WO2021020245A1 - 安定性に優れた変異型逆転写酵素 - Google Patents

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WO2021020245A1
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reverse transcriptase
amino acid
mutant
acid sequence
mutant reverse
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貴圭 肥山
奨 横江
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東洋紡株式会社
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    • C12N9/10—Transferases (2.)
    • C12N9/12—Transferases (2.) transferring phosphorus containing groups, e.g. kinases (2.7)
    • C12N9/1241—Nucleotidyltransferases (2.7.7)
    • C12N9/1276—RNA-directed DNA polymerase (2.7.7.49), i.e. reverse transcriptase or telomerase
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
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    • C12P19/00—Preparation of compounds containing saccharide radicals
    • C12P19/26—Preparation of nitrogen-containing carbohydrates
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    • C12Y207/07—Nucleotidyltransferases (2.7.7)
    • C12Y207/07049—RNA-directed DNA polymerase (2.7.7.49), i.e. telomerase or reverse-transcriptase
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
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    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/70—Vectors or expression systems specially adapted for E. coli

Definitions

  • the present invention relates to mutant reverse transcriptase. More specifically, the present invention relates to a mutant reverse transcriptase having excellent storage stability and thermal stability over time, a reverse transcriptase method using the mutant reverse transcriptase, and a poly encoding the mutant reverse transcriptase. It relates to a nucleotide, a kit containing the mutant reverse transcriptase, and the like.
  • Reverse transcriptase generally has an activity of synthesizing cDNA using RNA as a template (hereinafter referred to as "RNA-dependent DNA polymerase activity") and an activity of degrading RNA strands in an RNA: DNA hybrid (hereinafter referred to as "RNaseH”). Has “activity”).
  • Reverse transcriptase is used, for example, for analysis of the base sequence of mRNA that directly reflects the amino acid sequence of a protein expressed in a living body, construction of a cDNA library, RT-PCR, and the like.
  • MMLV Moloney murine leukemia virus reverse transcriptase
  • AMV avian myeloblastosis virus reverse transcriptase
  • RNA secondary structure when mRNA has a base sequence that easily forms a secondary structure, the synthesis of cDNA by reverse transcriptase is hindered by the secondary structure. Therefore, the formation of the secondary structure is suppressed by raising the reaction temperature. However, it is desired to synthesize cDNA. However, the Moloney murine leukemia virus reverse transcriptase and avian myeloblastosis virus reverse transcriptase often have low thermal stability and are inactivated at high temperatures such that the formation of RNA secondary structure is suppressed. I may end up doing it.
  • Non-Patent Document 1 Non-Patent Document 1
  • reverse transcriptase is known to have low storage stability, and not only at high temperatures that suppress the formation of RNA secondary structure, but also under relatively mild conditions such as 4 ° C and 25 ° C. Even during storage, it may gradually become inactivated and lose its enzyme activity. Therefore, strict temperature control and expiration date control during storage and transportation are required.
  • the present invention has been made in view of the above-mentioned prior art, and an object of the present invention is to provide a further useful novel mutant reverse transcriptase having improved storage stability and / or thermal stability over time.
  • the present inventors have conducted diligent research, and as a result, the reverse transcriptase has improved storage stability and / or thermal stability over time by modifying the cysteine residue at a specific site of the reverse transcriptase.
  • the present invention was reached by finding that
  • a typical invention has the following configuration.
  • [Item 1] In the amino acid sequence having 90% or more identity with the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 1, from positions 90, 157, 236, 262, 310, 409, 495, and 635.
  • a mutant reverse transcriptase consisting of an amino acid sequence in which a cysteine residue is modified at a position corresponding to at least one selected from the group.
  • [Item 2] In the amino acid sequence having deletion, substitution and / or addition of one or several amino acid residues in the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 1, positions 90, 157, 236, 262 and 310.
  • the mutant reverse transcription enzyme according to Item 1 which comprises an amino acid sequence in which a cysteine residue is modified at a position corresponding to at least one selected from the group consisting of positions 409, 495, and 635.
  • Item 3 The mutant reverse transcriptase according to Item 1 or 2, wherein the modification of the cysteine residue is a deletion of the cysteine residue and / or a substitution with another amino acid residue.
  • Item 4 Any of items 1 to 3, wherein the modification of the cysteine residue is a substitution with at least one non-polar amino acid residue selected from the group consisting of alanine, glycine, valine, leucine, and isoleucine. The mutant reverse transcription enzyme described in.
  • [Item 5] The mutant reverse transcriptase according to any one of Items 1 to 4, wherein the modification of the cysteine residue is a substitution with an alanine residue.
  • the amino acid sequence having 90% or more identity with the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 1 is characterized in that the cysteine residue at the position corresponding to at least position 310 is modified.
  • the modification of the cysteine residue at the position corresponding to position 310 is a substitution with a non-polar amino acid residue selected from the group consisting of alanine, glycine, valine, leucine, and isoleucine, items 1 to 6.
  • the mutant reverse transcription enzyme according to any one of.
  • [Item 13] A vector containing the polynucleotide according to Item 12.
  • [Item 14] Cells transformed with the vector according to Item 13.
  • [Item 15] At least selected from the group consisting of the mutant reverse transcriptase according to any one of Items 1 to 11, the polynucleotide according to Item 12, the vector according to Item 13, and the cell according to Item 14.
  • [Item 17] A reverse transcriptase method for synthesizing cDNA from an RNA template using the mutant reverse transcriptase according to any one of Items 1 to 11.
  • [Item 18] A kit containing the mutant reverse transcriptase according to any one of Items 1 to 11. Item 19. The kit according to Item 18, which is used for synthesizing cDNA using RNA as a template.
  • the present invention provides a novel and useful mutant reverse transcriptase with improved storage stability and / or thermal stability over time. Since the mutant reverse transcriptase of the present invention is excellent in storage stability over time, it can be handled more easily during storage, transportation, etc., and can be a highly convenient reagent. Further, since the mutant reverse transcriptase of the present invention is excellent in thermal stability, the reverse transcriptase can be efficiently carried out even in a nucleic acid synthesis method including, for example, a step of raising the reaction temperature.
  • the mutant reverse transcriptase of the present invention is characterized in that the cysteine residue at a specific position in the wild-type reverse transcriptase is modified.
  • the present invention is based on a new finding that by modifying a cysteine residue, storage stability over time is improved, and a reverse transcriptase having excellent thermal stability can be obtained.
  • Cysteine has a thiol group and generally contributes to the maintenance of the tertiary structure of proteins through the formation of disulfide bonds and the like.
  • the present invention states that by modifying such cysteine residues (eg, deleting and / or substituting for other amino acids), the performance of reverse transcriptase is altered to improve thermostability and / or storage stability. It is a thing.
  • the cysteine residue at a predetermined position in the wild-type reverse transcriptase may be modified, and the mode of modification of the cysteine residue is not limited as long as the effect of the present invention is exhibited.
  • modification of a cysteine residue can be a deletion and / or substitution of the cysteine residue with another amino acid. From the viewpoint that a higher stabilizing effect can be more reliably achieved, substitution with other amino acid residues is preferable, and above all, substitution with non-polar amino acid residues is preferable.
  • the mutant reverse transcriptase of the present invention as described above is characterized in that it has reverse transcription activity and has improved thermal stability and / or storage stability as compared with the reverse transcriptase before modification. ..
  • the wild-type reverse transcriptase refers to a reverse transcriptase in which a mutation has not been artificially introduced.
  • WT wild-type reverse transcriptase
  • examples of the wild-type reverse transcriptase include a reverse transcriptase having the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 1.
  • amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 1 refers to the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 1 in the sequence listing (Morony mouse leukemia virus reverse transcriptase).
  • “Murine leukemia virus reverse transcriptase” may be referred to as "MMLV reverse transcriptase”.
  • the present invention may be a mutant reverse transcriptase derived from the amino acid sequence of Moloney murine leukemia virus reverse transcriptase, but has a predetermined relationship with the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 1 from the viewpoint of amino acid sequence identity and the like. It may be a mutant reverse transcriptase derived from a protein having an amino acid sequence having high homology (for example, ortholog, homolog, etc.). From the viewpoint that a high stability improving effect can be obtained more reliably, a mutant reverse transcriptase derived from the amino acid sequence of Moloney murine leukemia virus reverse transcriptase is preferable.
  • the mutant reverse transcriptase of the present invention is located at positions 90, 157, 236, 262, 310, 409, 495, and 635 in the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 1. It is characterized by being a mutant reverse transcriptase containing a modification at a cysteine residue at a position corresponding to at least one selected from the group consisting of.
  • the amino acid sequence before modification is not limited to the case where it is completely the same as SEQ ID NO: 1, and is not particularly limited as long as the reverse transcription activity is not lost.
  • the amino acid sequence before modification is the same as that of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 1.
  • amino acid sequences having an identity of 90% or more, preferably 95% or more, more preferably 96% or more, still more preferably 97% or more, even more preferably 98% or more, and particularly 99% or more.
  • identity of the amino acid sequence can be evaluated by any means known in the art. For example, it can be calculated using commercially available analysis tools available on the market or through telecommunications lines (Internet), for example, the National Center for Biotechnology Information (NCBI) homology algorithm BLAST (Basic local alignment search tool) http. : // www. ncbi. nlm. nih. By using the default (initial setting) parameters in gov / BLAST /, it is possible to calculate the identity of the amino acid sequence.
  • NCBI National Center for Biotechnology Information
  • amino acid sequence before modification may be an amino acid sequence in which one or several amino acids are deleted, substituted, and / or added in the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 1.
  • amino acid sequence before modification is not particularly limited as long as the reverse transcription activity is not lost, but for example, 1 to 20, preferably 1 to 10, more preferably 1 to 5, and even more preferably. There are 1 to 3 pieces.
  • the amino acid sequence before modification as described above may be, for example, artificially prepared by a genetic engineering technique, or may be an amino acid sequence of a naturally occurring protein.
  • the primary structure of the sequence is compared (alignment) with the site corresponding to a certain position (order) on SEQ ID NO: 1 in the amino acid sequence that is not exactly the same as the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 1.
  • this means the position corresponding to the position of SEQ ID NO: 1.
  • mutant reverse transcriptase of the present invention refers to a reverse transcriptase in which one or more amino acids are modified in the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 1 and has an amino acid sequence different from that of SEQ ID NO: 1. It does not matter whether the transcriptase is a reverse transcriptase obtained by an artificial mutation or a reverse transcriptase obtained by a mutation in nature.
  • the reverse transcription enzyme of the present invention is located at position 90 in the amino acid sequence having a predetermined relationship with the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 1 from the viewpoint of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1 or the amino acid sequence identity.
  • the cysteine residue at the position corresponding to at least one selected from the group consisting of positions 157, 236, 262, 310, 409, 495 and 635 is modified. Therefore, the mutant reverse transcriptase of the present invention may be a modified cysteine residue at a site corresponding to two or more positions in the amino acid sequence as described above, as long as the effect of the present invention is exhibited.
  • cysteine residue at the site corresponding to three or more, four or more, five or more, six or more, or seven or more positions may be modified, or all eight identified above may be modified.
