权利要求1至7中任一项的突变型RT。
11.权利要求1至7中任一项的突变型RT用于cDNA合成的用途。
12.一种用于RNA逆转录的方法，所述方法包括使用权利要求1至7中任一项的突变型RT，从RNA合成cDNA。
13.一种用于检测样品中的RNA标记物的方法，
a）在有助于突变型RT活性的条件下，使样品与权利要求1至7中任一项的突变型RT接触；
b）使用所述突变型RT，从所述RNA标记物合成cDNA；和
c）检测步骤b）中合成的cDNA的存在，从而检测所述样品中的RNA标记物。
14.权利要求13的方法，其中所述样品选自体液、血液、血浆、血清、尿、胆汁、脑脊髓液、拭子、临床样本、器官样品和组织样品，和/或其中所述样品已得自细胞培养物、怀疑被污染的来源或受试者，特别地其中所述受试者选自人、动物和植物，尤其是人。
15.权利要求13或14的方法，其中所述RNA标记物指示微生物、细胞、病毒、细菌、真菌、哺乳动物物种、遗传状况或疾病。
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SE01 Entry into force of request for substantive examination
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GR01 Patent grant
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