JP2022552137A - 非天然アミノ酸組み込み増強のためのキメラ耐熱性アミノアシルｔＲＮＡシンテターゼ - Google Patents
非天然アミノ酸組み込み増強のためのキメラ耐熱性アミノアシルｔＲＮＡシンテターゼ Download PDFInfo
- Publication number
- JP2022552137A JP2022552137A JP2022520264A JP2022520264A JP2022552137A JP 2022552137 A JP2022552137 A JP 2022552137A JP 2022520264 A JP2022520264 A JP 2022520264A JP 2022520264 A JP2022520264 A JP 2022520264A JP 2022552137 A JP2022552137 A JP 2022552137A
- Authority
- JP
- Japan
- Prior art keywords
- seq
- aminoacyl
- trna synthetase
- cell
- amino acid
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Pending
Links
- 102000052866 Amino Acyl-tRNA Synthetases Human genes 0.000 title claims abstract description 129
- 108700028939 Amino Acyl-tRNA Synthetases Proteins 0.000 title claims abstract description 129
- 150000001413 amino acids Chemical class 0.000 title claims description 75
- 238000010348 incorporation Methods 0.000 title claims description 15
- 241000588724 Escherichia coli Species 0.000 claims abstract description 62
- 230000001580 bacterial effect Effects 0.000 claims abstract description 35
- 238000000034 method Methods 0.000 claims abstract description 30
- 239000000203 mixture Substances 0.000 claims abstract description 27
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 claims description 79
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 claims description 73
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 claims description 59
- 108020004566 Transfer RNA Proteins 0.000 claims description 50
- VKBLQCDGTHFOLS-NSHDSACASA-N (2s)-2-(4-benzoylanilino)propanoic acid Chemical compound C1=CC(N[C@@H](C)C(O)=O)=CC=C1C(=O)C1=CC=CC=C1 VKBLQCDGTHFOLS-NSHDSACASA-N 0.000 claims description 38
- 230000035772 mutation Effects 0.000 claims description 35
- 150000007523 nucleic acids Chemical group 0.000 claims description 30
- GEYBMYRBIABFTA-VIFPVBQESA-N O-methyl-L-tyrosine Chemical compound COC1=CC=C(C[C@H](N)C(O)=O)C=C1 GEYBMYRBIABFTA-VIFPVBQESA-N 0.000 claims description 26
- 108091028043 Nucleic acid sequence Proteins 0.000 claims description 20
- 241000894006 Bacteria Species 0.000 claims description 18
- 210000003527 eukaryotic cell Anatomy 0.000 claims description 18
- 210000004962 mammalian cell Anatomy 0.000 claims description 17
- 108020004705 Codon Proteins 0.000 claims description 14
- 108091033319 polynucleotide Proteins 0.000 claims description 13
- 102000040430 polynucleotide Human genes 0.000 claims description 13
- 239000002157 polynucleotide Substances 0.000 claims description 13
- 241000193385 Geobacillus stearothermophilus Species 0.000 claims description 10
- 239000002243 precursor Substances 0.000 claims description 10
- 230000004071 biological effect Effects 0.000 claims description 9
- 108020004707 nucleic acids Proteins 0.000 claims description 8
- 102000039446 nucleic acids Human genes 0.000 claims description 8
- 244000005700 microbiome Species 0.000 claims description 7
- 239000000758 substrate Substances 0.000 claims description 7
- 230000001965 increasing effect Effects 0.000 claims description 6
- 239000011022 opal Substances 0.000 claims description 6
- 241000238631 Hexapoda Species 0.000 claims description 3
- 230000008859 change Effects 0.000 claims description 3
- 241000589516 Pseudomonas Species 0.000 claims description 2
- 241000191940 Staphylococcus Species 0.000 claims description 2
- 241000194017 Streptococcus Species 0.000 claims description 2
- 241000186339 Thermoanaerobacter Species 0.000 claims description 2
- 239000006143 cell culture medium Substances 0.000 claims description 2
- 238000012258 culturing Methods 0.000 claims description 2
- 239000001963 growth medium Substances 0.000 claims description 2
- 210000005253 yeast cell Anatomy 0.000 claims description 2
- 241000589499 Thermus thermophilus Species 0.000 claims 1
- 101710146427 Probable tyrosine-tRNA ligase, cytoplasmic Proteins 0.000 abstract description 59
- 101710107268 Tyrosine-tRNA ligase, mitochondrial Proteins 0.000 abstract description 59
- 230000000694 effects Effects 0.000 abstract description 50
- 101150067361 Aars1 gene Proteins 0.000 abstract description 8
- 102100034298 Tyrosine-tRNA ligase, cytoplasmic Human genes 0.000 abstract 3
- 102100025336 Tyrosine-tRNA ligase, mitochondrial Human genes 0.000 description 49
- 235000018102 proteins Nutrition 0.000 description 39
- 239000013612 plasmid Substances 0.000 description 33
- 235000001014 amino acid Nutrition 0.000 description 24
- 229940024606 amino acid Drugs 0.000 description 24
- 101000640796 Geobacillus stearothermophilus Tyrosine-tRNA ligase Proteins 0.000 description 20
- 230000010354 integration Effects 0.000 description 10
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 description 9
- 239000000284 extract Substances 0.000 description 9
- 238000003556 assay Methods 0.000 description 8
- 239000012634 fragment Substances 0.000 description 8
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 7
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 7
- 102000018378 Tyrosine-tRNA ligase Human genes 0.000 description 7
- 230000000875 corresponding effect Effects 0.000 description 7
- 108010048367 enhanced green fluorescent protein Proteins 0.000 description 7
- 150000003668 tyrosines Chemical class 0.000 description 7
- 241000206602 Eukaryota Species 0.000 description 6
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 6
- 230000003115 biocidal effect Effects 0.000 description 6
- 238000013519 translation Methods 0.000 description 6
- 238000001262 western blot Methods 0.000 description 6
- FWMNVWWHGCHHJJ-SKKKGAJSSA-N 4-amino-1-[(2r)-6-amino-2-[[(2r)-2-[[(2r)-2-[[(2r)-2-amino-3-phenylpropanoyl]amino]-3-phenylpropanoyl]amino]-4-methylpentanoyl]amino]hexanoyl]piperidine-4-carboxylic acid Chemical compound C([C@H](C(=O)N[C@H](CC(C)C)C(=O)N[C@H](CCCCN)C(=O)N1CCC(N)(CC1)C(O)=O)NC(=O)[C@H](N)CC=1C=CC=CC=1)C1=CC=CC=C1 FWMNVWWHGCHHJJ-SKKKGAJSSA-N 0.000 description 5
- 240000004808 Saccharomyces cerevisiae Species 0.000 description 5
- 238000010276 construction Methods 0.000 description 5
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 5
- 230000002255 enzymatic effect Effects 0.000 description 5
- 150000002993 phenylalanine derivatives Chemical class 0.000 description 5
- 230000004927 fusion Effects 0.000 description 4
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 4
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 description 4
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 description 4
- 229920002704 polyhistidine Polymers 0.000 description 4
- 239000000523 sample Substances 0.000 description 4
- 238000002415 sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis Methods 0.000 description 4
- 238000000527 sonication Methods 0.000 description 4
- 238000002849 thermal shift Methods 0.000 description 4
- 238000001890 transfection Methods 0.000 description 4
- 238000011144 upstream manufacturing Methods 0.000 description 4
- 239000013598 vector Substances 0.000 description 4
- 241000203069 Archaea Species 0.000 description 3
- 230000003321 amplification Effects 0.000 description 3
- 230000008901 benefit Effects 0.000 description 3
- 238000011161 development Methods 0.000 description 3
- 238000002330 electrospray ionisation mass spectrometry Methods 0.000 description 3
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 3
- 238000012921 fluorescence analysis Methods 0.000 description 3
- 230000037433 frameshift Effects 0.000 description 3
- 239000000499 gel Substances 0.000 description 3
- 238000011534 incubation Methods 0.000 description 3
- BPHPUYQFMNQIOC-NXRLNHOXSA-N isopropyl beta-D-thiogalactopyranoside Chemical compound CC(C)S[C@@H]1O[C@H](CO)[C@H](O)[C@H](O)[C@H]1O BPHPUYQFMNQIOC-NXRLNHOXSA-N 0.000 description 3
- 238000005259 measurement Methods 0.000 description 3
- 239000012528 membrane Substances 0.000 description 3
- 238000003199 nucleic acid amplification method Methods 0.000 description 3
- 239000000047 product Substances 0.000 description 3
- 230000004044 response Effects 0.000 description 3
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 3
- 108091035707 Consensus sequence Proteins 0.000 description 2
- 108010014303 DNA-directed DNA polymerase Proteins 0.000 description 2
- 102000016928 DNA-directed DNA polymerase Human genes 0.000 description 2
- 241000626621 Geobacillus Species 0.000 description 2
- DHMQDGOQFOQNFH-UHFFFAOYSA-N Glycine Chemical compound NCC(O)=O DHMQDGOQFOQNFH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- ROHFNLRQFUQHCH-YFKPBYRVSA-N L-leucine Chemical compound CC(C)C[C@H](N)C(O)=O ROHFNLRQFUQHCH-YFKPBYRVSA-N 0.000 description 2
- QIVBCDIJIAJPQS-VIFPVBQESA-N L-tryptophane Chemical compound C1=CC=C2C(C[C@H](N)C(O)=O)=CNC2=C1 QIVBCDIJIAJPQS-VIFPVBQESA-N 0.000 description 2
