KR20240034646A

KR20240034646A - 다량체 단백질 어셈블리 구조체 제조방법 및 이에 의해 제조된 다량체 단백질 어셈블리 구조체

Info

Publication number: KR20240034646A
Application number: KR1020230107626A
Authority: KR
Inventors: 유태현; 윤형돈; 박예섭
Original assignee: 아주대학교산학협력단
Priority date: 2022-09-06
Filing date: 2023-08-17
Publication date: 2024-03-14
Also published as: WO2024053899A1

Abstract

본 발명은 (a) 제1 목적 단백질을 암호화하는 유전자 및 제1 태그 단백질을 암호화하는 유전자를 포함하는 제1 유전자 구조체, 및 제2 목적 단백질을 암호화하는 유전자, 제2 태그 단백질을 암호화하는 유전자, 제1 리보솜 결합부위, 및 제2 리보솜 결합부위를 포함하는 제2 유전자 구조체가 도입된 재조합 미생물을 배양하여, 제1 목적 단백질 다량체 및 제2 목적 단백질 다량체가 공유결합에 의해 연결된 다량체 단백질 어셈블리 구조체를 생성하는 단계; 및 (b) 상기 생성된 다량체 단백질 어셈블리 구조체를 회수하는 단계를 포함하는 다량체 단백질 어셈블리 구조체의 제조방법에 관한 것이다. 본 발명은 또한 상기 다량체 단백질 어셈블리 구조체의 제조방법에 의해 제조된 다량체 단백질 어셈블리 구조체에 관한 것이다. 본 발명의 다량체 단백질 어셈블리 구조체는 2개의 리보솜 결합 부위를 통한 번역 시작점 조절로 인해 태그 단백질이 융합된 목적 단백질을 포함하는 다량체 단백질들간의 과도한 응집을 예방할 수 있다. 또한 본 발명의 다량체 어셈블리 구조체는 효소간의 효과를 극대화하여 반응에 있어서의 중간체 확산을 억제하고, 목표 생산물의 생성을 증가시킬 수 있다.

Description

다량체 단백질 어셈블리 구조체 제조방법 및 이에 의해 제조된 다량체 단백질 어셈블리 구조체 {Manufacturing method of multimeric protein assembly structure and multimeric protein assembly structure manufactured by the method}

본 발명은 태그(tag)를 포함하는 단백질의 발현을 조절함으로써 다량체 단백질의 과다한 응집을 예방하는 다량체 단백질 어셈블리 구조체 제조방법 및 이에 의해 제조된 다량체 단백질 어셈블리 구조체에 관한 것이다.

세포 내 단백질의 어셈블리를 통한 하나의 복합체(complex) 형성은 자연계에서 널리 사용되는 방법으로서 복합체를 형성해야만 정상적인 기능을 수행하거나 또는 복합체 형성에 의해 질병을 유발하는 등의 생명현상에 영향을 준다, 예를 들어, 바이러스의 껍질 구성 성분인 캡시드(capsid) 또는 치매의 원인으로 알려진 타우(tau) 단백질의 조립 등이 있다. 정교하게 제작되는 다양한 모양 및 기능을 가지는 자연계 단백질의 어셈블리 방법에 대해서 많은 연구가 이루어졌으며, 그 결과 여러가지 방식의 인공 자가조립 단백질 어셈블리 방법이 개발되었다. 상기 조립된 복합체는 높은 생체 친화도로 인하여 생명공학 및 의학분야에서 응용 가능성이 높다.

효소내 특정 기질로부터 생산물이 생성될 때 여러 효소가 동시에 관여하여 반응에 참여한다. 이 반응 과정 중 중간체의 확산 또는 다른 효소에 의한 부반응은 원하는 생산물의 생성에 방해가 될 수 있다. 중간체의 확산의 경우, 중간체의 세포 내 낮은 농도를 초래하고 이는 효소 반응을 느려지게 할 수 있고, 또한 확산된 중간체가 독성을 가질 경우 세포의 사멸 및 효소의 활성을 저해할 수 있다. 다른 효소에 의한 부반응의 경우, 세포 내 존재하는 다양한 효소들은 여러 기질에 반응할 수 있는데, 여러 효소 반응을 거칠 때 생성되는 중간체가 반응과 관련없는 다른 효소에 의해 부반응이 일어나면, 원치 않는 생성물이 만들어져 목표 생산물의 생산에 영향을 줄 수 있다.

자연계에서는 이를 극복하기 위해 반응에 참여하는 효소들이 어셈블리되어 복합체가 형성되도록 한 후 이를 사용하였다. 이는 효소 간 활성 부위(active site)가 가깝게 위치되게 함으로써 효율적인 생산물이 생성될 수 있게 한다. 예를 들어, 피루브산 탈수소 효소 복합체(Pyruvate dehydrogenase complexes, PDCs) 및 셀룰로솜 복합체(Cellulosomal complex) 등이 있다. 상기 복합체에 의한 반응은 효소들의 활성 부위를 가깝게 위치시키기 때문에, 단순히 관련 효소들이 섞여 있는 상태에서 반응하는 것보다 더 빠르게 반응이 일어날 수 있다. 이는 반응 중간체의 확산 이전에 반응이 일어나도록 할 수 있고, 중간체가 독성을 가질 경우 중간체 독성에 의한 세포 사멸을 예방할 수 있으며, 중간체가 다른 효소와 부반응이 일어나지 않게 할 수 있다는 점에서 장점이 있다.

목표 생산물의 생성을 증가시키기 위한 목적으로 인공 효소 복합체에 대한 연구가 진행되었으며, 이를 위해 많은 단백질 쌍들이 연구되었다. 예를 들어, Spytag/Spycatcher가 있다. 펩티드인 Spytag과 단백질인 Spycatcher는 Streptococcus pyogenes 유래 fibronectin-binding protein FbaB의 일부로, 이 단백질 내부에서 자발적으로 공유 결합이 일어나는 것을 이용하여 제작되었다. 그 이외에 비슷한 원리로 Snooptag/Snoopcatcher쌍도 개발되었고, 이 orthogonal한 2개의 단백질 쌍을 이용하여 mevalonate pathway의 3개의 효소를 인공 복합체로 제작하여 Escherichia coli 내에서 5배 증가한 라이코펜(lycopene) 생산량 및 2배 증가한 아스타잔틴(Astaxanthin) 생산량을 확인하였다. cAMP-dependent protein kinase(PKA) 및 A kinase-anchoring proteins(AKAPs)에서 유래된 RIDD, RIAD 펩티드도 인공 효소 복합체 제작에 활용된다. Mevalonate pahtway 및 cartenoid pathway를 이어주는 두 효소에 이 펩티드들을 융합(fusion)하여 복합체를 제작하였고 E. coli 내에서 5.7배 증가한 카로티노이드(carotenoid) 생산량을 확인하였다. 이러한 효소들의 직접적인 어셈블리 복합체 외에도 Tobacco Mosaic Virus(TMV) virus-like particles(VLPs), proliferating cell nuclear antigen(PCNA) proteins 등의 단백질 기반의 스캐폴드(scaffold) 또는 DNA 기반의 스캐폴드를 이용한 인공 효소 복합체 제작을 통해 생산물의 생성을 증가시켰다는 여러 보고가 있다.

이 때, 효소들은 종류에 따라 단량체로 존재하거나 단량체가 합쳐진 다량체로 존재한다. 단량체 효소를 이용한 효소 복합체 제조는 각 효소가 1:1의 비율로 효소 복합체를 형성하기 때문에 효소 복합체 제조 및 이용에 용이하다. 다만, 다량체를 이용한 효소 복합체 제조 시, 다량체를 형성하는 단량체가 모두 어셈블리를 위한 태그를 가지고 있다면 오히려 과도한 효소 간 어셈블리로 인하여 효소 응집이 일어나 효소의 활성이 감소 또는 상실될 수 있다(도 1).