  • the cysteine residue at the site corresponding to the position may be modified.
  • the mutant reverse transcription enzyme of the present invention has an amino acid sequence having a predetermined relationship with the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 1 from the viewpoint of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1 or the amino acid sequence identity.
  • the cysteine residue at at least one position selected from the group consisting of positions 90, 157, 236, 262, 310, 409, 495 and 635 is replaced with a non-polar amino acid. ..
  • the cysteine residue at the position corresponding to at least one selected from the group consisting of positions 90, 157, 236, 262, 310, 409, 495 and 635 is glycine, alanine and isoleucine.
  • Glycine, alanine, isoleucine, leucine, and valine are non-polar amino acids, all of which are known to have an isoelectric point of about 6.0, and exhibit the same effect as amino acids that can exhibit common properties. Can be expected to be done.
  • the mutant reverse transcription enzyme of the present invention is, for example, at positions 90 and 157 in the amino acid sequence having a predetermined relationship with the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 1 from the viewpoint of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1 or the amino acid sequence identity. It can be obtained by producing a protein in which a cysteine residue at a position corresponding to at least one selected from the group consisting of positions 2, 236, 262, 310, 409, 495 and 635 is modified.
  • the method for introducing an amino acid modification in the amino acid sequence can be appropriately carried out by those skilled in the art by any method known in the art.
  • a mutation is introduced into a gene encoding a wild-type reverse transcriptase, and a protein of a new mutant reverse transcriptase in which an amino acid modification is introduced at a predetermined position can be produced by a protein engineering technique.
  • a site-specific mutation introduction method based on the Inverse PCR method can be used.
  • KOD-Plus-Mutagenesis Kit manufactured by Toyo Boseki Co., Ltd.
  • the mutant reverse transcriptase of the invention may lack RNase activity.
  • RNase activity As an example of a mutant reverse transcriptase lacking RNase activity, aspartic acid at the position corresponding to position 524 is replaced with alanine, but the present invention is not limited to this.
  • the RNase activity generally possessed by wild reverse transcriptase may degrade RNA, which is a template for reverse transcriptase, and is particularly problematic when synthesizing cDNA using long RNA (for example, full-length RNA) as a template. obtain.
  • a mutant reverse transcriptase modified so as to lack RNase activity can prevent the RNA chain template from being degraded during the reverse transcription reaction using a long RNA as a template. preferable.
  • the present invention can provide a mutant reverse transcriptase with improved storage stability and / or thermal stability.
  • the mutant reverse transcriptase provided by the present invention is a mutant reverse transcriptase having excellent storage stability and thermal stability.
  • mutant reverse transcriptase for example, a mutant reverse transcriptase showing a residual activity rate of 20% or more when stored at 25 ° C. for 35 days. It can be a copy enzyme. It can be a mutant reverse transcriptase that preferably exhibits a residual activity rate of 30% or more, more preferably 40% or more, and even more preferably 50% or more. Furthermore, the mutant reverse transcriptase of the present invention, which is excellent in storage stability over time, has a residual activity rate of 20% or more, preferably 30% or more, when stored at 25 ° C. for 25 days, for example.
  • mutant reverse transcriptase that exhibits a rate, more preferably a residual activity rate of 40% or more, and even more preferably a residual activity rate of 50% or more. Further, the mutant reverse transcriptase having excellent storage stability over time of the present invention has, for example, a residual activity rate of 40% or more, preferably 45% or more, when stored at 25 ° C. for 10 days. It can be a mutant reverse transcriptase that more preferably has a residual activity rate of 50% or more, and more preferably 60% or more.
  • the mutant reverse transcriptase that exhibits such a high residual activity rate after long-term storage is, for example, the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 1 or the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 1 from the viewpoint of amino acid sequence identity. It can be appropriately obtained by a person skilled in the art by modifying the amino acid in the related amino acid sequence and evaluating the obtained mutant reverse transcriptase by measuring the residual activity rate as described below.
  • the mutant reverse transcriptase provided by the present invention which has excellent storage stability over time, is wild-type when stored at 25 ° C. for, for example, 10 days, 25 days, or 35 days. It can be a mutant reverse transcriptase that exhibits a high residual activity rate as compared with the residual activity rate of the reverse transcriptase. Specifically, for example, when stored at 25 ° C. for 10 days, the residual activity rate of the wild-type reverse transcriptase is about 1.1 times or more, preferably about 1.2 times or more, more preferably. It can be a mutant reverse transcriptase that exhibits a residual activity rate that is 1.3 times or more, more preferably about 1.4 times or more. Further, for example, when stored at 25 ° C.
  • the residual activity rate of the wild-type reverse transcriptase is about 1.1 times or more, preferably about 1.5 times or more, more preferably about 2 times or more. Of these, it can be a mutant reverse transcriptase that exhibits a residual activity rate that is four times or more higher. Further, for example, when stored at 25 ° C. for 35 days, the residual activity rate of the wild-type reverse transcriptase is about 1.1 times or more, preferably about 1.5 times or more, more preferably about 2 times or more. Of these, it can be a mutant reverse transcriptase that exhibits a residual activity rate that is about 4 times or more higher. Variant reverse transcriptases that exhibit such a high residual activity rate after long-term storage at 25 ° C.
  • the thermally stable mutant reverse transcriptase provided by the present invention is, for example, a mutant reverse transcriptase exhibiting a residual activity rate of 70% or more when heat-treated at 45 ° C. for 5 minutes.
  • the mutant reverse transcriptase having excellent thermal stability of the present invention can be, for example, a mutant reverse transcriptase showing a residual activity rate of 65% or more even when heat-treated at 45 ° C. for 10 minutes.
  • the mutant reverse transcriptase having excellent thermal stability of the present invention is, for example, a mutation exhibiting a residual activity rate of 65% or more, preferably 68% or more when heat-treated at 50 ° C. for 5 minutes. It may be a type reverse transcriptase.
  • the mutant reverse transcriptase having excellent thermal stability of the present invention is, for example, a mutant type showing a residual activity rate of 20% or more, preferably 25% or more when heat-treated at 55 ° C. for 5 minutes. It may be a reverse transcriptase.
  • the mutant reverse transcriptase that exhibits such a high residual activity rate after heat treatment has a predetermined relationship with the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 1, for example, from the viewpoint of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 1 or the amino acid sequence identity. It can be appropriately obtained by a person skilled in the art by modifying an amino acid in a certain amino acid sequence and evaluating the obtained mutant reverse transcriptase by measuring the residual activity rate as described below.
  • the thermally stable mutant reverse transcriptase provided by the present invention is, for example, when heat-treated at 45 ° C. for 5 minutes, 50 ° C. for 5 minutes, or 55 ° C. for 5 minutes.
  • It can be a mutant reverse transcriptase that shows a high residual activity rate as compared with the residual activity rate of the wild type reverse transcriptase.
  • the residual activity rate of the wild-type reverse transcriptase is about 1.1 times or more, preferably about 1.2 times or more, more preferably.
  • It can be a mutant reverse transcriptase that exhibits a residual activity rate that is 1.3 times or more, more preferably about 1.4 times or more.
  • the mutant reverse transcriptase when heat-treated at 50 ° C. for 5 minutes, shows a residual activity rate that is about 1.1 times or more, preferably about 1.2 times or more higher than that of the wild-type reverse transcriptase. It can be a copy enzyme. Further, for example, when heat-treated at 55 ° C. for 5 minutes, the residual activity rate of the wild-type reverse transcriptase is about 1.1 times or more, preferably about 1.2 times or more, more preferably about 1.4 times. As described above, the mutant reverse transcriptase preferably shows a residual activity rate that is about 1.6 times or more higher.
  • the mutant reverse transcriptase that exhibits such a high residual activity rate after heat treatment is a measurement of the residual activity rate as described below for both the wild-type reverse transcriptase and the mutant reverse transcriptase with modified amino acid residues. Can be appropriately obtained by a person skilled in the art by evaluating in the above and comparing with the value of the residual activity rate of the wild-type reverse transcriptase.
  • the reverse transcription activity of reverse transcriptase can be measured by the following operation.
  • the sample containing the measurement target may be appropriately diluted for measurement.
  • This liquid is filtered with a glass filter (GF / C filter manufactured by Watman), thoroughly washed with 0.1N hydrochloric acid and ethanol, and the radioactivity of the filter is measured using a liquid scintillation counter (Tri-Carb2810 TR manufactured by Packard). Measure nucleotide uptake.
  • One unit of enzyme activity is the amount of enzyme that incorporates 1 nmole nucleotides into the acid-insoluble fraction per 10 minutes under these conditions.
  • -Liquid A 250 mM Tris-HCl (pH 8.3), 375 mM potassium chloride, 15 mM magnesium chloride, 50 mM dithiothreitol, -Liquid B: 1 mg / mL polyA, 1 pmol / ⁇ L dT20, 10 mM dTTP, -Liquid C: [3H] -dTTP, -Liquid D: 0.07M sodium pyrophosphate, 0.7M trichloroacetic acid.
  • Each mutant reverse transcriptase to be measured is diluted to 100 U / ⁇ L with a storage buffer (50 mM Tris-HCl (pH 7.5), 300 mM KCl, 50% glycerol, 0.1 mM EDTA), and then the reverse transcriptase.
  • the reverse transcription activity value before storage is measured according to the procedure described in the method for measuring activity.
  • each mutant reverse transcriptase to be measured diluted in the above-mentioned storage buffer solution is subjected to predetermined storage conditions (specifically, when evaluating the storage stability over time, for example, at 25 ° C.).
  • the invention provides a polynucleotide encoding the mutant reverse transcriptase of the invention as described above.
  • the polynucleotide encoding the mutant reverse transcriptase refers to a polynucleotide from which the protein of the mutant reverse transcriptase of the present invention can be obtained, for example, when it is expressed by a conventional method. That is, it refers to a polynucleotide composed of a base sequence corresponding to the amino acid sequence of the protein of the mutant reverse transcriptase of the present invention.
  • Those skilled in the art can easily determine the base sequence corresponding to a predetermined amino acid sequence according to a codon table or the like well known in the art.
  • the polynucleotide encoding the mutant reverse transcriptase of the present invention also includes polynucleotides that differ due to codon decompression.
  • the polynucleotide can be any nucleic acid polymer such as DNA or RNA.
  • the present invention provides a vector containing the polynucleotide.
  • the polynucleotide encoding the above-mentioned mutant reverse transcriptase is transferred to a vector (for example, an expression vector, a cloning vector, etc.) as needed.
  • the vector may be any as long as it enables cloning and / or expression of the mutant reverse transcriptase of the present invention, and examples thereof include a plasmid.
  • the plasmid include, but are not limited to, pUC118, pUC18, pBR322, pBluescript, pLED-M1, p73, pGW7, pET3a, pET8c and the like.
  • the invention provides cells transformed with the vector. Such cells can be suitably used for expressing the protein encoding the mutant reverse transcriptase of the present invention.
  • the recombinant host cell of the invention is obtained by transforming the host cell with the expression vector described above. Examples of the host cell include Escherichia coli and yeast, and Escherichia coli is particularly preferable. Examples of Escherichia coli include Escherichia coli DH5 ⁇ , JM109, HB101, XL1Blue, PR1, HS641 (DE3), BL21 (DE3) and the like. That is, in the present invention, it is preferable to insert the gene encoding the above-mentioned mutant reverse transcriptase into the above vector to form an expression vector, and further transform the host cell with the expression vector.
  • the expression vector of the present invention may contain elements to facilitate purification of the mutant reverse transcriptase, such as extracellular secretory signals, His tags, and the like.
  • a method of producing the mutant reverse transcriptase using a reagent comprising the polynucleotide, the vector, the transformed cell, and / or one or more of them.
  • a reagent comprising the polynucleotide, the vector, the transformed cell, and / or one or more of them.
  • a reagent comprising the polynucleotide, the vector, the transformed cell, and / or one or more of them.