- ROHFNLRQFUQHCH-UHFFFAOYSA-N Leucine Natural products CC(C)CC(N)C(O)=O ROHFNLRQFUQHCH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 239000000020 Nitrocellulose Substances 0.000 description 2
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 2
- 102220602924 Transmembrane protein 184A_Y37V_mutation Human genes 0.000 description 2
- QIVBCDIJIAJPQS-UHFFFAOYSA-N Tryptophan Natural products C1=CC=C2C(CC(N)C(O)=O)=CNC2=C1 QIVBCDIJIAJPQS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 239000002253 acid Substances 0.000 description 2
- 229960000723 ampicillin Drugs 0.000 description 2
- AVKUERGKIZMTKX-NJBDSQKTSA-N ampicillin Chemical compound C1([C@@H](N)C(=O)N[C@H]2[C@H]3SC([C@@H](N3C2=O)C(O)=O)(C)C)=CC=CC=C1 AVKUERGKIZMTKX-NJBDSQKTSA-N 0.000 description 2
- 125000001314 canonical amino-acid group Chemical group 0.000 description 2
- 230000001413 cellular effect Effects 0.000 description 2
- 229960005091 chloramphenicol Drugs 0.000 description 2
- WIIZWVCIJKGZOK-RKDXNWHRSA-N chloramphenicol Chemical compound ClC(Cl)C(=O)N[C@H](CO)[C@H](O)C1=CC=C([N+]([O-])=O)C=C1 WIIZWVCIJKGZOK-RKDXNWHRSA-N 0.000 description 2
- 238000010790 dilution Methods 0.000 description 2
- 239000012895 dilution Substances 0.000 description 2
- 238000002073 fluorescence micrograph Methods 0.000 description 2
- 230000002068 genetic effect Effects 0.000 description 2
- 238000009396 hybridization Methods 0.000 description 2
- 238000003384 imaging method Methods 0.000 description 2
- 239000006166 lysate Substances 0.000 description 2
- 238000002703 mutagenesis Methods 0.000 description 2
- 231100000350 mutagenesis Toxicity 0.000 description 2
- 229920001220 nitrocellulos Polymers 0.000 description 2
- 239000008188 pellet Substances 0.000 description 2
- 230000004962 physiological condition Effects 0.000 description 2
- 230000004481 post-translational protein modification Effects 0.000 description 2
- 230000012846 protein folding Effects 0.000 description 2
- 238000001742 protein purification Methods 0.000 description 2
- 108091008146 restriction endonucleases Proteins 0.000 description 2
- 238000002864 sequence alignment Methods 0.000 description 2
- 238000002741 site-directed mutagenesis Methods 0.000 description 2
- 241000894007 species Species 0.000 description 2
- 239000007858 starting material Substances 0.000 description 2
- 108091005946 superfolder green fluorescent proteins Proteins 0.000 description 2
- 235000002374 tyrosine Nutrition 0.000 description 2
- 125000001493 tyrosinyl group Chemical group [H]OC1=C([H])C([H])=C(C([H])=C1[H])C([H])([H])C([H])(N([H])[H])C(*)=O 0.000 description 2
- MTCFGRXMJLQNBG-REOHCLBHSA-N (2S)-2-Amino-3-hydroxypropansäure Chemical compound OC[C@H](N)C(O)=O MTCFGRXMJLQNBG-REOHCLBHSA-N 0.000 description 1
- DZZSIOPBHTZWLL-HNNXBMFYSA-N (2S)-2-[benzyl(nitro)amino]-3-(4-hydroxyphenyl)propanoic acid Chemical compound [N+](=O)([O-])N([C@@H](CC1=CC=C(C=C1)O)C(=O)O)CC1=CC=CC=C1 DZZSIOPBHTZWLL-HNNXBMFYSA-N 0.000 description 1
- VEVCTKUSISWYDS-VIFPVBQESA-N (2S)-2-amino-3-(5-azido-1H-indol-3-yl)propanoic acid Chemical compound C1=C(N=[N+]=[N-])C=C2C(C[C@H](N)C(O)=O)=CNC2=C1 VEVCTKUSISWYDS-VIFPVBQESA-N 0.000 description 1
- FDKWRPBBCBCIGA-REOHCLBHSA-N (2r)-2-azaniumyl-3-$l^{1}-selanylpropanoate Chemical compound [Se]C[C@H](N)C(O)=O FDKWRPBBCBCIGA-REOHCLBHSA-N 0.000 description 1
- KZDNJQUJBMDHJW-VIFPVBQESA-N (2s)-2-amino-3-(5-bromo-1h-indol-3-yl)propanoic acid Chemical compound C1=C(Br)C=C2C(C[C@H](N)C(O)=O)=CNC2=C1 KZDNJQUJBMDHJW-VIFPVBQESA-N 0.000 description 1
- HMZJSKDXXVDHAC-LBPRGKRZSA-N (2s)-2-amino-3-(5-prop-2-ynoxy-1h-indol-3-yl)propanoic acid Chemical compound C1=C(OCC#C)C=C2C(C[C@H](N)C(O)=O)=CNC2=C1 HMZJSKDXXVDHAC-LBPRGKRZSA-N 0.000 description 1
- YNJSNEKCXVFDKW-VIFPVBQESA-N (2s)-3-(5-amino-1h-indol-3-yl)-2-azaniumylpropanoate Chemical compound C1=C(N)C=C2C(C[C@H](N)C(O)=O)=CNC2=C1 YNJSNEKCXVFDKW-VIFPVBQESA-N 0.000 description 1
- QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 2-amino-2-(hydroxymethyl)propane-1,3-diol;hydron;chloride Chemical compound Cl.OCC(N)(CO)CO QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- ACWBBAGYTKWBCD-ZETCQYMHSA-N 3-chloro-L-tyrosine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC1=CC=C(O)C(Cl)=C1 ACWBBAGYTKWBCD-ZETCQYMHSA-N 0.000 description 1
- -1 5-O-allyltryptophan Chemical compound 0.000 description 1
- KVNPSKDDJARYKK-JTQLQIEISA-N 5-methoxytryptophan Chemical compound COC1=CC=C2NC=C(C[C@H](N)C(O)=O)C2=C1 KVNPSKDDJARYKK-JTQLQIEISA-N 0.000 description 1
- 239000004475 Arginine Substances 0.000 description 1
- DCXYFEDJOCDNAF-UHFFFAOYSA-N Asparagine Natural products OC(=O)C(N)CC(N)=O DCXYFEDJOCDNAF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241000193830 Bacillus <bacterium> Species 0.000 description 1
- 108700010070 Codon Usage Proteins 0.000 description 1
- 102000018832 Cytochromes Human genes 0.000 description 1
- 108010052832 Cytochromes Proteins 0.000 description 1
- FDKWRPBBCBCIGA-UWTATZPHSA-N D-Selenocysteine Natural products [Se]C[C@@H](N)C(O)=O FDKWRPBBCBCIGA-UWTATZPHSA-N 0.000 description 1
- 102000012410 DNA Ligases Human genes 0.000 description 1
- 108010061982 DNA Ligases Proteins 0.000 description 1
- 238000007400 DNA extraction Methods 0.000 description 1
- 239000006144 Dulbecco’s modified Eagle's medium Substances 0.000 description 1
- 241001269524 Dura Species 0.000 description 1
- 241000287828 Gallus gallus Species 0.000 description 1
- WHUUTDBJXJRKMK-UHFFFAOYSA-N Glutamic acid Natural products OC(=O)C(N)CCC(O)=O WHUUTDBJXJRKMK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000004471 Glycine Substances 0.000 description 1
- 108010093488 His-His-His-His-His-His Proteins 0.000 description 1
- XUJNEKJLAYXESH-REOHCLBHSA-N L-Cysteine Chemical compound SC[C@H](N)C(O)=O XUJNEKJLAYXESH-REOHCLBHSA-N 0.000 description 1
- ONIBWKKTOPOVIA-BYPYZUCNSA-N L-Proline Chemical compound OC(=O)[C@@H]1CCCN1 ONIBWKKTOPOVIA-BYPYZUCNSA-N 0.000 description 1
- QNAYBMKLOCPYGJ-REOHCLBHSA-N L-alanine Chemical compound C[C@H](N)C(O)=O QNAYBMKLOCPYGJ-REOHCLBHSA-N 0.000 description 1
- ODKSFYDXXFIFQN-BYPYZUCNSA-P L-argininium(2+) Chemical compound NC(=[NH2+])NCCC[C@H]([NH3+])C(O)=O ODKSFYDXXFIFQN-BYPYZUCNSA-P 0.000 description 1
- DCXYFEDJOCDNAF-REOHCLBHSA-N L-asparagine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC(N)=O DCXYFEDJOCDNAF-REOHCLBHSA-N 0.000 description 1
- CKLJMWTZIZZHCS-REOHCLBHSA-N L-aspartic acid Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC(O)=O CKLJMWTZIZZHCS-REOHCLBHSA-N 0.000 description 1
- WHUUTDBJXJRKMK-VKHMYHEASA-N L-glutamic acid Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CCC(O)=O WHUUTDBJXJRKMK-VKHMYHEASA-N 0.000 description 1
- ZDXPYRJPNDTMRX-VKHMYHEASA-N L-glutamine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CCC(N)=O ZDXPYRJPNDTMRX-VKHMYHEASA-N 0.000 description 1
- HNDVDQJCIGZPNO-YFKPBYRVSA-N L-histidine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC1=CN=CN1 HNDVDQJCIGZPNO-YFKPBYRVSA-N 0.000 description 1
- AGPKZVBTJJNPAG-WHFBIAKZSA-N L-isoleucine Chemical compound CC[C@H](C)[C@H](N)C(O)=O AGPKZVBTJJNPAG-WHFBIAKZSA-N 0.000 description 1
- KDXKERNSBIXSRK-YFKPBYRVSA-N L-lysine Chemical compound NCCCC[C@H](N)C(O)=O KDXKERNSBIXSRK-YFKPBYRVSA-N 0.000 description 1
- FFEARJCKVFRZRR-BYPYZUCNSA-N L-methionine Chemical compound CSCC[C@H](N)C(O)=O FFEARJCKVFRZRR-BYPYZUCNSA-N 0.000 description 1
- COLNVLDHVKWLRT-QMMMGPOBSA-N L-phenylalanine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC1=CC=CC=C1 COLNVLDHVKWLRT-QMMMGPOBSA-N 0.000 description 1
- AYFVYJQAPQTCCC-GBXIJSLDSA-N L-threonine Chemical compound C[C@@H](O)[C@H](N)C(O)=O AYFVYJQAPQTCCC-GBXIJSLDSA-N 0.000 description 1
- OUYCCCASQSFEME-QMMMGPOBSA-N L-tyrosine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC1=CC=C(O)C=C1 OUYCCCASQSFEME-QMMMGPOBSA-N 0.000 description 1
- KZSNJWFQEVHDMF-BYPYZUCNSA-N L-valine Chemical compound CC(C)[C@H](N)C(O)=O KZSNJWFQEVHDMF-BYPYZUCNSA-N 0.000 description 1
- 239000006142 Luria-Bertani Agar Substances 0.000 description 1
- 239000006137 Luria-Bertani broth Substances 0.000 description 1
- KDXKERNSBIXSRK-UHFFFAOYSA-N Lysine Natural products NCCCCC(N)C(O)=O KDXKERNSBIXSRK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000004472 Lysine Substances 0.000 description 1
- 241000203407 Methanocaldococcus jannaschii Species 0.000 description 1
- 108010021466 Mutant Proteins Proteins 0.000 description 1
- 102000008300 Mutant Proteins Human genes 0.000 description 1
- 108091060545 Nonsense suppressor Proteins 0.000 description 1
- CIQHWLTYGMYQQR-QMMMGPOBSA-N O(4')-sulfo-L-tyrosine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC1=CC=C(OS(O)(=O)=O)C=C1 CIQHWLTYGMYQQR-QMMMGPOBSA-N 0.000 description 1
- 239000002033 PVDF binder Substances 0.000 description 1
- ONIBWKKTOPOVIA-UHFFFAOYSA-N Proline Natural products OC(=O)C1CCCN1 ONIBWKKTOPOVIA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108010026552 Proteome Proteins 0.000 description 1