이러한 기술적 배경하에서, 본 발명자들은 2개의 상이한 리보솜 결합부위(ribosome binding site, RBS)를 사용하여, 태그를 포함하는 단백질의 발현을 조절함으로써 태그를 포함하는 효율적인 다량체 단백질 어셈블리 구조체를 제조하였다. 상기 다량체 단백질 어셈블리 구조체를 이용하여 과다한 다량체 단백질의 응집을 예방하고 효소의 활성을 극대화하여 목표 생산물의 생성을 증가시키는 것을 확인함으로써, 본 발명을 완성하였다(도 2).

본 배경기술 부분에 기재된 상기 정보는 오직 본 발명의 배경에 대한 이해를 향상시키기 위한 것이며, 이에 본 발명이 속하는 기술분야에서 통상의 지식을 가지는 자에 있어 이미 알려진 선행기술을 형성하는 정보를 포함하지 않을 수 있다.

본 발명의 목적은 태그를 포함하는 단백질, 특히 효소의 태그 발현의 조절 없이 모든 단량체에 태그가 발현되는 경우, 단백질들의 과도한 어셈블리로 인한 단백질의 활성 감소 또는 활성을 잃은 단백질의 비율 증가를 예방하기 위해, 번역 시작점을 조절하여 효율적인 태그(tag)를 포함하는 단백질의 발현을 조절함으로써 효율적인 다량체 단백질 어셈블리 구조체를 제조하는 방법 및 이에 의해 제조된 다량체 단백질 어셈블리 구조체를 제공하는 것이다.

상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 (a) 제1 목적 단백질을 암호화하는 유전자 및 제1 태그 단백질을 암호화하는 유전자를 포함하는 제1 유전자 구조체, 및 제2 목적 단백질을 암호화하는 유전자, 제2 태그 단백질을 암호화하는 유전자, 제1 리보솜 결합부위, 및 제2 리보솜 결합부위를 포함하는 제2 유전자 구조체가 도입된 재조합 미생물을 배양하여, 제1 목적 단백질 다량체 및 제2 목적 단백질 다량체가 공유결합에 의해 연결된 다량체 단백질 어셈블리 구조체를 생성하는 단계; 및 (b) 상기 생성된 다량체 단백질 어셈블리 구조체를 회수하는 단계를 포함하는 다량체 단백질 어셈블리 구조체의 제조방법을 제공한다.

본 발명은 또한, 상기 방법에 의해 제조된 다량체 단백질 어셈블리 구조체를 제공한다.

본 발명의 다량체 단백질 어셈블리 구조체의 제조방법 및 이에 의해 제조된 다량체 단백질 어셈블리 구조체는 2개의 리보솜 결합 부위를 통한 번역 시작점 조절로 인해 태그 단백질이 융합된 목적 단백질을 포함하는 다량체 단백질들간의 과도한 응집을 예방할 수 있다. 또한 본 발명의 다량체 어셈블리 구조체는 효소간의 효과를 극대화하여 반응에 있어서의 중간체 확산을 억제하고, 목표 생산물의 생성을 증가시킬 수 있다.

도 1은 다량체 단백질 제조시 과도한 응집이 일어날 수 있는 기존 기술의 문제점을 나타낸 개략도이다.
도 2는 태그를 포함하는 단백질의 발현을 조절하는 방법에 관한 개략도이다. 2개의 리보솜 결합부위를 이용하여 단백질 N말단에서 번역 시작점을 조절하여 효율적인 태그를 포함하는 다량체 단백질 어셈블리 구조체를 제조한다.
도 3은 동시 다발적으로 일어나는 효소 반응에서 중간체에 의해 부반응이 일어나거나 원하지 않는 생성물이 생성되어 원하는 생성물의 생산에 영향을 줄 수 있음을 나타내는 개략도이다.
도 4는 효소 복합체에 의한 반응 시 중간체가 다른 효소와 부반응을 일어나지 않게 하여 빠른 반응이 일어날 수 있다는 것을 나타낸 개략도이다.
도 5는 다양한 화합물들을 효율적으로 생성하기 위해 자연적으로 관련 효소들이 복합체를 형성하여 반응에 이용하는 예로서, 피루브산 탈수소 효소 복합체(Pyruvate dehydrogenase complexes, PDCs)가 관련된 반응에 대한 개략도이다.
도 6은 단량체를 이용한 효소 복합체 형성 및 효율적인 태그를 가지는 효소를 이용한 다량체 효소 복합체 형성을 나타낸 것이다.
도 7은 3-하이드록시프로피온산(3-hydroxypropionic acid, 3-HP)의 생성 경로를 나타낸 것이다. Glycerol dehydratase 및 Aldehyde dehydrogenase는 효소이며, 3-hydroxypropionaldehyde(3-HPA)는 독성을 가지는 중간체이다.
도 8은 본 발명의 기술을 이용하여 인공 효소 복합체를 제조함으로써, 중간체인 3-HPA의 확산을 감소시키고 최종적으로 3-HP의 생산량을 증가시킬 수 있음을 예시한 것이다.
도 9는 본 발명의 태그 단백질 쌍의 예시로서 Streptococcus pyogenes 유래 fibronectin-binding protein FbaB를 분리하여 만들어낸 spytag(ST)/spycatcher(SC)의 구조 및 결합 원리, 및 이들의 아미노산 서열 등을 나타낸 것이다(PNAS 2012,　109　(12),　E690-E697 및 PNAS　2019,　116　(52),　26523-26533).
도 10은 첫 번째 효소인 글리세롤 탈수소효소(glycerol dehydratase, GDHt)의 C-말단에 ST, ST3 및 SC3를 융합한 유전자 형태, 두 번째 효소인 알파-케토글루타릭 세미알데히드 탈수소효소(α-ketoglutaric semialdehyde dehydrogenase, KGSADH)의 N-말단에 ST 및 SC3를 융합한 유전자 형태, 및 이들의 효소 정제 결과를 나타낸 것이다.
도 11은 태그를 포함하는 효소와 태그를 포함하지 않는 효소의 활성을 비교한 결과 및 효소 간 ST/SC 결합을 측정한 결과를 나타낸 것이다.
도 12는 글리세롤과 2개의 효소 GDHt 및 KGSADH를 넣어 3-HP가 생성될 때, 함께 생성되는 NADH에 의한 변화량을 340nm의 흡광도를 통하여 관찰한 결과를 나타낸 것이다.
도 13은 용해도 향상 태그 후보 5가지(ubiquitin, Z domain, CMB66, Trx, Fh8)를 KGSADH 구조체(ST-K)에 추가적으로 융합시킨 구조체 모식도 및 기존 구조체와 용해도를 비교한 결과를 나타낸 것이다.
도 14는 용해도 향상 태그 Z-domain의 유무에 따른 ST-K 효소의 활성 및 효소 간 ST/SC 결합을 측정한 결과를 나타낸 것이다.
도 15는 단백질 발현시 사용하는 inducer인 IPTG의 농도를 기존 조건인 0.1mM에서 0.01mM으로 낮추어 발현한 뒤 3-HP 생산량을 분석한 결과를 나타낸 것이다.
도 16은 3-HP 생산 시 발현되는 2개의 효소(첫 번째 효소는 IPTG inducible, 두 번째 효소는 arabinose inducible)를 서로 다른 inducer에 의해 발현되도록 분리한 뒤 각각의 inducer 농도를 조절하여 3-HP 생산을 분석한 결과를 나타낸 것이다.