  • Any known method may be used for crushing the cells, and for example, sonication, a physical crushing method such as French press or glass bead crushing, or a lytic enzyme such as lysozyme can be used. Any method may be used for obtaining the purified reverse transcription enzyme from the obtained crude enzyme solution, and for example, centrifugation, ultracentrifugation, ultrafiltration, salting out, dialysis, ion exchange column chromatography, etc.
  • the mutant reverse transcription enzyme of the present invention can be isolated by subjecting it to adsorption column chromatography, affinity chromatography, gel filtration column chromatography and the like.
  • the present invention also provides a reverse transcription method characterized by using the mutant reverse transcriptase.
  • the reverse transcription method of the present invention is characterized in that cDNA is synthesized from an RNA template using the mutant reverse transcriptase of the present invention.
  • the mutant reverse transcriptase of the present invention has higher thermal stability than the wild-type reverse transcriptase. Therefore, according to the reverse transcription method of the present invention, the reverse transcription reaction can be carried out in a wide temperature range including a temperature high enough to suppress the formation of secondary structure of RNA. Therefore, the reverse transcription method of the present invention can efficiently carry out the reverse transcription reaction regardless of the type of RNA, and is highly versatile.
  • the mutant reverse transcriptase in the reverse transcription method of the present invention, the mutant reverse transcriptase, a template RNA, an oligonucleotide primer complementary to a part of the RNA, and four kinds of deoxyribonucleoside triphosphates
  • the reverse transcription reaction can be carried out by incubating with and in a buffer for reverse transcription reaction.
  • the reaction temperature in the reverse transcription reaction differs depending on the type of RNA used, the type of mutant reverse transcriptase used, etc., it is appropriately set according to the type of RNA used, the type of mutant reverse transcriptase used, and the like. Is preferable.
  • the reaction temperature can be set to 37 to 45 ° C., for example, when the RNA used is RNA that does not easily form a secondary structure. Further, the reaction temperature is set to a temperature higher than the reaction temperature suitable for wild-type reverse transcriptase, for example, 45 to 60 ° C., when the RNA used is an RNA that easily forms a secondary structure. Can be set.
  • the mutant reverse transcriptase of the present invention has high thermal stability, there is an advantage that the reverse transcriptase can be sufficiently carried out even under such a high reaction temperature condition.
  • the reaction time can be, for example, about 1 minute to 1 hour, preferably about 5 minutes to 30 minutes, but is not limited.
  • the buffer solution for reverse transcription reaction used in the reverse transcription method of the present invention may contain divalent cations such as magnesium ion and manganese ion.
  • concentration of the divalent cation is preferably set appropriately according to the type of the mutant reverse transcriptase, other components contained in the reverse transcription reaction buffer, and the like.
  • the divalent cation concentration in the reverse transcription reaction buffer is set at 1 to 30 mM.
  • the buffer solution for reverse transcription reaction is, if necessary, a reducing agent (for example, dithiothreitol, etc.), a stabilizer (for example, glycerol, trehalose, etc.), and an organic substance, as long as the object of the present invention is not impaired. It may contain components such as a solvent (eg, dimethyl sulfoxide, formamide, etc.).
  • the invention provides a reagent comprising said mutant reverse transcriptase, said polynucleotide, said vector, and / or said cell.
  • reagents may contain other arbitrary components (for example, arbitrary additives such as stabilizers and preservatives) depending on the purpose of use and the like.
  • the reagent containing the mutant reverse transcriptase may further contain the buffer solution for the reverse transcription reaction and the like.
  • the use of the reagent of the present invention is not particularly limited, and for example, it can be suitably used for a reverse transcription reaction in which cDNA synthesis is performed using RNA as a template.
  • the reagent of the present invention can be suitably used for producing the mutant reverse transcriptase of the present invention.
  • the invention provides a kit composed of a reagent comprising said mutant reverse transcriptase, said polynucleotide, said vector, said cell, and / or one or more of these.
  • the kit of the present invention may be, for example, a kit for performing a reverse transcription reaction in which cDNA is synthesized using RNA as a template, a kit for producing the mutant reverse transcriptase of the present invention, and the like, but RNA is preferable.
  • RNA is preferable.
  • Is a kit used for synthesizing cDNA using the above as a template this is also referred to as a reverse transcription reaction kit or the like).
  • the reverse transcriptase kit of the present invention is a kit for carrying out a reverse transcriptase reaction, and is provided as a mutant reverse transcriptase of the present invention (provided as a reagent containing the mutant reverse transcriptase). It is one of the features that it contains (including). Since the reverse transcriptase kit of the present invention contains the mutant reverse transcriptase of the present invention having high thermal stability, a wide range of temperatures including a temperature high enough to suppress the formation of secondary structure of RNA. Even reverse transcription reactions in the range can be preferably used.
  • the kit of the present invention may further include instructions for use when performing a reverse transcription reaction using the mutant reverse transcriptase of the present invention.
  • the kit of the present invention can be provided in an embodiment in which the mutant reverse transcriptase or the like is packed in, for example, one package and includes information on how to use the kit.
  • the reagents required to carry out the reverse transcriptase may be encapsulated in a container different from the container containing the mutant reverse transcriptase. As long as the progress of the reverse transcription reaction during storage of the reagent is stopped, it may be encapsulated in the same container as the mutant reverse transcriptase.
  • the reagent may be encapsulated in a container in an amount suitable for carrying out the reverse transcription reaction. This eliminates the need to mix each reagent in an amount suitable for the reverse transcription reaction, so that handling can be facilitated.
  • Example 1 Preparation of MMLV reverse transcriptase plasmid DNA (SEQ ID NO: 2) encoding reverse transcriptase derived from Moroni-mouse leukemia virus was cloned into pET-23b (+) to prepare a plasmid (pMMLV) incorporating wild-type MMLV.
  • pMMLV plasmid
  • a plasmid having a mutation was prepared using pMMLV as a template and KOD-PLUS-Mutagenesis Kit (manufactured by Toyobo), and the method was performed according to the instruction manual.
  • Table 1 shows the prepared plasmid and the primers used at that time.
  • the obtained plasmid was transformed into BL21-CodonPlus Competent Cells (Agilent Technologies) and used for enzyme preparation.
  • Example 2 Acquisition of reverse transcriptase The culture of the cells obtained in Example 1 was carried out as follows. First, 80 mL of TB medium (Molecular cloning 2nd edition, p.A.2) containing 100 ⁇ g / mL ampicillin that had been sterilized was dispensed into a 500 mL Sakaguchi flask. A plasmid transformant that was previously cultured in 3 mL of LB medium (1% bactotrypton, 0.5% yeast extract, 0.5% sodium chloride) containing 100 ⁇ g / mL ampicillin at 37 ° C. for 16 hours in this medium. Was seeded and aerated and cultured at 30 ° C. for 16 hours.
  • TB medium Molecular cloning 2nd edition, p.A.2
  • LB medium 1% bactotrypton, 0.5% yeast extract, 0.5% sodium chloride
  • IPTG manufactured by Nacalai Tesque
  • the cells were aerated and cultured at 30 ° C. for another 4 hours.
  • the cells were collected from the culture solution by centrifugation, suspended in 50 mL of disruption buffer (10 mM Tris-HCl (pH 7.5), 300 mM KCl, 5% glycerol), and then the cells were disrupted by sonication treatment. A cell disruption solution was obtained.
  • the cell lysate was then purified by His GraviTrap (GE Healthcare).
  • the washing conditions were 10 mM Tris-HCl (pH 7.5), 300 mM KCl, 5% glycerol, 50 mM imidazole, and the elution conditions were 10 mM Tris-HCl (pH 7.5), 300 mM KCl, 5% glycerol, 300 mM imidazole. Finally, it was replaced with a storage buffer (50 mM Tris-HCl (pH 7.5), 300 mM KCl, 50% glycerol, 0.1 mM EDTA) to obtain each mutant reverse transcriptase.
  • a storage buffer 50 mM Tris-HCl (pH 7.5), 300 mM KCl, 50% glycerol, 0.1 mM EDTA
  • the activity of the reverse transcriptase purified above was measured by the following procedure. When the enzyme activity was high, the sample was diluted for measurement.
  • Solution A 250 mM Tris-HCl (pH 8.3), 375 mM potassium chloride, 15 mM magnesium chloride, 50 mM dithiothreitol Solution B: 1 mg / mL polyA, 1 pmol / ⁇ L dT20, 10 mM dTTP, Liquid C: [3H] -dTTP Solution D: 0.07M sodium pyrophosphate, 0.7M trichloroacetic acid
  • This liquid is filtered with a glass filter (GF / C filter manufactured by Watman), thoroughly washed with 0.1N hydrochloric acid and ethanol, and the radioactivity of the filter is measured using a liquid scintillation counter (Tri-Carb2810 TR manufactured by Packard). Nucleotide uptake was measured.
  • One unit of enzyme activity was the amount of enzyme that incorporated 1 nmole nucleotides into the acid-insoluble fraction per 10 minutes under these conditions.
  • Table 2 shows the residual activity rate of each mutant reverse transcriptase.
  • Wild-type MMLV reverse transcriptase (WT) was less stable during storage at 25 ° C., with activity reduced to 39% after 10 days and 8% after 35 days.
  • each mutant reverse transcriptase in which the cysteine residue at a predetermined position shown in Table 2 was modified (substituted) with an alanine residue remained active at 45% or more after 10 days and at 24% or more even after 35 days.
  • C310A contributed significantly to the improvement of stability, and showed a residual activity of 50% even after 35 days.
  • the reverse transcriptase of the present invention has improved storage stability over the wild-type reverse transcriptase. The above result shows the stability during storage at 25 ° C., but it is considered that the stability is improved even under normally used storage / transportation conditions such as 4 ° C. and ⁇ 20 ° C., which is very useful.
  • Sample Buffer 125 mM Tris-HCl (pH 6.8), 4% (w / v) SDS, 20% glycerol, 0.01% BPB
  • FIG. 1 shows the results of non-reducing SDS-PAGE analysis before storage (0 days) and after storage for 30 days (30 days) of WT
  • FIG. 2 shows non-reduction of C310A before storage (0 days) and after storage for 30 days (30 days).
  • the result of SDS-PAGE analysis is shown. From the WT analysis results, after incubation at 25 ° C for 30 days, the reverse transcriptase band (solid arrow in the figure) becomes thinner and the upper band of reverse transcriptase (dotted arrow in the figure) becomes darker. confirmed. This is because the reverse transcriptase is denatured and inactivated during storage.
  • Example 5 Heat resistance test of mutant reverse transcriptase Various mutant reverse transcriptases of C90A, C157A, C236A, C262A, C409A, C495A and C635A were added to 10U in a storage buffer (50 mM Tris-HCl (pH 7.5), 300 mM KCl, 50% glycerol, 0.1 mM EDTA). It was diluted to / ⁇ L and heat-treated at 45 ° C. for 5 minutes. Then, reverse transcriptase measurement was performed to determine the residual activity rate of each mutant reverse transcriptase after heat treatment. For the C310A mutant reverse transcriptase, in addition to the heat treatment at 45 ° C. for 5 minutes, the heat treatment at 50 ° C. or 55 ° C. for 5 minutes was carried out, and the residual activity rate was measured in the same manner. The residual activity rate was determined by dividing the activity measurement result after the heat treatment by the activity measurement result before the heat treatment.
  • a storage buffer 50 mM
  • Example 6 Heat resistance test of mutant reverse transcriptase (C310A, C310I, C310G)
  • the C310A mutant prepared in Example 2 and the above C310I mutant were diluted to 10 U / ⁇ L with a storage buffer (50 mM Tris-HCl (pH 7.5), 300 mM KCl, 50% glycerol, 0.1 mM EDTA). Heat treatment was performed at 50 ° C. for 5 minutes. Then, the reverse transcription activity was measured, and the residual activity rate after each heat treatment was calculated according to the above formula (I). As a comparative example, the wild-type MMLV reverse transcriptase (WT) was also heat-treated at 50 ° C. for 5 minutes to determine the residual activity rate after the heat treatment.
  • WT wild-type MMLV reverse transcriptase
  • the residual activity rate of the C310A mutant reverse transcriptase after heat treatment at 50 ° C. for 5 minutes was about 1.19 times that of the wild-type MMLV reverse transcriptase (WT), which is a comparative example, and the C310I mutant type. Reverse transcriptase was shown to be about 1.26 times higher. From this result, the stability of the reverse transcriptase is improved not only when the cysteine residue (C) at position 310 is modified to the alanine residue (A) but also when it is replaced with the isoleucine residue (I). Was confirmed. Both alanine and isoleucine are known to be non-polar amino acids having an isoelectric point of about 6.0 and exhibit common properties.
  • the present invention provides a modified reverse transcriptase having excellent stability, which is useful in the field of molecular biology, and a reagent, a kit, or the like containing the reverse transcriptase. Since the present invention is particularly useful in gene expression analysis, is highly versatile and highly convenient, it can be used not only for research but also for clinical diagnosis and environmental tests.

