JP2023090534A - 熱安定性に優れた逆転写酵素 - Google Patents

Abstract

【課題】熱安定性に優れた新規の逆転写酵素を提供すること。【解決手段】（ａ）特定のアミノ酸配列に対して９４％以上の同一性を有するアミノ酸配列；又は（ｂ）前記特定のアミノ酸配列において１又は数個のアミノ酸の欠失、置換、挿入、又は付加を有するアミノ酸配列、からなる逆転写酵素。【選択図】なし

Description

本発明は、逆転写酵素に関する。さらに詳しくは、本発明は、熱安定性に優れた逆転写酵素、並びに該逆転写酵素を用いる逆転写方法、該逆転写酵素をコードするポリヌクレオチド、該逆転写酵素を含むキット等に関する。

逆転写酵素は、一般的に、ＲＮＡをテンプレートとしてｃＤＮＡを合成する活性（以下、「ＲＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼ活性」という）と、ＲＮＡ：ＤＮＡハイブリッド中のＲＮＡ鎖を分解する活性（以下、「ＲＮａｓｅ Ｈ活性」という）を有している。逆転写酵素は、例えば、生体で発現しているタンパク質のアミノ酸配列を直接反映しているｍＲＮＡの塩基配列の解析、ｃＤＮＡライブラリーの構築、ＲＴ－ＰＣＲなどの用途に用いられている。このような用途に用いる逆転写酵素としては、従来より、モロニーマウス白血病ウイルス逆転写酵素（ＭＭＬＶ）またはトリ骨髄芽球症ウイルス逆転写酵素（ＡＭＶ）等が知られている。

ｍＲＮＡが二次構造を形成しやすい塩基配列を有する場合、逆転写酵素によるｃＤＮＡの合成が前記二次構造によって妨げられることから、反応温度を高くすることによって二次構造の形成を抑制しながらｃＤＮＡを合成することが望まれる。しかしながら、前記モロニーマウス白血病ウイルス逆転写酵素およびトリ骨髄芽球症ウイルス逆転写酵素は、熱安定性が低いことが多く、ＲＮＡの二次構造の形成が抑制されるような高い温度では、失活してしまうことがある。そこで、近年では逆転写酵素に複数のアミノ酸変異を導入するなどの工夫により、野生型逆転写酵素よりも高い熱安定性を保有し、通常は安定性に乏しかった４２～６０℃でも反応性が改善した逆転写酵素等が種々開発されている（特許文献１、２、非特許文献１）。しかしながら、更なる安定性が向上した逆転写酵素は依然として望まれている。

従来の逆転写酵素の改良方法は、１又は数個、多くても十数個のアミノ酸について変異を導入して評価するという手法が一般的であった。しかし、この方法では、変異の組み合わせの選定には膨大な数の実験が必要となる。そのため実際には、研究者の経験や勘などで変異をある程度絞って選定し、評価する場合も多い。そのため、これまでに見出されてきた逆転写酵素の変異体は、野生型の逆転写酵素のアミノ酸配列との相同性が比較的高いものが多かった。また、変異箇所は鋳型と接するヘリックスやシート構造のアミノ酸をターゲットとすることが多く、ループ構造を変異させる場合でも、鋳型に接する部分のアミノ酸残基をターゲットとして変異させることが殆どであった。

特開２０００－１３９４５７号公報 特許第６１８０００２号公報

Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｖｏｌ．１５０，Ｉｓｓｕｅ ３，Ｐａｇｅｓ ２９９－３０６，（２０１０年発刊）

熱安定性の向上した、新規な逆転写酵素を提供することが一つの課題である。

本発明者らは、上記課題に鑑み、鋭意研究の結果、逆転写酵素活性（以下、逆転写活性ともいう）を有し、且つ改善された熱安定性を示す逆転写酵素を見出し、本発明に到達した。
［項１］ 以下のアミノ酸配列からなる逆転写酵素：
（ａ）配列番号２に示されるアミノ酸配列に対して９４％以上の同一性を有するアミノ酸配列；又は
（ｂ）配列番号２に示されるアミノ酸配列において１又は数個のアミノ酸の欠失、置換、挿入、又は付加を有するアミノ酸配列。
［項２］ 前記（ａ）又は（ｂ）のアミノ酸配列において、以下の（ｉ）～（ｖｉ）のアミノ酸残基を有する、項１に記載の逆転写酵素：
（ｉ）６７番目に相当する位置のアミノ酸がＬ又はＭである、
（ｉｉ）１７５番目に相当する位置のアミノ酸がＤである、
（ｉｉｉ）２２９番目に相当する位置のアミノ酸がＬ又はＩである、
（ｉｖ）３０８番目に相当する位置のアミノ酸がＡである、
（ｖ）４３７番目に相当する位置のアミノ酸がＡ又はＴである、及び、
（ｖｉ）５９２番目に相当する位置のアミノ酸がＡである。
［項３］ 前記（ａ）又は（ｂ）のアミノ酸配列において、以下の（１）～（４）からなる群より選択される少なくとも１つのアミノ酸残基を有する、項１又は２に記載の逆転写酵素：
（１）６３番目に相当する位置のアミノ酸がＲある、
（２）２１７番目に相当する位置のアミノ酸がＱである、
（３）４７６番目に相当する位置のアミノ酸がＰである、及び
（４）４７８番目に相当する位置のアミノ酸がＩである。
［項４］ 前記（ａ）又は（ｂ）のアミノ酸配列において、以下の（３）のアミノ酸残基を有する、項１～３のいずれかに記載の逆転写酵素：
（３）４７６番目に相当する位置のアミノ酸がＰである。
［項５］ 前記（ａ）及び（ｂ）のアミノ酸配列において、以下の（５）～（１０）、（３）、又は（１１）～（１３）からなる群より選択される少なくとも１つのアミノ酸残基を有する、項１～４のいずれかに記載の逆転写酵素：
（５）４７番目に相当する位置のアミノ酸がＰである、
（６）６２番目に相当する位置のアミノ酸がＶである、
（７）１４４番目に相当する位置のアミノ酸がＲである、
（８）２３３番目に相当する位置のアミノ酸がＴである、
（９）３５４番目に相当する位置のアミノ酸がＳである、
（１０）４２９番目に相当する位置のアミノ酸がＬである、
（３）４７６番目に相当する位置のアミノ酸がＰである、
（１１）４９５番目に相当する位置のアミノ酸がＤである、
（１２）５４２番目に相当する位置のアミノ酸がＶである、及び
（１３）６６２番目に相当する位置のアミノ酸がＬである。
［項６］
配列番号１に示されるアミノ酸配列に対して８０％以上の同一性を有し、以下の（１）～（４）からなる群より選択される少なくとも１つのアミノ酸残基を有する、逆転写酵素：
（１）６３番目に相当する位置のアミノ酸がＲある、
（２）２１７番目に相当する位置のアミノ酸がＱである、
（３）４７６番目に相当する位置のアミノ酸がＰである、及び
（４）４７８番目に相当する位置のアミノ酸がＩである。
［項７］
配列番号１に示されるアミノ酸配列に対して８０％以上の同一性を有し、以下の（３）のアミノ酸残基を有する、項６に記載の逆転写酵素：
（３）４７６番目に相当する位置のアミノ酸がＰである。
［項８］
配列番号１に示されるアミノ酸配列に対して８０％以上の同一性を有し、以下の（５）～（１０）、（３）、及び（１１）～（１３）から成る群より選択される少なくとも１つのアミノ酸残基を有する、項６又は７に記載の逆転写酵素：
（５）４７番目に相当する位置のアミノ酸がＰである、
（６）６２番目に相当する位置のアミノ酸がＶである、
（７）１４４番目に相当する位置のアミノ酸がＲである、
（８）２３３番目に相当する位置のアミノ酸がＴである、
（９）３５４番目に相当する位置のアミノ酸がＳである、
（１０）４２９番目に相当する位置のアミノ酸がＬである、
（３）４７６番目に相当する位置のアミノ酸がＰである、
（１１）４９５番目に相当する位置のアミノ酸がＤである、
（１２）５４２番目に相当する位置のアミノ酸がＶである、及び
（１３）６６２番目に相当する位置のアミノ酸がＬである。
［項９］ 配列番号１又は２に示されるアミノ酸配列の（Ａ）９１番目～１０５番目に相当する領域、（Ｂ）１０９番目～１２０番目に相当する領域、（Ｃ）１２５番目～１３８番目に相当する領域、（Ｄ）１４６番目～１５７番目に相当する領域、（Ｅ）１８２番目～２０５番目に相当する領域、（Ｆ）２２０番目～２２８番目に相当する領域、（Ｇ）２５１番目～２６３番目に相当する領域、（Ｈ）３０２番目～３１９番目に相当する領域、（Ｉ）３５１番目～３５８番目に相当するｖ、及び（Ｊ）３９１番目～４０４番目に相当する領域から成る群から選択される１個以上に相当する領域のアミノ酸配列が、配列番号１又は２のアミノ酸配列において対応する領域のアミノ酸配列と９０％以上の同一性を有する、項１～８のいずれかに記載の逆転写酵素。
［項１０］ 前記（ａ）のアミノ酸配列が、配列番号２に示されるアミノ酸配列に対して９７％以上の同一性を有するアミノ酸配列である、項１～９のいずれかに記載の逆転写酵素。
［項１１］ ＲＮａｓｅＨ活性を欠く、項１～１０のいずれかに記載の逆転写酵素。
［項１２］ ５０℃で１０分間熱処理を行った場合に７０％以上の残存活性率を示す、項１～１１のいずれかに記載の逆転写酵素。
［項１３］項１～１２のいずれかに記載の逆転写酵素をコードするポリヌクレオチド。
［項１４］ 項１３に記載のポリヌクレオチドを含むベクター。
［項１５］ 項１４に記載のベクターで形質転換された細胞。
［項１６］ 項１～１２のいずれかに記載の逆転写酵素、項１３に記載のポリヌクレオチド、項１４に記載のベクター、及び／又は項１５に記載の細胞を含む試薬。
［項１７］ 項１３に記載のポリヌクレオチド、項１４に記載のベクター、項１５に記載の細胞、及び／又は項１６に記載の試薬を用いて、項１～１２のいずれかに記載の逆転写酵素を製造する方法。
［項１８］ 項１～１２のいずれかに記載の逆転写酵素を用いて、ＲＮＡのテンプレートからｃＤＮＡを合成する方法。
［項１９］ 項１～１２のいずれかに記載の逆転写酵素を含むキット。
［項２０］ ＲＮＡをテンプレートとしてｃＤＮＡを合成するために用いられる、項１９に記載のキット。