다른 식으로 정의되지 않는 한, 본 명세서에서 사용된 모든 기술적 및 과학적 용어들은 본 발명이 속하는 기술분야에서 숙련된 전문가에 의해서 통상적으로 이해되는 것과 동일한 의미를 갖는다. 일반적으로 본 명세서에서 사용된 명명법은 본 기술분야에서 잘 알려져 있고 통상적으로 사용되는 것이다.

효소들은 종류에 따라 단량체로 존재하거나 단량체가 합쳐진 다량체로 존재한다. 단량체 효소를 이용한 효소 복합체 제조는 각 효소가 1:1의 비율로 효소 복합체를 형성하므로 제조 및 이용에 용이하나, 다량체를 형성하는 단량체가 모두 어셈블리를 위한 태그를 가지고 있다면 오히려 과도한 효소 간 어셈블리로 인하여 효소 응집이 일어나 효소의 활성이 감소 또는 상실될 수 있다(도 1). 또한, 효소 반응은 동시 다발적으로 일어나며 중간체에 의해 부반응이 일어나거나 원하지 않는 생성물이 생성되어 원하는 생성물의 생산에 영향을 줄 수 있다(도 3).

이에, 본 발명자들은 2개의 상이한 리보솜 결합부위(ribosome binding site, RBS)를 사용하여, 태그를 포함하는 단백질의 발현을 조절함으로써 태그를 포함하는 효율적인 다량체 단백질 어셈블리 구조체를 제조하였다. 상기 다량체 단백질 어셈블리 구조체를 이용하여 과다한 다량체 단백질의 응집을 예방하고, 효소 반응에 있어서 중간체에 의한 부반응을 최소화하여 목표 생산물의 생성을 증가시키는 것을 확인하였다(도 2).

본 발명의 다량체 단백질 어셈블리 구조체는 효소들의 활성부위를 가깝게 위치시켜 반응시 중간체가 다른 효소와 부반응을 일어나지 않게 하여 빠른 반응이 일어날 수 있도록 하고 중간체의 확산을 최소화하여 목표 생산물의 생성을 증가시킬 수 있다(도 4 및 도 8).

따라서, 본 발명은 일 관점에서, (a) 제1 목적 단백질을 암호화하는 유전자 및 제1 태그 단백질을 암호화하는 유전자를 포함하는 제1 유전자 구조체, 및 제2 목적 단백질을 암호화하는 유전자, 제2 태그 단백질을 암호화하는 유전자, 제1 리보솜 결합부위, 및 제2 리보솜 결합부위를 포함하는 제2 유전자 구조체가 도입된 재조합 미생물을 배양하여, 제1 목적 단백질 다량체 및 제2 목적 단백질 다량체가 공유결합에 의해 연결된 다량체 단백질 어셈블리 구조체를 생성하는 단계 및 (b) 상기 생성된 다량체 단백질 어셈블리 구조체를 회수하는 단계를 포함하는 다량체 단백질 어셈블리 구조체의 제조방법에 관한 것이다.

본 발명은 다른 관점에서, 상기 다량체 단백질 어셈블리 구조체의 제조방법에 의해 제조된 다량체 단백질 어셈블리 구조체에 관한 것이다.

본 발명에 있어서, 상기 제2 목적 단백질 다량체 1개당 연결되는 제1 목적 단백질 다량체는 1개 내지 4개인 것을 특징으로 할 수 있다.

본 발명에 있어서, 상기 제2 유전자 구조체는 제1 리보솜 결합부위, 제2 태그 단백질을 암호화하는 유전자, 제2 리보솜 결합부위 및 제2 목적 단백질을 암호화하는 유전자를 순차적으로 포함하는 것을 특징으로 할 수 있다.

본 발명에 있어서, 상기 제2 유전자 구조체는 제3 태그 단백질을 암호화하는 유전자를 추가적으로 포함하는 것을 특징으로 할 수 있다.

본 발명에 있어서, 상기 제2 유전자 구조체는 제1 리보솜 결합부위, 제3 태그 단백질을 암호화하는 유전자, 제2 태그 단백질을 암호화하는 유전자, 제2 리보솜 결합부위 및 제2 목적 단백질을 암호화하는 유전자를 순차적으로 포함하고, 상기 제3 태그는 Z-domain인 것을 특징으로 할 수 있다.

본 발명에 있어서, 상기 목적 단백질은 효소인 것을 특징으로 할 수 있다.

본 발명에 있어서, 제1 목적 단백질은 글리세롤 탈수소효소(glycerol dehydratase, GDHt)이고, 제2 목적 단백질은 알파-케토글루타릭 세미알데히드 탈수소효소(α-ketoglutaric semialdehyde dehydrogenase, KGSADH)인 것을 특징으로 할 수 있다.

본 발명에 있어서, 상기 제1 태그 및 상기 제2 태그는 각각 Spytag(ST) 및 Spycathcer003(SC3), 또는 각각 Spycathcer003(SC3) 및 Spytag(ST)인 것을 특징으로 할 수 있다.

본 발명에 있어서, 상기 공유결합은 이소펩티드결합(isopeptide bond)인 것을 특징으로 할 수 있다.

본 발명에 있어서, 상기 태그 단백질이 융합된 목적 단백질 발현은 번역 시작 지점의 조절에 의해 수행될 수 있다.

도 2에 도시된 바와 같이, 상기 번역 시작 지점은 2개의 리보솜 결합부위를 이용하여 수행될 수 있다. 구체적으로 2개의 리보솜 결합부위를 이용한다는 것은 예를 들어, 리보솜 결합부위 서열을 변경하는 것을 의미한다. 예를 들어, UTR designer와 같은 oline tool은 리보솜 결합부위가 특정서열을 가질 때 단백질의 발현양을 예측해 준다. 이를 통해, 유전자 구조체의 2개의 리보솜 결합부위 서열을 변경하여 리보솜 결합부위 세기의 강도를 조절함으로써, 번역이 시작되는 것을 조절할 수 있다. 따라서, 본 발명의 유전자 구조체에서 목적 단백질만 발현시키거나 태그 단백질까지 발현시켜 목적 단백질 및/또는 태그 단백질이 융합된 목적 단백질을 통해 목적 단백질 다량체를 합성할 수 있다.

본 발명에 있어서 또한, 상기 다량체 단백질 어셈블리 구조체의 제조방법은 상기 2개의 리보솜 결합부위에 무작위적으로 변이(mutation)를 유발하여 라이브러리를 제작하고 이를 스크리닝 또는 셀렉션하는 단계; 및 효율적인 태그 단백질을 포함하는 목적 단백질 및 태그 단백질 어셈블리를 제조할 때의 리보솜 결합부위를 찾는 단계를 추가로 포함하는 것을 특징으로 할 수 있다.

본 발명에 있어서, 상기 번역 시작 지점의 조절은 단백질 N-말단에서 이루어지는 것을 특징으로 할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.

상기 번역 시작 지점의 조절은 태그 단백질을 발현하는 핵산서열의 양 옆에 존재하는 2개의 리보솜 결합부위를 이용하여 수행될 수 있다. mRNA와 같은 단일-가닥 RNA는 그 자체로 특정 구조를 형성할 수 있기 때문에, 리보솜 결합부위와 그 주변의 핵산서열에 따라 mRNA의 특정 구조가 변형될 수 있고, 이에 따라 리보솜이 결합할 수 있는 세기가 달라질 수 있다. 예를 들어, 비번역부위(untranslated region, UTR) designer를 이용하여 2개의 리보솜 결합부위의 주변 핵산서열을 조절함으로써 상기 목적 단백질의 태그 개수를 조절할 수 있고, 이 때 5'-UTR 서열, 단백질 코딩 서열, 16s rRNA 서열 등을 조절함으로써 상기 목적 단백질의 태그 개수를 조절할 수 있다(https://sbi.postech.ac.kr/utr_designer/).