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Abstract

安定性に優れた新規の変異型逆転写酵素を提供することを目的とする。本発明は、配列番号１に記載のアミノ酸配列と９０％以上の同一性を有するアミノ酸配列において、９０位、１５７位、２３６位、２６２位、３１０位、４０９位、４９５位、及び６３５位からなる群より選ばれる少なくとも一つに相当する位置におけるシステイン残基が改変されているアミノ酸配列からなる変異型逆転写酵素を提供する。特定の実施形態では、前記システイン残基の改変は、アラニン、グリシン、バリン、ロイシン、及びイソロイシンからなる群より選択される少なくとも一つの非極性アミノ酸残基への置換である。

Description

安定性に優れた変異型逆転写酵素

　本発明は、変異型逆転写酵素に関する。さらに詳しくは、本発明は、経時的な保存安定性や熱安定性に優れた変異型逆転写酵素、並びに該変異型逆転写酵素を用いる逆転写方法、該変異型逆転写酵素をコードするポリヌクレオチド、該変異型逆転写酵素を含むキット等に関する。

　逆転写酵素は、一般的に、ＲＮＡをテンプレートとしてｃＤＮＡを合成する活性（以下、「ＲＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼ活性」という）と、ＲＮＡ：ＤＮＡハイブリッド中のＲＮＡ鎖を分解する活性（以下、「ＲＮａｓｅＨ活性」という）を有している。逆転写酵素は、例えば、生体で発現しているタンパク質のアミノ酸配列を直接反映しているｍＲＮＡの塩基配列の解析、ｃＤＮＡライブラリーの構築、ＲＴ－ＰＣＲなどの用途に用いられている。このような用途に用いる逆転写酵素としては、従来より、モロニーマウス白血病ウイルス逆転写酵素（ＭＭＬＶ）またはトリ骨髄芽球症ウイルス逆転写酵素（ＡＭＶ）等が知られている。 

　また、ｍＲＮＡが二次構造を形成しやすい塩基配列を有する場合、逆転写酵素によるｃＤＮＡの合成が前記二次構造によって妨げられることから、反応温度を高くすることによって二次構造の形成を抑制しながらｃＤＮＡを合成することが望まれる。しかしながら、前記モロニーマウス白血病ウイルス逆転写酵素およびトリ骨髄芽球症ウイルス逆転写酵素は、熱安定性が低いことが多く、ＲＮＡの二次構造の形成が抑制されるような高い温度では、失活してしまうことがある。そこで、近年では逆転写酵素に複数のアミノ酸変異を導入するなどの工夫により、野生型逆転写酵素よりも高い熱安定性を保有し、通常は安定性に乏しかった４２～６０℃でも反応性が改善した変異型逆転写酵素等が種々開発されている（特許文献１、２、非特許文献１）。

　また、逆転写酵素は保存安定性が低いことが知られており、ＲＮＡの二次構造の形成が抑制されるような高い温度のみならず、４℃、２５℃といった比較的穏やかな条件下で保存中でも徐々に失活し、酵素活性を失ってしまうことがある。そのため、保管中や輸送中の厳重な温度管理や使用期限管理等が必要となる。

　上述の理由により、従来よりも、熱安定性が向上した逆転写酵素及び／又は保存中の経時的な安定性が向上した、更なる有用な新規の逆転写酵素の開発が待ち望まれていた。

特開２０００－１３９４５７号公報 特許第６１８０００２号

Ｊｏｕｒｎａｌ　ｏｆ　Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｖｏｌ．１５０，Ｉｓｓｕｅ　３，Ｐａｇｅｓ　２９９－３０６，（２０１０年発刊）

　本発明は上記の従来技術に鑑みてなされたものであり、経時的な保存安定性及び／又は熱安定性が向上した、更なる有用な新規の変異型逆転写酵素の提供を課題とする。

　本発明者らは、上記課題に鑑み、鋭意研究の結果、逆転写酵素の特定部位におけるシステイン残基を改変することで、経時的な保存安定性及び／又は熱安定性が向上した逆転写酵素が得られることを見出し、本発明に到達した。

　すなわち、代表的な本発明は以下の構成からなる。

［項１］　配列番号１に記載のアミノ酸配列と９０％以上の同一性を有するアミノ酸配列において、９０位、１５７位、２３６位、２６２位、３１０位、４０９位、４９５位、及び６３５位からなる群より選ばれる少なくとも一つに相当する位置におけるシステイン残基が改変されているアミノ酸配列からなる変異型逆転写酵素。

［項２］　配列番号１に記載のアミノ酸配列において１又は数個のアミノ酸残基の欠失、置換及び／又は付加を有するアミノ酸配列において、９０位、１５７位、２３６位、２６２位、３１０位、４０９位、４９５位、及び６３５位からなる群より選ばれる少なくとも一つに相当する位置におけるシステイン残基が改変されているアミノ酸配列からなる、項１に記載の変異型逆転写酵素。

［項３］　前記システイン残基の改変が、システイン残基の欠失及び／又は他のアミノ酸残基への置換である、項１又は２に記載の変異型逆転写酵素。

［項４］　前記システイン残基の改変が、アラニン、グリシン、バリン、ロイシン、及びイソロイシンからなる群より選択される少なくとも一つの非極性アミノ酸残基への置換である、項１から３のいずれかに記載の変異型逆転写酵素。

［項５］　前記システイン残基の改変が、アラニン残基への置換である、項１から４のいずれかに記載の変異型逆転写酵素。

［項６］　配列番号１に記載のアミノ酸配列と９０％以上の同一性を有するアミノ酸配列において、少なくとも３１０位に相当する位置のシステイン残基が改変されていることを特徴とする、項１から５のいずれかに記載の変異型逆転写酵素。

［項７］　前記３１０位に相当する位置のシステイン残基の改変がアラニン、グリシン、バリン、ロイシン、及びイソロイシンからなる群より選択される非極性アミノ酸残基への置換である、項１から６のいずれかに記載の変異型逆転写酵素。

［項８］　前記３１０位に相当する位置のシステイン残基の改変がアラニン残基への置換である、項１から７のいずれかに記載の変異型逆転写酵素。

［項９］　ＲＮａｓｅ活性を欠く、項１から８のいずれかに記載の変異型逆転写酵素。

［項１０］　２５℃で３５日間保存した場合に３０％以上の残存活性率を示す、変異型逆転写酵素。

［項１１］　２５℃で３５日間保存した場合に５０％以上の残存活性率を示す、変異型逆転写酵素。

［項１２］　項１から８のいずれかに記載の逆転写酵素をコードするポリヌクレオチド。

［項１３］　項１２に記載のポリヌクレオチドを含むベクター。

［項１４］　項１３に記載のベクターで形質転換された細胞。

［項１５］　項１から１１のいずれかに記載の変異型逆転写酵素、項１２に記載のポリヌクレオチド、項１３に記載のベクター、及び項１４に記載の細胞からなる群より選択される少なくとも１つを含む試薬。

［項１６］　項１２に記載のポリヌクレオチド、項１３に記載のベクター、項１４に記載の細胞、及び項１５に記載の試薬からなる群より選択される少なくとも１つを用いて、項１から１１のいずれかに記載の変異型逆転写酵素を製造する方法。

［項１７］　項１から１１のいずれかに記載の変異型逆転写酵素を用いて、ＲＮＡのテンプレートからｃＤＮＡを合成することを特徴とする逆転写方法。

［項１８］　項１から１１のいずれかに記載の変異型逆転写酵素を含むキット。

［項１９］　ＲＮＡをテンプレートとしてｃＤＮＡを合成するために用いられる、項１８に記載のキット。

　本発明により、経時的な保存安定性及び／又は熱安定性が向上した新規の有用な変異型逆転写酵素が提供される。本発明の変異型逆転写酵素は、経時的な保存安定性に優れるので保管時や輸送時等の取扱いをより容易なものとし、利便性が高い試薬とすることができる。また、本発明の変異型逆転写酵素は、熱安定性に優れるので、例えば、反応温度を高くする工程を含む核酸合成法においても効率よく逆転写反応を行うことができる。

実施例４における野生型逆転写酵素（ＷＴ）の安定性試験の結果を示す図である。 実施例４における本発明の変異型逆転写酵素（Ｃ３１０Ａ）の安定性試験の結果を示す図である。

　以下に本発明を詳細に説明するが、本発明はこれらに限定されるものではない。

　本発明の変異型逆転写酵素は、野生型逆転写酵素における特定位置のシステイン残基が改変されていることを特徴とする。本発明では、システイン残基を改変することで経時的な保存安定性が向上し、熱安定性にも優れた逆転写酵素とすることができるという新たな知見に基づく。システインはチオール基を有し、一般にジスルフィド結合の形成などを通じてタンパク質の三次構造の維持に寄与する。本発明は、このようなシステイン残基を改変（例えば、欠失及び／又は他のアミノ酸に置換）することによって逆転写酵素の性能を変え、熱安定性及び／又は保存安定性を向上させるというものである。

　従って、本発明では、野生型逆転写酵素において所定の位置のシステイン残基を改変すればよく、本発明の効果を奏する限り、システイン残基の改変の態様は限定されない。一例として、システイン残基の改変は、当該システイン残基の欠失及び／又は他のアミノ酸への置換であり得る。より確実に高い安定化効果が奏され得るという観点から、好ましくは、他のアミノ酸残基への置換であるのがよく、なかでも、非極性アミノ酸残基への置換であることが好ましい。前記のような本発明の変異型逆転写酵素は、逆転写活性を有し、かつ改変前の逆転写酵素に比べて熱安定性及び／又は保存安定性が向上していることを特徴としている。