本発明により、熱安定性の向上した新規の有用な逆転写酵素が提供される。熱安定性の向上した逆転写酵素は高次構造を組むＲＮＡから逆転写反応をする場合であっても、野生型逆転写酵素と比較してｃＤＮＡ合成量が増大し、様々な鋳型からｃＤＮＡ合成を行うことができる。

実施例５において電気泳動を行った結果を示す図である。 変異型逆転写酵素Ｇ７のアミノ酸配列と野生型逆転写酵素（ＭＭＬＶ及びＨＩＶ）のアミノ酸配列とをアラインメントした結果を示す図である。 実施例７において電気泳動を行った結果を示す図である。 変異型逆転写酵素Ｇ７、Ｇ２、及びＧ６のアミノ酸配列と野生型逆転写酵素（ＭＭＬＶ）のアミノ酸配列とのアライメントにおいて、保存性が高い領域を示す図である。

以下に本発明を詳細に説明するが、本発明はこれらに限定されるものではない。

本発明は、熱安定性が向上した新規の逆転写酵素を提供する。

本明細書において「逆転写酵素」とは、ＲＮＡをテンプレートとしてｃＤＮＡを合成する活性（以下、「ＲＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼ活性」、又は「逆転写活性」「逆転写酵素活性」などともいう）を有する酵素をいい、ＲＮａｓｅ Ｈ活性は有していても有していなくてもよい。ＲＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼ活性の有無は、後述の逆転写活性の測定方法により確認することができる。逆転写酵素には、野生型逆転写酵素、及び野生型逆転写酵素のアミノ酸配列に人為的に変異が導入された変異型逆転写酵素などが含まれ得る。

本明細書において、「野生型逆転写酵素」（以下、「ＷＴ」ともいう。）とは、人為的に変異が導入されていない逆転写酵素をいう。このような野生型逆転写酵素としては、配列番号１に記載するアミノ酸配列からなる逆転写酵素があげられる。ここで、「配列番号１に記載のアミノ酸配列」とは、配列表の配列番号１に示されるアミノ酸配列（モロニーマウス白血病ウイルス逆転写酵素のアミノ酸配列）をいう。さらに、「モロニーマウス白血病ウイルス逆転写酵素」を「ＭＭＬＶ逆転写酵素」と表すこともある。

本発明の新規逆転写酵素は、従来知られた野生型逆転写酵素とは異なるアミノ酸配列を有する。従って、本明細書では、本発明の逆転写酵素を、変異型逆転写酵素又は改変型逆転写酵素ということがある。本明細書において「変異型逆転写酵素」又は「改変型逆転写酵素」という場合の「変異型」又は「改変型」は互換可能に用いられ、従来知られた逆転写酵素とは異なるアミノ酸配列を備えることを意味するものであり、人為的変異によるか自然界における変異によるかを区別するものではない。従って、本発明の変異型逆転写酵素は、野生型の逆転写酵素配列を示す配列番号１に記載のアミノ酸配列において１以上のアミノ酸が改変されて、配列番号１とは異なるアミノ酸配列を有する逆転写酵素であり、当該変異型逆転写酵素が、人為的変異により得られた逆転写酵素であるか、自然界における変異により得られた逆転写酵素であるかを問わない。

本明細書においては、塩基配列、アミノ酸配列およびその個々の構成因子については、アルファベット表記による簡略化した記号を用いる場合があるが、いずれも分子生物学・遺伝子工学分野における慣行に従う。また、本明細書においては、アミノ酸配列の変異を簡潔に示すため、例えば「Ｋ６３Ｒ」などの表記を用いる。「Ｋ６３Ｒ」は、第６３番目のリシン（Ｋ）のアルギニン（Ｒ）にへの置換を示しす。すなわち、置換前のアミノ酸残基の種類、その場所、置換後のアミノ酸残基の種類を示す。また、配列番号は、特に断らない限り、配列表に記載された配列番号に対応する。また、多重変異体の場合は、上記の表記を「／」でつなげて表すことができる（例えば、Ｋ６３Ｒ／Ｄ２１７Ｑ／Ｖ４７６Ｐ／Ａ４７８Ｉのように表記できる）。なお、本明細書において、配列番号２に示されるアミノ酸配列と完全同一ではないアミノ酸配列おける、配列番号２上のある位置（Ｘ番目）に相当する位置とは、配列の一次構造を比較（アラインメント）したときに、配列番号２の当該位置と対応する位置をいうものとする。

一実施形態において変異型逆転写酵素は、配列番号２に示すアミノ酸配列と一定以上のアミノ酸配列同一性を有することが好ましい。そのような変異型逆転写酵素は、逆転写活性を有しながら、改善された熱安定性を示す。

一実施形態において変異型逆転写酵素は、以下の（ａ）及び／又は（ｂ）のアミノ酸配列を有する：
（ａ）配列番号２に示されるアミノ酸配列に対して９４％以上の同一性を有するアミノ酸配列；又は
（ｂ）配列番号２に示されるアミノ酸配列において１又は数個のアミノ酸の置換、欠失、挿入、又は付加を有するアミノ酸配列。
一実施形態において、変異型逆転写酵素は、上記のようなアミノ酸配列を有し、且つ、逆転写酵素活性と熱安定性（例えば、５０℃で１０分間熱処理を行った場合に７０％以上の残存活性率を示す）を示す。

配列番号２に示されるアミノ酸配列を有する逆転写酵素は、野生型逆転写酵素（ＭＭＬＶ）に対するアミノ酸配列同一性が９３％である。このように野生型逆転写酵素と比較的高いアミノ酸配列同一性を有するが、野生型逆転写酵素には無い高い熱安定性を示すことが後述の試験例の結果より明らかとなっている。本発明の逆転写酵素は、配列番号２に示されるアミノ酸配列からなるものに限定されず、このアミノ酸配列を更に改変したものであってもよい。