상기 번역 시작 지점의 조절은 또한 2개의 리보솜 결합부위의 주변 핵산서열을 랜덤화하여 라이브러리를 제작한 후, 다량체 단백질 어셈블리 구조체로 단백질 발현이 증가한 균주를 선별하는 selection 방법을 통해, 리보솜 결합부위의 적절한 조합을 찾는 연구로도 조절할 수 있다. 이 때, 리보솜 결합부위에 따른 단백질 발현 증가는, 단백질을 세포 내에서 발현하여 SDS-PAGE를 통해, 태그가 달린 단백질과 태그가 없는 단백질의 밴드 위치가 다른 점을 이용하여, 밴드의 강도를 측정함으로써 정성적으로 분석할 수 있다.

본 발명의 용어 "목적 단백질(target protein)" 또는 "외래 단백질(heterologous protein)"은 업자가 대량으로 생산하고자 하는 단백질로서, 재조합 벡터에 상기 단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 삽입하여 형질전환체에서 발현이 가능한 모든 단백질을 의미한다.

본 발명에 있어서, 상기 목적 단백질은 항원, 항체, 세포수용체, 효소 단백질, 구조 단백질, 혈청 및 세포 단백질로 구성된 군에서 선택되는 1종 이상인 것일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.

본 발명에 있어서, 상기 목적 단백질은 글리세롤 탈수소효소(glycerol dehydratase, GDHt) 및/또는 알파-케토글루타릭 세미알데히드 탈수소효소(α-ketoglutaric semialdehyde dehydrogenase, KGSADH)을 포함할 수 있으나, 이에 제한된 것은 아니다.

본 발명에 있어서, “글리세롤 탈수소효소(glycerol dehydratase, GDHt)”는 글리세롤로부터 3-하이드록시프로피온알데하이드(3-hydroxypropionaldehyde, 3-HPA)라는 중간체를 생성하는 반응을 촉매하는 산화환원효소의 일종이다. 이 때, 중간체인 3-HPA의 축적이 보다 더 많은 3-HP 생산에 큰 방해요소 중 하나로 알려져 있다.

본 발명에 있어서, “알파-케토글루타릭 세미알데히드 탈수소효소(α-ketoglutaric semialdehyde dehydrogenase, KGSADH)”는 3-HPA를 3-하이드록시프로피온산(3-hydroxypropionic acid, 3-HP)으로 전환하는 반응을 촉매하는 산화환원효소의 일종으로, 3-HP가 생성될 때 NADH도 함께 생성된다.

3-HP는 여러 화학공정에 사용되는 아크릴산, 아크릴아마이드, 1,3-프로판디올, 말로닉산 등을 생산하는데 원료로 사용되고, 생분해성 고분자 합성에도 사용된다. 글리세롤을 이용한 3-HP의 생물학적 생산은 여러 가지 박테리아에 3-HP 생산 경로에 필요한 주요 효소들의 유전자 조작을 통해 성공적으로 이루어지고 있으나, 3-HP 생산량을 더욱 증가시키는 데에 어려움이 있었다. 특히, 3-HP 생산을 위한 발효 시간이 지속됨에 따라 GDHt 및 KGSADH 등과 같은 효소들이 불안정해지거나 활성을 잃어버리고, GDHt가 3-HPA와 함께 존재할 때 3-HPA의 농도에 따라 그 활성이 감소하는 문제점들이 관찰되고 있다.

본 발명에 있어서, 단백질 발현시 유도물질(inducer)이 사용될 수 있다. “유도물질(inducer)”은 단백질의 발현량을 높일 수 있는 것이라면 어느 것이나 가능하며, IPTG, arabinose, anhydrotetracycline(ATC), 및 doxycycline(DOX)로 구성된 군에서 선택될 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.

본 발명에 있어서, 유도물질(inducer)의 농도는 1mM 이하, 0.1mM 이하, 0.01mM 이하 또는 0.001mM 이하일 수 있고, 1% 이하, 0.1% 이하, 0.01% 이하, 또는 0.001% 이하일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.

본 발명의 용어, "태그(tag) 단백질"은 재조합 단백질에 유전적으로 이식된 펩티드 서열을 의미한다. 태그는 다양한 목적으로 단백질에 부착된다. 일반적으로 태그 단백질은 발현된 단백질의 검출 및 정제를 용이하게 하기 위해 단백질에 부착된다. 또한, 관심 단백질과 다른 단백질의 융합을 구축하는데 사용할 수도 있다. 본 발명에서는 다량체 단백질 어셈블리 구조체 또는 효소 어셈블리 구조체 형성시 태그 단백질이 융합된 목적 단백질 형태로 사용될 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.

본 발명에 있어서, 상기 태그 단백질은 Spytag/Spycatcher, Snooptag/Snoopcatcher, 및 RIDD/RIAD peptide로 구성된 군에서 선택될 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.

본 발명에 있어서, 상기 태그 단백질은 상기 목적 단백질의 N-말단에 연결된 것일 수 있으나, 이제 제한되는 것은 아니다.

본 발명에 있어서, “제3 태그 단백질”은 효소의 용해도 개선을 위해 상기 유전자 구조체에 추가적으로 융합될 수 있고, ubiquitin, Z-domain, CMB66, Trx, Fh8, MBP, NusA, SUMO, GST, SET, GB1, HaloTag, SNUT, Skp, T7PK, EspA, Mocr, Ecotin, CaBP, ArsC 및 IF2-domain I로 구성된 군에서 선택될 수 있으며, 바람직하게는 Z-domain일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.

본 발명에 있어서, 상기 GDHt는 서열번호 1 또는 3의 아미노산 서열을 포함하는 것을 특징으로 할 수 있다.

본 발명에 있어서 또한, 상기 GDHt를 암호화하는 핵산서열은 서열번호 2 또는 4의 염기서열을 포함하는 것을 특징으로 할 수 있다.

본 발명에 있어서, 상기 KGSADH에 Spytag(ST) 및 Z-domain이 추가로 융합된 구조체(Z-ST-K)는 서열번호 5의 아미노산 서열을 포함하는 아미노산 서열을 발현하는 것을 특징으로 할 수 있다.

본 발명에 있어서 또한, 상기 KGSADH에 Spytag(ST) 및 Z-domain이 추가로 융합된 구조체(Z-ST-K)의 핵산서열은 서열번호 6의 염기서열을 포함하는 것을 특징으로 할 수 있다.

본 발명에 있어서, 상기 태그 단백질은 서열번호 7, 8, 9 또는 10의 아미노산 서열을 포함하는 것을 특징으로 할 수 있다.

본 발명에 있어서 또한, 상기 태그 단백질을 암호화하는 핵산서열은 서열번호 11, 12, 13 또는 14의 염기서열을 포함하는 것을 특징으로 할 수 있다.

본 발명에 따른 서열은 하기 표 1에 기재된 바와 같다.

상기 번역 시작 지점의 조절은 태그 단백질을 발현하는 KGSADH 유전자 구조체의 핵산서열의 양 옆에 존재하는 2개의 리보솜 결합부위를 이용하여 수행될 수 있다. 구체적으로, KGSADH 유전자 구조체의 RBS1 및 RBS2의 5'-UTR의 구체적인 서열 및 예측 발현량은 하기 [표 2]를 참조한다.