　なお、本発明において、「野生型逆転写酵素」（以下、「ＷＴ」ともいう。）とは、人為的に変異が導入されていない逆転写酵素をいう。前記野生型逆転写酵素としては、配列番号１に記載するアミノ酸配列からなる逆転写酵素などがあげられる。ここで、「配列番号１に記載のアミノ酸配列」とは、配列表の配列番号１に示されるアミノ酸配列（モロニーマウス白血病ウイルス逆転写酵素）をいう。さらに、「モロニーマウス白血病ウイルス逆転写酵素」を「ＭＭＬＶ逆転写酵素」と表すこともある。本発明は、モロニーマウス白血病ウイルス逆転写酵素のアミノ酸配列に由来する変異型逆転写酵素であり得るが、アミノ酸配列の同一性等の観点から配列番号１に記載のアミノ酸配列と所定の関係にあり高い相同性を有するアミノ酸配列からなるタンパク質（例えば、オルソログ、ホモログ等）に由来する変異型逆転写酵素であってもよい。より確実に高い安定性向上効果が得られ易いという観点から、好ましくは、モロニーマウス白血病ウイルス逆転写酵素のアミノ酸配列に由来する変異型逆転写酵素である。

　一つの実施形態において、本発明の変異型逆転写酵素は、配列番号１に記載のアミノ酸配列において、９０位、１５７位、２３６位、２６２位、３１０位、４０９位、４９５位、及び６３５位からなる群より選ばれる少なくとも一つに相当する位置のシステイン残基において改変を含む変異型逆転写酵素であることを特徴とする。改変前のアミノ酸配列は、配列番号１と完全に同一である場合に限られるものではなく、逆転写活性が失われていない限り特に制限されないが、例えば、配列番号１に記載のアミノ酸配列との同一性が９０％以上、好ましくは９５％以上、より好ましくは９６％以上、更に好ましくは９７％以上、更により好ましくは９８％以上、なかでも９９％以上であるアミノ酸配列から構成されるものが好適である。ここで、アミノ酸配列の同一性は、当該分野で公知の任意の手段で評価することができる。例えば、市販の又は電気通信回線（インターネット）を通じて利用可能な解析ツールを用いて算出することができ、一例として、全米バイオテクノロジー情報センター（ＮＣＢＩ）の相同性アルゴリズムＢＬＡＳＴ（Ｂａｓｉｃ　ｌｏｃａｌ　ａｌｉｇｎｍｅｎｔ　ｓｅａｒｃｈ　ｔｏｏｌ）ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ＢＬＡＳＴ／においてデフォルト（初期設定）のパラメータを用いることにより、アミノ酸配列の同一性を算出することが可能である。さらに、改変前のアミノ酸配列は、配列番号１に記載のアミノ酸配列において、１又は数個のアミノ酸が欠失、置換、及び／又は付加されたアミノ酸配列であってもよい。ここで「１又は数個」とは、逆転写活性が失われていない限り特に制限されないが、例えば、１～２０個、好ましくは１～１０個、より好ましくは１～５個、更に好ましくは１～３個である。前記のような改変前のアミノ酸配列は、例えば、遺伝子工学的な手法により人為的に作製するものであってもよいし、天然に由来するタンパク質のアミノ酸配列であってもよい。

　本明細書においては、塩基配列、アミノ酸配列およびその個々の構成因子については、アルファベット表記による簡略化した記号を用いる場合があるが、いずれも分子生物学・遺伝子工学分野における慣行に従う。また、本明細書においては、アミノ酸配列の変異を簡潔に示すため、例えば「Ｃ９０Ａ」などの表記を用いる。「Ｃ９０Ａ」は、第９０番目のシステインをアラニンに置換したことを示しており、すなわち、置換前のアミノ酸残基の種類、その場所、置換後のアミノ酸残基の種類を示している。また、配列番号は、特に断らない限り、配列表に記載された配列番号に対応する。また、多重変異体の場合は、上記の表記を「／」でつなげて表す。なお、本明細書において、配列番号１に示されるアミノ酸配列と完全同一ではないアミノ酸配列おける、配列番号１上のある位置（順番）に相当する部位とは、配列の一次構造を比較（アラインメント）したときに、配列番号１の当該位置と対応する位置をいうものとする。

　また、本明細書において「変異型逆転写酵素」又は「改変型逆転写酵素」という場合の「変異型」又は「改変型」は互換可能に用いられ、従来知られた逆転写酵素とは異なるアミノ酸配列を備えることを意味するものであり、人為的変異によるか自然界における変異によるかを区別するものではない。従って、本発明の変異型逆転写酵素は、配列番号１に記載のアミノ酸配列において１以上のアミノ酸が改変されて、配列番号１とは異なるアミノ酸配列を有する逆転写酵素をいい、当該変異型逆転写酵素が、人為的変異により得られた逆転写酵素であるか、自然界における変異により得られた逆転写酵素であるかを問わない。

　特定の好ましい実施形態において、本発明の逆転写酵素は、配列番号１のアミノ酸配列又はアミノ酸配列同一性等の観点から配列番号１に記載のアミノ酸配列と所定の関係にあるアミノ酸配列において、９０位、１５７位、２３６位、２６２位、３１０位、４０９位、４９５位及び６３５位からなる群より選ばれる少なくとも一つに相当する位置のシステイン残基を改変したものである。従って、本発明の変異型逆転写酵素は、本発明の効果を奏する限り、前記のようなアミノ酸配列において、２つ以上の位置に相当する部位のシステイン残基を改変したものであってもよいし、３つ以上、４つ以上、５つ以上、６つ以上、７つ以上の位置に相当する部位のシステイン残基を改変したものであってもよいし、前記で特定した８つ全ての位置に相当する部位のシステイン残基を改変したものであってもよい。後述の実施例の結果に示されるように、配列番号１において３１０位に相当する位置のシステイン残基を改変することにより、特に高い安定化効果が奏されることが示されている。従って、特定の好ましい実施形態では、前記のようなアミノ酸配列において少なくとも３１０位に相当する位置におけるシステイン残基が改変されたものとすることができる。

　特定の好ましい実施形態において、本発明の変異型逆転写酵素は、配列番号１のアミノ酸配列又はアミノ酸配列同一性等の観点から配列番号１に記載のアミノ酸配列と所定の関係にあるアミノ酸配列において、９０位、１５７位、２３６位、２６２位、３１０位、４０９位、４９５位及び６３５位からなる群より選ばれる少なくとも一つに相当する位置のシステイン残基を非極性アミノ酸に置換したものである。好ましくは、９０位、１５７位、２３６位、２６２位、３１０位、４０９位、４９５位及び６３５位からなる群より選ばれる少なくとも一つに相当する位置のシステイン残基を、グリシン、アラニン、イソロイシン、ロイシン、バリン、フェニルアラニン、プロリン、メチオニン、又はトリプトファンに置換したものであり；より好ましくは、グリシン、アラニン、イソロイシン、ロイシン、バリン、フェニルアラニン、又はプロリンに置換したものであり；更に好ましくは、グリシン、アラニン、イソロイシン、ロイシン、又はバリンに置換したものであり；更により好ましくは、グリシン、アラニン又はイソロイシンであり、なかでも好ましくは、アラニン又はイソロイシンである。グリシン、アラニン、イソロイシン、ロイシン、バリンは、非極性アミノ酸であって、いずれも等電点が約６．０であることが知られており、共通の性質を示し得るアミノ酸として同等の効果が発揮されることが期待できる。

　本発明の変異型逆転写酵素は、例えば、配列番号１のアミノ酸配列又はアミノ酸配列同一性等の観点から配列番号１に記載のアミノ酸配列と所定の関係にあるアミノ酸配列において、９０位、１５７位、２３６位、２６２位、３１０位、４０９位、４９５位及び６３５位からなる群より選ばれる少なくとも一つに相当する位置のシステイン残基を改変したタンパク質を製造することによって得ることができる。アミノ酸配列においてアミノ酸改変を導入する方法は、当該分野で公知の任意の手法により、当業者に適宜行われ得る。例えば、野生型逆転写酵素をコードする遺伝子に変異を導入して、タンパク質工学的手法により、所定の位置にアミノ酸改変を導入した新たな変異型逆転写酵素のタンパク質を製造することができる。アミノ酸の改変を導入する方法の一態様としては、Ｉｎｖｅｒｓｅ　ＰＣＲ法に基づく部位特異的変異導入法を用いることができる。例えば、ＫＯＤ　－Ｐｌｕｓ－　Ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ　Ｋｉｔ（東洋紡製）は、（１）目的とする遺伝子を挿入したプラスミドを変性させ、該プラスミドに変異プライマーをアニーリングさせ、続いてＫＯＤ　ＤＮＡポリメラーゼを用いて伸長反応を行う、（２）（１）のサイクルを１５回繰り返す、（３）制限酵素ＤｐｎＩを用いて鋳型としたプラスミドのみを選択的に切断する、（４）新たに合成された遺伝子をリン酸化、Ｌｉｇａｔｉｏｎを実施し環化させる、（５）環化した遺伝子を大腸菌に形質転換することで、目的とする変異の導入されたプラスミドを保有する形質転換体を取得することのできるキットであり、本発明の変異型逆転写酵素の作製に好適に用いることができる。

　特定の実施形態において、本発明の変異型逆転写酵素は、ＲＮａｓｅ活性を欠くものであってもよい。ＲＮａｓｅ活性を欠く変異型逆転写酵素の一例として、５２４位に相当する位置のアスパラギン酸をアラニンに置換したものが挙げられるが、これに限定するものではない。野生型逆転写酵素が一般に有するＲＮａｓｅ活性は、逆転写反応のテンプレートであるＲＮＡを分解する場合があり、特に、長鎖ＲＮＡ（例えば、完全長ＲＮＡ）をテンプレートとしてｃＤＮＡを合成する際に問題となり得る。ＲＮａｓｅ活性を欠くように改変した変異型逆転写酵素であれば、長鎖ＲＮＡをテンプレートとする逆転写反応において、その反応途中にＲＮＡ鎖のテンプレートが分解されてしまうのを抑制することができるので好ましい。

　後述の試験例の結果に示されるように、本発明により、保存安定性及び／又は熱安定性が向上した変異型逆転写酵素を提供することができる。好ましい実施形態では、本発明により提供される変異型逆転写酵素は、保存安定性及び熱安定性の両方に優れた性質を有する変異型逆転写酵素である。