一つの実施形態において、変異型逆転写酵素は、配列番号２に記載のアミノ酸配列において一定の割合で改変を有するものであり得る。一実施形態において、変異型逆転写酵素は、配列番号１に示されるアミノ酸配列に対して８０％以上の同一性を有することが好ましい。変異型逆転写酵素は、逆転写活性及び／又は熱安定性が失われていない限り特に制限されない。例えば、配列番号１のアミノ酸との同一性が８５％以上、９０％以上、９５％以上、９６％以上、９７％以上、９８％以上、９９％以上のアミノ酸配列を有するもの、又は配列番号２に記載のアミノ酸配列との同一性が９４％以上、９５％以上、９６％以上、９７％以上、９８％以上、９９％以上であるアミノ酸配列から構成されるものが好適である。ここで、アミノ酸配列の同一性は、当該分野で公知の任意の手段で評価することができる。例えば、市販の又は電気通信回線（インターネット）を通じて利用可能な解析ツールを用いて算出することができ、一例として、全米バイオテクノロジー情報センター（ＮＣＢＩ）の相同性アルゴリズムＢＬＡＳＴ（Ｂａｓｉｃ ｌｏｃａｌ ａｌｉｇｎｍｅｎｔ ｓｅａｒｃｈ ｔｏｏｌ）ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ＢＬＡＳＴ／においてデフォルト（初期設定）のパラメータを用いることにより、アミノ酸配列の同一性を算出することが可能である。さらに、改変型逆転写酵素のアミノ酸配列は、配列番号２に記載のアミノ酸配列において、１又は数個のアミノ酸が欠失、置換、挿入、及び／又は付加されたアミノ酸配列であってもよい。ここで「１又は数個」とは、逆転写活性及び／又は熱安定性が失われていない限り特に制限されないが、例えば、１～３０個、さらには１～２０個、好ましくは１～１０個、より好ましくは１～５個、更に好ましくは１～３個である。前記のようなアミノ酸配列は、例えば、遺伝子工学的な手法により人為的に作製するものであってもよいし、天然に由来するタンパク質のアミノ酸配列であってもよい。

一実施形態において、変異型逆転写酵素が、配列番号１又は２に記載のアミノ酸配列において置換を有する場合、その置換は、構造的及び／又は化学的に類似するアミノ酸間での置換（いわゆる保存的置換）であることが好ましい。保存的置換の例としては、例えば、塩基性アミノ酸（Ｈ，Ｋ，Ｒ）間での置換、酸性アミノ酸（Ｄ、Ｅ）間での置換、中性の非極性アミノ酸（Ａ，Ｖ，Ｌ，Ｉ，Ｐ，Ｆ，Ｍ，Ｗ）間での置換、中性の極性アミノ酸（Ｇ，Ｎ，Ｑ，Ｓ，Ｔ，Ｖ，Ｃ）間での置換、芳香族アミノ酸（Ｗ，Ｆ，Ｈ，Ｙ）間での置換、含窒素アミノ酸（Ｋ，Ｒ，Ｎ，Ｑ，Ｐ）間での置換、含硫黄アミノ酸（Ｃ、Ｍ）間での置換、含酸素アミノ酸（Ｓ，Ｔ）間での置換、β分岐鎖アミノ酸（Ｖ，Ｌ，Ｉ）間での置換、直鎖アルキル又は水素の側鎖を有するアミノ酸（Ａ，Ｇ）間での置換が挙げられるが、これらに限定されない。

一つの実施形態において、変異型逆転写酵素は、逆転写酵素を特徴づけるアミノ酸残基として後述の実施例で特定されたアミノ酸残基を有することが好ましい。このようなアミノ酸残基としては、具体的に、下記の（ｉ）～（ｖｉ）のアミノ酸残基を挙げることができる。本発明の逆転写酵素は、下記（ｉ）～（ｖｉ）のいずれか１つのアミノ酸残基を有するものであり得るが、好ましくは、（ｉ）～（ｖｉ）のうち２以上、３以上、４以上、５以上、特に好ましくは６つ全てのアミノ酸残基を有するものが好ましい。
［逆転写酵素を特徴づけるアミノ酸残基の例］
（ｉ）６７番目に相当する位置のアミノ酸がＬ又はＭである、
（ｉｉ）１７５番目に相当する位置のアミノ酸がＤである、
（ｉｉｉ）２２９番目に相当する位置のアミノ酸がＬ又はＩである、
（ｉｖ）３０８番目に相当する位置のアミノ酸がＡである、
（ｖ）４３７番目に相当する位置のアミノ酸がＡ又はＴである、
（ｖｉ）５９２番目に相当する位置のアミノ酸がＡである。

特定の好ましい実施形態では、変異型逆転写酵素は、上記のような逆転写酵素を特徴づけるアミノ酸残基として、６７番目、１７５番目、２２９番目、３０８番目、４３７番目、及び５９２番目の順に６つのアミノ酸残基がＬＤＬＡＡＡ、ＭＤＩＡＡＡ、ＭＤＩＡＴＡ、ＭＤＬＡＡＡ、又はＭＤＬＡＴＡのいずれかのアミノ酸残基を有するものであり得る。これらのなかでも、ＬＤＬＡＡＡ、ＭＤＩＡＴＡ、又はＭＤＬＡＡＡのいずれかのアミノ酸残基を有するものが好ましく、とりわけＭＤＬＡＡＡのアミノ酸残基を有するものが好ましい。このような６つのアミノ酸残基を有することによって、より確実に逆転写活性を有する酵素となり得る。

一つの実施形態において、変異型逆転写酵素は、配列番号２で示される逆転写酵素のアミノ酸配列に特徴的なアミノ酸残基を有することが好ましい。このようなアミノ酸残基としては、野生型の逆転写酵素（ＭＭＬＶ、ＨＩＶ）のアミノ酸配列において共通して認められるにもかかわらず、配列番号２で示されるアミノ酸配列では異なるアミノ酸残基が挙げられる。このような配列番号２のアミノ酸配列に特徴的なアミノ酸残基を有することで、野生型逆転写酵素とは異なる優れた熱安定性がより確実に発揮され得る。このようなアミノ酸残基としては、例えば、下記の（１）～（４）のアミノ酸残基を挙げることができる。
［配列番号２で示される逆転写酵素に特徴的なアミノ酸残基］
（１）６３番目に相当する位置のアミノ酸がＲある、
（２）２１７番目に相当する位置のアミノ酸がＱである、
（３）４７６番目に相当する位置のアミノ酸がＰである、
（４）４７８番目に相当する位置のアミノ酸がＩである。
変異型逆転写酵素は上記（１）～（４）のいずれかの１つのアミノ酸残基を有することが好ましく、より好ましくは、（１）～（４）のうち２以上、３以上を有するものであり、特に上記４個の全てのアミノ酸残基を有するものが好ましい。

逆転写酵素（ＭＭＬＶ）は一般に、αヘリックス、βシート、ループなどのタンパク質の二次元構造が複雑に絡み合って三次元立体構造をとり、５つのドメイン（Ｆｉｎｇｅｒｓ、Ｐａｌｍ、Ｔｈｕｍｂ、Ｃｏｎｎｅｃｔｉｏｎ、ＲＮａｓｅＨドメイン）を構成することが知られている。配列番号２で示される逆転写酵素に特徴的な上記（１）～（４）のアミノ酸残基は、ループ領域に偏在していることが分かっている。従来の変異型逆転写酵素は、鋳型と接するヘリックスやシート構造のアミノ酸を変異させることが多く、ループ領域の変異体はあまり知られていない。本発明の逆転写酵素は、ループ領域において立体構造の柔軟性や化学的性質を変え、鋳型ＲＮＡへの結合力を維持又は向上させながら、構造安定性を高めて、高い耐熱性を示していることが推察される。

一実施形態において、変異型逆転写酵素は、配列番号１又は２のアミノ酸配列のうち下記（Ａ）～（Ｊ）の領域の保存性が高いことが好ましい。
（Ａ）：９１位～１０５位 （Ｔｈｕｍｂ上部）
（Ｂ）：１０９位～１２０位 （Ｔｈｕｍｂ上部２）
（Ｃ）：１２５位～１３８位 （Ｔｈｕｍｂ－Ｐａｌｍ）
（Ｄ）：１４６位～１５７位 （Ｐａｌｍ活性中心）
（Ｅ）：１８２位～２０５位 （Ｔｈｕｍｂ 中部）
（Ｆ）：２２０位～２２８位 （Ｐａｌｍ 活性中心横）
（Ｇ）：２５１位～２６３位 （Ｐａｌｍ 活性中心横）
（Ｈ）：３０２位～３１９位 （Ｆｉｎｇｅｒ）
（Ｉ）：３５１位～３５８位 （Ｆｉｎｇｅｒ）
（Ｊ）：３９１位～４０４位 （Ｆｉｎｇｅｒ－ＲＮａｓｅＨ）
これらの領域は、野生型逆転写酵素（配列番号１）と変異型逆転写酵素（配列番号２～４）とで共通したアミノ酸配列を有する領域である（図４）。一実施形態において、変異型逆転写酵素は、配列番号１又は２のアミノ酸配列と一定以上の同一性を有し、（Ａ）～（Ｊ）から成る群から選択される１個以上に相当する領域のアミノ酸配列は、配列番号１又は２のアミノ酸配列と９０％以上、９５％以上、９６％以上、９８％以上、９９％以上、又は１００％の同一性を有することが好ましい。ここで、１個以上とは、好ましくは、２個以上、３個以上、４個以上、５個以上、６個以上、７個以上、８個以上、９個以上、又は１０個である。