본 발명의 용어 "유전자 구조체(gene construct)"는 세포에 도입하기 위해 제조된 재조합 DNA로 구조체는 일괄적으로 여러 유전자(기능유전자, 표지유전자, 적절한 조절유전자)를 포함하며 일반적으로 GMO 생산에 사용되는 DNA 단위로 원하는 유전자의 전달이나 발현에 필요한 기능적 단위를 의미한다.

본 발명에 있어서, 목적 단백질을 암호화하는 유전자 및 태그 단백질을 암호화하는 유전자는 직접 또는 링커를 통해 연결되는 것을 특징으로 할 수 있다.

본 발명의 용어 "번역(translation)"은 mRNA에 리보솜 복합체가 결합하여 5'에서 3' 방향으로 단백질을 합성하는 것을 의미한다. 리보솜의 A site에 정지코돈이 위치하면 방출인자(release factor)가 결합하고 리보솜 복합체가 방출되어 번역이 종결한다.

본 발명의 용어 "다량체(multimer)"는 두개 이상의 폴리펩타이드 단위체가 모여서 이루어진 단백질 분자를 의미한다. 본 발명에 있어서, "다량체 단백질(multimeric protein)"은 2개 이상의 다른 단백질 분자가 모여서 특정한 작용을 하는 단백질 분자를 의미한다.

본 발명에서 용어 "리보솜 결합부위(Ribosome binding site, RBS)"란, 단백질이 생합성을 개시할 때, DNA로부터 전사된 mRNA가 숙주세포내에서 리보솜과 결합할 수 있도록 하는 리보솜 결합부위를 의미한다. 원핵생물에서는 샤인-달가노(Shine-Dalgarno) 서열이라고 한다. 일반적으로 시작 코돈 AUG의 8염기 앞쪽에 위치한다. 이 RNA 배열은 리보솜을 mRNA로 끌어들여 시작 코돈 위치에 리보솜을 배열하여 단백질 합성이 시작하는 것을 돕는다. 진핵생물의 경우 mRNA의 5'cap 부분에 리보솜이 결합하고 시작 코돈을 만날 때까지 5'에서 3'으로 스캔한다. 시작 코돈을 만난 후 번역이 시작된다.

본 발명의 용어 "어셈블리(assembly)"는 각각의 성분들이 자발적으로 또는 특정 결합에 의하여 일정한 구조를 이루는 것을 의미한다. 본 발명에 있어서, "단백질 어셈블리"는 2개 이상의 단백질이 결합하여 일정한 구조를 이루는 것을 의미한다. 본 발명에 있어서, 어셈블리는 복합체(complex) 또는 융합(fusion)과 상호교환적으로 사용될 수 있다.

본 발명의 용어 "복합체(complex)"는 두 가지 이상의 물체가 모여서 된 물체를 의미하는 것으로 본 발명에서 "단백질 복합체"는 두 가지 이상의 단백질이 모여 기능의 다양성을 가질 수 있는 단백질 집합을 의미할 수 있으며, 이 복합체를 이루는 단백질 분자 하나를 "서브유닛(subunit)"이리고 부른다. 본 발명의 용어 "융합(fusion)"은 다른 종류의 것이 한 가지 상태로 결합하는 것을 의미한다.

본 발명에서 "단백질 융합(protein fusion)" 또는 "융합 단백질(fusion protein)"은 목적 단백질과 태그 단백질이 결합되어 있는 형태의 단백질을 의미한다. 구체적으로, 본 발명은 당업자가 원하는 모든 단백질에 적용 가능하며, 특히, 의료, 연구용 및 산업용 단백질, 예를 들어, 항원, 항체, 세포수용체, 효소, 구조 단백질, 혈청, 세포 단백질로 이루어진 군으로부터 선택되는 생물학적 활성을 갖는 다양한 목적 단백질을 재조합 단백질 형태로 발현할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.

본 발명에 있어서, 상기 (a)단계는 상기 제1 유전자 구조체 및 제2 유전자 구조체가 도입된 재조합 미생물 또는 숙주세포를 배양하는 것을 특징으로 할 수 있다.

본 발명에 있어서, 상기 유전자 구조체는 재조합 미생물 또는 숙주세포의 염색체 내에 삽입되어 있는 것을 특징으로 할 수 있고, 또는 상기 유전자 구조체가 작동 가능하도록 연결된 재조합 벡터는 재조합 미생물 또는 숙주세포에 삽입되어 있는 것을 특징으로 할 수 있다.

본 발명이 속하는 기술분야의 당업자에게 있어 상기 유전자 구조체를 재조합 미생물 또는 숙주세포의 게놈 염색체에 삽입하여서도 상기 벡터를 재조합 미생물 또는 숙주세포에 도입한 경우와 동일한 효과를 가질 것은 자명하다 할 것이다.

본 발명에 있어서, 상기 유전자 구조체를 재조합 미생물 또는 숙주세포의 염색체상에 삽입하는 방법으로는 통상적으로 알려진 유전자 조작방법을 사용할 수 있으며, 예를 들어, 레트로바이러스 벡터, 아데노바이러스 벡터, 아데노-연관 바이러스 벡터, 헤르페스 심플렉스 바이러스 벡터, 폭스바이러스 벡터, 렌티바이러스 벡터 또는 비바이러스성 벡터를 이용하는 방법으로 숙주세포의 염색체상에 삽입할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.

본 발명에 있어서, 상기 숙주세포는 대장균 (Escherichia coli), 고초균 (Bacillussubtillis) 등과 같은 원핵세포가 널리 이용되어 왔다. 상기한 원핵세포 뿐만 아니라, 단백질의 번역 후 수식(post-translational modification), 분비과정 및 활성형의 3차원 구조, 단백질의 활성상태의 문제점들을 해결하기 위해 최근 단세포 진핵세포인 효모 계열(Pichia pastoris, Saccharomyces cerevisiae, Hansenulapolymorpha 등), 사상성 진균류 (filamentous fungi), 곤충세포 (insect cells), 식물세포, 포유동물세포(mammalian cells) 등 고등생물에 이르기까지 재조합 단백질 생산의 숙주세포로 활용하고 있으므로, 대장균 또는 재조합 미생물뿐만 아니라 다른 숙주세포를 이용하는 것은 당업계의 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 용이하게 적용 가능하다. 예를 들어, CHO 세포주, HEK 세포주 등이 발현을 위한 숙주세포로 사용될수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.

본 발명에 있어서, 상기 재조합 미생물은 대장균, 리조비움 (Rhizobium), 비피도박테리움 (Bifidobacterium), 로도코커스 (Rhodococcus), 칸디다(Candida), 에르위니아 (Erwinia), 엔테로박터 (Enterobacter), 파스테렐라 (Pasteurella), 맨하이미아(Mannheimia), 액티노바실러스 (Actinobacillus), 아그레가티박터 (Aggregatibacter), 잔토모나스(Xanthomonas), 비브리오 (Vibrio), 슈도모나스 (Pseudomonas), 아조토박터 (Azotobacter), 애시네토박터(Acinetobacter), 랄스토니아 (Ralstonia), 아그로박테리움 (Agrobacterium), 로도박터 (Rhodobacter), 자이모모나스 (Zymomonas), 바실러스 (Bacillus), 스테필로코커스 (Staphylococcus), 락토코커스 (Lactococcus), 스트렙토코커스 (Streptococcus), 락토바실러스 (Lactobacillus), 클로스트리디움 (Clostridium), 코리네박테리움 (Corynebacterium), 스트렙토마이세스 (Streptomyces), 비피도박테리움 (Bifidobacterium), 사이아노박테리움 (Cyanobacterium) 및 사이클로박테리움 (Cyclobacterium)으로 구성된 군에서 선택되는 것을 특징으로 할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.