　具体的に、本発明により提供される経時的な保存安定性に優れた変異型逆転写酵素としては、例えば、２５℃で３５日間保存した場合に２０％以上の残存活性率を示す変異型逆転写酵素であり得る。好ましくは３０％以上の残存活性率、より好ましくは４０％以上の残存活性率、更に好ましくは５０％以上の残存活性率を示す変異型逆転写酵素であり得る。更には、本発明の経時的な保存安定性に優れた変異型逆転写酵素は、例えば、２５℃で２５日間保存した場合に、２０％以上の残存活性率、好ましくは３０％以上の残存活性率、より好ましくは４０％以上の残存活性率、更に好ましくは５０％以上の残存活性率を示すを示す変異型逆転写酵素であり得る。また本発明の経時的な保存安定性に優れた変異型逆転写酵素は、例えば、２５℃で１０日間保存した場合に、４０％以上の残存活性率、好ましくは４５％以上の残存活性率、よりに好ましくは５０％以上の残存活性率、更に好ましくは６０％以上の残存活性率を示す変異型逆転写酵素であり得る。長期間保存後にこのように高い残存活性率を示す変異型逆転写酵素は、例えば、配列番号１に記載のアミノ酸配列又はアミノ酸配列同一性等の観点から配列番号１に記載のアミノ酸配列と所定の関係にあるアミノ酸配列においてアミノ酸を改変し、得られた変異型逆転写酵素について以下に説明するような残存活性率の測定で評価することにより、当業者により適宜取得され得る。
特定の実施形態において、本発明により提供される経時的な保存安定性に優れた変異型逆転写酵素は、例えば、２５℃で１０日間、２５日間、又は３５日間にわたり保存した場合に、野生型逆転写酵素の残存活性率と比較して高い残存活性率を示す変異型逆転写酵素であり得る。具体的には、例えば、２５℃で１０日間保存した場合に、野生型逆転写酵素の残存活性率と比較して約１．１倍以上、好ましくは約１．２倍以上、より好ましくは、１．３倍以上、更に好ましくは約１．４倍以上高い残存活性率を示す変異型逆転写酵素であり得る。さらに例えば、２５℃で２５日間保存した場合に、野生型逆転写酵素の残存活性率と比較して約１．１倍以上、好ましくは約１．５倍以上、より好ましくは約２倍以上、なかでも好ましくは４倍以上高い残存活性率を示す変異型逆転写酵素であり得る。また例えば、２５℃で３５日間保存した場合に、野生型逆転写酵素の残存活性率と比較して約１．１倍以上、好ましくは約１．５倍以上、より好ましくは約２倍以上、なかでも好ましくは約４倍以上高い残存活性率を示す変異型逆転写酵素であり得る。２５℃での長期保存後にこのように高い残存活性率を示す変異型逆転写酵素は、野生型逆転写酵素とアミノ酸残基を改変した変異型逆転写酵素の両方について、以下に説明するような残存活性率の測定で評価し、野生型逆転写酵素の残存活性率の値と比較することにより、当業者により適宜取得され得る。

　更なる実施形態において、本発明により提供される熱安定性に優れた変異型逆転写酵素は、例えば、４５℃で５分間熱処理した場合に７０％以上の残存活性率を示す変異型逆転写酵素であり得る。更には、本発明の熱安定性に優れた変異型逆転写酵素は、例えば、４５℃で１０分間熱処理した場合にも６５％以上の残存活性率を示す変異型逆転写酵素であり得る。さらに、本発明の熱安定性に優れた変異型逆転写酵素は、例えば、５０℃で５分間熱処理した場合に、６５％以上の残存活性率、好ましくは６８％以上の残存活性率を示す変異型逆転写酵素であってもよい。また、本発明の熱安定性に優れた変異型逆転写酵素は、例えば、５５℃で５分間熱処理した場合に２０％以上の残存活性率、好ましくは２５％以上の残存活性率を示す変異型逆転写酵素であってもよい。熱処理後にこのように高い残存活性率を示す変異型逆転写酵素は、例えば、配列番号１に記載のアミノ酸配列又はアミノ酸配列同一性等の観点から配列番号１に記載のアミノ酸配列と所定の関係にあるアミノ酸配列においてアミノ酸を改変し、得られた変異型逆転写酵素について以下に説明するような残存活性率の測定で評価することにより、当業者により適宜取得され得る。

　特定の実施形態において、本発明により提供される熱安定性に優れた変異型逆転写酵素は、例えば、４５℃で５分間、５０℃で５分間、又は５５℃で５分間にわたり熱処理した場合に、野生型逆転写酵素の残存活性率と比較して高い残存活性率を示す変異型逆転写酵素であり得る。具体的には、例えば、４５℃で５分間熱処理した場合に、野生型逆転写酵素の残存活性率と比較して約１．１倍以上、好ましくは約１．２倍以上、より好ましくは、１．３倍以上、更に好ましくは約１．４倍以上高い残存活性率を示す変異型逆転写酵素であり得る。さらに例えば、５０℃で５分間熱処理した場合に、野生型逆転写酵素の残存活性率と比較して約１．１倍以上、好ましくは約１．２倍以上高い残存活性率を示す変異型逆転写酵素であり得る。また例えば、５５℃で５分間熱処理した場合に、野生型逆転写酵素の残存活性率と比較して約１．１倍以上、好ましくは約１．２倍以上、より好ましくは約１．４倍以上、なかでも好ましくは約１．６倍以上高い残存活性率を示す変異型逆転写酵素であり得る。熱処理後にこのように高い残存活性率を示す変異型逆転写酵素は、野生型逆転写酵素とアミノ酸残基を改変した変異型逆転写酵素の両方について、以下に説明するような残存活性率の測定で評価し、野生型逆転写酵素の残存活性率の値と比較することにより、当業者により適宜取得され得る。

　［逆転写活性の測定方法］

　本明細書において、逆転写酵素の逆転写活性は、以下の操作により測定することができる。本測定方法において、酵素活性が高い場合は、測定対象を含むサンプルを適宜希釈して測定を行えばよい。

　先ず、予め調製した下記のＡ液１０μＬ、Ｂ液２２μＬ、Ｃ液１μＬ、及び滅菌水１２μＬを、マイクロチューブ等の反応容器に加えて攪拌混合後、測定対象を含むサンプル液又はその希釈液５μＬを加えて、４２℃で１０分間反応させる。その後、冷却し、下記のＤ液１５０μＬを加えて、攪拌後さらに１０分間氷冷する。この液をガラスフィルター（ワットマン製ＧＦ／Ｃフィルター）でろ過し、０．１Ｎ塩酸及びエタノールで十分洗浄し、フィルターの放射活性を液体シンチレーションカウンター（パッカード製Ｔｒｉ－Ｃａｒｂ２８１０　ＴＲ）を用いて計測し、ヌクレオチドの取り込みを測定する。酵素活性の１単位はこの条件下で１０分当たり１ｎｍｏｌｅのヌクレオチドを酸不溶性画分に取り込む酵素量とする。（逆転写酵素活性測定用試薬）

・Ａ液：２５０ｍＭ　Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ（ｐＨ８．３）、３７５ｍＭ　塩化カリウム、１５ｍＭ　塩化マグネシウム、５０ｍＭ　ジチオスレイトール、

・Ｂ液：１ｍｇ／ｍＬ　ｐｏｌｙＡ、１ｐｍｏｌ／μＬ　ｄＴ２０、１０ｍＭ　ｄＴＴＰ、

・Ｃ液：［３Ｈ］－ｄＴＴＰ、

・Ｄ液：０．０７Ｍ　ピロリン酸ナトリウム、０．７Ｍ　トリクロロ酢酸。

　［逆転写活性の残存活性率の測定］

　測定対象となる各変異型逆転写酵素を、保存緩衝液（５０ｍＭ　Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ（ｐＨ７．５）、３００ｍＭ　ＫＣｌ、５０％　ｇｌｙｃｅｒｏｌ、０．１ｍＭ　ＥＤＴＡ）により１００Ｕ／μＬに希釈した後、前記逆転写活性の測定方法に記載の手順に従い、保存前の逆転写活性値を測定する。次いで、上記の保存緩衝液に希釈した測定対象の各変異型逆転写酵素を、所定の保存条件下（具体的には、経時的な保存安定性を評価する場合には、例えば、２５℃のインキュベータ内で１０日間～３５日間保存する条件下；熱安定性を評価する場合には、例えば、４５℃～５５℃のインキュベータ内で５分間保存する条件下）に置いて保存する。保存開始から所定時間経過後（具体的には、経時的な保存安定性を評価する場合には、例えば１０日～３５日後；熱安定性を評価する場合には、例えば５分後）に、保存前と同様に前記逆転写活性の測定方法に記載の手順に従い、保存後の逆転写活性値を測定する。次いで、以下の式Ｉに記載のように、保存後の逆転写活性値を保存前の逆転写活性値で除算することにより、残存活性率を算出できる。

　残存活性率（％）＝（保存後の逆転写活性値／保存前の逆転写活性値）×１００・・・（式Ｉ）

　更なる実施形態において、本発明は、前記のような本発明の変異型逆転写酵素をコードするポリヌクレオチドを提供する。ここで、変異型逆転写酵素をコードするポリヌクレオチドとは、例えばそれを常法により発現させた場合に、本発明の変異型逆転写酵素のタンパク質が得られるポリヌクレオチドをいう。即ち、本発明の変異型逆転写酵素のタンパク質のアミノ酸配列に対応する塩基配列から構成されるポリヌクレオチドを指す。当業者は、当該分野で周知のコドン表などに従って、所定のアミノ酸配列に対応する塩基配列を容易に決定することができる。また、本発明の変異型逆転写酵素をコードするポリヌクレオチドは、コドンの縮重により相違するポリヌクレオチドも包含する。ポリヌクレオチドとしては、ＤＮＡ、ＲＮＡ等の任意の核酸ポリマーであり得る。

　更なる実施形態において、本発明は、前記ポリヌクレオチドを含むベクターを提供する。具体的には、上記変異型逆転写酵素をコードするポリヌクレオチドを必要に応じてベクター（例えば、発現ベクター、クローニングベクター等）に移し替える。該ベクターは、本発明の変異型逆転写酵素のクローニング及び／又は発現等を可能とするものであればいかなるものでもよく、例えばプラスミドが挙げられる。プラスミドとしてはｐＵＣ１１８、ｐＵＣ１８、ｐＢＲ３２２、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ、ｐＬＥＤ－Ｍ１、ｐ７３、ｐＧＷ７、ｐＥＴ３ａ、ｐＥＴ８ｃなどが挙げられるがこれに限定するものではない。

　更なる実施形態において、本発明は、前記ベクターで形質転換された細胞を提供する。このような細胞は、本発明の変異型逆転写酵素をコードするタンパク質を発現させるために好適に使用され得る。特定の好ましい実施形態において、本発明の組換え宿主細胞は、上記発現ベクターを用いて宿主細胞を形質転換することにより得られるものである。該宿主細胞としては、大腸菌、酵母などが挙げられるが、特に大腸菌が好ましい。大腸菌としては、例えばエシェリヒア・コリ（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ　ｃｏｌｉ）ＤＨ５α、ＪＭ１０９、ＨＢ１０１、ＸＬ１Ｂｌｕｅ、ＰＲ１、ＨＳ６４１（ＤＥ３）、ＢＬ２１（ＤＥ３）などが挙げられる。すなわち、本発明においては、上記の変異型逆転写酵素をコードする遺伝子を上記ベクターに挿入して発現ベクターとし、さらに該発現ベクターにて宿主細胞を形質転換することが好ましい。

　一つの実施形態において、本発明の発現ベクターは、変異型逆転写酵素の精製をより容易にするためのエレメント、例えば、細胞外分泌シグナル、Ｈｉｓタグなどを含有していてもよい。

　更なる実施形態では、前記ポリヌクレオチド、前記ベクター、前記形質転換細胞、及び／又はこれらの１つ以上を含む試薬を用いて、前記変異型逆転写酵素を製造する方法をも提供する。例えば、該発現ベクターを用いて宿主細胞を形質転換した後、アンピシリン等の薬剤を含む寒天培地に塗布し、コロニーを形成させる。コロニーを栄養培地、例えばＬＢ培地や２×ＹＴ培地に接種し、３７℃で１２～２０時間培養した後、菌体を破砕して粗酵素液を抽出する。菌体を破砕する方法としては公知のいかなる手法を用いても良いが、例えば超音波処理、フレンチプレスやガラスビーズ破砕のような物理的破砕法やリゾチームのような溶菌酵素を用いることができる。得られた粗酵素液から精製逆転写酵素を取得する方法は、いかなる手法を用いてもよいが、例えば、遠心分離、超遠心分離、限外濾過、塩析、透析、イオン交換カラムクロマトグラフィー、吸着カラムクロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィー、ゲル濾過カラムクロマトグラフィーなどに供することにより、本発明の変異型逆転写酵素を単離することができる。