更に特定の実施形態では、変異型逆転写酵素は、配列番号２で示される逆転写酵素のアミノ酸配列に特徴的な上記（１）～（４）のアミノ酸残基のうち、野生型逆転写酵素において対応する位置のアミノ酸残基と構造的及び／又は化学的性質が大きく異なるアミノ酸残基を有することが好ましい。このように野生型逆転写酵素におけるアミノ酸残基と性質が大きく異なるアミノ酸残基は、野生型逆転写酵素では見られなかった本発明の逆転写酵素の高い熱安定性に大きく寄与していると推察される。このようなアミノ酸残基としては、以下の（３）であり得る。
［配列番号２で示される逆転写酵素に特徴的で野生型と性質の異なるアミノ酸残基］
（３）４７６番目に相当する位置のアミノ酸がＰである。

更に後述の実施例に示すように、本発明の逆転写酵素と同様の熱安定性を有することが示された逆転写酵素（配列番号３、４のアミノ酸配列を有する逆転写酵素）のアミノ酸配列と、配列番号２に示されるアミノ酸配列とは、野生型のＭＭＬＶ逆転写酵素にはない特徴的なアミノ酸残基を共通して有していることが確認されている。従って、特定の実施形態では、本発明の逆転写酵素はこの配列番号２、３、４で共通しているアミノ酸残基を有することが好ましい。このようなアミノ酸残基としては、以下の（５）～（１０）、（３）、又は（１１）～（１３）のいずれかであり得る。
［配列番号２、３、４で示される逆転写酵素に特徴的なアミノ酸残基］
（５）４７番目に相当する位置のアミノ酸がＰである、
（６）６２番目に相当する位置のアミノ酸がＶである、
（７）１４４番目に相当する位置のアミノ酸がＲである、
（８）２３３番目に相当する位置のアミノ酸がＴである、
（９）３５４番目に相当する位置のアミノ酸がＳである、
（１０）４２９番目に相当する位置のアミノ酸がＬである、
（３）４７６番目に相当する位置のアミノ酸がＰである、
（１１）４９５番目に相当する位置のアミノ酸がＤである、
（１２）５４２番目に相当する位置のアミノ酸がＶである、
（１３）６６２番目に相当する位置のアミノ酸がＬである。
一つの好ましい実施形態では、本発明の逆転写酵素は、配列番号１又は２のアミノ酸配列と一定以上の同一性を有するアミノ酸配列において、上記（５）～（１０）、（３）、（１１）～（１３）の１０つのアミノ酸残基のうち、２以上、３以上、４以上、５以上、６以上、７以上、８以上、９以上、特に好ましくは１０個の全てのアミノ酸残基を有するものとすればよい。なかでも、上記アミノ酸残基のうちＦｉｎｇｅｒｓドメイン、Ｐａｌｍドメイン又はそれらの近傍のループ領域にある上記（５）、（６）、（７）、（８）から選択される１以上のアミノ酸残基を有することが好ましい。

本発明の逆転写酵素は、上記のようなアミノ酸残基を含むアミノ酸配列で構成され得る。当業者は、当該分野で公知の任意の遺伝子工学的手法により、例えば、目的のアミノ酸配列をコードする塩基配列を適宜設計し、それを任意の発現ベクター等に組み込んだものを宿主細胞に形質転換して発現させる等の手順により、目的のアミノ酸配列の逆転写酵素タンパク質を製造することができる。

特定の実施形態において、本発明の逆転写酵素は、ＲＮａｓｅ活性を欠くものであってもよい。ＲＮａｓｅ活性を欠く逆転写酵素の一例として、５２４位のアスパラギン酸をアラニンに置換したもの及び／又は５８３位のアスパラギン酸をアスパラギンに置換したものが挙げられるが、これに限定するものではない。野生型逆転写酵素が一般に有するＲＮａｓｅ活性は、逆転写反応のテンプレートであるＲＮＡを分解する場合があり、特に、長鎖ＲＮＡ（例えば、完全長ＲＮＡ）をテンプレートとしてｃＤＮＡを合成する際に問題となり得る。ＲＮａｓｅ活性を欠くように改変した逆転写酵素であれば、長鎖ＲＮＡをテンプレートとする逆転写反応において、その反応途中にＲＮＡ鎖のテンプレートが分解されてしまうのを抑制することができるので好ましい。

本発明の逆転写酵素は、逆転写活性と高い熱安定性を併せ持つことを特徴としている。ここで逆転写活性及び熱安定性は、具体的に、以下の測定方法により確認することができる。当業者は、配列番号１又は２に示されるアミノ酸配列と所定の関係にある変異型逆転写酵素について、下記の方法に従って逆転写活性及び熱安定性の有無を評価でき、取得することができる。

［逆転写活性の測定方法］
本明細書において、逆転写酵素の逆転写活性は、以下の操作により測定することができる。本測定方法において、酵素活性が高い場合は、測定対象を含むサンプルを適宜希釈して測定を行えばよい。

先ず、予め調製した下記のＡ液１０μＬ、Ｂ液２２μＬ、Ｃ液１μＬ、及び滅菌水１２μＬを、マイクロチューブ等の反応容器に加えて攪拌混合後、測定対象を含むサンプル液又はその希釈液５μＬを加えて、４２℃で１０分間反応させる。その後、冷却し、下記のＤ液１５０μＬを加えて、攪拌後さらに１０分間氷冷する。この液をガラスフィルター（ワットマン製ＧＦ／Ｃフィルター）でろ過し、０．１Ｎ塩酸及び１００％エタノールで十分洗浄し、フィルターの放射活性を液体シンチレーションカウンター（パッカード製Ｔｒｉ－Ｃａｒｂ２８１０ ＴＲ）を用いて計測し、ヌクレオチドの取り込みを測定する。酵素活性の１単位はこの条件下で１０分当たり１ｎｍｏｌｅのヌクレオチドを酸不溶性画分に取り込む酵素量とする。

（逆転写酵素活性測定用試薬）
・Ａ液：２５０ｍＭ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ（ｐＨ８．３）、３７５ｍＭ 塩化カリウム、１５ｍＭ 塩化マグネシウム、５０ｍＭ ジチオスレイトール、
・Ｂ液：１ｍｇ／ｍＬ ｐｏｌｙＡ、１ｐｍｏｌ／μＬ ｄＴ２０、１０ｍＭ ｄＴＴＰ、
・Ｃ液：［３Ｈ］－ｄＴＴＰ、
・Ｄ液：０．０７Ｍ ピロリン酸ナトリウム、０．７Ｍ トリクロロ酢酸。

［熱安定性（熱処理後の逆転写活性の残存活性率）の測定］
測定対象となる各変異型逆転写酵素を、保存緩衝液（５０ｍＭ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ（ｐＨ７．５）、３００ｍＭ ＫＣｌ、５０％ ｇｌｙｃｅｒｏｌ、０．１ｍＭ ＥＤＴＡ）により１００Ｕ／μＬに希釈した後、前記逆転写活性の測定方法に記載の手順に従い、保存前の逆転写活性値を測定する。次いで、上記の保存緩衝液に希釈した測定対象の各変異型逆転写酵素を、所定の保存条件下（例えば、４５℃～５５℃のインキュベータ内で５～１５分間保存する条件下、好ましい実施形態では５０℃のインキュベータ内で１０分間保存する条件下）に置いて保存する。保存開始から所定時間経過後（例えば５～１５分後、好ましい実施形態では１０分後）に、保存前と同様に前記逆転写活性の測定方法に記載の手順に従い、保存後の逆転写活性値を測定する。次いで、以下の式Ｉに記載のように、保存後の逆転写活性値を保存前の逆転写活性値で除算することにより、残存活性率を算出できる。
残存活性率（％）＝（保存後の逆転写活性値／保存前の逆転写活性値）×１００・・・（式Ｉ）