- 102000007056 Recombinant Fusion Proteins Human genes 0.000 description 1
- 108010008281 Recombinant Fusion Proteins Proteins 0.000 description 1
- MTCFGRXMJLQNBG-UHFFFAOYSA-N Serine Natural products OCC(N)C(O)=O MTCFGRXMJLQNBG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108010006785 Taq Polymerase Proteins 0.000 description 1
- 108020005038 Terminator Codon Proteins 0.000 description 1
- 241000589596 Thermus Species 0.000 description 1
- AYFVYJQAPQTCCC-UHFFFAOYSA-N Threonine Natural products CC(O)C(N)C(O)=O AYFVYJQAPQTCCC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000004473 Threonine Substances 0.000 description 1
- KZSNJWFQEVHDMF-UHFFFAOYSA-N Valine Natural products CC(C)C(N)C(O)=O KZSNJWFQEVHDMF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000021736 acetylation Effects 0.000 description 1
- 238000006640 acetylation reaction Methods 0.000 description 1
- 230000003213 activating effect Effects 0.000 description 1
- 230000006978 adaptation Effects 0.000 description 1
- 230000002411 adverse Effects 0.000 description 1
- 238000001042 affinity chromatography Methods 0.000 description 1
- 235000004279 alanine Nutrition 0.000 description 1
- 125000000266 alpha-aminoacyl group Chemical group 0.000 description 1
- 230000000689 aminoacylating effect Effects 0.000 description 1
- 239000003242 anti bacterial agent Substances 0.000 description 1
- 229940088710 antibiotic agent Drugs 0.000 description 1
- 238000013459 approach Methods 0.000 description 1
- ODKSFYDXXFIFQN-UHFFFAOYSA-N arginine Natural products OC(=O)C(N)CCCNC(N)=N ODKSFYDXXFIFQN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000003491 array Methods 0.000 description 1
- 235000009582 asparagine Nutrition 0.000 description 1
- 229960001230 asparagine Drugs 0.000 description 1
- 235000003704 aspartic acid Nutrition 0.000 description 1
- 150000001576 beta-amino acids Chemical class 0.000 description 1
- OQFSQFPPLPISGP-UHFFFAOYSA-N beta-carboxyaspartic acid Natural products OC(=O)C(N)C(C(O)=O)C(O)=O OQFSQFPPLPISGP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000012148 binding buffer Substances 0.000 description 1
- 238000010364 biochemical engineering Methods 0.000 description 1
- 239000012620 biological material Substances 0.000 description 1
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 1
- 239000012830 cancer therapeutic Substances 0.000 description 1
- 238000004113 cell culture Methods 0.000 description 1
- 238000010367 cloning Methods 0.000 description 1
- 239000000470 constituent Substances 0.000 description 1
- 230000002596 correlated effect Effects 0.000 description 1
- 239000013078 crystal Substances 0.000 description 1
- 235000018417 cysteine Nutrition 0.000 description 1
- XUJNEKJLAYXESH-UHFFFAOYSA-N cysteine Natural products SCC(N)C(O)=O XUJNEKJLAYXESH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000003247 decreasing effect Effects 0.000 description 1
- 238000001514 detection method Methods 0.000 description 1
- 238000011156 evaluation Methods 0.000 description 1
- 238000010195 expression analysis Methods 0.000 description 1
- 239000013613 expression plasmid Substances 0.000 description 1
- 239000013604 expression vector Substances 0.000 description 1
- 238000000799 fluorescence microscopy Methods 0.000 description 1
- 238000001943 fluorescence-activated cell sorting Methods 0.000 description 1
- 108020001507 fusion proteins Proteins 0.000 description 1
- 102000037865 fusion proteins Human genes 0.000 description 1
- 238000010353 genetic engineering Methods 0.000 description 1
- 235000013922 glutamic acid Nutrition 0.000 description 1
- 239000004220 glutamic acid Substances 0.000 description 1
- ZDXPYRJPNDTMRX-UHFFFAOYSA-N glutamine Natural products OC(=O)C(N)CCC(N)=O ZDXPYRJPNDTMRX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000009036 growth inhibition Effects 0.000 description 1
- 230000036541 health Effects 0.000 description 1
- HNDVDQJCIGZPNO-UHFFFAOYSA-N histidine Natural products OC(=O)C(N)CC1=CN=CN1 HNDVDQJCIGZPNO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 125000002887 hydroxy group Chemical group [H]O* 0.000 description 1
- 238000003119 immunoblot Methods 0.000 description 1
- 238000000338 in vitro Methods 0.000 description 1
- 238000001727 in vivo Methods 0.000 description 1
- 230000001939 inductive effect Effects 0.000 description 1
- 230000003993 interaction Effects 0.000 description 1
- 230000009878 intermolecular interaction Effects 0.000 description 1
- 230000003834 intracellular effect Effects 0.000 description 1
- 238000011835 investigation Methods 0.000 description 1
- AGPKZVBTJJNPAG-UHFFFAOYSA-N isoleucine Natural products CCC(C)C(N)C(O)=O AGPKZVBTJJNPAG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229960000310 isoleucine Drugs 0.000 description 1
- 229960000318 kanamycin Drugs 0.000 description 1
- 229930027917 kanamycin Natural products 0.000 description 1
- SBUJHOSQTJFQJX-NOAMYHISSA-N kanamycin Chemical compound O[C@@H]1[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CN)O[C@@H]1O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](O[C@@H]2[C@@H]([C@@H](N)[C@H](O)[C@@H](CO)O2)O)[C@H](N)C[C@@H]1N SBUJHOSQTJFQJX-NOAMYHISSA-N 0.000 description 1
- 229930182823 kanamycin A Natural products 0.000 description 1
- 101150109249 lacI gene Proteins 0.000 description 1
- 230000000670 limiting effect Effects 0.000 description 1
- 125000003588 lysine group Chemical group [H]N([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])(N([H])[H])C(*)=O 0.000 description 1
- 230000002101 lytic effect Effects 0.000 description 1
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 description 1
- 239000003550 marker Substances 0.000 description 1
- 238000004949 mass spectrometry Methods 0.000 description 1
- 239000000463 material Substances 0.000 description 1
- 230000007246 mechanism Effects 0.000 description 1
- 239000012092 media component Substances 0.000 description 1
- 230000001404 mediated effect Effects 0.000 description 1
- 108020004999 messenger RNA Proteins 0.000 description 1
- 229930182817 methionine Natural products 0.000 description 1
- 230000000813 microbial effect Effects 0.000 description 1
- ZLVYMPOQNJTFSG-QMMMGPOBSA-N monoiodotyrosine Chemical compound OC(=O)[C@@H](NI)CC1=CC=C(O)C=C1 ZLVYMPOQNJTFSG-QMMMGPOBSA-N 0.000 description 1
- 238000007857 nested PCR Methods 0.000 description 1
- 230000003647 oxidation Effects 0.000 description 1
- 238000007254 oxidation reaction Methods 0.000 description 1
- COLNVLDHVKWLRT-UHFFFAOYSA-N phenylalanine Natural products OC(=O)C(N)CC1=CC=CC=C1 COLNVLDHVKWLRT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229920002981 polyvinylidene fluoride Polymers 0.000 description 1
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 1
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 description 1
- 102000004196 processed proteins & peptides Human genes 0.000 description 1
- 238000000746 purification Methods 0.000 description 1
- 238000005215 recombination Methods 0.000 description 1
- 230000006798 recombination Effects 0.000 description 1
- 230000002829 reductive effect Effects 0.000 description 1
- 230000010076 replication Effects 0.000 description 1
- 238000011160 research Methods 0.000 description 1
- 239000011347 resin Substances 0.000 description 1
- 229920005989 resin Polymers 0.000 description 1
- 210000003705 ribosome Anatomy 0.000 description 1
- ZKZBPNGNEQAJSX-UHFFFAOYSA-N selenocysteine Natural products [SeH]CC(N)C(O)=O ZKZBPNGNEQAJSX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 235000016491 selenocysteine Nutrition 0.000 description 1
- 229940055619 selenocysteine Drugs 0.000 description 1
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 1
- 229960000268 spectinomycin Drugs 0.000 description 1
- UNFWWIHTNXNPBV-WXKVUWSESA-N spectinomycin Chemical compound O([C@@H]1[C@@H](NC)[C@@H](O)[C@H]([C@@H]([C@H]1O1)O)NC)[C@]2(O)[C@H]1O[C@H](C)CC2=O UNFWWIHTNXNPBV-WXKVUWSESA-N 0.000 description 1
- 238000001228 spectrum Methods 0.000 description 1
- 239000000126 substance Substances 0.000 description 1
- 230000009897 systematic effect Effects 0.000 description 1
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 1
- 230000001225 therapeutic effect Effects 0.000 description 1
- 230000001052 transient effect Effects 0.000 description 1
- 238000011282 treatment Methods 0.000 description 1
- 125000005454 tryptophanyl group Chemical group 0.000 description 1
- OUYCCCASQSFEME-UHFFFAOYSA-N tyrosine Natural products OC(=O)C(N)CC1=CC=C(O)C=C1 OUYCCCASQSFEME-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000004474 valine Substances 0.000 description 1
- 230000003612 virological effect Effects 0.000 description 1
Images
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
- C12N9/93—Ligases (6)