　本発明は更に、前記変異型逆転写酵素を用いることを特徴とする逆転写方法をも提供する。本発明の逆転写方法は、本発明の変異型逆転写酵素を用いてＲＮＡのテンプレートからｃＤＮＡを合成することを特徴としている。本発明の変異型逆転写酵素は、野生型逆転写酵素と比べて高い熱安定性を有している。そのため、本発明の逆転写方法によれば、ＲＮＡの二次構造の形成を抑制するのに十分な高い温度を含む幅広い温度範囲で逆転写反応を行なうことができる。したがって、本発明の逆転写方法は、ＲＮＡの種類によらず、逆転写反応を効率よく行なうことができ、汎用性が高い。

　一つの好ましい実施形態において、本発明の逆転写方法では、前記変異型逆転写酵素と、テンプレートとなるＲＮＡと、前記ＲＮＡの一部に相補的なオリゴヌクレオチドプライマーと、４種のデオキシリボヌクレオシドトリホスフェートとを、逆転写反応用緩衝液中でインキュベーションすることにより逆転写反応を行なうことができる。

　逆転写反応における反応温度は、用いられるＲＮＡの種類、用いられる変異型逆転写酵素の種類などによって異なるため、用いられるＲＮＡの種類、用いられる変異型逆転写酵素の種類などに応じて適宜設定することが好ましい。前記反応温度は、例えば、用いられるＲＮＡが二次構造を形成しにくいＲＮＡである場合、３７～４５℃となるように設定することができる。また、前記反応温度は、例えば、用いられるＲＮＡが二次構造を形成しやすいＲＮＡである場合、野生型逆転写酵素に適した反応温度よりも高い温度、例えば、４５～６０℃となるように設定することができる。本発明の変異型逆転写酵素は高い熱安定性を有しているため、このように反応温度が高い条件であっても、十分に逆転写反応を行うことができるというメリットがある。前記反応時間は、例えば、１分間～１時間程度、好ましくは５分間～３０分間程度とすることができるが、限定されない。

　本発明の逆転写方法に用いられる前記逆転写反応用緩衝液は、２価の陽イオン、例えば、マグネシウムイオン、マンガンイオンなどを含有してもよい。２価の陽イオンの濃度は、変異型逆転写酵素の種類や逆転写反応緩衝液に含まれる他の成分などに応じて適宜設定することが好ましい。例えば、逆転写反応用緩衝液中における２価の陽イオン濃度は、１～３０ｍＭで設定される。また、前記逆転写反応用緩衝液は、本発明の目的を妨げない範囲で、必要に応じて、還元剤（例えば、ジチオスレイトールなど）、安定化剤（例えば、グリセロール、トレハロースなど）、有機溶媒（例えば、ジメチルスルホキシド、ホルムアミドなど）などの成分を含有していてもよい。

　更なる実施形態において、本発明は、前記変異型逆転写酵素、前記ポリヌクレオチド、前記ベクター、及び／又は前記細胞を含む試薬を提供する。これらの試薬は使用目的等に応じて他に任意の成分（例えば、安定化剤、防腐剤等の任意の添加剤）を含むことができる。例えば、前記変異型逆転写酵素を含む試薬は、前記逆転写反応用緩衝液等を更に含むものであってもよい。本発明の前記試薬の用途は特に限定されず、例えば、ＲＮＡをテンプレートとしてｃＤＮＡ合成を行う逆転写反応に好適に使用することができる。更には、本発明の前記試薬は、本発明の変異型逆転写酵素を製造するために好適に使用することができる。

　更なる実施形態において、本発明は、前記変異型逆転写酵素、前記ポリヌクレオチド、前記ベクター、前記細胞、及び／又はこれらの１つ以上を含む試薬で構成されたキットを提供する。本発明の前記キットは、例えば、ＲＮＡをテンプレートとしてｃＤＮＡ合成を行う逆転写反応を行うためのキット、本発明の変異型逆転写酵素を製造するためのキット等であり得るが、好ましくは、ＲＮＡをテンプレートとしてｃＤＮＡを合成するために用いられるキット（これを、逆転写反応キット等ともいう）である。

　一つの実施形態において、本発明の逆転写反応キットは、逆転写反応を行なうためのキットであって、本発明の変異型逆転写酵素（当該変異型逆転写酵素を含む試薬として提供される場合も含む）を含有することを一つの特徴としている。本発明の逆転写反応キットは、高い熱安定性を有する本発明の変異型逆転写酵素を含有しているため、ＲＮＡの二次構造の形成を抑制するのに十分な高い温度を含む幅広い温度範囲での逆転写反応であっても好適に使用され得る。また、保存中の安定性が向上している逆転写酵素を含有しているため、キットの輸送中や保管中の管理が従来よりも容易となり、長期保存にも適したキットとなり得るため、利便性が高い。本発明の前記キットは更に、本発明の変異型逆転写酵素を使用して逆転写反応を行う場合の使用説明書等を含み得る。本発明のキットは、前記変異型逆転写酵素等を例えば一つの包装体に梱包し、当該キットの使用方法に関する情報を含む態様で提供することができる。

　特定の実施態様において、例えば、逆転写反応キットにおいて、前記逆転写反応を行なうのに必要な試薬は、変異型逆転写酵素が入った容器とは異なる容器中に封入されていてもよく、また、前記試薬の保存中における逆転写反応の進行が停止されているのであれば、前記変異型逆転写酵素と同じ容器に封入されていてもよい。前記試薬は、逆転写反応を行なうのに適した量となるように容器に封入されていてもよい。これにより、各試薬を逆転写反応に適した量となるように混合する必要がなくなるので、取り扱いを容易にすることができる。

　以下、本発明を実施例により具体的に説明する。なお、本発明は実施例に特に限定されるものではない。

　実施例１　ＭＭＬＶ逆転写酵素プラスミドの作製

　モロニ―マウス白血病ウイルス由来逆転写酵素をコードするＤＮＡ（配列番号２）をｐＥＴ－２３ｂ（＋）にクローニングし、野生型ＭＭＬＶを組み込んだプラスミド（ｐＭＭＬＶ）を作成した。変異を持つプラスミドの作製には、ｐＭＭＬＶを鋳型に、ＫＯＤ　－ＰＬＵＳ－　Ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ　Ｋｉｔ（Ｔｏｙｏｂｏ製）を用いて、方法は取扱説明書に準じて行った。作成したプラスミド及びその際に使用したプライマーを表１に示す。得られたプラスミドはＢＬ２１－ＣｏｄｏｎＰｌｕｓ　Ｃｏｍｐｅｔｅｎｔ　Ｃｅｌｌｓ（Ａｇｉｌｅｎｔ　Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）に形質転換し、酵素調製に用いた。

Figure JPOXMLDOC01-appb-T000001

　実施例２　逆転写酵素の取得

　実施例１で得られた菌体の培養は、以下の通り実施した。まず、滅菌処理した１００μｇ／ｍＬのアンピシリンを含有するＴＢ培地（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　ｃｌｏｎｉｎｇ　２ｎｄ　ｅｄｉｔｉｏｎ，ｐ．Ａ．２）８０ｍＬを、５００ｍＬ坂口フラスコに分注した。この培地に、あらかじめ１００μｇ／ｍＬのアンピシリンを含有する３ｍＬのＬＢ培地（１％バクトトリプトン、０．５％酵母エキス、０．５％塩化ナトリウム）で３７℃、１６時間培養したプラスミド形質転換株を播種し、３０℃で１６時間通気培養した。その後、ＩＰＴＧ（ナカライテスク製）を終濃度１ｍＭになるように添加し、３０℃でさらに４時間通気培養した。培養液より菌体を遠心分離により回収し、５０ｍＬの破砕緩衝液（１０ｍＭ　Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ（ｐＨ７．５）、３００ｍＭ　ＫＣｌ、５％　ｇｌｙｃｅｒｏｌ）に懸濁後、ソニケーション処理により菌体を破砕し、細胞破砕液を得た。次に、細胞破砕液をＨｉｓ　ＧｒａｖｉＴｒａｐ（ＧＥヘルスケア）によって精製した。洗浄条件は１０ｍＭ　Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ（ｐＨ７．５）、３００ｍＭ　ＫＣｌ、５％　ｇｌｙｃｅｒｏｌ、５０ｍＭ　ｉｍｉｄａｚｏｌｅ、溶出条件は１０ｍＭ　Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ（ｐＨ７．５）、３００ｍＭ　ＫＣｌ、５％　ｇｌｙｃｅｒｏｌ、３００ｍＭ　ｉｍｉｄａｚｏｌｅで実施した。最後に保存緩衝液（５０ｍＭ　Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ（ｐＨ７．５）、３００ｍＭ　ＫＣｌ、５０％　ｇｌｙｃｅｒｏｌ、０．１ｍＭ　ＥＤＴＡ）に置換し、各変異型逆転写酵素を得た。

　上記で精製した逆転写酵素の活性測定は、以下の操作で行った。また、酵素活性が高い場合はサンプルを希釈して測定を行った。

　（逆転写酵素活性測定用試薬）

Ａ液：２５０ｍＭ　Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ（ｐＨ８．３）、３７５ｍＭ　塩化カリウム、１５ｍＭ　塩化マグネシウム、５０ｍＭ　ジチオスレイトール

Ｂ液：１ｍｇ／ｍＬ　ｐｏｌｙＡ、１ｐｍｏｌ／μＬ　ｄＴ２０、１０ｍＭ　ｄＴＴＰ、

Ｃ液：［３Ｈ］－ｄＴＴＰ

Ｄ液：０．０７Ｍ　ピロリン酸ナトリウム、０．７Ｍ　トリクロロ酢酸

　（逆転写酵素活性測定方法）

　Ａ液１０μＬ、Ｂ液２２μＬ、Ｃ液１μＬ、および滅菌水１２μＬを、マイクロチューブに加えて攪拌混合後、上記精製酵素希釈液５μＬを加えて、４２℃で１０分間反応する。その後、冷却し、Ｄ液１５０μＬを加えて、攪拌後さらに１０分間氷冷する。この液をガラスフィルター（ワットマン製ＧＦ／Ｃフィルター）でろ過し、０．１Ｎ塩酸及びエタノールで十分洗浄し、フィルターの放射活性を液体シンチレーションカウンター（パッカード製Ｔｒｉ－Ｃａｒｂ２８１０　ＴＲ）を用いて計測し、ヌクレオチドの取り込みを測定した。酵素活性の１単位はこの条件下で１０分当たり１ｎｍｏｌｅのヌクレオチドを酸不溶性画分に取り込む酵素量とした。

　上記測定の結果、本発明の改変型ＭＭＬＶ逆転写酵素は全て、野生型ＭＭＬＶ逆転写酵素と同程度に十分な逆転写活性を有することが確認された。

　実施例３　変異型逆転写酵素の安定性試験

　各変異型逆転写酵素を、保存緩衝液を用いて１００Ｕ／μＬに希釈し、２５℃インキュベータ内で保存した。保存開始から１０日後、２５日後および３５日後に各変異型逆転写酵素の逆転写酵素活性測定を行った。以下の式Ｉに従って、保存後の活性値を保存前の活性値で割ることで残存活性率を求めた。