本発明の逆転写酵素は、野生型の逆転写酵素よりも高い熱安定性を示す。好ましい実施形態では、本発明の逆転写酵素は、例えば５０℃で１０分間熱処理した場合に、５０％以上の残存活性を示す逆転写酵素であり得、更には６０％以上の残存活性を率を示す逆転写酵素であり得、７０％以上の残存活性率を示す逆転写酵素であることが好ましい。

更に別の観点から、本発明の逆転写酵素は、例えば、５０℃で１０分間にわたり熱処理した場合に、野生型逆転写酵素の残存活性率と比較して高い残存活性率を示す変異型逆転写酵素であり得る。具体的には、例えば、５０℃で１０分間熱処理した場合に、野生型逆転写酵素の残存活性率と比較して約１．５倍以上、好ましくは約２．０倍以上高い残存活性率を示す逆転写酵素であり得る。

更なる実施形態において、本発明は、前記のような本発明の逆転写酵素をコードするポリヌクレオチドを提供する。ここで、逆転写酵素をコードするポリヌクレオチドとは、例えばそれを常法により発現させた場合に、本発明の逆転写酵素のタンパク質が得られるポリヌクレオチドをいう。即ち、本発明の逆転写酵素のタンパク質のアミノ酸配列に対応する塩基配列から構成されるポリヌクレオチドを指す。当業者は、当該分野で周知のコドン表などに従って、所定のアミノ酸配列に対応する塩基配列を容易に決定することができる。また、本発明の逆転写酵素をコードするポリヌクレオチドは、コドンの縮重により相違するポリヌクレオチドも包含する。ポリヌクレオチドとしては、ＤＮＡ、ＲＮＡ等の任意の核酸ポリマーであり得る。

更なる実施形態において、本発明は、前記ポリヌクレオチドを含むベクターを提供する。具体的には、上記逆転写酵素をコードするポリヌクレオチドを必要に応じてベクター（例えば、発現ベクター、クローニングベクター等）に移し替える。該ベクターは、本発明の逆転写酵素のクローニング及び／又は発現等を可能とするものであればいかなるものでもよく、例えばプラスミドが挙げられる。プラスミドとしてはｐＵＣ１１８、ｐＵＣ１８、ｐＢＲ３２２、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ、ｐＬＥＤ－Ｍ１、ｐ７３、ｐＧＷ７、ｐＥＴ３ａ、ｐＥＴ８ｃ、ｐＥＴ２３ｂなどが挙げられるがこれに限定するものではない。

更なる実施形態において、本発明は、前記ベクターで形質転換された細胞を提供する。このような細胞は、本発明の逆転写酵素をコードするタンパク質を発現させるために好適に使用され得る。特定の好ましい実施形態において、本発明の組換え宿主細胞は、上記発現ベクターを用いて宿主細胞を形質転換することにより得られるものである。該宿主細胞としては、大腸菌、酵母などが挙げられるが、特に大腸菌が好ましい。大腸菌としては、例えばエシェリヒア・コリ（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）ＤＨ５α、ＪＭ１０９、ＨＢ１０１、ＸＬ１Ｂｌｕｅ、ＰＲ１、ＨＳ６４１（ＤＥ３）、ＢＬ２１（ＤＥ３）などが挙げられる。すなわち、本発明においては、上記の逆転写酵素をコードする遺伝子を上記ベクターに挿入して発現ベクターとし、さらに該発現ベクターにて宿主細胞を形質転換することが好ましい。

一つの実施形態において、本発明の発現ベクターは、逆転写酵素の精製をより容易にするためのエレメント、例えば、細胞外分泌シグナル、Ｈｉｓタグなどを含有していてもよい。

更なる実施形態では、前記ポリヌクレオチド、前記ベクター、前記形質転換細胞、及び／又はこれらの１つ以上を含む試薬を用いて、前記逆転写酵素を製造する方法をも提供する。例えば、該発現ベクターを用いて宿主細胞を形質転換した後、アンピシリン等の薬剤を含む寒天培地に塗布し、コロニーを形成させる。コロニーを栄養培地、例えばＬＢ培地や２×ＹＴ培地に接種し、３７℃で１２～２０時間培養した後、菌体を破砕して粗酵素液を抽出する。菌体を破砕する方法としては公知のいかなる手法を用いても良いが、例えば超音波処理、フレンチプレスやガラスビーズ破砕のような物理的破砕法やリゾチームのような溶菌酵素を用いることができる。得られた粗酵素液から精製逆転写酵素を取得する方法は、いかなる手法を用いてもよいが、例えば、遠心分離、超遠心分離、限外濾過、塩析、透析、イオン交換カラムクロマトグラフィー、吸着カラムクロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィー、ゲル濾過カラムクロマトグラフィーなどに供することにより、本発明の逆転写酵素を単離することができる。

本発明は更に、前記の本発明の逆転写酵素を用いることを特徴とする逆転写方法を提供する。本発明の逆転写方法は、本発明の逆転写酵素を用いてＲＮＡのテンプレートからｃＤＮＡを合成することを特徴としている。本発明の逆転写酵素は、野生型逆転写酵素と比べて高い熱安定性を有している。そのため、本発明の逆転写方法によれば、ＲＮＡの二次構造の形成を抑制するのに十分な高い温度を含む幅広い温度範囲（例えば、～５０℃付近まで）で逆転写反応を行なうことができる。したがって、本発明の逆転写方法は、ＲＮＡの種類によらず、例えば、二次構造を形成しやすいＲＮＡを鋳型とした逆転写反応を効率よく行なうことができ、汎用性が高い。

一つの好ましい実施形態において、本発明の逆転写方法では、前記逆転写酵素と、テンプレートとなるＲＮＡと、前記ＲＮＡの一部に相補的なオリゴヌクレオチドプライマーと、４種のデオキシリボヌクレオシドトリホスフェートとを、逆転写反応用緩衝液中でインキュベーションすることにより逆転写反応を行なうことができる。

逆転写反応における反応温度は、用いられるＲＮＡの種類、用いられる逆転写酵素の種類などによって異なるため、用いられるＲＮＡの種類、用いられる逆転写酵素の種類などに応じて適宜設定することが好ましい。前記反応温度は、例えば、用いられるＲＮＡが二次構造を形成しにくいＲＮＡである場合、３７～４２℃となるように設定することができる。また、前記反応温度は、例えば、用いられるＲＮＡが二次構造を形成しやすいＲＮＡである場合、野生型逆転写酵素に適した反応温度よりも高い温度、例えば、４２～５０℃となるように設定することができる。本発明の逆転写酵素は高い熱安定性を有しているため、このように反応温度が高い条件であっても、十分に逆転写反応を行うことができるというメリットがある。前記反応時間は、例えば、１分間～１時間程度、好ましくは３分間～３０分間程度、より好ましくは５分～１０分間程度とすることができるが、限定されない。

本発明の逆転写方法に用いられる前記逆転写反応用緩衝液は、２価の陽イオン、例えば、マグネシウムイオン、マンガンイオンなどを含有してもよい。２価の陽イオンの濃度は、逆転写酵素の種類や逆転写反応緩衝液に含まれる他の成分などに応じて適宜設定することが好ましい。例えば、逆転写反応用緩衝液中における２価の陽イオン濃度は、１～３０ｍＭで設定される。また、前記逆転写反応用緩衝液は、本発明の目的を妨げない範囲で、必要に応じて、還元剤（例えば、ジチオスレイトールなど）、安定化剤（例えば、グリセロール、トレハロースなど）、有機溶媒（例えば、ジメチルスルホキシド、ホルムアミドなど）などの成分を含有していてもよい。

更なる実施形態において、本発明は、前記逆転写酵素、前記ポリヌクレオチド、前記ベクター、及び／又は前記細胞を含む試薬を提供する。これらの試薬は使用目的等に応じて他に任意の成分（例えば、安定化剤、防腐剤等の任意の添加剤）を含むことができる。例えば、前記逆転写酵素を含む試薬は、前記逆転写反応用緩衝液等を更に含むものであってもよい。本発明の前記試薬の用途は特に限定されず、例えば、ＲＮＡをテンプレートとしてｃＤＮＡ合成を行う逆転写反応に好適に使用することができる。更には、本発明の前記試薬は、本発明の逆転写酵素を製造するために好適に使用することができる。