본 발명의 용어 "미생물(microorganism)"은 아주 작아 육안으로 관찰할 수 없는 생물을 의미한다. 미생물은 단세포이거나 다세포라 할지라도 세포간의 형태적, 기능적 분화가 되어 있지 않아 단세포로도 독립적으로 살아갈 수 있는 생물을 의미한다. 본 발명에서 "재조합 미생물"은 다량제 단백질 복합체를 제조하기 위해 상기 유전자 구조체 또는 유전자 구조체를 포함하는 벡터가 도입된 미생물을 의미한다.

본 발명에 있어서, 상기 재조합 벡터는 제1 목적 단백질 다량체를 합성하기 위해 제1 유전자 구조체가 작동 가능하도록 연결된 재조합 벡터 및/또는 제2 목적 단백질 다량체를 합성하기 위해 제2 유전자 구조체가 작동 가능하도록 연결된 재조합 벡터일 수 있다.

본 발명의 용어 "벡터(vector)"는 적합한 숙주 내에서 유전자를 발현시킬 수 있는 적합한 발현 조절 서열에 작동 가능하게 연결된 핵산 서열을 함유하는 핵산 제조물을 의미한다. 벡터는 플라스미드, 파지 입자, 또는 간단하게 잠재적 게놈 삽입물일 수 있다. 적당한 숙주로 형질전환되면, 벡터는 숙주 게놈과 무관하게 복제하고 기능할 수 있거나, 또는 일부 경우에 게놈 그 자체에 통합될 수 있다. 플라스미드가 현재 벡터의 가장 통상적으로 사용되는 형태이므로, 본 발명의 명세서에서 "플라스미드 (plasmid)" 및 "벡터 (vector)"는 때로 상호 교환적으로 사용된다. 그러나, 본 발명은 당업계에 알려진 또는 알려지게 되는 바와 동등한 기능을 갖는 벡터의 다른 형태를 포함한다. 대장균에서 사용되는 단백질 발현 벡터로는 Novagen (미국) 사의 pET 계열, pCDF 계열, pRSF 계열, pACYC 계열 및 pCOLA 계열; Invitrogen (미국)의 pBAD 계열; Takara (일본)의 pHCE 나 pCOLD; 제노포커스(대한민국)의 pACE 계열; 카이스트 (대한민국)의 pTac15K, pTrc99A, pTacCDFS, pTrcCDFS 계열; 넓은 균주 범위에서 활용 가능한 pBBR1MCS 계열 등을 사용할 수 있다. 고초균에서는 게놈의 특정부분에 목적 유전자를 삽입하여 단백질 발현을 구현하거나, MoBiTech (독일)의 pHT 계열의 벡터, 등을 사용할 수 있다. 곰팡이나 효모에서도 게놈 삽입이나 자가복제 벡터들 이용하여 단백질 발현이 가능하다. Agrobacterium tumefaciens나 Agrobacterium rhizogenes 등의 T-DNA 시스템을 이용하여 식물용 단백질 발현 벡터를 사용할 수 있다. 포유동물 세포 배양물 발현을 위한 전형적인 발현 벡터는 예를 들면 pRK5 (EP 307,247호), pSV16B (WO 91/08291호) 및 pVL1392 (Pharmingen)을 기초로 한다.

본 발명에 있어서, 상기 재조합 벡터는 형질전환 등의 방법으로 미생물에 도입될 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.

본 발명의 용어 "형질전환(transduction)"은 DNA를 숙주로 도입하여 DNA가 염색체 외 인자로서 또는 염색체 통합완성에 의해 복제 가능하게 되는 것을 의미한다. 형질전환 방법은임의의 형질전환 방법이 사용될 수 있으며, 당업계의 통상적인 방법에 따라 용이하게 수행할 수 있다. 일반적으로 형질전환 방법에는 CaCl2 침전법, CaCl2 방법에 DMSO (dimethyl sulfoxide)라는 환원물질을 사용함으로써 효율을 높인 Hanahan 방법, 전기천공법 (electroporation), 인산칼슘 침전법, 원형질 융합법, 실리콘 카바이드 섬유를 이용한 교반법, 아그로박테리아 매개된 형질전환법, PEG를 이용한 형질전환법, 덱스트란 설페이트, 리포펙타민 및 건조/억제 매개된 형질전환 방법 등을 이용할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.

본 발명의 용어 "작동 가능하게 연결된"은 연결된 DNA 서열이 접촉하고, 또한 분비 리더의 경우 접촉하고 리딩 프레임 내에 존재하는 것을 의미한다. 그러나, 인핸서(enhancer)는 접촉할 필요가 없다. 이들 서열의 연결은 편리한 제한 효소 부위에서 라이게이션(연결)에 의해 수행된다. 그러한 부위가 존재하지 않는 경우, 통상의 방법에 따른 합성 올리고뉴클레오티드 어댑터(oligonucleotide adaptor) 또는 링커(linker)를 사용한다.

본 발명에 있어서, 상기 재조합 벡터는 프로모터(promoter)를 추가로 포함하는 것을 특징으로 할 수 있다.

본 발명에 있어서, 상기 프로모터는 trc 프로모터, tac 프로모터, T7 프로모터, 락토스 프로모터 및 trp 프로모터로 구성된 군에서 선택되는 것을 특징으로 할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.

본 발명의 용어 "프로모터(promoter)"는 전사(DNA에서 RNA를 합성하는 단계)의 시작에 관여하는 유전자의 상류 영역을 가리킨다. 즉, RNA 중합 효소(RNA Polymerase)가 결합하는 DNA 가닥의 한 부위 또는 DNA 한 가닥에 상보적인 RNA를 합성, 즉 전사가 시작되는 부위를 의미한다.

본 발명에 있어서, 상기 재조합 벡터는 전사의 확실성 및 효율을 증가시키기 위하여 종결자(terminator)를 추가로 포함할 수 있다.

본 명의 용어 "종결자(terminator)"는 전사 종결에 관여하는 유전자의 영역을 의미한다. 상기 종결자는 예를 들어 CaMV 35S 터미네이터, 노팔린 신타아제(NOS), 벼 α-아밀라아제 RAmy1 A 터미네이터, 파세올린(phaseoline) 터미네이터, 아그로박테리움 투메파시엔스(Agrobacteriumtumefaciens)의 옥토파인(Octopine) 유전자의 터미네이터, 대장균의 rrnB1/B2 터미네이터, T7 터미네이터 등을 포함할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.

본 발명의 용어 “배양”은 미생물을 배양하여, 목적하고자 하는 효능을 이끌어 내는 것을 의미하며, 본 발명에서 목적하고자 하는 효능은 목적 단백질 및 태그 단백질의 어셈블리 구조체를 제조하여 과도한 단백질의 응집을 예방하는 것을 의미한다. 상기 배양은 사용되는 미생물에 적합화되고 적어도 1종의 단순 탄소 공급원 및 필요한 경우에 공동-기질을 함유하는 적절한 배양 배지를 갖는 배양기에서 일반적으로 수행될 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.

본 발명에 있어서, 목적 단백질 다량체 합성은 세포 외(in vitro) 또는 무세포(cell-free) 단백질 합성 방법에 의해 수행되는 것을 특징으로 할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.

단백질의 생산 방법은 살아있는 세포의 세포질을 파괴하는 방법 또는 화학적으로 아미노산을 중합하는 방법이 주로 이용되어 왔다. 다만, 상기 방법들은 세포 파쇄 과정 및 정제/분리 과정에 있어서 매우 복잡한 생산 과정을 거치며, 제작된 단백질이 정상적으로 발현이 되지 않거나, 체내에서 잘 받아들여지지 못하고 면역반응을 일으키며, 긴 사슬의 단백질 중합에서 아미노산 서열의 정확성이 떨어지는 등의 단점들을 가지고 있었다. 따라서 최근에는 펩티드 또는 단백질 생산과정에서 세포를 이용하지 않는 무세포 단백질 합성시스템 (cell-free 혹은 in vitro protein synthesis system)의 개발이 활발히 진행되고 있다.