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P3/00—Drugs for disorders of the metabolism
- A61P3/08—Drugs for disorders of the metabolism for glucose homeostasis
- A61P3/10—Drugs for disorders of the metabolism for glucose homeostasis for hyperglycaemia, e.g. antidiabetics
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
- A61P31/12—Antivirals
- A61P31/14—Antivirals for RNA viruses
- A61P31/18—Antivirals for RNA viruses for HIV
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P35/00—Antineoplastic agents
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N1/00—Microorganisms, e.g. protozoa; Compositions thereof; Processes of propagating, maintaining or preserving microorganisms or compositions thereof; Processes of preparing or isolating a composition containing a microorganism; Culture media therefor
- C12N1/20—Bacteria; Culture media therefor
- C12N1/205—Bacterial isolates
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
- C12N15/70—Vectors or expression systems specially adapted for E. coli
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K2319/00—Fusion polypeptide
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Y—ENZYMES
- C12Y601/00—Ligases forming carbon-oxygen bonds (6.1)
- C12Y601/01—Ligases forming aminoacyl-tRNA and related compounds (6.1.1)
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Zoology (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- General Chemical & Material Sciences (AREA)
- Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
- Pharmacology & Pharmacy (AREA)
- Animal Behavior & Ethology (AREA)
- Public Health (AREA)
- Veterinary Medicine (AREA)
- Diabetes (AREA)
- Virology (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Plant Pathology (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Tropical Medicine & Parasitology (AREA)
- Communicable Diseases (AREA)
- Oncology (AREA)
- AIDS & HIV (AREA)
- Emergency Medicine (AREA)
- Endocrinology (AREA)
- Hematology (AREA)
- Obesity (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
- Enzymes And Modification Thereof (AREA)
- Peptides Or Proteins (AREA)
Abstract
本発明は、最適な活性及び高い耐熱性を示す細菌に由来するキメラアミノアシル－ｔＲＮＡシンテターゼ（ａａＲＳ）を作製する方法を記載する。これらのキメラａａＲＳは、より積極的に作製されて、生理学的温度で安定である、より広範な種類のＵａａ選択的変異体を生成し得る。本発明はさらに、大腸菌及びＧ．ｓｔｅａｒｏｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ ＴｙｒＲＳから生成されるキメラＴｙｒＲＳの組成物を記載し、これらはＥｃＴｙｒＲＳに比べて安定性が向上し、両方のＴｙｒＲＳ酵素と比較してより高い活性を示す。【選択図】図３
Description
〔関連出願〕
本出願は、２０１９年１０月１５日に出願された米国仮出願第６２／９７３，５９９号の３５Ｕ．Ｓ．Ｃ．§１１９（ｅ）に基づく利益を主張し、その全体は参照により本明細書に組み込まれる。
本出願は、２０１９年１０月１５日に出願された米国仮出願第６２／９７３，５９９号の３５Ｕ．Ｓ．Ｃ．§１１９（ｅ）に基づく利益を主張し、その全体は参照により本明細書に組み込まれる。
〔政府支援〕
現在の技術は、米国国立衛生研究所（Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ ｏｆ Ｈｅａｌｔｈ、ＮＩＨ）認可番号Ｒ０１ＧＭ１２６２２０、Ｒ０１ＧＭ１２４３１９及びＮＩＨ／ＮＩＧＭＳ Ｒ３５ ＧＭ１３６４３７の助成金を受けて開発されたものであり、米国政府は、本発明に一定の権利を有する。
現在の技術は、米国国立衛生研究所（Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ ｏｆ Ｈｅａｌｔｈ、ＮＩＨ）認可番号Ｒ０１ＧＭ１２６２２０、Ｒ０１ＧＭ１２４３１９及びＮＩＨ／ＮＩＧＭＳ Ｒ３５ ＧＭ１３６４３７の助成金を受けて開発されたものであり、米国政府は、本発明に一定の権利を有する。
〔配列表〕
本出願は、ＡＳＣＩＩフォーマットで電子的に提出された配列リストを含み、その全体が参照により本明細書に組み込まれる。２０２０年１０月１５日に作成されたＡＳＣＩＩコピーは０３４２＿０００９ＷＯ１＿ＳＬ．ｔｘｔと名付けられ、サイズは８７，７７８バイトである。
本出願は、ＡＳＣＩＩフォーマットで電子的に提出された配列リストを含み、その全体が参照により本明細書に組み込まれる。２０２０年１０月１５日に作成されたＡＳＣＩＩコピーは０３４２＿０００９ＷＯ１＿ＳＬ．ｔｘｔと名付けられ、サイズは８７，７７８バイトである。
本発明は、バイオテクノロジーの分野において、非天然アミノ酸を部位特異的に組み込んだタンパク質を効率的に発現させるためのプラットフォームの開発に焦点を当てたものである。
非天然アミノ酸（Ｕａａｓ）の部位特異的組み込みは、哺乳動物細胞のバイオロジーを調べ、操作する（ｐｒｏｂｅ ａｎｄ ｅｎｇｉｎｅｅｒ）上で大きな可能性を秘めている。この技術の中心は、アミノアシルｔＲＮＡシンテターゼ（ａａＲＳ）／ｔＲＮＡのペア（ｐａｉｒ）であり、ナンセンスコドン又はフレームシフトコドンに応答して目的のＵａａを荷電（ｃｈａｒｇｅ）させるように設計されており、その宿主側のいかなる対応物とも交差反応を起こさないようになっている。このような「直交」ａａＲＳ／ｔＲＮＡペアは、典型的には、異なる生命ドメインから宿主細胞に移入される。したがって、真核細胞におけるＵａａｓの組み込みは、主に細菌に由来するａａＲＳ／ｔＲＮＡペアに依存している。
これまでのところ、真核生物におけるＵａａの組み込みには、チロシン、ロイシン、トリプトファンを付加する３種類の細菌性ａａＲＳ／ｔＲＮＡペアが用いられてきた。これらはすべてＥ．ｃｏｌｉ（大腸菌）に由来する。大腸菌のチロシルｔＲＮＡシンテターゼ（ＥｃＴｙｒＲＳ）／ｔＲＮＡペアは、２０年近く前に真核生物にＵａａｓを組み込ませるために初めて工学的に成功したペアであった。しかし、このペアを用いて生成されたＵａａ選択的変異体の数は、非常に限定されたままである。対照的に、ＥｃＴｙｒＲＳと類似の活性部位構造を有する古細菌由来チロシルペアは、高い選択性及び効率で１００以上のＵａａｓを荷電することに成功した。しかし、古細菌由来のチロシルペアは真核生物の対応物と交差反応を起こすため、真核生物で使用することはできない。細菌のＴｙｒＲＳ／ｔＲＮＡペアをさらに改良して、より幅広い種類のＵａａｓを受け入れることができれば、真核細胞におけるタンパク質の構造及び機能の探査及びエンジニアリングに関連する数多くの応用にとって極めて有用となる。
タンパク質の活性部位に変異を導入してその活性を変化させることは、しばしば、その三次及び四次構造の安定性の低下に繋がることが以前から観察されている。古細菌ＴｙｒＲＳは、その構造安定性が高く、変異体の多くは安定性が低下しても生理的温度で機能可能（ｖｉａｂｌｅ）であることから、工学的に優れた成果を上げているものと考えられる。対照的に、ＥｃＴｙｒＲＳは、有意に低い耐熱性を示す。その結果、変異体の安定性が損なわれると、生理学的温度では機能できないタンパク質が容易に生じる。このような破局的な安定性の喪失は、より広範な種類の構造的に新規なＵａａｓを荷電し得る可能性を持ったＥｃＴｙｒＲＳ変異体へのアクセスを妨げている。より耐熱性の高い細菌ＴｙｒＲＳを開発することができれば、この制約を克服し、構造的に異なるＵａａｓを荷電するより広範に設計された変異体を利用することが可能になるであろう。同じ概念は、真核細胞におけるＵａａ組み込みのために設計された、あるいは設計され得るすべての細菌由来のａａＲＳ変異体に広く当てはめることができる。
本明細書で使用されるように、用語「及び／又は」は、関連する列挙された項目のうちの１つ又は複数の任意の組合せ及びすべての組合せを含む。さらに、単数形及び冠詞「ａ」、「ａｎ」及び「ｔｈｅ」は、特に断らない限り、複数形も含むことを意図している。さらに、用語：含む、備える、含む及び／又は構成するは、本明細書で使用される場合、記載された特徴、整数、ステップ、操作、要素、及び／又は構成要素の存在を規定するが、１又は複数の他の特徴、整数、ステップ、操作、要素、構成要素、及び／又はそれらの群の存在又は追加を排除しないことがさらに理解されよう。
本発明は、高い耐熱性ならびに活性を示し、より積極的にエンジニアリングして、より広範は選択のＵａａｓを活性化し得る変異体を生成できる細菌由来のキメラアミノアシル－ｔＲＮＡシンテターゼ／ｔＲＮＡ対を生成する新しい戦略を確立するものである。また、本明細書には、それらの野生型の対応物よりも安定で、活性が高く、かつエンジニアリングが可能である細菌由来のキメラＴｙｒＲＳの組成物などが記載される。
さらに、本発明は、非天然アミノ酸（本明細書では、非標準アミノ酸又はｎｃＡＡとも呼ばれる）を有するアミノアシレート／荷電ｔＲＮＡに対して、向上した耐熱性ならびに最適な生物学的活性を示すキメラ細菌アミノアシル－ｔＲＮＡシンテターゼ（ａａＲＳ）を生成する方法を記載する。簡潔に述べると、本明細書で特許請求される方法は、以下のステップを含む。最初に、種々の好熱性細菌（例えば、Ｇｅｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｔｅａｒｏｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）及び中温性細菌（例えば、大腸菌）由来のａａＲＳホモログを評価して、それらの活性及び耐熱性を特徴付け／同定する。次に、熱安定性ａａＲＳと高いアミノアシル酵素活性を有するホモログの配列をハイブリダイズすることにより、一連のキメラを作製する。キメラは、より高い耐熱性ならびに最適な生物学的活性を示すものを同定するように特徴付けられ、ここで、生物学的活性は、ｔＲＮＡをアミノアシル化する能力として定義することができる。また、本明細書では、大腸菌ＴｙｒＲＳ（ＥｃＴｙｒＲＳ）及びＧｅｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｔｅａｒｏｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ ＴｙｒＲＳ（ＧｓＴｙｒＲＳ）に由来する、そのようなキメラ細菌ＴｙｒＲＳ（ＣｈＴｙｒＲＳ）の組成物も記載される。ＣｈＴｙｒＲＳは、ＥｃＴｙｒＲＳよりも高い耐熱性を示し、ＧｓＴｙｒＲＳ及びＥｃＴｙｒＲＳの両方よりも高い活性を示す。ＣｈＴｙｒＲＳは、ＥｃＴｙｒＲＳよりもＵａａ選択的変異体に耐性が高く、それらの野生型対応物と比較してより高い溶解度と活性を有している。従って、記載されるＣｈＴｙｒＲＳ組成物は、より工学的であり、遺伝暗号拡張（ＧＣＥ）にとって有用である。
特に、本発明は、その中温性細菌アミノアシル－ｔＲＮＡシンテターゼホモログの核酸配列にハイブリダイズした耐熱性細菌アミノアシル－ｔＲＮＡシンテターゼの核酸配列に由来するキメラ耐熱性アミノアシル－ｔＲＮＡシンテターゼを含む組成物を包含する。耐熱性微生物は、典型的には、約５０℃～約７０～８０℃の範囲で増殖する。中温性微生物は、典型的には、約２０℃～約４５℃の、より生理的な条件下で増殖する。
多種多様な耐熱性細菌が当業者に知られており、例えば、ゲオバチルス・ステアロサーモフィルス（Ｇｅｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｔｅａｒｏｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｉｓ）、バチルス・ステアロサーモフィルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｔｅａｒｏｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｉｓ）、サーマス・サーモフィラス（Ｔｈｅｒｍｕｓ ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｉｓ）又はサーモアナエロバクター属を含むことができる。多くの中温性細菌も当業者に公知であり、例えば、大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）、任意のブドウ球菌（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ）属、任意の連鎖球菌（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ）属、または任意のシュードモナス属を含み得る。本発明の特定の実施形態は、耐熱性細菌の核酸配列の関連部分がＧｅｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｔｅａｒｏｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｉｓであり、中温性細菌の核酸配列の関連部分が大腸菌であるキメラにハイブリダイズするキメラを含む。キメラ細菌の個々の構成要素の核酸配列の関連部分の選択は、当業者に公知の技術を使用して、本明細書に記載されるように決定される。
本明細書に記載のキメラ組成物はまた、野生型アミノアシルｔＲＮＡシンテターゼと比較して、その活性部位にアミノアシル－ｔＲＮＡシンテターゼの基質特異性に変化をもたらすような１つ又は複数の変異（ｍｕｔａｔｉｏｎｓ）／変化（ｖａｒｉａｔｉｏｎｓ）を組み込むように遺伝子操作することができる中温性細菌アミノアシルｔＲＮＡシンテターゼ（ａａＲＳ）を含むキメラ（本明細書ではキメラ耐熱性アミノアシル－ｔＲＮＡシンテターゼの変異型（変異体）とも呼ぶ）、を包含する。これらの変異／変化は、ａａＲＳが、非天然アミノ酸を有する対応する／同族（ｃｏｇｎａｔｅ）ｔＲＮＡを荷電する能力をもたらす。ａａＲＳは、耐熱性ａａＲＳとの連結／ハイブリダイゼーションの前に、選択された変異を用いて遺伝子操作することができる。あるいは、ａａＲＳは、その耐熱性対応物へのハイブリダイゼーション／連結後に活性部位変異を組み込むように操作することができる。同族ｔＲＮＡは、野生型ｔＲＮＡでも良く、あるいは国際出願番号ＰＣＴ／ＵＳ２０２０／０３８７６６（その教示は、は参照により本明細書に組み込まれる）に記載されるように、その活性を改善するために遺伝子操作されたものであり得る。重要なことは、本明細書中に記載されるように、本発明のキメラアミノアシル－ｔＲＮＡシンテターゼは、その個々の野生型中温性細菌前駆体ａａＲＳと比較して耐熱性の向上、及びその個々の野生型好熱性前駆体ａａＲＳと比較してより高い生物学的活性（例えば、構造安定性の向上及び／又は生理学的温度（例えば、約６０℃まで）での溶解性の増大、又はその同族ｔＲＮＡをアミノアシル化する能力の向上）を示すことである。従って、本発明のキメラは、哺乳動物タンパク質に非天然アミノ酸を組み込むために、それらの野生型前駆体アミノアシル－ｔＲＮＡシンテターゼと比較して、最適な耐熱性及び生物学的活性を有する。
本明細書中に記載されるように、本発明のキメラ耐熱性アミノアシル－ｔＲＮＡシンテターゼは、中温性野生型細菌ａａＲＳと比較して、耐熱性を向上させる。キメラ熱安定性中温性細菌ａａＲＳの生物学的活性は、既知の天然に存在するアミノ酸のいずれかを有するその同族の野生型又は変異型ｔＲＮＡをアミノアシル化／電荷化する活性、又はキメラが変異型キメラである場合は、非天然アミノ酸を有するその同族ｔＲＮＡをアミノアシル化／荷電する活性と定義することができる。
本発明のキメラアミノアシル－ｔＲＮＡシンテターゼ変異体は、野生型アミノアシル－ｔＲＮＡシンテターゼよりも生物学的活性が増加して、その同族の野生型又は非天然アミノ酸を有する変異型ｔＲＮＡをアミノアシル化／荷電することができる。非天然アミノ酸（Ｕａａｓ）は、当業者に公知であり、天然に存在するアミノ酸のいずれかのアナログ／誘導体を含むことができる。本発明のＵａａｓのいくつかの例は、ｐ－ベンゾイルフェニルアラニン（ｐＢｐＡ）などのフェニルアラニンアナログ、Ｏ－メチルチロシン（ＯＭｅＹ）などのチロシンアナログ、トリプトファニルアナログ（５－アジドトリプトファン、５－プロパルギルオキシトリプトファン、５－アミノトリプトファン、５－メトキシトリプトファン、５－Ｏ－アリルトリプトファン、又は５－ブロモトリプトファン）又はリジルアナログを含むことができる。これらのアナログは、商業的供給源（例えば、ｗｗｗ．ｃｈｅｍｉｍｐｅｘ．ｃｏｍ）から購入することができ、又は公知の方法を使用して当業者によって合成することができる（また、例えば、米国特許第１０／７１７，９７５号を参照のこと。この教示は、その全体が本明細書中に援用される）。
本発明の特定の実施形態は、好熱性細菌アミノアシル－ｔＲＮＡシンテターゼＧｓＴｙｒＲＳ及び中温性細菌アミノアシル－ｔＲＮＡシンテターゼＥｃＴｙｒＲＳを含むキメラ組成物である。より具体的には、本発明のキメラ組成物（本明細書においてＣｈ２ＴｙｒＲＳ－ＷＴ又はＣｈＴｙｒＲＳ－Ｈ２と呼ばれる）は、配列ＩＤ番号１、配列ＩＤ番号４１を含む核酸配列、又は配列ＩＤ番号１もしくは配列ＩＤ番号４１と少なくとも８０％の配列同一性を有する核酸配列、又は配列ＩＤ番号１もしくは配列ＩＤ番号４１と約８０％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、もしくは９９％の配列同一性を含む核酸配列を含む。このキメラに対応するアミノ酸配列は、図１５において配列ＩＤ番号４２として見出される。