更なる実施形態において、本発明は、前記逆転写酵素、前記ポリヌクレオチド、前記ベクター、前記細胞、及び／又はこれらの１つ以上を含む試薬で構成されたキットを提供する。本発明の前記キットは、例えば、ＲＮＡをテンプレートとしてｃＤＮＡ合成を行う逆転写反応を行うためのキット、本発明の逆転写酵素を製造するためのキット等であり得るが、好ましくは、ＲＮＡをテンプレートとしてｃＤＮＡを合成するために用いられるキット（これを、逆転写反応キット等ともいう）である。

一つの実施形態において、本発明の逆転写反応キットは、逆転写反応を行なうためのキットであって、本発明の逆転写酵素（当該逆転写酵素を含む試薬として提供される場合も含む）を含有することを一つの特徴としている。本発明の逆転写反応キットは、高い熱安定性を有する本発明の逆転写酵素を含有しているため、ＲＮＡの二次構造の形成を抑制するのに十分な高い温度を含む幅広い温度範囲での逆転写反応であっても好適に使用され得る。また、熱安定性が向上しているため、低濃度の鋳型も検出可能であることから、利便性が高い。本発明の前記キットは更に、本発明の逆転写酵素を使用して逆転写反応を行う場合の使用説明書等を含み得る。本発明のキットは、前記逆転写酵素等を例えば一つの包装体に梱包し、当該キットの使用方法に関する情報を含む態様で提供することができる。

特定の実施態様において、例えば、逆転写反応キットにおいて、前記逆転写反応を行なうのに必要な試薬は、逆転写酵素が入った容器とは異なる容器中に封入されていてもよく、また、前記試薬の保存中における逆転写反応の進行が停止されているのであれば、前記逆転写酵素と同じ容器に封入されていてもよい。前記試薬は、逆転写反応を行なうのに適した量となるように容器に封入されていてもよい。これにより、各試薬を逆転写反応に適した量となるように混合する必要がなくなるので、取り扱いを容易にすることができる。

以下、本発明を実施例により具体的に説明する。なお、本発明は実施例に特に限定されるものではない。

実施例１ バイオインフォマティクスによる逆転写酵素遺伝子のスクリーニング
本実施例では、既知の膨大な数のタンパク質群のビッグデータから、バイオインフォマティクス技術を利用して酵素の遺伝子設計を試みた。詳細には、タンパク質のアミノ酸配列のシークエンスアラインメントを用いて、既存のデータベースの中から、目的酵素活性を有する既知のタンパク質のアミノ酸配列と類似するアミノ酸配列を有する複数のタンパク質からなるライブラリーを作成し、それらの間で少なくとも２つの相関残基を特定し、当該相関残基を有するタンパク質を選択し、評価することによって、新規逆転写酵素のスクリーニングを行った。
本実施例では、配列番号１に示される野生型逆転写酵素のアミノ酸配列を指標として、ＢＬＡＳＴｐにおいて類似配列を５０００個選別した。そのうち極端に長い配列又は短い配列のものを除去するキュレーションを行い４５０配列まで絞り込みを行った。次いで、選別されたアミノ酸配列について特開２０１８－８８８６４号公報（参照することによりその全体が本明細書に組み込まれる）に記載の統計学手法を用いて解析を行った。得られた結果から分類を行い、逆転写酵素を分類できる６つのアミノ酸残基（配列番号１の６７、１７５、２２９、３０８、４３７及び５２９位）が、ＬＤＬＡＡＡ、ＭＤＩＡＡＡ、ＭＤＩＡＴＡ、ＭＤＬＡＡＡ、ＭＤＬＡＴＡであることを特定した。そして、これら６つのアミノ酸残基を有する類似配列のみ選別し、それらの配列において野生型逆転写酵素のアミノ酸配列として比較的保存されたアミノ酸に一部を置換して、複数の候補アミノ酸配列を得た。

実施例２ 逆転写酵素遺伝子のタンパク質発現用ベクター作成
上記実施例１において取得したアミノ酸配列のうち１つを選択し、タンパク質発現用ベクターを作成した。具体的には、１種（Ｇ７）の候補アミノ酸配列からＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉのコドンユーセージに基づきＤＮＡ配列を得た（配列番号５）。これらをｐＥＴ－２３ｂ（＋）にクローニングし、候補逆転写酵素配列を組み込んだプラスミド（ｐＧ７）を作成した。得られたプラスミドはＢＬ２１－Ｇｏｌｄ Ｃｏｍｐｅｔｅｎｔ Ｃｅｌｌｓ（Ａｇｉｌｅｎｔ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ製）に形質転換し、酵素調製に用いた。

実施例３ 逆転写酵素の取得
実施例２で得られた菌体の培養は、以下の通り実施した。まず、滅菌処理した１００μｇ／ｍＬのアンピシリンを含有するＴＢ培地（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｃｌｏｎｉｎｇ ２ｎｄ ｅｄｉｔｉｏｎ，ｐ．Ａ．２）８０ｍＬを、５００ｍＬ坂口フラスコに分注した。この培地に、あらかじめ１００μｇ／ｍＬのアンピシリンを含有する３ｍＬのＬＢ培地（１％バクトトリプトン、０．５％酵母エキス、０．５％塩化ナトリウム）で３７℃、１６時間培養したプラスミド形質転換株を播種し、３０℃で１６時間通気培養した。その後、ＩＰＴＧ（ナカライテスク製）を終濃度０．１ｍＭになるように添加し、３０℃でさらに４時間通気培養した。培養液より菌体を遠心分離により回収し、５０ｍＬの破砕緩衝液（１０ｍＭ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ（ｐＨ７．５）、３００ｍＭ ＫＣｌ、５％ｇｌｙｃｅｒｏｌ）に懸濁後、ソニケーション処理により菌体を破砕し、細胞破砕液を得た。次に、細胞破砕液をＨｉｓ ＧｒａｖｉＴｒａｐ（ＧＥヘルスケア製）によって精製した。洗浄条件は１０ｍＭ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ（ｐＨ７．５）、３００ｍＭ ＫＣｌ、５％ｇｌｙｃｅｒｏｌ、５０ｍＭ ｉｍｉｄａｚｏｌｅ、溶出条件は１０ｍＭ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ（ｐＨ７．５）、３００ｍＭ ＫＣｌ、５％ｇｌｙｃｅｒｏｌ、３００ｍＭ ｉｍｉｄａｚｏｌｅで実施した。最後に保存緩衝液（５０ｍＭ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ（ｐＨ７．５）、３００ｍＭ ＫＣｌ、５０％ｇｌｙｃｅｒｏｌ、０．１ｍＭ ＥＤＴＡ）に置換し、逆転写酵素を得た。

上記で精製した逆転写酵素の活性測定は、以下の操作で行った。また、酵素活性が高い場合はサンプルを希釈して測定を行った。

（逆転写酵素活性測定用試薬）
Ａ液：２５０ｍＭ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ（ｐＨ８．３）、３７５ｍＭ 塩化カリウム、１５ｍＭ 塩化マグネシウム、５０ｍＭ ジチオスレイトール
Ｂ液：１ｍｇ／ｍＬ ｐｏｌｙＡ、１ｐｍｏｌ／μＬ ｄＴ２０、１０ｍＭ ｄＴＴＰ、
Ｃ液：［３Ｈ］－ｄＴＴＰ
Ｄ液：０．０７Ｍ ピロリン酸ナトリウム、０．７Ｍ トリクロロ酢酸

（逆転写酵素活性測定方法）
Ａ液１０μＬ、Ｂ液２２μＬ、Ｃ液１μＬ、および滅菌水１２μＬを、マイクロチューブに加えて攪拌混合後、上記精製酵素希釈液５μＬを加えて、４２℃で１０分間反応する。その後、冷却し、Ｄ液１５０μＬを加えて、攪拌後さらに１０分間氷冷する。この液をガラスフィルター（ワットマン製ＧＦ／Ｃフィルター）でろ過し、０．１Ｎ塩酸及びエタノールで十分洗浄し、フィルターの放射活性を液体シンチレーションカウンター（パッカード製Ｔｒｉ－Ｃａｒｂ２８１０ ＴＲ）を用いて計測し、ヌクレオチドの取り込みを測定した。酵素活性の１単位はこの条件下で１０分当たり１ｎｍｏｌｅのヌクレオチドを酸不溶性画分に取り込む酵素量とした。