　残存活性率（％）＝（保存後の逆転写活性値／保存前の逆転写活性値）×１００・・・（式Ｉ）

Figure JPOXMLDOC01-appb-T000002

　表２に各変異型逆転写酵素の残存活性率を示す。野生型のＭＭＬＶ逆転写酵素（ＷＴ）は２５℃で保存中の安定性が低く、１０日後で３９％、３５日後で８％まで活性が低下していた。一方で、表２に示す所定位置におけるシステイン残基をアラニン残基に改変（置換）した各変異型逆転写酵素は１０日後でいずれも４５％以上、３５日後でも２４％以上の活性が残存していた。また各変異型逆転写酵素の中でも特にＣ３１０Ａは安定性向上への寄与が大きく、３５日後でも５０％の活性の残存を示した。本発明の逆転写酵素が野生型逆転写酵素より向上した保存中の安定性を有していることが示された。上記結果は２５℃保存中での安定性であるが、４℃や－２０℃といった通常用いられる保管・輸送条件でも安定性が向上していると考えられ、非常に有用である。

　実施例４　変異型逆転写酵素の安定性試験

　実施例３と同じ方法で調製した１００Ｕ／μＬの変異型逆転写酵素（Ｃ３１０Ａ）及び野生型逆転写酵素（ＷＴ）を２５℃インキュベータ内で１０日間または３０日間保存した。保存前および保存後の各変異型逆転写酵素を非還元ＳＤＳ－ＰＡＧＥで解析した。変異型逆転写酵素２００ＵをＳａｍｐｌｅ　Ｂｕｆｆｅｒ（１２５ｍＭ　Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ（ｐＨ６．８）、４％（ｗ／ｖ）ＳＤＳ、２０％ｇｌｙｃｅｒｏｌ、０．０１％ＢＰＢ）と混合し、２５℃で１時間インキュベート後、ＳＤＳ－ＰＡＧＥ解析に供した。ＳＤＳ－ＰＡＧＥ解析にはＳｕｐｅｒＳｅｐ　Ａｃｅ、１０％（富士フィルム和光純薬株式会社）を使用した。

　図１にＷＴの保存前（０ｄａｙ）および３０日保存後（３０ｄａｙｓ）の非還元ＳＤＳ－ＰＡＧＥ解析の結果を、図２にＣ３１０Ａの保存前（０ｄａｙ）および３０日保存後（３０ｄａｙｓ）の非還元ＳＤＳ－ＰＡＧＥ解析の結果を示す。ＷＴの解析結果から、３０日間２５℃でインキュベート後は、逆転写酵素のバンド（図中の実線矢印）が薄くなり、逆転写酵素の上方のバンド（図中の点線矢印）が濃くなる現象が確認された。これは、保存中に逆転写酵素が変性・失活していることに起因する。一方でＣ３１０Ａ変異型逆転写酵素の解析結果から、Ｃ３１０Ａ変異型逆転写酵素では上方のバンド（図１の点線矢印に相当する位置におけるバンド）が出現しないことが分かった。本結果からも、Ｃ３１０Ａは保存中の安定性が向上していることが示された。

　実施例５　変異型逆転写酵素の耐熱性試験

　Ｃ９０Ａ、Ｃ１５７Ａ、Ｃ２３６Ａ、Ｃ２６２Ａ、Ｃ４０９Ａ、Ｃ４９５Ａ及びＣ６３５Ａの各種変異型逆転写酵素を保存緩衝液（５０ｍＭ　Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ（ｐＨ７．５）、３００ｍＭ　ＫＣｌ、５０％　ｇｌｙｃｅｒｏｌ、０．１ｍＭ　ＥＤＴＡ）にて１０Ｕ／μＬに希釈し、４５℃５分間熱処理を行った。その後、逆転写活性測定を行い、各変異型逆転写酵素の熱処理後の残存活性率求めた。Ｃ３１０Ａ変異型逆転写酵素に関しては、４５℃５分間の熱処理の他に、５０℃又は５５℃５分間の熱処理を実施し、同様に残存活性率を測定した。残存活性率は、熱処理後の活性測定結果を熱処理前の活性測定結果で割ることで求めた。

Figure JPOXMLDOC01-appb-T000003
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000004

　表３から、ＷＴでは４５℃５分間の熱処理によって、残存活性率が６５％であったが、各変異型逆転写酵素はいずれも８０％から９５％程度の非常に高い残存活性率を示した。このことから、各変異型逆転写酵素は耐熱性が著しく向上していることが分かった。表４に示したＣ３１０Ａでは、４５℃５分間で９３％、５０℃５分間で７０％、５５℃５分間で２９％の残存活性を示し、ＷＴよりも大きく熱安定性が向上していることが分かった。以上から、いずれの変異型逆転写酵素も熱安定性が向上しており、特にＣ３１０Ａが熱安定性の向上に対する寄与が特に大きいことが分かった。

　実施例６　変異型逆転写酵素（Ｃ３１０Ａ、Ｃ３１０Ｉ、Ｃ３１０Ｇ）の耐熱性試験

　実施例１と同様の手順で、ｐＭＭＬＶを鋳型にして、ＫＯＤ　－ＰＬＵＳ－　Ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ　Ｋｉｔ（Ｔｏｙｏｂｏ製）を用いて、３１０位のシステイン残基をイソロイシン残基に改変するように設計した変異型ＭＭＬＶプラスミドを作成した。次いで、このプラスミドをＢＬ２１－ＣｏｄｏｎＰｌｕｓ　Ｃｏｍｐｅｔｅｎｔ　Ｃｅｌｌｓ（Ａｇｉｌｅｎｔ　Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）に形質転換し、実施例２と同様にして培養を行い、変異型ＭＭＬＶ逆転写酵素（Ｃ３１０Ｉ）の調製を行った。このようにして得られたＣ３１０Ｉ変異体について逆転写酵素活性を測定したところ、野生型のＭＭＬＶ逆転写酵素と同程度に十分な逆転写活性を有することを確認した。

　実施例２で調製したＣ３１０Ａ変異体と上記Ｃ３１０Ｉ変異体を保存緩衝液（５０ｍＭ　Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ（ｐＨ７．５）、３００ｍＭ　ＫＣｌ、５０％　ｇｌｙｃｅｒｏｌ、０．１ｍＭ　ＥＤＴＡ）にて１０Ｕ／μＬに希釈し、５０℃５分間熱処理を行った。その後、逆転写活性測定を行い、それぞれの熱処理後の残存活性率を、上記式（Ｉ）に従って算出した。比較例として、野生型のＭＭＬＶ逆転写酵素（ＷＴ）についても同様に５０℃５分間の熱処理を行い、熱処理後の残存活性率を求めた。

　この結果、比較例である野生型ＭＭＬＶ逆転写酵素（ＷＴ）と比較して、５０℃５分間の熱処理後のＣ３１０Ａ変異型逆転写酵素の残存活性率は約１．１９倍となり、Ｃ３１０Ｉ変異型逆転写酵素は約１．２６倍となることが示された。この結果から、３１０位のシステイン残基（Ｃ）をアラニン残基（Ａ）に改変する場合だけでなく、イソロイシン残基（Ｉ）に置換した場合にも逆転写酵素の安定性が向上することが確認された。アラニンとイソロイシンは、共に等電点が約６．０の非極性アミノ酸で共通の性質を示すアミノ酸であることが知られている。よってＭＭＬＶ逆転写酵素におけるシステイン残基を、このようなアミノ酸残基に改変することで特に高い安定性が得られることが分かる。また、同様にして３１０位のシステイン残基をグリシン残基に改変した変異型ＭＭＬＶ逆転写酵素（Ｃ３１０Ｇ）を新たに調製して、５０℃５分間の熱処理条件下の安定性を評価したところ、野生型ＭＭＬＶ逆転写酵素の残存活性率よりも高い残存活性を示し、安定性が向上していることが確認できた。

　本発明により、分子生物学分野において有用な安定性に優れる改変された逆転写酵素、及びその逆転写酵素を含む試薬、キット等が提供される。本発明は、遺伝子発現解析に際して特に有用であり、汎用性が高く利便性も高いいことから、研究用とのみならず、臨床診断や環境検査等にも利用できる。

Claims (19)


  1. 　配列番号１に記載のアミノ酸配列と９０％以上の同一性を有するアミノ酸配列において、９０位、１５７位、２３６位、２６２位、３１０位、４０９位、４９５位、及び６３５位からなる群より選ばれる少なくとも一つに相当する位置におけるシステイン残基が改変されているアミノ酸配列からなる変異型逆転写酵素。

  2. 　配列番号１に記載のアミノ酸配列において１又は数個のアミノ酸残基の欠失、置換及び／又は付加を有するアミノ酸配列において、９０位、１５７位、２３６位、２６２位、３１０位、４０９位、４９５位、及び６３５位からなる群より選ばれる少なくとも一つに相当する位置におけるシステイン残基が改変されているアミノ酸配列からなる、請求項１に記載の変異型逆転写酵素。

  3. 　前記システイン残基の改変が、システイン残基の欠失及び／又は他のアミノ酸残基への置換である、請求項１又は２に記載の変異型逆転写酵素。

  4. 　前記システイン残基の改変が、アラニン、グリシン、バリン、ロイシン、及びイソロイシンからなる群より選択される少なくとも一つの非極性アミノ酸残基への置換である、請求項１から３のいずれかに記載の変異型逆転写酵素。

  5. 　前記システイン残基の改変が、アラニン残基への置換である、請求項１から４のいずれかに記載の変異型逆転写酵素。

  6. 　配列番号１に記載のアミノ酸配列と９０％以上の同一性を有するアミノ酸配列において、少なくとも３１０位に相当する位置のシステイン残基が改変されていることを特徴とする、請求項１から５のいずれかに記載の変異型逆転写酵素。

  7. 　前記３１０位に相当する位置のシステイン残基の改変がアラニン、グリシン、バリン、ロイシン、及びイソロイシンからなる群より選択される非極性アミノ酸残基への置換である、請求項１から６のいずれかに記載の変異型逆転写酵素。

  8. 　前記３１０位に相当する位置のシステイン残基の改変がアラニン残基への置換である、請求項１から７のいずれかに記載の変異型逆転写酵素。

  9. 　ＲＮａｓｅ活性を欠く、請求項１から８のいずれかに記載の変異型逆転写酵素。

  10. 　２５℃で３５日間保存した場合に３０％以上の残存活性率を示す、変異型逆転写酵素。

  11. 　２５℃で３５日間保存した場合に５０％以上の残存活性率を示す、変異型逆転写酵素。

  12. 　請求項１から８のいずれかに記載の逆転写酵素をコードするポリヌクレオチド。

  13. 　請求項１２に記載のポリヌクレオチドを含むベクター。

  14. 　請求項１３に記載のベクターで形質転換された細胞。

  15. 　請求項１から１１のいずれかに記載の変異型逆転写酵素、請求項１２に記載のポリヌクレオチド、請求項１３に記載のベクター、及び請求項１４に記載の細胞からなる群より選択される少なくとも１つを含む試薬。

  16. 　請求項１２に記載のポリヌクレオチド、請求項１３に記載のベクター、請求項１４に記載の細胞、及び請求項１５に記載の試薬からなる群より選択される少なくとも１つを用いて、請求項１から１１のいずれかに記載の変異型逆転写酵素を製造する方法。

  17. 　請求項１から１１のいずれかに記載の変異型逆転写酵素を用いて、ＲＮＡのテンプレートからｃＤＮＡを合成することを特徴とする逆転写方法。

  18. 　請求項１から１１のいずれかに記載の変異型逆転写酵素を含むキット。

  19. 　ＲＮＡをテンプレートとしてｃＤＮＡを合成するために用いられる、請求項１８に記載のキット。
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