あるいは、キメラ組成物（本明細書中でＣｈ６ＴｙｒＲＳ－ＷＴ又はＣｈＴｙｒＲＳ－Ｈ６と呼ばれる）は、配列ＩＤ番号２、配列ＩＤ番号４５、又は配列ＩＤ番号２もしくは配列ＩＤ番号４５と約８０％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％もしくは９９％の配列同一性を有するキメラ核酸配列を含む。対応するアミノ酸配列は、図１５において配列ＩＤ番号４６として見出される。
本明細書中に記載される核酸配列及びアミノ酸配列の全ては、具体的に命名した特定の配列ＩＤ番号と約８０％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、又は９９％の配列同一性を含む対応配列を含むことが理解されるべきである。
さらに包含されるのは、活性部位に変異を有する変異型キメラ耐熱性アミノアシル－ｔＲＮＡシンテターゼであり、例えば、活性部位における変異は、哺乳動物タンパク質における非天然アミノ酸の組み込みのための酵素活性をもたらす。一実施形態では、Ｕａａはフェニルアラニンアナログである。特定の実施形態では、フェニルアラニンアナログは、ｐ－ベンゾイルフェニルアラニン（ｐＢｐＡ）である。
より詳細には、ｐＢｐＡを哺乳動物タンパク質に組み込むキメラ熱安定性ａａＲＳのアミノ酸配列は、本明細書中でＣｈ２ＴｙｒＲＳ－ｐＢｐＡと呼ばれ、配列ＩＤ番号４３（活性部位Ｙ３７Ｇ、Ｄ１７９Ｇ、Ｌ１８３Ａに変異を有する）、又は配列ＩＤ番号４３と少なくとも８０％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、もしくは９９％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。
あるいは、ｐＢｐＡを哺乳動物タンパク質に組み込むキメラ熱安定性ａａＲＳのアミノ酸配列は、本明細書中でＣｈ６ＴｙｒＲＳ－ｐＢｐＡと呼ばれ、配列ＩＤ番号４７（活性部位Ｙ３７Ｇ、Ｄ１８２Ｇ、Ｌ１８６Ａに変異を有する）、又は配列ＩＤ番号４６と少なくとも８０％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、もしくは９９％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。
活性部位における変異が、チロシンアナログの哺乳動物タンパク質への組み込みをもたらすａａＲＳもまた、本明細書に包含される。より具体的には、チロシンアナログは、Ｏ－メチルチロシン（ＯＭｅＹ）であってもよい 。ＯＭｅＹを哺乳動物タンパク質に組み込むキメラ耐熱性ａａＲＳのアミノ酸配列は、本明細書においてＣｈ２ＴｙｒＲＳ－ｐｏｌｙと呼ばれ、配列ＩＤ番号４４（活性部位変異Ｙ３７Ｖ、Ｄ１７６Ｓ、Ｆ１８０Ｍ、Ｌ１８３Ａを有する）、又は配列ＩＤ番号４４と少なくとも８０％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、もしくは９９％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。
本発明はまた、本発明のキメラａａＲＳを含む細胞（インビトロ又はインビボのいずれかで培養される）を包含する。このような細胞はまた、キメラａａＲＳの同族ｔＲＮＡを含み得る。このような細胞は、例えば、リボソーム、内因性ｔＲＮＡ、翻訳酵素、ｍＲＮＡ及びアミノ酸などの翻訳系成分を含む、ポリヌクレオチドのタンパク質への翻訳に必要な全ての細胞成分をさらに含んでもよく、その結果、天然又は非天然アミノ酸が組み込まれたタンパク質を産生する能力を生じる。
本発明の細胞は、本明細書に記載のキメラ熱安定性ａａＲＳ／ｔＲＮＡ、又はキメラ熱安定性ａａＲＳ変異型／ｔＲＮＡペアと共に使用するのに適した任意の細菌細胞又は真核細胞であり得る。例えば、細胞は、酵母細胞、昆虫細胞又は哺乳動物細胞からなる群から選択することができる。特に、細菌細胞は、遺伝子操作された大腸菌細胞、又は相同／類似の細菌細胞である。より具体的には、大腸菌は、本明細書に記載のＡＴＭＹ系列の株である。
キメラ耐熱性アミノアシル－ｔＲＮＡシンテターゼを産生する方法もまた、本発明に包含される。第１のステップは、キメラとして連結するのに適したａａＲＳ酵素配列を同定することである。例えば、当業者であれば、中温性微生物（例えば、Ｅ．ｃｏｌｉ（大腸菌）のような細菌）における目的のアミノアシル－ｔＲＮＡシンテターゼを同定／評価し得る。次のステップは、本明細書中に記載されるように、中温性微生物アミノアシル－ｔＲＮＡシンテターゼの耐熱性と比較して耐熱性が向上した好熱性微生物由来の適切なａａＲＳホモログを同定／評価することである。
一旦、適切なａａＲＳ配列が同定され、特性が明らかになれば、耐熱性アミノアシル－ｔＲＮＡシンテターゼ及び中温性アミノアシル－ｔＲＮＡシンテターゼの関連配列を含むキメラが、本明細書中に記載されるように構築され得る。次いで、キメラは、野生型前駆体であるアミノアシル－ｔＲＮＡシンテターゼと比較して、その同族ｔＲＮＡをアミノアシル化／荷電する耐熱性及び生物学的活性について評価することができる。
より具体的には、本明細書中に記載されるように、ＤＮＡシャッフリングの技術を使用して、本発明のキメラを産生した。ＤＮＡシャフリングは、遺伝子又は相同遺伝子をランダムな断片に消化し、ＰＣＲによってそれらの断片を完全長遺伝子に再集合させることを含む。再構築された遺伝子配列を、好熱性及び酵素活性について評価／試験する。
本明細書に記載される特定の実施形態において、中温性ａａＲＳは、非天然アミノ酸アナログをアミノアシル化するように操作することができ、非天然アミノ酸アナログでその同族ｔＲＮＡを荷電／アミノアシル化する酵素活性を有する変異型キメラ耐熱性ａａＲＳを形成する。Ｕａａはフェニルアラニンアナログであってもよく、具体的には、フェニルアラニンアナログはｐ－ベンゾイルフェニルアラニン（ｐＢｐＡ）である。あるいは、Ｕａａはチロシンアナログである。より具体的には、チロシンアナログは、Ｏ－メチルチロシン（ＯＭｅＹ）であり得る。さらなるチロシンアナログは、当業者に公知であり、例えば、スルホチロシン、ヨードチロシン、クロロチロシン及びニトロベンジルチロシンを含むことができる。
また、本明細書には、タンパク質中の特定の位置に１つ又は複数の非天然アミノ酸を有するタンパク質を細胞中で産生する方法も包含される。
本方法は、以下のステップを含む。
本方法は、以下のステップを含む。
ａ．細胞を、増殖に適した条件下で培養培地中で細胞培養するステップであって、ここで、細胞は、１つ又は複数の、アンバー又はオパールのセレクターコドンを有するタンパク質をコードする核酸分子を含み、細胞は、セレクターコドンを認識するＥｃ－ｔＲＮＡＵＡＡをさらに含み、細胞は、非天然アミノ酸でＥｃ－ｔＲＮＡＵＡＡを優先的にアミノアシル化するキメラ耐熱性アミノアシル－ｔＲＮＡシンテターゼをさらに含む。
ｂ．セレクターコドンに応じて１つ又は複数の非天然アミノ酸をタンパク質に組み込むのに適した条件下で、細胞培養培地をＥｃ－ｔＲＮＡＵＡＡのＵａａに対応する１つ又は複数の非天然アミノ酸アナログと接触させ、それによって、タンパク質の特定の位置に１つ又は複数の非天然アミノ酸を有するタンパク質を産生する。
特に、本方法は、本明細書に記載のキメラ耐熱性アミノアシル－ｔＲＮＡシンテターゼのいずれかを含むことができる。特に、キメラは、核酸配列の配列ＩＤ番号１もしくは配列ＩＤ番号４１、又は配列ＩＤ番号１もしくは配列ＩＤ番号４１に対して少なくとも８０％の配列同一性を有する核酸配列、又は核酸配列の配列ＩＤ番号２もしくは配列ＩＤ番号４５、又は配列ＩＤ番号２もしくは配列ＩＤ番号４５に対して少なくとも８０％の配列同一性を有する核酸配列を含むことができる。
一実施形態では、タンパク質に組み込まれる非天然アミノ酸は、ｐ－ベンゾイルフェニルアラニン（ｐＢｐＡ）であり、キメラは、Ｃｈ２ＴｒｙＲＳ－ｐＢｐＡ又はＣｈ６ＴｒｙＲＳ－ｐＢｐＡであり、Ｃｈ２ＴｒｙＲＳ－ｐＢｐＡキメラのアミノ酸配列は、配列ＩＤ番号４３又は配列ＩＤ番号４７、又は配列ＩＤ番号４３又は配列ＩＤ番号４７のいずれかと少なくとも８０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。
別の実施形態では、タンパク質に組み込まれる非天然アミノ酸は、非天然アミノ酸Ｏ－メチルチロシン（ＯＭｅＹ）であり、キメラは、Ｃｈ２ＴｙｒＲＳ－ポリであり、Ｃｈ２ＴｙｒＲＳ－ポリキメラは、配列ＩＤ番号４４、またはいずれかの配列ＩＤ番号４４と少なくとも８０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。
細胞は大腸菌細胞でも真核細胞でもよい。一実施形態では、真核細胞は哺乳動物細胞である。別の実施形態では、大腸菌はＡＴＭＹ大腸菌株である。
さらに、本発明は、細胞内でタンパク質を産生するためのキットであって、ここで、タンパク質に１つ以上のＵＡａが組み込まれてなるキットを対象とするものである。例えば、タンパク質が１つ以上のｐＢｐＡ残基を含む場合、キットは、細胞内の目的の核酸中のアンバーまたはオパールセレクターコドンを認識するＥｃ－ｔＲＮＡｐｂｐａをコードするポリヌクレオチド配列が入った容器を含み、また、キメラ耐熱性アミノアシル－ｔＲＮＡシンテターゼＣｈ２ＴｒｙＲＳ－ｐＢｐＡまたはＣｈ６ＴｙｒＲＳ－ｐＢｐＡをコードするポリヌクレオチド配列を含む容器を含む。
キメラをコードするポリヌクレオチドは、配列ＩＤ番号４３または配列ＩＤ番号４７を含むキメラのアミノ酸配列、または配列ＩＤ番号４３または配列ＩＤ番号４７のいずれかと少なくとも８０％の配列同一性を有するアミノ酸配列をコードする。キットは、１つまたは複数のｐ－ベンゾイルフェニルアラニン分子をさらに含むことができ、タンパク質を産生するための説明書を含むこともできる。
あるいは、本キットは、１つ以上のＯ－メチルチロシン（ＯＭｅＹ）残渣を含む、細胞内でタンパク質を産生するために使用することができ、タンパク質は、１つ又は複数のＯ－メチルチロシン（ＯＭｅＹ）残基を含む。このキットは、細胞内の目的の核酸中のアンバーまたはオパールセレクターコドン（複数可）を認識するＥｃ－ｔＲＮＡｐｏｌｙをコードするポリヌクレオチド配列が入った容器、及びキメラ耐熱性アミノアシル－ｔＲＮＡシンテターゼＣｈ２ＴｙｒＲＳ－ポリをコードするポリヌクレオチド配列が入った容器を含むことができる。
キメラをコードするポリヌクレオチドは、アミノ酸配列ＩＤ番号４４、または配列ＩＤ番号４４と少なくとも８０％の配列同一性を含むアミノ酸配列をコードする。キットは、１つ又は複数のＯ－メチルチロシン（ＯＭｅＹ）分子、及びタンパク質を産生するための説明書をさらに含むことができる。
本発明は、以下の図面の説明及び詳細な説明を読むことにより、当業者にとって明らかになる特徴及び利点を示すものである。
添付の図面において、参照符号は、異なる図を通して同じ部分を指す。図面は、必ずしも縮尺通りではなく、代わりに、本発明の原理を示すことに重点が置かれている。この特許又は出願書類は，色彩を付して作成された少なくとも１の図面を含んでいる。この特許又は特許出願公開の写しでカラー図面を付したものは、請求と必要な手数料の支払によって，国内官庁から提供される。
図１Ａ～１Ｃは、作製されたＴｙｒＲＳ変異体がより低い耐熱性を示すことを示す。
Ａ）ＥｃＴｙｒＲＳ活性部位は、結合したチロシンをマゼンタで示し、作製された変異体（後述）の変異残基を強調表示した。Ｂ）ＥｃＴｙｒＲＳ－ＷＴ及びＥｃＴｙｒＲＳ－ｐＢｐＡを発現させた大腸菌無細胞抽出物の可溶性及び不溶性画分のウェスタンブロット分析は、ＥｃＴｙｒＲＳ－ｐＢｐＡが大部分において不溶性であることを明らかにしている。Ｃ）各種ＴｙｒＲＳ変異体のサーマルシフトアッセイ。示されたＴｙｒＲＳ変異型（左）を発現する大腸菌無細胞抽出物の可溶性画分について、示された温度（上）でのインキュベーション後に、ドットブロットを行った（抗ポリヒスチジン抗体を使用して）。
Ａ）ＥｃＴｙｒＲＳ活性部位は、結合したチロシンをマゼンタで示し、作製された変異体（後述）の変異残基を強調表示した。Ｂ）ＥｃＴｙｒＲＳ－ＷＴ及びＥｃＴｙｒＲＳ－ｐＢｐＡを発現させた大腸菌無細胞抽出物の可溶性及び不溶性画分のウェスタンブロット分析は、ＥｃＴｙｒＲＳ－ｐＢｐＡが大部分において不溶性であることを明らかにしている。Ｃ）各種ＴｙｒＲＳ変異体のサーマルシフトアッセイ。示されたＴｙｒＲＳ変異型（左）を発現する大腸菌無細胞抽出物の可溶性画分について、示された温度（上）でのインキュベーション後に、ドットブロットを行った（抗ポリヒスチジン抗体を使用して）。
図２Ａ～２Ｃは、ＧｓＴｙｒＲＳ及びＥｃＴｙｒＲＳから作製された細菌ＴｙｒＲＳキメラが、より高い活性及び中程度の耐熱性を示すことを表している。Ａ）２つのキメラ、Ｃｈ２ＴｙｒＲＳ及びＣｈ６ＴｙｒＲＳは、ＥｃＴｙｒＲＳ（グリーン、翻訳図面では淡色）及びＧｓＴｙｒＲＳ（マゼンタ、翻訳図面では濃色）配列を融合して作られた。ＥｃＴｙｒＲＳ結晶構造を用いて、２つのキメラにおける前駆体配列を強調した。Ｂ）大腸菌無細胞抽出物中の２つのキメラならびにそれらの野生型前駆体のサーマルシフトアッセイ。示されたＴｙｒＲＳ変異型（左）を発現する大腸菌無細胞抽出物の可溶性画分について、示された温度（上）でのインキュベーション後に、ドットブロットを行った（抗ポリヒスチジン抗体を使用して）。Ｃ）ｔＲＮＡＣＵＡ
Ｔｙｒの存在下でのｓｆＧＦＰ－１５１ＴＡＧレポータを発現させ、測定したＡＴＭＹ大腸菌株におけるＴｙｒＲＳ変異体の活性。全長ｓｆＧＦＰ－１５１－ＴＡＧレポーターの特徴的な蛍光を、再懸濁細胞において測定した。
図３Ａ～３Ｂは、キメラＴｙｒＲＳ変異体が、ｐＢｐＡ選択的変異をよりよく許容することを示す。Ａ）２つの野生型またはキメラ型足場から構築されたｐＢｐＡ選択的ＴｙｒＲＳ変異体の、大腸菌無細胞抽出物中でのサーマルシフトアッセイ。示されたＴｙｒＲＳ－ｐＢｐＡ変異型（左）を発現する大腸菌無細胞抽出物の可溶性画分について、示された温度（上）でのインキュベーション後に、ドットブロットを行った（抗ポリヒスチジン抗体を使用して）。Ｂ）ＡＴＭＹ大腸菌株におけるＴｙｒＲＳ－ｐＢｐＡ変異体の活性を、ｔＲＮＡＣＵＡ
Ｔｙｒの存在下において、及び１ｍＭ ｐＢｐＡの存在下及び非存在下において、ｓｆＧＦＰ－１５１ＴＡＧレポータの発現を用いて測定した。完全長ｓｆＧＦＰ－１５１－ＴＡＧレポーターの特徴的な蛍光を、再懸濁細胞において測定した。
図４Ａ～４Ｃ。図４Ａ及び４Ｂは、キメラＴｙｒＲＳ由来の変異体が、哺乳動物細胞におけるｎｃＡＡ組み込みについて改善された活性を示すことを表す。Ａ）ＴｙｒＲＳ－ｐＢｐＡ変異体を、ｐＢｐＡの存在下及び非存在下で、ｔＲＮＡＣＵＡ
Ｔｙｒ及びＥＧＦＰ－３９－ＴＡＧと共にＨＥＫ２９３Ｔ細胞において共発現させ、全長レポーターの発現を、無細胞抽出物におけるその特徴的な蛍光によってモニターした。発現レベルは、野生型ＥＧＦＰレポーター（ＴＡＧなし）をレポーターとして使用した同一実験の％として報告した。Ｂ）Ｃｈ２ＴｙｒＲＳ‐ＰｏｌｙのｎｃＡＡ組み込み効率は高活性ＥｃＴｙｒＲＳ‐Ｐｏｌｙに匹敵する。活性を、１ｍＭ ＯＭｅＹの存在下及び非存在下で、セクション（Ａ）に記載されるように測定した。全ての関連する蛍光画像については、図９を参照されたい。図４Ｃは、ＣｈＴｙｒＲＳ－ｐＢｐＡが、いずれかの野生型対応物と比較して増強された活性を示すことを表す。活性はｔＲＮＡ‐ＥｃＴｙｒ（ＴＡＧサプレッサー）存在下で大腸菌細胞にＧＦＰ‐１５１‐ＴＡＧレポーターを発現させて測定した。
図５は、ＣｈＴｙｒＲＳ－Ｈ２（配列ＩＤ番号１）及びＣｈＴｙｒＲＳ－Ｈ６（配列ＩＤ番号２）の核酸分子配列を示す。
図６は、ＥｃＴｙｒＲＳ－ｐＢｐＡの活性がＥｃＴｙｒＲＳ－ＷＴに比べて著しく 弱いことを示す。活性は、ＡＴＭＹ大腸菌で発現させたｓｆＧＦＰ－１５１－ＴＡＧレポーターを使用して、再懸濁細胞における全長レポーターの特徴的な蛍光を測定することによって評価した。ＥｃＴｙｒＲＳ－ｐＢｐＡについては、１ｍＭ ｐＢｐＡの存在下または非存在下で発現 を測定した。
図７は、本研究で用いたＭｊＴｙｒＲＳ変異体を示す。ＭｊＴｙｒＲＳの活性部位構造はまた、非標準アミノ酸（ｎｃＡＡまたはＵａａ）選択的変異体を生成するために変異された主要な残基を強調している。
図８は、ＥｃＴｙｒＲＳ－ＷＴ（配列ＩＤ番号２９）及びＧｓＴｙｒＲＳ－ＷＴ（配列ＩＤ番号３０）の配列アラインメント及びそのコンセンサス配列を示す。
図９は、種々のＴｙｒＲＳ／ｔＲＮＡペア（上記に示される）を使用して、関連するｎｃＡＡの存在下または非存在下で、ＥＧＦＰ－３９－ＴＡＧレポーターを発現する哺乳動物細胞の蛍光画像を示す（左）。これらの画像は、図４に示す蛍光値に対応する。
図１０は、Ｃｈ２ＴｙｒＲＳ－ｐＢｐＡを用いたＨＥＫ２９３Ｔ細胞において発現されたＥＧＦＰ－３９－ｐＢｐＡレポーターのＳＤＳ－ＰＡＧＥ分析を示す。
図１１Ａ～Ｂは、Ｃｈ２ＴｙｒＲＳ－ｐＢｐＡを用いたＨＥＫ２９３Ｔ細胞において発現させたＥＧＦＰ－３９－ｐＢｐＡレポーターのデコンボリューションＥＳＩ－ＭＳ分析を示す。同じスペクトルの２つの異なる倍率を示す。主要な種（２９７７１Ｄａ）は予想される質量に対応し、２９７２９ＤａのピークはＮ末端アセチル化（４２Ｄａ）を欠く同じ種を表す可能性が高いが、２９７８７Ｄａのピークは酸化（＋１６Ｄａ）から生じる可能性が高い。
最終的なプラスミドマップと配列のテキストは以下のような色分けで示されている。ａａＲＳは赤、抗生物質の選択マーカーは青、ｔＲＮＡは紫、ｌａｃＩは緑、複製起点はオレンジで強調されている。図面は色分けされていない。
図１２は、ｐＢＫ ＭＣＳ ＧｓＹＲＳ ＷＴのプラスミドマップ及び配列を示し、ここで、活性部位変異がＣｈ２ＴｙｒＲＳ－ｐＢｐＡ変異型に位置し、また、活性部位変異がＣｈ６ＴｙｒＲＳ－ｐＢｐＡ変異型にも位置する（配列ＩＤ番号３１、１及び２、それぞれ出現順）。
図１３は、ｐＥＴ２２ｂ １０Ｘ Ｎ末端Ｈｉｓ ＧｓＹＲＳのプラスミドマップ及び配列を示す（配列ＩＤ番号３２～３６、それぞれ出現順）。
図１４は、ｐＢＩＵ Ｇｓ－ＢＰＡ－ＲＳのプラスミドマップ及び配列を示し、ここで、活性部位変異がＣｈ２ＹｙｒＲＳ－ＯＭｅＹ変異型に位置する（配列ＩＤ番号３７～４０、それぞれ出現順）。
図１５は、以下の配列を出現順に示す。
Ｃｈ２ＴｙｒＲＳ－ＷＴヌクレオチド配列（配列ＩＤ番号４１）及びそのコードされるアミノ酸配列（配列ＩＤ番号４２）。
Ｃｈ２ＴｙｒＲＳ－ｐＢｐＡアミノ酸配列ＩＤ番号４３。変異は赤色で強調されているＹ３７Ｇ、Ｄ１７９Ｇ、Ｌ１８３Ａ。
Ｃｈ２ＴｙｒＲＳ－ポリアミノ酸配列ＩＤ番号４４。変異は赤色で強調されている Ｙ３７Ｖ、Ｄ１７６Ｓ、Ｆ１８０Ｍ、Ｌ１８３Ａ。
Ｃｈ６ＴｙｒＲＳ－ＷＴヌクレオチド配列（配列ＩＤ番号４５）及びそのコードされるアミノ酸配列（配列ＩＤ番号４６）。
Ｃｈ６ＴｙｒＲＳ－ｐＢｐＡアミノ酸配列ＩＤ番号４７。変異は赤色で強調されている Ｙ３７Ｇ、Ｄ１８２Ｇ、Ｌ１８６Ａ。
Ｃｈ２ＴｙｒＲＳ－ＷＴヌクレオチド配列（配列ＩＤ番号４１）及びそのコードされるアミノ酸配列（配列ＩＤ番号４２）。
Ｃｈ２ＴｙｒＲＳ－ｐＢｐＡアミノ酸配列ＩＤ番号４３。変異は赤色で強調されているＹ３７Ｇ、Ｄ１７９Ｇ、Ｌ１８３Ａ。
Ｃｈ２ＴｙｒＲＳ－ポリアミノ酸配列ＩＤ番号４４。変異は赤色で強調されている Ｙ３７Ｖ、Ｄ１７６Ｓ、Ｆ１８０Ｍ、Ｌ１８３Ａ。
Ｃｈ６ＴｙｒＲＳ－ＷＴヌクレオチド配列（配列ＩＤ番号４５）及びそのコードされるアミノ酸配列（配列ＩＤ番号４６）。
Ｃｈ６ＴｙｒＲＳ－ｐＢｐＡアミノ酸配列ＩＤ番号４７。変異は赤色で強調されている Ｙ３７Ｇ、Ｄ１８２Ｇ、Ｌ１８６Ａ。
好ましい実施形態の詳細な説明
本発明はその好ましい態様に関して、特に示され記載されるが、添付の特許請求の範囲に包含される本発明の範囲を逸脱することなく、本明細書中で形式及び詳細において種々の変更がなされ得ることを当業者は理解しよう。
本発明はその好ましい態様に関して、特に示され記載されるが、添付の特許請求の範囲に包含される本発明の範囲を逸脱することなく、本明細書中で形式及び詳細において種々の変更がなされ得ることを当業者は理解しよう。