上記測定の結果、本実施例で調製した本候補逆転写酵素（Ｇ７）は、十分な逆転写活性を有することが確認された。

実施例４ 逆転写酵素の熱安定性試験
Ｇ７の逆転写酵素を保存緩衝液（５０ｍＭ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ（ｐＨ７．５）、３００ｍＭ ＫＣｌ、５０％ ｇｌｙｃｅｒｏｌ、０．１ｍＭ ＥＤＴＡ）にて１０Ｕ／μＬに希釈し、５０℃に１０分間保存した。その後、逆転写活性測定を行い、本発明の変異型逆転写酵素の保存後の残存活性率求めた。残存活性率は、以下の式Ｉに記載のように、保存後の逆転写活性値を保存前の逆転写活性値で除算することにより、残存活性率を算出できる。
残存活性率（％）＝（保存後の逆転写活性値／保存前の逆転写活性値）×１００・・・（式Ｉ）

表１から、ＷＴでは５０℃１０分間の熱処理によって、残存活性率が３２％であったが、変異型逆転写酵素Ｇ７は７０％程度の非常に高い残存活性率を示した。このことから、変異型逆転写酵素Ｇ７は耐熱性が著しく向上していることが分かった。

実施例５ 逆転写酵素のｃＤＮＡ合成能試験
逆転写酵素（Ｇ７）を保存緩衝液（２０ｍＭ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ（ｐＨ７．５）、１００ｍＭ ＮａＣｌ、５０％ｇｌｙｃｅｒｏｌ、０．１ｍＭ ＥＤＴＡ、１ｍＭ ＤＴＴ、０．０１％ＮＰ－４０）で１０Ｕ／μＬに希釈し、各１μＬと、逆転写反応液５×Ｂｕｆｆｅｒ（Ｔｏｙｏｂｏ製）４μＬと、１０ｍＭ ｄＮＴＰｓ ２μＬと、Ｈｕｍａｎ Ｔｏｔａｌ ＲＮＡ １０ｎｇと、下記に示すプライマー１０μＭを１μＬと滅菌水を１１μＬ混合し、３７℃、４２℃、５０℃、５５℃の各温度で２０分間逆転写反応を行った。
逆転写プライマー：ｇｔｔｃｇａｃｃｇｔｃｔｔｃｔｃａｇｃｇｃｔｃｃ（配列番号６）

得られたｃＤＮＡを９５℃５分間熱処理して逆転写酵素を失活させた後、ｃＤＮＡ １μＬをＫＯＤ－Ｐｌｕｓ－（Ｔｏｙｏｂｏ製）の取扱説明書に準じてＰＣＲを行った。プライマーセットを１０μＭ ０．６μＬ添加した。配列を以下に示す。
順方向：ｇｃｃａｔｇｃａｔｇｔｃｔｇａｇｔａｃｇｃａｃｇｇ（配列番号７）
逆方向：ｔｃｔａｇａａｔｔａｃｃａｃａｇｔｔａｔｃｃａａｇ（配列番号８）
増幅産物を１．５％アガロースゲルで電気泳動を行い、増幅の有無を確認した。

図１に示す通り、ＷＴでは逆転写温度が５０℃以上となると増幅がみられない。一方、変異型逆転写酵素Ｇ７は逆転写温度が５０℃になっても明瞭なバンドが認められ、十分に逆転写反応が行われたことが分かる。また、４２℃の場合を比較しても、ＷＴに比べて明らかに変異型逆転写酵素Ｇ７の方が高い増幅活性を維持していることが確認された。

実施例６ 変異型逆転写酵素と野生型逆転写酵素（ＭＭＬＶ、ＨＩＶ）の配列比較
上記実施例において逆転写活性と高い熱安定性を併せ持つことが確認された変異型逆転写酵素（Ｇ７）のアミノ酸配列と、野生型逆転写酵素のアミノ酸配列との比較を行い、本発明の逆転写酵素を特徴づけるアミノ酸残基の特定を行った。ここで、野生型逆転写酵素としては、野生型ＭＭＬＶ逆転写酵素及び野生型ＨＩＶ逆転写酵素を比較対象として選定した。野生型ＭＭＬＶ逆転写酵素と野生型ＨＩＶ逆転写酵素は、共に逆転写活性を有し、且つモチーフ等に類似性があることが知られている。従って、野生型ＭＭＬＶ逆転写酵素及び野生型ＨＩＶ逆転写酵素で共通しており、且つ、変異型逆転写酵素Ｇ７において異なるアミノ酸残基は、確認された熱安定性に寄与していると推測できる。このアラインメント結果を図２に示す。図２に示されるように、変異型逆転写酵素は、野生型逆転写酵素とのアミノ酸配列同一性が比較的高いものの、特にアミノ酸相同性が高い野生型ＭＭＬＶ逆転写酵素配列と比較しても約４０残基程度アミノ酸が異なることが分かる。そして、野生型ＭＭＬＶ逆転写酵素及び野生型ＨＩＶ逆転写酵素が共通している一方で、変異型逆転写酵素（Ｇ７）が異なっているアミノ酸残基を特定した。その結果、本発明の逆転写酵素を特徴づける４個のアミノ酸残基（Ｋ６３Ｒ、Ｄ２１７Ｑ、Ｖ４７６Ｐ、Ａ４７８Ｉ：配列番号２のアミノ酸配列に相当する位置における、野生型逆転写酵素のアミノ酸残基からのアミノ酸変異を示す）が、ＭＭＬＶのループ領域に相当する位置に見出された。これらのアミノ酸残基のなかでも、１つのアミノ酸残基（Ｖ４７６Ｐ）は、野生型逆転写酵素におけるアミノ酸残基と構造的・化学的性質が異なるアミノ酸残基に置換されており、熱安定性の向上に寄与していることが推察された。

実施例７ 更なる逆転写酵素の取得と配列比較
上記実施例１のスクリーニングで得られた複数の候補アミノ酸配列の中から、更に別の候補アミノ酸配列（Ｇ２（配列番号３），Ｇ６（配列番号４））を選択し、上記実施例２～３と同様にして逆転写酵素を取得した。具体的には、Ｇ２，Ｇ６の候補アミノ酸配列からＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉのコドンユーセージに基づきＤＮＡ配列をそれぞれ設計し（配列番号９、１０）、これらを各々ｐＥＴ－２３ｂ（＋）にクローニングし、候補逆転写酵素配列を組み込んだプラスミド（ｐＧ２、ｐＧ６）を作成した。得られたプラスミドはＢＬ２１－Ｇｏｌｄ Ｃｏｍｐｅｔｅｎｔ Ｃｅｌｌｓ（Ａｇｉｌｅｎｔ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ製）に形質転換した。この菌体を実施例３と同じ条件で培養し、培養液から回収した菌体の細胞破砕液から精製により逆転写酵素を取得した。取得した逆転写酵素（Ｇ２、Ｇ６）について、実施例４と同様にして５０℃で１０分間保存後の逆転写活性測定を行った結果を以下の表２に示す。また、実施例５と同様にして、３７℃、４２℃、５０℃、５５℃の各温度で２０分間逆転写反応を行い、ＰＣＲを行った後の増幅産物の有無を確認した結果を図３に示す。

上記表２及び図３の結果に示されるように、本実施例において取得した逆転写酵素Ｇ２、Ｇ６は、変異型逆転写酵素Ｇ７と同様の熱安定性を示すことが確認された。逆転写酵素Ｇ２及びＧ６と、逆転写酵素Ｇ７と、野生型逆転写酵素とをアラインメントした結果を図４に示す。この逆転写酵素Ｇ２、Ｇ６のアミノ酸配列を確認したところ、逆転写酵素を特徴づける６７番目、１７５番目、２２９番目、３０８番目、４３７番目、及び５９２番目の６つのアミノ酸残基としてＬＤＬＡＡＡ又はＭＤＩＡＴＡを有していた。また、配列番号２で示される逆転写酵素は、このＧ２、Ｇ６の逆転写酵素のアミノ酸配列と共通していて野生型ＭＭＬＶ逆転写酵素とは異なる、以下：（２）４７番目に相当する位置にＰ、（５）６２番目に相当する位置にＶ、（１０）１４４番目に相当する位置にＲ、（１４）２３３番目に相当する位置にＴ、（２０）３５４番目に相当する位置にＳ、（２５）４２９番目に相当する位置にＬ、（２７）４７６番目に相当する位置にＰ、（２９）４９５番目に相当する位置にＤ、（３３）５４２番目に相当する位置にＶ、（４３）６６２番目に相当する位置にＬのアミノ酸を有することが確認された。これらのアミノ酸残基は、野生型ＭＭＬＶ逆転写酵素においては認められず、同様の熱安定性を示す逆転写酵素Ｇ２、Ｇ６、及びＧ７において共通で認められたことから、熱安定性向上に寄与している可能性が高いことが推察された。
一方、配列番号２～４に示されるアミノ酸配列のうち、（Ａ）９１番目～１０５番目に相当する領域、（Ｂ）１０９番目～１２０番目に相当する領域、（Ｃ）１２５番目～１３８番目に相当する領域、（Ｄ）１４６番目～１５７番目に相当する領域、（Ｅ）１８２番目～２０５番目に相当する領域、（Ｆ）２２０番目～２２８番目に相当する領域、（Ｇ）２５１番目～２６３番目に相当する領域、（Ｈ）３０２番目～３１９番目に相当する領域、（Ｉ）３５１番目～３５８番目に相当する領域、及び（Ｊ）３９１番目～４０４番目に相当する領域のアミノ酸配列（図４において（Ａ）～（Ｊ）として囲った部分）は、配列番号１に示される野生型の逆転写酵素における対応する領域のアミノ酸配列と高い保存性を示すことが確認された。この結果から、これらの領域における変異は少ない方が望ましいと考えられる。