본 발명에 있어서, 상기 (a) 단계는 무세포 단백질 합성 방법을 사용하여 제1목적 단백질 다량체 및/또는 제2 목적 단백질 다량체를 합성하는 것을 특징으로 할 수 있다.

본 발명에서, "무세포 단백질 합성 방법(cell-free 혹은 in vitro protein synthesis method)"은 생산 대상에 따라 '무세포 합성 방법(cell-free 또는 in vitro synthesis method)', '무세포 펩타이드 합성 방법(cell-free 혹은 in vitro peptide synthesis method)' 또는 '무세포 단백질/펩타이드 합성 방법'과 동일한 의미로 상호호환적으로 사용될 수 있다.

본 발명의 용어 "무세포 단백질 합성 방법"은 세포 파쇄액(cell lysates)이나 추출액에 기질(substrate)이나 효소(enzyme)를 첨가하여 단백질 합성에 필요한 핵심 요소들(ATP(adenosine triphosphate), 아미노산 등)을 이용하여 시험관 내에 서 단백질을 합성하는 방법을 의미한다. 이러한 무세포 단백질 합성 방법은 기존의 세포를 이용한 단백질 생산 방법의 단점을 극복할 수 있고, 무세포 단백질 합성(cell-free protein synthesis)은 세포에서 단백질 생산에 관련되는 세포 내 기구와 이의 인자들만을 추출하여 세포 외부에서 세포의 생리적 조절 기작이 배제된 상태로 단백질의 합성 과정만을 인위적으로 반복시켜 단기간에 목적 단백질을 대량 생산함으로써, 세포 배양공정을 거치지 않고 고속으로 단백질을 합성할 수 있을 뿐만 아니라 세포막과 세포벽의 공간 안에서 단백질 발현이 진행되는 세포 배양공정에 비해 물리적인 장벽이 존재하지 않는 완전히 열린 방법으로서, 다양한 연구에 적용하기 위해서 단백질 합성의 조건을 자유롭게 변형시킬 수 있다는 장점을 가지고 있다. 또한, 세포 내 단백질 합성 방법은 생산되는 단백질이 세포독성을 나타내는 경우, 그 생산 및 수율에 커다란 문제가 있으나, 무세포 단백질 합성 방법을 사용하는 경우 이러한 문제에서 자유롭게 펩타이드 또는 단백질을 생산할 수 있다. 또한, 단백질이 합성될 때의 pH, 온도, 이온 세기 등 다양한 외부 조건에 대해서 자유로울 수 있기 때문에 생산성을 증가시킬 수 있을 것으로도 기대된다.

이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 예시하기 위한 것으로서, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되는 것으로 해석되지 않는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에 있어서 자명할 것이다.

실시예 1: 태그 단백질 선정

목표 생산물의 생성을 증가시키기 위한 태그 단백질로서 Streptococcus pyogenes 유래 fibronectin-binding protein FbaB를 분리하여 만들어낸 spytag(ST)/spycatcher(SC)를 선정하였다(도 9).

Spytag과 spycatcher는 자발적으로 isopeptide bond를 만든다. 2012년에 처음으로 이 단백질 쌍이 보고되었고, 2019년도에는 낮은 농도에서도 결합이 형성될 수 있는 003 버전의 spytag003/spycatcher003이 보고되었다(PNAS 2012,　109　(12),　E690-E697 및 PNAS　2019,　116　(52),　26523-26533).

Spytag, Spytag002, Spytag003, SpyCatcher, SpyCatcher002 및 SpyCatcher003의 아미노산 서열은 도 9에 개시되어 있다.

실시예 2: 유전자 구조체 클로닝

선정된 태그 단백질 쌍(spytag(ST)/spycatcher(SC))을 암호화하는 서열을 포함하는 제1 유전자 구조체 및 제2 유전자 구조체를 제조하였다.

구체적으로, 효소 구조를 토대로 효소 활성에 영향을 최소화하는 위치를 고려하여 태그 단백질이 GDHt의 C-말단에 발현되도록, GDHt를 암호화하는 염기서열, 및 spytag(ST), spytag003(ST3) 또는 spycatcher003(SC3)의 태그 단백질을 암호화하는 염기서열로 구성된 제1 유전자 구조체를 제작하였다(도 10 좌측 상단).

또한, 효소 구조를 토대로 효소 활성에 영향을 최소화하는 위치를 고려하여 태그 단백질이 KGSADH의 N-말단에 발현되도록, KGSADH를 암호화하는 염기서열, 및 spytag(ST) 또는 spycatcher(SC3)의 태그 단백질을 암호화하는 염기서열로 구성된 제2 유전자 구조체를 제작하였다(도 10 좌측 하단).

실시예 3: 단백질의 발현 및 정제

상기 실시예 2에서 제조된 제1 유전자 구조체를 pDK7 벡터에 삽입하여, GDHt 를 발현하는 재조합 벡터를 제작하였다. 상기 재조합 벡터를 대장균(W strain)으로 도입하였고, 2xYT 배지를 사용하여 다음과 같은 조건으로 배양하였다: Culture condition: 30°C, 1mM IPTG induction at OD600=1, culture for 7hrs after induction.

또한, 상기 실시예 2에서 제조된 제2 유전자 구조체를 pQE80L 벡터에 삽입하여, KGSADH를 발현하는 재조합 벡터를 제작하였다. 상기 재조합 벡터를 대장균(W strain)으로 도입하였고, 2xYT 배지를 사용하여 다음과 같은 조건으로 배양하였다: Culture condition: 37°C, 1mM IPTG induction at OD600=0.5, culture for 6hrs after induction.

배양 후 얻은 태그 단백질이 융합된 GDHt 및 KGSADH를 Histidine*6 tag을 이용한 affinity chromatography를 통해 정제하였다.

실시예 4: 태그 단백질이 융합된 GDHt 및 KGSADH의 특성 분석

실시예 4-1: 태그 단백질이 융합된 GDHt 및 KGSADH의 효소 활성

정제한 태그가 달린 효소 GDHt 및 KGSADH가 태그 유무에 따라 기질에 대한 효소 활성의 변화가 나타나는지 확인하기 위해, 태그 유무에 따른 효소의 활성을 비교하였다.

그 결과, GDHt 및 KGSADH의 태그 유무에 따라 기질에 대한 활성(kcat/Km)은 유의한 차이를 보이지 않았다(도 11 좌측).

실시예 4-2: 태그 단백질이 융합된 GDHt 및 KGSADH의 태그 간 conjugation 비교

또한, 정제한 태그가 달린 GDHt 및 KGSADH의 태그 간 conjugation이 일어나는지 확인하기 위해, SDS-폴리아크릴아미드 겔 전기영동(SDS-polyacrylamide gel electrophoresis, SDS-PAGE)로 분석하였다. 이 때, 태그 간에 공유결합이 형성될 경우 SDS-PAGE 결과에서 밴드의 이동이 나타날 것이다.

그 결과, 태그 ST/SC가 달린 효소가 각 쌍에 맞게 혼합되어 있을 경우 밴드의 이동이 관찰되었다. 이로부터, 효소 GDHt 및 KGSADH의 태그 ST/SC가 서로 공유결합으로 conjugation이 나타남을 확인할 수 있다(도 11 우측).