生細胞におけるタンパク質の非標準アミノ酸（ｎｃＡＡ）変異誘発は、大きな可能性を秘めた強力な技術として出現した１－５。目的のｎｃＡＡは、ナンセンスまたはフレームシフトコドンに応答して、直交アミノアシル－ｔＲＮＡシンテターゼ（ａａＲＳ）／ｔＲＮＡペアを使用して、同時翻訳的に組み込むことができる１－５。この技術の中心は、天然型ａａＲＳの基質特異性を指向性進化法により設計する能力である。多くの有用なｎｃＡＡは、Ｍｅｔｈａｎｏｃａｌｄｏｃｏｃｃｕｓ ｊａｎｎａｓｃｈｉｉ由来のチロシルｔＲＮＡシンテターゼ（ＭｊＴｙｒＲＳ）／ｔＲＮＡペアを用いて大腸菌に遺伝的にコードされており、バイオコンジュゲーションハンドル、光親和性プローブ、生物物理学的プローブ、天然の翻訳後修飾のためのモデルなどを含む１，２，５。これらの機能性のいくつかはまた、他のａａＲＳ／ｔＲＮＡペアを使用して遺伝的にコードされ得るが、いくつかの他のもの（例えば、天然の翻訳後修飾をモデル化するもの）は、ＴｙｒＲＳ活性部位の独特の構造に依存する１，２，５。しかし残念ながら、古細菌由来のＭｊＴｙｒＲＳ／ｔＲＮＡペアがその真核細胞対応物と交差反応するので、このツールセットは真核細胞において使用することができない。典型的には、細菌由来ａａＲＳ／ｔＲＮＡペアは、これらの細胞において直交する傾向があるので、真核生物におけるｎｃＡＡ組み込みに適している１，３，５－７。実際、大腸菌由来のチロシル－ｔＲＮＡシンテターゼ（ＥｃＴｙｒＲＳ）／ｔＲＮＡペアは、真核細胞におけるｎｃＡＡ取り込みのために確立されている８－１２。２０年近く前に真核細胞で発現されるタンパク質にｎｃＡＡを組み込むように工学的に改変されたのが最初であった。しかし、このペアを用いて開発されたｎｃＡＡ－ツールボックスは、特に、同時期のＭｊＴｙｒＲＳ／ｔＲＮＡペアの顕著な成功と比較した場合、驚くほど限定的なものにとどまっている１－３，５，１３。細菌ＴｙｒＲＳ／ｔＲＮＡペアを用いてＭｊＴｙｒＲＳ／ｔＲＮＡプラットフォームの成功を再現することができれば、真核生物における遺伝暗号拡張（ＧＣＥ）技術の幅が大きく広がり、ａａＲＳ／ｔＲＮＡペアによる遺伝暗号化が困難な構造的にユニークなｎｃＡＡにアクセスすることができるようになるであろう。
ＥｃＴｙｒＲＳ／ｔＲＮＡペアの限られた治療成功は、少なくとも部分的には、その基質特異性を変化させるために使用される指向性進化プラットフォームに関連する課題に起因し得る１，３，７，１３。容易な大腸菌ベースの指向性進化システムを用いて容易に作製することができるＭｊＴｙｒＲＳとは異なり、ＥｃＴｙｒＲＳを作製するためには、より扱いにくい酵母ベースの選択方式が必要である８。この課題を解決するために、内因性ＥｃＴｙｒＲＳ／ｔＲＮＡペアを古細菌の対応物で機能的に置換した固有の大腸菌株（ＡＴＭＹ株）の開発を含む新規戦略を開発した１，３，７，１３。（米国特許第１０／７１７９７５号も参照）。このような株は、大きな増殖阻害を受けることなく作成できることが実証された１３。「遊離した」ＥｃＴｙｒＲＳ／ｔＲＮＡペアは、続いて、直交ナンセンスサプレッサーとして得られたＡＴＭＹ株に定着させることができる。これにより、ＥｃＴｙｒＲＳの基質特異性を改変するために、大腸菌を用いた容易な指向性進化プラットフォームが利用できるようになった１３。
この容易な指向性進化プラットフォームを用いてＥｃＴｙｒＲＳ／ｔＲＮＡペアを迅速に作製する能力はいくつかの新たなｎｃＡＡへのアクセスを提供するが、いくつかの例では、結果として作製された変異体の中には活性が低いものがあった。例えば、弱く一過性の分子間相互作用を捕捉するのに有用な強力な光親和性プローブであるｐ－ベンゾイルフェニルアラニン（ｐＢｐＡ）を効率的に荷電するＥｃＴｙｒＲＳ変異体を開発することが試みられた８，１４－１７。ＥｃＴｙｒＲＳは、ｐＢｐＡを選択的に荷電するために酵母ベースの選択プラットフォームを使用して以前、作製されたが、その活性が弱いため、この変異体の有用性は限定的であった。大規模なＥｃＴｙｒＲＳ活性部位変異体ライブラリーを容易な選択システムにかけたところ、酵母での選択によって以前に開発された変異体と同じものが同定された。このことは、観察された変異のセットが、実際に、ｐＢｐＡを荷電させるためのＥｃＴｙｒＲＳ活性部位を最適に再コードしていることを示している。このｐＢｐＡ選択的ＥｃＴｙｒＲＳの活性は、ＡＴＭＹ大腸菌株でｓｆＧＦＰ－１５１－ＴＡＧレポーターを用いて測定したところ、若干低かった（図６）。系統的な調査により、ＥｃＴｙｒＲＳ－ｐＢｐＡ変異体は大腸菌にほとんど不溶性であり、その活性が低いことを説明できる可能性があることが確認された（図１Ｂ）。ポリヒスチジンタグ付きＥｃＴｙｒＲＳ－ＷＴ及びＥｃＴｙｒＲＳ－ｐＢｐＡを発現する大腸菌の無細胞抽出物の可溶性画分及び不溶性画分をウェスタンブロット分析すると、後者はほぼ不溶性画分にのみ存在することがわかった（図１Ｂ）。対照的に、野生型ＥｃＴｙｒＲＳは大部分が可溶性画分中に見出された。
これまで、タンパク質の機能を変化させるために指向性進化法に供した場合、得られる変異体の安定性が損なわれる場合があることが知られていた１８－２１。そのため、タンパク質の安定性によって、タンパク質をどの程度まで操作できるかが制限されることが多い。ＭｊＴｙｒＲＳは好熱性古細菌由来の酵素であり、その構造的安定性により、遺伝子操作の成功が容易になったのではないかと推測される。一方、中温性細菌由来のＥｃＴｙｒＲＳは、足場が安定でなく、活性部位の変異に対する耐性がより低い可能性がある。この考えを検証するために、改変した細胞内サーマルシフトアッセイ（ＣＥＴＳＡ）を利用した２２，２３。このアッセイでは、標的タンパク質を発現する無細胞抽出物を、温度を上昇させながら加熱し、続いて、可溶性画分中の残存タンパク質の量を、免疫ブロッティングによってテストした。可溶性画分からタンパク質が消失する温度範囲から、そのタンパク質の耐熱性を推定することができる。ＥｃＴｙｒＲＳ－ＷＴとＥｃＴｙｒＲＳ－ｐＢｐＡに加えて、高活性の多特異的ＥｃＴｙｒＲＳ変異体（ＥｃＴｙｒＲＳ－Ｐｏｌｙ）もテストした（図１Ａ）。比較のため、ＭｊＴｙｒＲＳ－ＷＴの他に、２つの同等に作製された変異体、すなわちｐＢｐＡ（ＭｊＴｙｒＲＳ－ｐＢｐＡ）に選択的な変異体２４、及びｎｃＡＡ多特異性を示す他の変異体（ＭｊＴｙｒＲＳ－Ｐｏｌｙ）を含めた（図７）２５。これらのタンパク質はすべて、抗ポリヒスチジン抗体を用いたドットブロットアッセイでの検出を容易にするために、Ｎ末端ヘキサヒスチジンタグ（配列ＩＤ番号３）をコードしている。予想通り、ＭｊＴｙｒＲＳは、８０℃まで溶解性を維持し、高い耐熱性を持つことが見出された（図１Ｃ）。一方、ＥｃＴｙｒＲＳは、はるかに安定性が低く、５０℃～６０℃の間で可溶性画分から失われた（図１Ｃ）。これらの値は、これまでに報告された耐熱性測定と一致している２６。遺伝子操作された変異体はすべて、野生型の対応物に比べて安定性が低下していることがわかった。ＭｊＴｙｒＲＳ‐ｐＢｐＡ変異体はその多特異的対応物よりもやや安定性が低かったが、いずれも生理学的温度では可溶性であった。一方、ＥｃＴｙｒＲＳについては、多特異性変異体のみが生理学的温度で可溶性であった。ｐＢｐＡ選択的変異体は、テストした最低温度でも可溶性画分には検出されなかった（図１Ｃ）。これらの観察は、ＥｃＴｙｒＲＳの安定性の低さがその工学的有用性に悪影響を及ぼすという仮説を支持する。ＥｃＴｙｒＲＳ－Ｐｏｌｙなどのその活性部位変異体のいくつかは、生理学的条件下で十分に安定で活性があるが、ＥｃＴｙｒＲＳ－ｐＢｐＡなどのより不安定な変異体は機能できない。
この課題を克服するために、ＥｃＴｙｒＲＳよりも高いエンジニアリング性を持つ可能性のある好熱菌由来のＴｙｒＲＳを適応することが検討された。好熱性細菌Ｇｅｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｔｅａｒｏｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ由来のいくつかのアミノアシル－ｔＲＮＡシンテターゼが精製され、構造的な特徴も明らかにされている２７－２９。この細菌由来のＴｙｒＲＳ（ＧｓＴｙｒＲＳ）は、ＥｃＴｙｒＲＳと相同であるが（図８）、有意に耐熱性が高く、ｎｃＡＡ選択的変異体を作製するための魅力的な足場を提供する２６。ＧｓＴｙｒＲＳの安定性及び活性を、上記のように、ＣＥＴＳＡ及びｓｆＧＦＰ－１５１－ＴＡＧ発現アッセイを用いてテストした（図２Ｂ）。ＧｓＴｙｒＲＳは実際にＥｃＴｙｒＲＳよりも有意に安定であったが、その活性は大腸菌ではやや低かった（図２Ｂ、２Ｃ）。好熱性細菌由来の酵素が、より低い温度でより弱い活性を示すかどうかは、以前から調べられていた３０。
次いで、ＥｃＴｙｒＲＳ及びＧｓＴｙｒＲＳからのキメラを構築し、安定性及び活性の最適なバランスを示した。このようなキメラ酵素は、タンパク質工学のための優れた足場となり得ることが以前から示されている３１，３２。本明細書中に記載されるように、ＤＮＡシャッフリングの技術を使用して、本発明のキメラを産生した。簡単に述べると、ＤＮＡシャッフリングは、遺伝子または相同遺伝子をランダムな断片に消化し、ＰＣＲによってそれらの断片を完全長遺伝子に再構築させることを含む。遺伝子断片は塩基配列の相同性に基づいて互いにプライミングし、ある遺伝子のコピーからの断片が別のコピーからの断片にアニーリングし、テンプレートスイッチ、またはクロスオーバー事象を引き起こすときに組換えが起こる。本明細書に記載されるように、中温性及び好熱性微生物由来のアミノアシル－ｔＲＮＡシンテターゼなどの天然に存在する相同遺伝子が、ハイブリッド型の前駆体ソースとして使用される。遺伝子は、適切な制限酵素を用いて、約１００～３００塩基対の長さの断片に消化／切断され、ランダムなセグメントになる。次いで、オーバーラップしたセグメントとともに適切なＤＮＡポリメラーゼを使用することによって、またはいくつかのバージョンのオーバーラップＰＣＲを使用することによって、セグメントを再構築する（例えば、Ｓｈｅｒｙｌ Ｂ．Ｒｕｂｉｎ－Ｐｉｔｅｌら，Ｂｉｏｐｒｏｃｅｓｓｉｎｇ ｆｏｒ Ｖａｌｕｅ－Ａｄｄｅｄ Ｐｒｏｄｕｃｔｓ ｆｒｏｍ Ｒｅｎｅｗａｂｌｅ Ｒｅｓｏｕｒｃｅｓ，２００７、Ｈ．Ｋａｍａｄａ，Ｓ．－Ｉ．Ｔｓｕｎｏｄａ，Ｂｉｏｍａｔｅｒｉａｌｓ ｆｏｒ Ｃａｎｃｅｒ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ，２０１３、Ｄａｖｉｄ Ｐ．Ｃｌａｒｋ，Ｎａｎｅｔｔｅ Ｊ．Ｐａｚｄｅｒｎｉｋ，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ （Ｓｅｃｏｎｄ Ｅｄｉｔｉｏｎ），２０１６が挙げられる）。次いで、得られたコンストラクトは、公知のプロトコルを使用して配列決定し、所望の特徴について評価することができる。
いくつかのキメラを構築し、ＥｃＴｙｒＲＳとＧｓＴｙｒＲＳとの間でテストし、２つのキメラ、Ｃｈ２ＴｙｒＲＳ及びＣｈ６ＴｙｒＲＳを同定した（図２Ａ）。これらは、ＡＴＭＹ大腸菌で発現させた場合、それらの野生型前駆体と比較して、より高いレベルの活性（図２Ｃ）及び中程度の耐熱性（図２Ｂ）を示す。次に、これらのＴｙｒＲＳ変異体のｐＢｐＡ選択的変異体を作製し、テストした。Ｃｈ２ＴｙｒＲＳ－ｐＢｐＡ及びＣｈ６ＴｙｒＲＳ－ｐＢｐＡは共に、ＥｃＴｙｒＲＳ－ｐＢｐＡよりも耐熱性が高く、生理的温度でも可溶性であった（図３Ａ）。このことは、これらの酵素で観察された有意に高い活性の度合いに反映されている（図３Ｂ）。興味深いことに、ＧｓＴｙｒＲＳが最も熱安定であったにもかかわらず、対応するｐＢｐＡ選択的変異体は大腸菌で発現させると、ほとんど不溶性で活性が低いことがわかった（図３Ａ、３Ｂ）。この観察の理由は不明であるが、キメラは新たなｎｃＡＡ選択的変異体を作製するのにより適している可能性を示している。
これらの作製したペアの活性をＡＴＭＹ大腸菌株で評価したところ、ａａＲＳ／ｔＲＮＡペアの発現レベルなど、アッセイ性能に影響するパラメータを制御するのが極めて容易であることが分かった。真核細胞におけるこれらの新しいツールの有用性を実証するために、ｐＢｐＡ選択的ＴｙｒＲＳ変異体の活性をＨＥＫ２９３Ｔ細胞でテストした。ＥｃＴｙｒＲＳ－ｐＢｐＡ、ＧｓＴｙｒＲＳ－ｐＢｐＡ、Ｃｈ２ＴｙｒＲＳ－ｐＢｐＡ、及びＣｈ６ＴｙｒＲＳ－ｐＢｐＡを、それぞれ、ＵｂｉＣプロモーター下で哺乳動物発現ベクターにクローニングし、該ベクターはｔＲＮＡＴｙｒ
ＣＵＡ発現カセットの１６コピーもコードしている。得られたプラスミドを、ＥＧＦＰ－３９－ＴＡＧレポーターをコードする別のプラスミドと共にＨＥＫ２９３Ｔ細胞に共導入し、そして完全長レポーター発現を、培地中の１ｍＭ ｐＢｐＡの存在下または不存在下でモニターした（図４Ａ、及び図９）。野生型ＥＧＦＰレポーター（インフレームＴＡＧコドンなし）の発現も対照として含めた。４つのＴｙｒＲＳ－ｐＢｐＡ変異体はすべて、レポーターへのｐＢｐＡの組み込みに成功した。しかし、Ｃｈ２ＴｙｒＲＳ－ｐＢｐＡ及びＣｈ６ＴｙｒＲＳ－ｐＢｐＡは、ＥｃＴｙｒＲＳ－ｐＢｐＡ及びＧｓＴｙｒＲＳ－ｐＢｐＡと比較して有意に高い活性（野生型ＥＧＦＰの最大３６％）を示した（図４Ａ）。Ｃｈ２ＴｙｒＲＳ－ｐＢｐＡを用いて発現させたレポータータンパク質を、Ｎｉ－ＮＴＡアフィニティークロマトグラフィーを用いて単離し、ＳＤＳ－ＰＡＧＥ（図１０）及び質量分析（図１１Ａ～Ｂ）によって特徴付けて、ｐＢｐＡ組み込みの成功を確認した。哺乳動物細胞におけるＧｓＴｙｒＲＳ－ｐＢｐＡの活性は、ほぼ不活性であることが判明したＡＴＭＹ大腸菌での評価から予想される活性よりも著しく高いことが判明したのは注目に値する。哺乳動物細胞では、より洗練されたタンパク質フォールディング機構が、ＧｓＴｙｒＲＳ－ｐＢｐＡのような不安定に作製されたタンパク質をよりうまく処理することができる可能がある。また、ＴｙｒＲＳ変異体は大腸菌よりも哺乳動物細胞で強く発現しており、これも観察された差異に寄与している可能性がある。
それにもかかわらず、これらの結果は、キメラＴｙｒＲＳ変異体が真核生物におけるＧＣＥ技術のための改良されたプラットフォームを提供することを実証する。このアプローチの汎用性をさらに強調するために、Ｏ‐メチルチロシン（ＯＭｅＹ）を含むいくつかの異なるｎｃＡＡを荷電させる作製された変異体であるＥｃＴｙｒＲＳ‐Ｐｏｌｙを生成するための既報の活性部位変異を導入することによって、Ｃｈ２ＴｙｒＲＳ－Ｐｏｌｙを構築した（図１Ａ）。ＨＥＫ２９３Ｔ細胞で試験した場合、ＥｃＴｙｒＲＳ－Ｐｏｌｙ及びＣｈ２ＴｙｒＲＳ－Ｐｏｌｙは共に、ＥＧＦＰ－３９－ＴＡＧレポーター発現について同等の活性を示した（図４Ｂ及び図９）。このことは、キメラＴｙｒＲＳが、次善の足場を提供しつつ、細菌工学的に良好に作製されたＥｃＴｙｒＲＳ変異体の活性を再現することができることを確認するものであった。
過去２０年間の研究により、タンパク質の生物物理学的特性がその進化にどのように影響するかについて深い洞察が得られている１８－２１。現在では、実験的あるいは自然な進化の過程で獲得された機能改変変異が、しばしばタンパク質の構造的安定性に負の影響を与えることが明らかになっている。この研究は、目的のｎｃＡＡを選択的に荷電する工学的に作製されたａａＲＳに依存するＧＣＥ技術への影響を強調する。ＭｊＴｙｒＲＳの構造的頑健性が示され、強力なＧＣＥプラットフォームとしてのその目覚しい成功に寄与している。一方、ＥｃＴｙｒＲＳは安定性が低いため、その活性部位を変化させることができない。同じ制限が、ｎｃＡＡ組み込みに適合された中温性生物（例えば、大腸菌または酵母）３，６，３３－３５に由来するいくつかの他のａａＲＳ／ｔＲＮＡペアの技術的可能性に影響をする可能性があることに留意することが重要である。実際、ｎｃＡＡ組み込みのためのこれらのプラットフォームの工学的成功は限定的であった。本明細書中に記載される研究の結果として、好熱性生物由来のより耐熱性のあるａａＲＳホモログを利用することによってこの課題を克服するための戦略が、現在利用可能である。
好熱性及び中温性ａａＲＳホモログから生成されたキメラは、この目的にさらに適している可能性がある。同様の戦略は、チトクロムＰ４５０のような酵素の指向性進化のための最適な出発点を作るために使われてきた３１。本明細書で報告されているような単純なａａＲＳキメラの代わりに、ＥｃＴｙｒＲＳ及びＧｓＴｙｒＲＳのＤＮＡシャッフリングライブラリーを構築し、選択することによって、より優れた特性を持つ高度なキメラを作り出すことが可能である。さらに、本明細書中に示したように、異なる発現系における同じａａＲＳの相対的な性能は異なることがある。例えば、ＧｓＴｙｒＲＳ－ｐＢｐＡ変異体は、大腸菌ではほとんど不溶性で不活性であるが、哺乳動物細胞で強固な活性を示した。これは、宿主細胞の違いによるタンパク質フォールディング機構の違いや、ａａＲＳの発現レベルの違い、翻訳速度、コドンの使い方などの他の要因に起因すると思われる。
以上のことから、ａａＲＳの構造的な頑健性は、ＧＣＥのためのエンジニアリング性に大きく影響する重要な因子であることが立証された。中温性及び好熱性細菌由来のホモログをハイブリダイズさせることによって、より工学的に優れた細菌ａａＲＳ変異体を作製するためのロードマップを提供する。このようなキメラＴｙｒＲＳから作製した変異体は、ＡＴＭＹ大腸菌や哺乳動物細胞の両方で強固な活性を示すことから、これらはより広範なエンジニアリングのための魅力的な足場となることが示唆された容易なＡＴＭＹ大腸菌ベースの選択システムを用いたこれらの指向性進化は、新しい有効なｎｃＡＡへのアクセスを提供するはずである。最後に、ＣｈＴｙｒＲＳ－ｐＢｐＡのｐＢｐＡ組み込み活性の向上は、真核細胞における新しい生体分子間相互作用を明らかにするために、この重要な光架橋ｎｃＡＡの応用をさらに促進するだろう。
さらに詳述することなく、当業者は、上記の説明に基づいて、本発明を最大限に利用することができると考えられる。したがって、以下の具体的な実施形態及び実施例は、単に例示的なものとして解釈されるべきであり、いかなる形でも本開示の残りの部分を限定するものではない。
例
以下の実施例は、本発明の実施形態を例示するために提供されるが、決してその範囲を限定することを意図するものではない。本明細書に記載される例は、例示的なプロトコルとして当業者には理解されるであろう。当業者であれば、これらの手順を適切に、そして必要に応じて改変することができるであろう。
以下の実施例は、本発明の実施形態を例示するために提供されるが、決してその範囲を限定することを意図するものではない。本明細書に記載される例は、例示的なプロトコルとして当業者には理解されるであろう。当業者であれば、これらの手順を適切に、そして必要に応じて改変することができるであろう。
序文
本発明は、野生型対応物よりもＵａａ組み込みのためにより積極的に作製することができる耐熱性細菌由来ＴｙｒＲＳ変異体の組成物を記載する。本発明はＴｙｒＲＳに限定されないが、本発明の一部として記載される、このような活性及び耐熱性変異体を生成する方法はまた、真核細胞におけるＵａａ組み込みのために工学的に設計することができる他のすべての細菌由来ａａＲＳに容易に拡張することが可能である。
本発明は、野生型対応物よりもＵａａ組み込みのためにより積極的に作製することができる耐熱性細菌由来ＴｙｒＲＳ変異体の組成物を記載する。本発明はＴｙｒＲＳに限定されないが、本発明の一部として記載される、このような活性及び耐熱性変異体を生成する方法はまた、真核細胞におけるＵａａ組み込みのために工学的に設計することができる他のすべての細菌由来ａａＲＳに容易に拡張することが可能である。
大腸菌由来ＴｙｒＲＳ（ＥｃＴｙｒＲＳ）を用いた本明細書に記載の研究は、既に開発されている作製された変異体の多くが、細胞内でのフォールディング及び安定性に劣ることが明らかになった。これらの変異体を発現させた後、ウエスタンブロット法でプロテオームの可溶性分画と不溶性分画を分析すると、変異タンパク質の大部分は不溶性であることが明らかになった。さらにＣＥＴＳＡ（Ｃｅｌｌｕｌａｒ Ｔｈｅｒｍａｌ Ｓｔａｂｉｌｉｔｙ Ａｓｓａｙ）を用いた解析の結果、ＥｃＴｙｒＲＳは、細菌に多数のＵａａｓを組み込むことに成功し古細菌由来の対応物ほどには耐熱性がないことが示された。さらに、古細菌ＴｙｒＲＳに由来する変異体もそれらの野生型対応物に比べて安定性に欠けるが、生理学的温度で依然として十分に機能可能であり、Ｕａａ選択的変異体の開発には耐熱性野生型ａａＲＳが重要であることが強調された。