本発明により、分子生物学分野において有用な熱安定性に優れる新規逆転写酵素、及びその逆転写酵素を含む試薬、キット等が提供される。本発明は、遺伝子発現解析に際して特に有用であり、汎用性が高く利便性も高いことから、研究用とのみならず、臨床診断や環境検査等にも利用できる。

Claims (20)

1. 以下のアミノ酸配列からなる逆転写酵素：
   （ａ）配列番号２に示されるアミノ酸配列に対して９４％以上の同一性を有するアミノ酸配列；又は
   （ｂ）配列番号２に示されるアミノ酸配列において１又は数個のアミノ酸の欠失、置換、挿入、又は付加を有するアミノ酸配列。
2. 前記（ａ）又は（ｂ）のアミノ酸配列において、以下の（ｉ）～（ｖｉ）のアミノ酸残基を有する、請求項１に記載の逆転写酵素：
   （ｉ）６７番目に相当する位置のアミノ酸がＬ又はＭである、
   （ｉｉ）１７５番目に相当する位置のアミノ酸がＤである、
   （ｉｉｉ）２２９番目に相当する位置のアミノ酸がＬ又はＩである、
   （ｉｖ）３０８番目に相当する位置のアミノ酸がＡである、
   （ｖ）４３７番目に相当する位置のアミノ酸がＡ又はＴである、及び、
   （ｖｉ）５９２番目に相当する位置のアミノ酸がＡである。
3. 前記（ａ）又は（ｂ）のアミノ酸配列において、以下の（１）～（４）からなる群より選択される少なくとも１つのアミノ酸残基を有する、請求項１又は２に記載の逆転写酵素：
   （１）６３番目に相当する位置のアミノ酸がＲある、
   （２）２１７番目に相当する位置のアミノ酸がＱである、
   （３）４７６番目に相当する位置のアミノ酸がＰである、及び
   （４）４７８番目に相当する位置のアミノ酸がＩである。
4. 前記（ａ）又は（ｂ）のアミノ酸配列において、以下の（３）のアミノ酸残基を有する、請求項１～３のいずれかに記載の逆転写酵素：
   （３）４７６番目に相当する位置のアミノ酸がＰである。
5. 前記（ａ）又は（ｂ）のアミノ酸配列において、以下の（５）～（１０）、（３）、及び（１１）～（１３）から成る群より選択される少なくとも１つのアミノ酸残基を有する、請求項１～４のいずれかに記載の逆転写酵素：
   （５）４７番目に相当する位置のアミノ酸がＰである、
   （６）６２番目に相当する位置のアミノ酸がＶである、
   （７）１４４番目に相当する位置のアミノ酸がＲである、
   （８）２３３番目に相当する位置のアミノ酸がＴである、
   （９）３５４番目に相当する位置のアミノ酸がＳである、
   （１０）４２９番目に相当する位置のアミノ酸がＬである、
   （３）４７６番目に相当する位置のアミノ酸がＰである、
   （１１）４９５番目に相当する位置のアミノ酸がＤである、
   （１２）５４２番目に相当する位置のアミノ酸がＶである、及び
   （１３）６６２番目に相当する位置のアミノ酸がＬである。
6. 配列番号１に示されるアミノ酸配列に対して８０％以上の同一性を有し、以下の（１）～（４）からなる群より選択される少なくとも１つのアミノ酸残基を有する、逆転写酵素：
   （１）６３番目に相当する位置のアミノ酸がＲある、
   （２）２１７番目に相当する位置のアミノ酸がＱである、
   （３）４７６番目に相当する位置のアミノ酸がＰである、及び
   （４）４７８番目に相当する位置のアミノ酸がＩである。
7. 配列番号１に示されるアミノ酸配列に対して８０％以上の同一性を有し、以下の（３）のアミノ酸残基を有する、請求項６に記載の逆転写酵素：
   （３）４７６番目に相当する位置のアミノ酸がＰである。
8. 配列番号１に示されるアミノ酸配列に対して８０％以上の同一性を有し、以下の（５）～（１０）、（３）、及び（１１）～（１３）から成る群より選択される少なくとも１つのアミノ酸残基を有する、請求項６又は７に記載の逆転写酵素：
   （５）４７番目に相当する位置のアミノ酸がＰである、
   （６）６２番目に相当する位置のアミノ酸がＶである、
   （７）１４４番目に相当する位置のアミノ酸がＲである、
   （８）２３３番目に相当する位置のアミノ酸がＴである、
   （９）３５４番目に相当する位置のアミノ酸がＳである、
   （１０）４２９番目に相当する位置のアミノ酸がＬである、
   （３）４７６番目に相当する位置のアミノ酸がＰである、
   （１１）４９５番目に相当する位置のアミノ酸がＤである、
   （１２）５４２番目に相当する位置のアミノ酸がＶである、及び
   （１３）６６２番目に相当する位置のアミノ酸がＬである。
9. 配列番号１又は２に示されるアミノ酸配列の（Ａ）９１番目～１０５番目に相当する領域、（Ｂ）１０９番目～１２０番目に相当する領域、（Ｃ）１２５番目～１３８番目に相当する領域、（Ｄ）１４６番目～１５７番目に相当する領域、（Ｅ）１８２番目～２０５番目に相当する領域、（Ｆ）２２０番目～２２８番目に相当する領域、（Ｇ）２５１番目～２６３番目に相当する領域、（Ｈ）３０２番目～３１９番目に相当する領域、（Ｉ）３５１番目～３５８番目に相当する領域、及び（Ｊ）３９１番目～４０４番目に相当する領域から成る群から選択される１個以上の領域のアミノ酸配列が、配列番号１又は２のアミノ酸配列における対応する領域のアミノ酸配列と９０％以上の同一性を有する、請求項１～８のいずれかに記載の逆転写酵素。
10. 前記（ａ）のアミノ酸配列が、配列番号２に示されるアミノ酸配列に対して９７％以上の同一性を有するアミノ酸配列である、請求項１～９のいずれかに記載の逆転写酵素。
11. ＲＮａｓｅＨ活性を欠く、請求項１～１０のいずれかに記載の逆転写酵素。
12. ５０℃で１０分間熱処理を行った場合に７０％以上の残存活性率を示す、請求項１～１１のいずれかに記載の逆転写酵素。
13. 請求項１～１２のいずれかに記載の逆転写酵素をコードするポリヌクレオチド。
14. 請求項１３に記載のポリヌクレオチドを含むベクター。
15. 請求項１４に記載のベクターで形質転換された細胞。
16. 請求項１～１２のいずれかに記載の逆転写酵素、請求項１３に記載のポリヌクレオチド、請求項１４に記載のベクター、及び／又は請求項１５に記載の細胞を含む試薬。
17. 請求項１３に記載のポリヌクレオチド、請求項１４に記載のベクター、請求項１５に記載の細胞、及び／又は請求項１６に記載の試薬を用いて、請求項１～１２のいずれかに記載の逆転写酵素を製造する方法。
18. 請求項１～１２のいずれかに記載の逆転写酵素を用いて、ＲＮＡのテンプレートからｃＤＮＡを合成する方法。
19. 請求項１～１２のいずれかに記載の逆転写酵素を含むキット。
20. ＲＮＡをテンプレートとしてｃＤＮＡを合成するために用いられる、請求項１９に記載のキット。

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