ＥｃＴｙｒＲＳの耐熱性の低さを克服するために、好熱性細菌Ｇｅｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｔｅａｒｏｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ由来の相同ＴｙｒＲＳ（ＧｓＴｙｒＲＳ）を同定し、評価した。ＧｓＴｙｒＲＳはより安定であったが、ＥｃＴｙｒＲＳと比較して有意に低い活性を示した。このことは、酵素の安定性と活性がしばしば負の相関を示すため、予想外ではなかった。
本発明は、耐熱性と活性との間の最適なバランスを示すキメラａａＲＳ変異体を作製する方法を記載する。高活性だが安定性の低いａａＲＳと、安定性の高いａａＲＳ（Ｇｅｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｔｅａｒｏｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓなどの好熱菌由来）の２つのａａＲＳホモログのキメラを生成することにより、そのような最適な特性を示すキメラを作製することが可能である。例えば、ＥｃＴｙｒＲＳとＧｓＴｙｒＲＳとの間のキメラを作製することによって、ＥｃＴｙｒＲＳよりもなお格段に安定でありながら、細菌細胞及び真核細胞の両方においてより高い活性を持つ新規配列が生成された。このようなキメラは、ホモログストレッチ（ｈｏｍｏｌｏｇｏｕｓ ｓｔｒｅｔｃｈｅｓ）の合理的融合によって、または耐熱性ａａＲＳ配列及び活性ａａＲＳ配列のＤＮＡシャッフリングによって生成することができる。
安定性がありながら活性もある細菌ａａＲＳ変異体を作製するための本発明に記載される方法は、任意の１つの特定のａａＲＳに限定されるものではない。同じ戦略を適用して、アラニン、グリシン、セリン、システイン、メチオニン、トリプトファン、フェニルアラニン、ロイシン、イソロイシン、バリン、プロリン、トレオニン、セレノシステイン、リジン、アルギニン、アスパラギン、グルタミン、グルタミン酸、アスパラギン酸、及びヒスチジンを荷電するものを含むがこれらに限定されない任意の他の細菌ａａＲＳの最適なキメラ変異体を生成することができる。
この方法によって生成されたキメラａａＲＳ変異体は、より積極的に作製することで、様々なＵａａｓを選択的に荷電する変異体を作り出すことができる。それらの頑健性の向上により、これらは、より幅広いＵａａ選択的変異体へのアクセスを提供するであろう。非天然アミノ酸に加えて、ａａＲＳ変異体は、ヒドロキシル酸、チオ酸、β－アミノ酸などを含むがこれらに限定されない他の非天然基質を荷電させるために使用することもできる。
これらの作製されたａａＲＳ変異体は、適切な同族ｔＲＮＡ（ナンセンスコドンまたはフレームシフトコドン、あるいは１つまたは複数の非天然核酸塩基からなるコドンを抑制する）とともに、任意の真核細胞に使用することができる。このような発現宿主としては、酵母、昆虫細胞、及び哺乳動物細胞が挙げられるが、これらに限定されるものではない。さらに、これらのａａＲＳ／ｔＲＮＡペアは、工学的ＡＴＭＹ大腸菌株におけるＵａａの組み込みにも使用することができ、そこでは、この細菌ペアが真核または古細菌ペアと機能的に置換されている。本発明は、野生型対応物よりもＵａａ組み込みのためにより積極的に設計され得る耐熱性細菌由来ＴｙｒＲＳ変異体の組成物を記載するものである。本発明はＴｙｒＲＳに限定されるものではない。本発明の一部として記載される、このような活性及び耐熱性変異体を生成する方法はまた、真核細胞におけるＵａａ組み込みのために設計され得る全ての他の細菌由来ａａＲＳに容易に拡張することが可能である。
例１：
材料及び方法
一般資料：
すべてのクローニングとプラスミドの増殖は、ＤＨ１０Ｂ大腸菌細胞で行われた。制限酵素、Ｐｈｕｓｉｏｎ ＨＳ ＩＩ Ｈｉｇｈ－Ｆｉｄｅｌｉｔｙ ＤＮＡポリメラーゼ、及びＩＰＴＧは、Ｆｉｓｈｅｒ社から入手した。Ｔ４ ＤＮＡリガーゼは、Ｅｎｚｙｍａｔｉｃ社から入手した。ＤＮＡ抽出及びＰＣＲクリーンアップを、Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社のＭａｃｈｅｒｅｙ－Ｎａｇｅｌ Ｂｉｎｄｉｎｇ Ｂｕｆｆｅｒ ＮＴＩ及びＥｐｏｃｈミニスピンカラムを用いて行った。培地成分は、Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃから入手した。以下の抗生物質ストック濃度をＬＢ寒天プレート及び培養物に使用した：アンピシリン１００μｇ／ｍＬ、カナマイシン５０μｇ／ｍＬ、スペクチノマイシン１００μｇ／ｍＬ、クロラムフェニコール３５μｇ／ｍＬ。大腸菌のライセートの作成には、Ｃｏｌｅ Ｐａｒｍｅｒ Ｕｌｔｒａｓｏｎｉｃ Ｐｒｏｃｅｓｓｏｒを超音波処理で使用した。タンパク質精製は、ＴｈｅｒｍｏＳｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社のＨｉｓＰｕｒ Ｎｉ－ＮＴＡ樹脂を用いて行った。ドットブロットは、ＧＥヘルスケア社のライフサイエンスニトロセルロースブロッティングメンブレン （０．４５ μｍ）を用いて行った。ウェスタンブロットは、Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社のウェスタンブロット用ＰＶＤＦ膜、抗体、及びＳｕｐｅｒＳｉｇｎａｌ Ｗｅｓｔ Ｄｕｒａ Ｅｘｔｅｎｄｅｄ Ｄｕｒａｔｉｏｎ Ｓｕｂｓｔｒａｔｅを用いて行った。
材料及び方法
一般資料：
すべてのクローニングとプラスミドの増殖は、ＤＨ１０Ｂ大腸菌細胞で行われた。制限酵素、Ｐｈｕｓｉｏｎ ＨＳ ＩＩ Ｈｉｇｈ－Ｆｉｄｅｌｉｔｙ ＤＮＡポリメラーゼ、及びＩＰＴＧは、Ｆｉｓｈｅｒ社から入手した。Ｔ４ ＤＮＡリガーゼは、Ｅｎｚｙｍａｔｉｃ社から入手した。ＤＮＡ抽出及びＰＣＲクリーンアップを、Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社のＭａｃｈｅｒｅｙ－Ｎａｇｅｌ Ｂｉｎｄｉｎｇ Ｂｕｆｆｅｒ ＮＴＩ及びＥｐｏｃｈミニスピンカラムを用いて行った。培地成分は、Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃから入手した。以下の抗生物質ストック濃度をＬＢ寒天プレート及び培養物に使用した：アンピシリン１００μｇ／ｍＬ、カナマイシン５０μｇ／ｍＬ、スペクチノマイシン１００μｇ／ｍＬ、クロラムフェニコール３５μｇ／ｍＬ。大腸菌のライセートの作成には、Ｃｏｌｅ Ｐａｒｍｅｒ Ｕｌｔｒａｓｏｎｉｃ Ｐｒｏｃｅｓｓｏｒを超音波処理で使用した。タンパク質精製は、ＴｈｅｒｍｏＳｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社のＨｉｓＰｕｒ Ｎｉ－ＮＴＡ樹脂を用いて行った。ドットブロットは、ＧＥヘルスケア社のライフサイエンスニトロセルロースブロッティングメンブレン （０．４５ μｍ）を用いて行った。ウェスタンブロットは、Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社のウェスタンブロット用ＰＶＤＦ膜、抗体、及びＳｕｐｅｒＳｉｇｎａｌ Ｗｅｓｔ Ｄｕｒａ Ｅｘｔｅｎｄｅｄ Ｄｕｒａｔｉｏｎ Ｓｕｂｓｔｒａｔｅを用いて行った。
アクセッションコード：
大腸菌のチロシルｔＲＮＡシンテターゼ（ＥｃＴｙｒＲＳ、ＮＣＢＩ ＢＡＡ１５３９８．２）
Ｇ．ｓｔｅａｒｏｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓチロシル－ｔＲＮＡシンテターゼ（ＧｓＴｙｒＲＳ、ＮＣＢＩ ＫＯＲ９２５２８．１）
大腸菌のチロシルｔＲＮＡシンテターゼ（ＥｃＴｙｒＲＳ、ＮＣＢＩ ＢＡＡ１５３９８．２）
Ｇ．ｓｔｅａｒｏｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓチロシル－ｔＲＮＡシンテターゼ（ＧｓＴｙｒＲＳ、ＮＣＢＩ ＫＯＲ９２５２８．１）
細菌株とウイルス株
化学物質、ペプチド、組み換えタンパク質
実験モデル：細胞株
ｓｆＧＦＰ及びＥＧＦＰへのｎｃＡＡ組み込み用ａａＲＳ発現プラスミドの構築：Ｇ．ｓｔｅａｒｏｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓチロシル－ａａＲＳをＩＤＴから購入したｇＢｌｏｃｋからＰＣＲ増幅し、ＮｄｅＩ／ＮｃｏＩで消化し、ｐＢＫベクターバックボーンに挿入した。次いで、変異体Ｇ．ｓｔｅａｒｏｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓチロシル‐ａａＲＳ変異体を、適切な活性部位残基の標準部位特異的変異誘発を介して生成した。ｐＢＫ大腸菌チロシル－ａａＲＳ野生型及び変異体は既報の通りである３６，３７。
大腸菌チロシル－ａａＲＳのＮ末端及びＧ．ｓｔｅａｒｏｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓのＣ末端をＰＣＲで増幅し、キメラＨ２及びＨ６ ａａＲＳ´を構築した。次いで、インサートをオーバーラップ増幅によって作成し、ＮｄｅＩ／ＮｃｏＩで消化し、ｐＢＫベクターバックボーンに挿入した。次いで、標準的な部位特異的変異導入によって変異体キメラａａＲＳを作製しした３８。
哺乳動物細胞におけるａａＲＳの発現のために、末端プライマーを用いて、それぞれのｐＢＫプラスミドからａａＲＳ´をＰＣＲ増幅した。これに続いて、ＰＣＲ産物をＮｈｅＩ／ＸｈｏＩで消化し、ｐＢ１Ｕベクターバックボーンとした。
ＣＥＴＳＡ用ａａＲＳを発現するためのプラスミドの構築：大腸菌、Ｇ．ｓｔｅａｒｏｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ、およびキメラａａＲＳ´を、それぞれのｐＢＫコンストラクトからＰＣＲ増幅し、ＮｄｅＩ／ＨｉｎｄＩＩＩで消化し、ｐＥＴ２２ｂベクタバックボーンに挿入した。Ｎ末端プライマーは、将来のイメージング用に各ａａＲＳに１０Ｘ－ヒスチジンタグ（配列ＩＤ番号４）を付加した。
ｓｆＧＦＰ＊蛍光分析及び発現：大腸菌発現のために、ｐＢＫ ａａＲＳ及びｐＥｖｏｌ Ｔ５ ＥｃＹ－ＴＡＧ ｓｆＧＦＰ１５１＊レポータープラスミドをＡＴＭＹ６細胞に共形質転換した３６。５ｍＬのオーバーナイト培養液に単一コロニーを接種し、適切な抗生物質を投与した。次いで、一晩のスターター培養物を使用して、抗生物質を補充した２０ｍＬのＬＢ培地培養物に接種した。培養物をＯＤ６００が０．６になるまで増殖させ、次いで、最終濃度１ｍＭのＩＰＴＧ及び適切なｎｃＡＡ（１ｍＭ）誘導し、振盪しながら３０℃で１６時間振盪培養した（２５０ｒｐｍ）。次いで、培養物をスピンダウンし、ＬＢ培地を除去し、細胞を１Ｘ ＰＢＳに再懸濁した。蛍光測定値は、ＳｐｅｃｔｒａＭＡＸ Ｍ５（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｅｖｉｃｅｓ）を用いて９６ウェルプレート中で収集した（ｅｘ＝４８８ｎｍ及びｅｍ＝５３４ｎｍ）。２つの独立した実験の平均値を報告し、エラーバーは標準偏差を表す。
ＥＧＦＰ＊蛍光分析、発現及び精製：蛍光分析のために、ＨＥＫ２９３Ｔ細胞を、トランスフェクションの前日に１２ウェルプレートについて６００，０００細胞／ウェルの密度で播種した。各ウェルのトランスフェクションには、総量１．５μｇのＤＮＡ（２プラスミドの場合は各プラスミドについて０．７５μｇ）＋３．５μＬのＰＥＩ＋１７．５μＬのＤＭＥＭを使用した。蛍光画像及びＥＧＦＰ発現分析を、前述のプロトコルに従って、トランスフェクションの４８時間後に行った３９。蛍光測定値を、ＳｐｅｃｔｒａＭＡＸ Ｍ５（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｅｖｉｃｅｓ）（ｅｘ＝４８８ｎｍ及びｅｍ＝５１０ｎｍ）を用いて９６ウェルプレート中で収集した。４つの独立した実験の平均値が報告され、エラーバーは標準偏差を表す。
１ｎｃＡＡを組み込んだＥＧＦＰタンパク質精製のために、ＨＥＫ２９３Ｔ細胞を、トランスフェクションの２４時間前に１００ｍｍ細胞培養ディッシュに播種した（５００万／ディッシュ）。
ＣＥＴＳＡアッセイ：ａａＲＳ発現については、ＴＯＰ１０大腸菌細胞を単一のｐＥＴ２２ｂ－Ｎ末端－１０Ｘ－ヒスチジンタグ－ａａＲＳプラスミドで形質転換した。一晩の培養物に単一コロニーを接種し、次いで、適切な抗生物質を含む２０ｍｌのＬＢ培地培養物に接種、ＯＤ６００が０．６になるまで増殖させ、振盪しながら３０℃で１５分間ＩＰＴＧ（最終濃度１ｍＭ）で誘導した。次いで、培養物をスピンダウンし、ＬＢ培地を除去し、細胞ペレットを５００μＬの超音波処理用緩衝液（１００ｍＭ ＮａＣｌ、２５ｍＭトリスＨＣｌ、ｐＨ８．０）に再懸濁した。
ライセートの調製は、細胞ペレットを３サイクル凍結融解し、続いて３サイクルの超音波処理（７５％出力、２０パルス）を行い、スピンダウンし、上清を回収した。各上澄みを５０μＬアリコートに分割し、Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ Ｃｅｔｕｓ ＤＮＡ Ｔｈｅｒｍａｌ Ｃｙｃｌｅｒ ４８０で温度を変えながら５分間加熱し、最高速度で１０分間スピンダウンした。次いで、３μＬの上清をニトロセルロース膜上に接種し、既述のプロトコルに従ってウェスタンブロット分析に供した３９。イメージングに使用される抗体には、マウス抗ヒスチジン６Ｘタグ（配列ＩＤ番号３）抗体（１：１０００希釈）、ニワトリの抗マウスＩｇＧ二次抗体－ＨＲＰコンジュゲート（１：５０００希釈）が含まれる。
溶解性ウエスタン：ＤＨ１０Ｂ細胞をｐＥＴ２２ｂ－Ｎ－末端－１０Ｘ－Ｈｉｓ－ａａＲＳプラスミドで形質転換し、５ｍＬの一晩の培養物にスターターコロニーを接種した。次いで、２０ｍｌの培養物を接種し、ＯＤ６００が０．６になるまで増殖させ、３０℃で４時間増殖させ、スピンダウンし、前述のＣＥＴＳＡアッセイと同じプロトコルに従って超音波処理によって溶解した。これを、１２％ＳＤＳ－ＰＡＧＥゲルを用いて分離し、既述のプロトコルに従ってウエスタン用に後処理（ｗｏｒｋｅｄ ｕｐ）した４。このプロトコルに使用した抗体は、ＣＥＴＳＡアッセイに使用したものと同じであった。
プライマー及び他のＤＮＡ配列：
例２
ＤＮＡシャッフリングによるチロシル－ｔＲＮＡシンテターゼ・キメラライブラリーの構築
Ｇ．ｓｔｅａｒｏｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ及び大腸菌ＴｙｒＲＳは、標的配列の上流及び下流約７０ｂｐにアニールする外部プライマーを用いてＰＣＲ増幅される。増幅した標的遺伝子をゲル精製し、等モル比で混合し、ＤＮＡＳｅ Ｉで部分的に消化した。断片化したインサートをゲル精製し、確立された段階的増幅プロトコルに従って再構築した４０。次いで、再構築された製品を、標的配列の上流及び下流約４０ｂｐにアニーリングする第２のプライマーセットでＰＣＲ増幅し、構成的に活性なプロモーターの後ろにあるプラスミドにクローニングした。
ＤＮＡシャッフリングによるチロシル－ｔＲＮＡシンテターゼ・キメラライブラリーの構築
Ｇ．ｓｔｅａｒｏｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ及び大腸菌ＴｙｒＲＳは、標的配列の上流及び下流約７０ｂｐにアニールする外部プライマーを用いてＰＣＲ増幅される。増幅した標的遺伝子をゲル精製し、等モル比で混合し、ＤＮＡＳｅ Ｉで部分的に消化した。断片化したインサートをゲル精製し、確立された段階的増幅プロトコルに従って再構築した４０。次いで、再構築された製品を、標的配列の上流及び下流約４０ｂｐにアニーリングする第２のプライマーセットでＰＣＲ増幅し、構成的に活性なプロモーターの後ろにあるプラスミドにクローニングした。
ＳｔＥＰを介したチロシル－ｔＲＮＡシンテターゼ・キメラライブラリーの構築
Ｇ．ｓｔｅａｒｏｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ及び大腸菌ＴｙｒＲＳは、標的配列の上流及び下流約７０ｂｐにアニールする外部プライマーを用いてＰＣＲ増幅される。増幅した標的遺伝子をゲル精製し、等モル比で混合し、標的配列の上流及び下流約４０ｂｐにアニーリングする第２のプライマーセットを用いてＴａｑポリメラーゼで８０サイクル（５５℃で５秒などの短い低温サイクル）でＰＣＲ増幅した４１。この増幅の間に、配列の短いストレッチが生成され、これは、次のサイクルにおいて異なる鋳型に再アニーリングし得、キメラコンストラクトが得られる。得られたキメラコンストラクトを、構成的に活性なプロモーターの後ろにあるプラスミドにクローニングした。
Ｇ．ｓｔｅａｒｏｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ及び大腸菌ＴｙｒＲＳは、標的配列の上流及び下流約７０ｂｐにアニールする外部プライマーを用いてＰＣＲ増幅される。増幅した標的遺伝子をゲル精製し、等モル比で混合し、標的配列の上流及び下流約４０ｂｐにアニーリングする第２のプライマーセットを用いてＴａｑポリメラーゼで８０サイクル（５５℃で５秒などの短い低温サイクル）でＰＣＲ増幅した４１。この増幅の間に、配列の短いストレッチが生成され、これは、次のサイクルにおいて異なる鋳型に再アニーリングし得、キメラコンストラクトが得られる。得られたキメラコンストラクトを、構成的に活性なプロモーターの後ろにあるプラスミドにクローニングした。
ａａＲＳ－ＧＦＰｍｕｔ３融合蛍光レポーターコンストラクトの構築及び選択
キメラＴｙｒＲＳ変異体のライブラリーは、まず活性について選択される。この選択は、活性型ＴｙｒＲＳ変異体がＴＡＧ不活性化抗生物質耐性遺伝子（アンピシリンやクロラムフェニコールなど）の発現を可能にし、宿主が対応する抗生物質処理に耐えられるようにする能力を用いるものである。次に、活性型キメラＴｙｒＲＳ変異体のライブラリーをＰＣＲ増幅し、オーバーラップエクステンションＰＣＲを用いてＧＦＰレポーター（例えば、ＧＦＰｍｕｔ３レポーター）と融合させた。全長融合インサート４２を、Ｔ５－ｌａｃのような強力で誘導可能なプロモーター下でプラスミドにクローニングした。得られたプラスミドライブラリーを大腸菌細胞に形質転換し、キメラタンパク質を発現させる。安定性の低いものは、融合ＧＦＰを非蛍光性にし、一方、安定な変異体は、ＧＦＰを蛍光に保つ。次いで、ＦＡＣＳ選択を使用して、最も安定かつ活性な変異体を濃縮する。単離された変異体を、それらの安定性及び活性の両方について個別にスクリーニングする。
キメラＴｙｒＲＳ変異体のライブラリーは、まず活性について選択される。この選択は、活性型ＴｙｒＲＳ変異体がＴＡＧ不活性化抗生物質耐性遺伝子（アンピシリンやクロラムフェニコールなど）の発現を可能にし、宿主が対応する抗生物質処理に耐えられるようにする能力を用いるものである。次に、活性型キメラＴｙｒＲＳ変異体のライブラリーをＰＣＲ増幅し、オーバーラップエクステンションＰＣＲを用いてＧＦＰレポーター（例えば、ＧＦＰｍｕｔ３レポーター）と融合させた。全長融合インサート４２を、Ｔ５－ｌａｃのような強力で誘導可能なプロモーター下でプラスミドにクローニングした。得られたプラスミドライブラリーを大腸菌細胞に形質転換し、キメラタンパク質を発現させる。安定性の低いものは、融合ＧＦＰを非蛍光性にし、一方、安定な変異体は、ＧＦＰを蛍光に保つ。次いで、ＦＡＣＳ選択を使用して、最も安定かつ活性な変異体を濃縮する。単離された変異体を、それらの安定性及び活性の両方について個別にスクリーニングする。
参考文献：
以下の参考文献は、その全体が参照により本明細書に組み込まれる。
以下の参考文献は、その全体が参照により本明細書に組み込まれる。
本発明は、特にその好ましい態様に関して、参照して示され、説明されてきたが、添付の特許請求の範囲に包含される本発明の範囲を逸脱することなく、その形態及び詳細における種々の変更がなされ得ることは、当業者によって理解されるであろう。
Claims (44)
- 中温性細菌アミノアシル－ｔＲＮＡシンテターゼの核酸配列由来であって、その耐熱性細菌アミノアシル－ｔＲＮＡシンテターゼホモログの核酸配列とハイブリダイズしたキメラ耐熱性アミノアシル－ｔＲＮＡシンテターゼを含む組成物。
- 中温性細菌アミノアシル－ｔＲＮＡシンテターゼが、野生型アミノアシル－ｔＲＮＡシンテターゼと比較して、その活性部位に、変異型アミノアシル－ｔＲＮＡシンテターゼの基質特異性に変化をもたらす変異を含む、変異型アミノアシル－ｔＲＮＡシンテターゼである、請求項１に記載の組成物。
- 耐熱性細菌が、ゲオバチルス・ステアロサーモフィルス、バチルス・ステアロサーモフィルス、サーマス・サーモフィラス又はサーモアナエロバクター属からなる群より選択される、請求項１に記載の組成物。
- 中温性細菌が、大腸菌、ブドウ球菌属、連鎖球菌属、またはシュードモナス属からなる群から選択される、請求項１に記載の組成物。
- 耐熱性細菌がゲオバチルス・ステアロサーモフィルスであり、中温性細菌が大腸菌である、請求項１に記載の組成物。
- キメラ耐熱性アミノアシル－ｔＲＮＡシンテターゼが、中温性野生型アミノアシル－ｔＲＮＡシンテターゼと比較して耐熱性が向上している、請求項１に記載の組成物。
- キメラ耐熱性アミノアシル－ｔＲＮＡシンテターゼが約６０℃まで可溶性である、請求項６に記載の組成物。
- キメラ熱安定性アミノアシル－ｔＲＮＡシンテターゼが、天然に存在するアミノ酸を有する同族の野生型ｔＲＮＡをアミノアシル化／荷電する、請求項６に記載の組成物。
- キメラアミノアシル－ｔＲＮＡシンテターゼが、それらの個々の野生型前駆体アミノアシル－ｔＲＮＡシンテターゼと比較して、その同族の野生型または非天然アミノ酸を有する変異体ｔＲＮＡをアミノアシル化／電荷させる生物活性を増加させている、請求項１に記載の組成物。
- キメラが、耐熱性細菌アミノアシル－ｔＲＮＡシンテターゼＧＳＴｙｒＲＳ及び中温性細菌アミノアシル－ｔＲＮＡシンテターゼＥｃＴｙｒＲＳを含む、請求項５に記載の組成物。
- キメラが、配列ＩＤ番号１もしくは配列ＩＤ番号４１の核酸配列、または配列ＩＤ番号１もしくは配列ＩＤ番号４１と少なくとも８０％の配列同一性を有する核酸配列を含む、請求項１０に記載の組成物。
- キメラが、配列ＩＤ番号２もしくは配列ＩＤ番号４５の核酸配列、または配列ＩＤ番号２もしくは配列ＩＤ番号４５と少なくとも８０％の配列同一性を有する核酸配列を含む、請求項１０に記載の組成物。
- 前記活性部位における変異が、哺乳動物タンパク質における非天然アミノ酸ｐ－ベンゾイルフェニルアラニン（ｐＢｐＡ）の組み込みをもたらす、請求項２に記載の組成物。
- キメラのアミノ酸配列が、配列ＩＤ番号４３もしくは配列ＩＤ番号４７、または配列ＩＤ番号４３もしくは配列ＩＤ番号４７のいずれかと少なくとも８０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、請求項１３に記載の組成物。
- 前記活性部位における変異が、哺乳動物タンパク質における非天然アミノ酸Ｏ－メチルチロシン（ＯＭｅＹ）の組み込みをもたらす、請求項２に記載の組成物。
- アミノ酸配列が、配列ＩＤ番号４４、または配列ＩＤ番号４４と少なくとも８０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、請求項１５に記載の組成物。
- 請求項１から１６のいずれかに 記載のキメラアミノアシル－ｔＲＮＡシンテターゼ変異体を含む細胞。
- 細胞が真核細胞である、請求項１７に記載の細胞。
- 細胞が、酵母細胞、昆虫細胞または哺乳動物細胞からなる群から選択される、請求項１８に記載の細胞。
- 細胞が細菌細胞である、請求項１７に記載の細胞。
- 細菌細胞が大腸菌の細胞である、請求項２０に記載の細胞。
- 前記大腸菌が、工学的に作製されたＡＴＭ大腸菌株である、請求項２１に記載の細胞。
- キメラ耐熱性アミノアシル－ｔＲＮＡシンテターゼを産生する方法であって、
ａ）中温性微生物における目的のアミノアシル－ｔＲＮＡシンテターゼを同定する工程と、
ｂ）ａ）のアミノアシル－ｔＲＮＡシンテターゼのアミノアシルｔＲＮＡシンテターゼホモログを同定し、ここで、アミノアシル－ｔＲＮＡシンテターゼホモログは、好熱性微生物に由来する工程と、
ｃ）ａ）及びｂ）で同定した熱安定性アミノアシル－ｔＲＮＡシンテターゼ及びアミノアシル－ｔＲＮＡシンテターゼの配列を含むキメラを構築する工程と、
ｄ）キメラの耐熱性及びそれらの同族ｔＲＮＡをアミノアシル化／荷電する生物活性の増大を、ａ）及びｂ）のその個々の野生型前駆体アミノアシル－ｔＲＮＡシンテターゼと比較して評価する工程を含み、それによってキメラ熱安定性アミノアシル－ｔＲＮＡシンテターゼを産生する工程を含む方法。 - 前記ａ）工程における、中温性アミノアシル－ｔＲＮＡシンテターゼが、野生型アミノアシル－ｔＲＮＡシンテターゼと比較して、その活性部位に、変異型アミノアシル－ｔＲＮＡシンテターゼの基質特異性の変化をもたらす変異を含む、変異型アミノアシル－ｔＲＮＡシンテターゼである、請求項２３に記載の方法。
- 変異型アミノアシル－ｔＲＮＡシンテターゼの活性部位変異が、哺乳動物タンパク質における非天然アミノ酸の組み込みをもたらす、請求項２４に記載の方法。
- 細胞中で、タンパク質中の特定の位置に１つ又は複数の非天然アミノ酸を有するタンパク質を産生する方法であって、
ａ．増殖に適した条件下で培養培地中で細胞を培養し、ここで、細胞は、１つ又は複数のアンバーまたはオパールセレクターコドンを有するタンパク質をコードする核酸を含み、さらに、細胞が、セレクターコドンを認識するＥｃ－ｔＲＮＡＵＡＡを含み、ここで、細胞が非天然アミノ酸でＥｃ－ｔＲＮＡＵＡＡを優先的にアミノアシル化するキメラ耐熱性アミノアシル－ｔＲＮＡシンテターゼをさらに含む工程と、
ｂ．細胞培養培地を、セレクターコドンに応じて１つ又は複数の非天然アミノ酸を前記タンパク質に組み込むのに適した条件下で、Ｅｃ－ｔＲＮＡＵＡＡのＵａａに対応する１つ又は複数の非天然アミノ酸アナログと接触させ、それによって、タンパク質の特定の位置に１つ又は複数の非天然アミノ酸を有するタンパク質を産生する工程とを含む方法。 - 前記キメラ耐熱性アミノアシル－ｔＲＮＡシンテターゼが、請求項１～１７のいずれかに記載のキメラを含む、請求項２６に記載の方法。
- 前記キメラが、配列ＩＤ番号１もしくは配列ＩＤ番号４１の核酸配列、または配列ＩＤ番号１もしくは配列ＩＤ番号４１と少なくとも８０％の配列同一性を有する核酸配列を含む、請求項２７に記載の方法。
- 前記キメラが、配列ＩＤ番号２もしくは配列ＩＤ番号４５の核酸配列、または配列ＩＤ番号２もしくは配列ＩＤ番号４５と少なくとも８０％の配列同一性を有する核酸配列を含む、請求項２７に記載の方法。
- 前記タンパク質に組み込まれる非天然アミノ酸が、ｐ－ベンゾイルフェニルアラニン（ｐＢｐＡ）であり、キメラがＣｈ２ＴｒｙＲＳ－ｐＢｐＡまたはＣｈ６ＴｒｙＲＳ－ｐＢｐＡである、請求項２６に記載の方法。
- Ｃｈ２ＴｒｙＲＳ－ｐＢｐＡキメラのアミノ酸配列が、配列ＩＤ番号４３もしくは配列ＩＤ番号４７、または配列ＩＤ番号４３もしくは配列ＩＤ番号４７のいずれかと少なくとも８０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、請求項３０に記載の方法。
- 前記タンパク質に組み込まれる非天然アミノ酸が、非天然アミノ酸Ｏ－メチルチロシン（ＯＭｅＹ）であり、キメラがＣｈ２ＴｙｒＲＳ－ｐｏｌｙである、請求項２６に記載の方法。
- Ｃｈ２ＴｙｒＲＳ－ポリキメラのアミノ酸配列が、配列ＩＤ番号４４、または配列ＩＤ番号４４と少なくとも８０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、請求項３２に記載の方法。
- 細胞が大腸菌細胞または真核細胞である、請求項２６記載の細胞。
- 前記真核細胞が哺乳動物細胞である、請求項３４に記載の細胞。
- 大腸菌が、大腸菌細胞のＡＴＭＹ株である、請求項３４に記載の細胞。
- 細胞内でタンパク質を産生するためのキットであって、ここで、前記タンパク質が、１つ又は複数のｐＢｐＡ残渣を含み、前記キットが
ａ．細胞内の目的の核酸中のアンバーまたはオパールセレクターコドンを認識するＥｃ－ｔＲＮＡｐｂｐａをコードするポリヌクレオチド配列を含む容器と、
ｂ．キメラ熱安定性アミノアシル－ｔＲＮＡシンテターゼＣｈ２ＴｒｙＲＳ－ｐＢｐＡまたはＣｈ６ＴｙｒＲＳ－ｐＢｐＡをコードするポリヌクレオチド配列を含む容器とを含む、キット。 - キメラをコードするポリヌクレオチドが、配列ＩＤ番号４３または配列ＩＤ番号４７を含むキメラのアミノ酸配列、または配列ＩＤ番号４３または配列ＩＤ番号４７のいずれかと少なくとも８０％の配列同一性を有するアミノ酸配列をコードする、請求項３７に記載のキット。
- キットが、１つ又は複数のｐ－ベンゾイルフェニルアラニン分子をさらに含む、請求項３７に記載のキット。
- 前記キットが、前記タンパク質を産生するための説明書をさらに含む、請求項３７に記載のキット。
- 細胞内でタンパク質を産生するためのキットであって、ここで、前記タンパク質が１つ又は複数のＯ－メチルチロシン（ＯＭｅＹ）残渣を含み、キットが、
ａ． 細胞内の目的の核酸中のアンバーまたはオパールセレクターコドンを認識するＥｃ－ｔＲＮＡｐｏｌｙをコードするポリヌクレオチド配列を含む容器と、
ｂ． キメラ熱安定性アミノアシル－ｔＲＮＡシンテターゼＣｈ２ＴｙｒＲＳ－ｐｏｌｙをコードするポリヌクレオチド配列を含む容器とを含む、キット。 - キメラをコードするポリヌクレオチドが、配列ＩＤ番号４４のアミノ酸配列、または配列ＩＤ番号４４と少なくとも８０％の配列同一性を含むアミノ酸配列をコードする、
請求項４１に記載のキット。 - 前記キットが、１つ又は複数のＯ－メチルチロシン（ＯＭｅＹ）分子をさらに含む、請求項４１に記載のキット。
- 前記キットが、前記タンパク質を産生するための説明書をさらに含む、請求項４１に記載のキット。
Applications Claiming Priority (3)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| US201962973599P | 2019-10-15 | 2019-10-15 | |
| US62/973,599 | 2019-10-15 | ||
| PCT/US2020/055834 WO2021076795A1 (en) | 2019-10-15 | 2020-10-15 | Chimeric thermostable aminoacyl-trna synthetase for enhanced unnatural amino acid incorporation |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JP2022552137A true JP2022552137A (ja) | 2022-12-15 |
| JPWO2021076795A5 JPWO2021076795A5 (ja) | 2023-10-12 |
Family
ID=73198471
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP2022520264A Pending JP2022552137A (ja) | 2019-10-15 | 2020-10-15 | 非天然アミノ酸組み込み増強のためのキメラ耐熱性アミノアシルｔＲＮＡシンテターゼ |
Country Status (9)
| Country | Link |
|---|---|
| US (1) | US20230279378A1 (ja) |
| EP (1) | EP4045639A1 (ja) |
| JP (1) | JP2022552137A (ja) |
| KR (1) | KR20220080101A (ja) |
| CN (1) | CN114555645A (ja) |
| AU (1) | AU2020366207A1 (ja) |
| CA (1) | CA3154273A1 (ja) |
| IL (1) | IL292115A (ja) |
| WO (1) | WO2021076795A1 (ja) |
-
2020
- 2020-10-15 JP JP2022520264A patent/JP2022552137A/ja active Pending
- 2020-10-15 KR KR1020227011835A patent/KR20220080101A/ko unknown
- 2020-10-15 EP EP20804057.6A patent/EP4045639A1/en active Pending
- 2020-10-15 CN CN202080071922.5A patent/CN114555645A/zh active Pending
- 2020-10-15 US US17/768,408 patent/US20230279378A1/en active Pending
- 2020-10-15 CA CA3154273A patent/CA3154273A1/en active Pending
- 2020-10-15 AU AU2020366207A patent/AU2020366207A1/en not_active Abandoned
- 2020-10-15 WO PCT/US2020/055834 patent/WO2021076795A1/en unknown
-
2022
- 2022-04-10 IL IL292115A patent/IL292115A/en unknown
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| CN114555645A (zh) | 2022-05-27 |
| AU2020366207A1 (en) | 2022-03-31 |
| CA3154273A1 (en) | 2021-04-22 |
| US20230279378A1 (en) | 2023-09-07 |
| IL292115A (en) | 2022-06-01 |
| EP4045639A1 (en) | 2022-08-24 |
| KR20220080101A (ko) | 2022-06-14 |
| WO2021076795A1 (en) | 2021-04-22 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| US11618892B2 (en) | Mutant reverse transcriptase with increased thermal stability as well as products, methods and uses involving the same | |
| US11319531B2 (en) | Transglutaminase variants | |
| US11104889B2 (en) | Phi29 DNA polymerase mutant having increased thermal stability and use thereof | |
| Endoh et al. | Cell-free protein synthesis at high temperatures using the lysate of a hyperthermophile | |
| CN116096872A (zh) | 热稳定的末端脱氧核苷酸转移酶 | |
| JP7296449B2 (ja) | 変異体ＲｐｏＣコード配列を含む核酸分子 | |
| CN113583989B (zh) | 经修饰的苏氨酸转醛酶及其应用 | |
| US8426572B2 (en) | Artificial entropic bristle domain sequences and their use in recombinant protein production | |
| JP2022547523A (ja) | １０－アセチル－３，７－ジヒドロキシフェノキサジンに対するペルオキシダーゼ活性 | |
| JP2022552137A (ja) | 非天然アミノ酸組み込み増強のためのキメラ耐熱性アミノアシルｔＲＮＡシンテターゼ | |
| JP5305440B2 (ja) | 変異体ＳｅｐＲＳ及びこれを用いるタンパク質への部位特異的ホスホセリン導入法 | |
| JPWO2013129427A1 (ja) | ｃｙｃｌｉｃｄｉ−ＧＭＰの実践的酵素合成法 | |
| Lee et al. | Development of orthogonal aminoacyl tRNA synthetase mutant with enhanced incorporation ability with para-azido-L-phenylalanine | |
| JP2020092615A (ja) | モノアシルグリセロールリパーゼ変異体及びその製造方法 | |
| US20090137004A1 (en) | Artificial entropic bristle domain sequences and their use in recombinant protein production | |
| JP2014207898A (ja) | 放線菌におけるタンパク質生産用ベクター | |
| CN117866923A (zh) | 一种LdCsm突变型复合物、含该突变型复合物的检测系统及其应用 | |
| KR20240034646A (ko) | 다량체 단백질 어셈블리 구조체 제조방법 및 이에 의해 제조된 다량체 단백질 어셈블리 구조체 | |
| JP2020092617A (ja) | モノアシルグリセロールリパーゼ変異体及びその製造方法 | |
| JP2020182427A (ja) | 分子クローニングにおける青白スクリーニングを安価に行えるプラスミドベクター | |
| WO2017132924A1 (zh) | 一种用于生物合成异戊二烯和异戊烯的酶及其突变体 | |
| JP2010183842A (ja) | 新規耐熱性ｄｎａポリメラーゼ | |
| JP2004357634A (ja) | 糖ヌクレオチド合成活性を有する耐熱性酵素および該酵素をコードするｄｎａ |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| A521 | Request for written amendment filed |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523 Effective date: 20231003 |
|
| A621 | Written request for application examination |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A621 Effective date: 20231003 |
|
| A977 | Report on retrieval |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A971007 Effective date: 20240909 |
|
| A131 | Notification of reasons for refusal |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A131 Effective date: 20241001 |