실시예 5: 태그 단백질이 융합된 GDHt 및 KGSADH의 어셈블리 구조체를 통한 3-HP 생산속도 측정

태그 ST/SC의 공유결합으로 연결된 GDHt 및 KGSADH의 다량체 단백질 어셈블리 구조체가 3-HP의 생산속도에 미치는 영향을 확인하기 위해, GDHt 효소의 기질인 0.2mM의 글리세롤과 10nM의 GDHt 및 10/20/30nM의 KGSADH를 3mM KCl, 1mM DTT, 2mM NAD+, 0.2% BSA, 15uM coenzyme B12의 조건에서 96-well microplate에 섞어주어 microplate reader를 통해 시간에 따른 340nm의 흡광도를 통해 관찰하였다.

그 결과, 태그 ST/SC의 공유결합으로 연결된 GDHt 및 KGSADH의 다량체 단백질 어셈블리 구조체의 경우, 단순히 GDHt 및 KGSADH를 혼합한 대조군(G/K)의 경우에 비하여 3-HP의 생산속도가 증가되는 것을 확인할 수 있다(도 12).

특히, GDHt 및 KGSADH가 각각 ST 및 SC3와 융합된 경우(G-ST/SC3-K), 단순히 GDHt 및 KGSADH를 혼합한 대조군(G/K)의 경우에 비하여 3-HP의 생산속도가 1.2배(G:K의 비율이 1:1), 1.27배(G:K의 비율이 1:2), 1.27배(G:K의 비율이 1:3) 증가되는 것을 확인할 수 있다(도 12). 또한, GDHt 및 KGSADH가 각각 SC3 및 ST와 융합된 경우(G-SC3/ST-K), 단순히 GDHt 및 KGSADH를 혼합한 대조군(G/K)의 경우에 비하여 3-HP의 생산속도가 1.33배(G:K의 비율이 1:1), 1.32배(G:K의 비율이 1:2), 1.46배(G:K의 비율이 1:3) 증가되는 것을 확인할 수 있다(도 12).

실시예 6: 효소 용해도 향상을 위한 용해도 향상 태그가 달린 GDHt 및 KGSADH의 어셈블리 구조체

실시예 6-1: 효소 용해도 향상을 위한 태그 선정

실시예 2에서와 유사한 방법으로, 효소 용해도 향상을 위한 5가지 후보의 태그(ubiquitin, Z domain, CMB66, Trx, Fh8)를, 암호화하는 서열을 포함하는 유전자 구조체를 제조하였다. 그 후, 실시예 2에서 제조된 유전자 구조체와 함께 효소 용해도를 측정하였다. 이 때, soluble한 효소만 활성을 가지는 것을 나타내며, 유전자 구조체에 1개의 RBS만 융합시켜 효소의 모든 단량체에 태그가 같이 발현되도록 하였다.

그 결과, 효소 용해도 향상을 위한 5가지 후보의 태그 중 Z-domain이 융합된 경우 효소 용해도가 가장 향상된 것을 확인하였다(도 13).

실시예 6-2: Z-domain 유무에 따른 효소 활성 및 태그 ST-SC간 conjugation 비교

KGSADH에 ST 및 Z-domain이 추가로 융합된 구조체의 경우(Z-ST-K), 태그가 융합되지 않은 경우와 비교하여 기질에 대한 활성(kcat/Km)은 유의한 차이를 보이지 않았다. 또한, Z-domain이 융합된 경우 태그 간 conjugation이 일어나는지 확인하기 위해 SDS-PAGE 분석하였고, 그 결과, GDHt 및 KGSADH의 태그 ST/SC가 서로 공유결합으로 conjugation이 나타남을 확인하였다(도 14 우측).

실시예 7: 태그 단백질이 융합된 GDHt 및 KGSADH의 어셈블리 구조체를 통한 3-HP 생산량 증가를 위한 조건 분석

실시예 7-1: IPTG의 농도에 따른 3-HP 생산량 증가

단백질 발현시 사용되는 inducer인 IPTG의 농도를 기존 조건인 0.1mM에서 0.01mM로 더욱 낮추어 단백질을 발현시킨 후, 본 발명의 다량체 단백질 어셈블리 구조체를 통해 3-HP 생산량이 증가되는지 여부를 측정하였다.

구체적으로, 100mM의 글리세롤에 대해 modified M9 media에서 3-HP 생산량을 측정하였고, modified M9 media는 2g/L의 NH4Cl, 2g/L의 NaCl, 1g/L의 yeast extract, 0.5g/L의 MgSO4 및 100mM의 pH7 potassium phosphate로 이루어진다.

또한 구체적으로, 2개의 벡터(pDK7-GDHt-SC3 및 pQE80L-RBS1-Z domain-RBS2-KGSADH)가 도입된 대장균(W strain) 콜로니를 test tube에 접종하여 밤새 키워주었다. 밤새 키운 세포에 대해 pre-culture 단계로 OD600=0.1이 되도록 50ml media(250ml flask)에 세포를 옮겨 37℃에서 키웠다. 약 OD600=1 정도가 되었을 때, main culture의 목적으로 OD600=0.1이 되도록 새로운 50ml media로 세포를 옮겨 37℃에서 키웠다(0시간). OD600=0.8~0.9일 때, 단백질 발현을 위해 inducer인 0.01mM의 IPTG를 넣어주었다. 위 0시간을 기준으로 4시간, 8시간, 18시간, 24시간에서의 3-HP 생산량에 대해 HPLC(Aminex HPX-87H)를 통해 분석하여 비교하였다.

그 결과, 2개의 RBS를 통해 태그 개수를 조절하여 KGSADH를 발현시킬 경우, 3-HP의 생산량이 대조군(G/K) 대비 8시간(118%)과 18시간(107%)에서 증가된 것을 확인할 수 있다. 특히, 1개의 RBS를 통해 KGSADH를 발현시킬 경우, 즉 모든 단량체에 태그가 포함되어 발현되는 경우, 오히려 3-HP의 생산량이 대조군(G/K) 대비 감소하는 것을 확인할 수 있다(도 15).

실시예 8-2: IPTG 및 arabinose에 따른 3-HP 생산량 증가

GDHt 및 KGSADH가 각각 서로 다른 inducer(각각 IPTG 및 arabinose)에 의해 발현되도록 분리하여, GDHt의 inducer인 IPTG의 농도를 0.001mM로, KGSADH의 inducer인 arabinose의 농도를 0.0002%로 더욱 낮추어 각 단백질을 발현시킨 후, 본 발명의 다량체 단백질 어셈블리 구조체를 통해 3-HP 생산량이 증가되는지 여부를 측정하였다.

또한 구체적으로, 2개의 벡터(pDK7-GDHt-SC3 및 pQE80L-RBS1-Z domain-RBS2-KGSADH)가 도입된 대장균(W strain) 콜로니를 test tube에 접종하여 밤새 키워주었다. 밤새 키운 세포에 대해 pre-culture 단계로 OD600=0.1이 되도록 50ml media(250ml flask)에 세포를 옮겨 37℃에서 키웠다. 약 OD600=1 정도가 되었을 때, main culture의 목적으로 OD600=0.1이 되도록 새로운 50ml media로 세포를 옮겨 37℃에서 키웠다(0시간). OD600=0.8~0.9일 때, 단백질 발현을 위해 inducer인 0.001mM의 IPTG 및 0.0002%의 arabinose를 넣어주었다. 위 0시간을 기준으로 4시간, 8시간, 18시간, 24시간에서의 3-HP 생산량에 대해 HPLC(Aminex HPX-87H)를 통해 분석하여 비교하였다.

그 결과, 2개의 RBS를 통해 태그 개수를 조절하여 KGSADH를 발현시킬 경우, 3-HP의 생산량이 대조군(G/K) 대비 18시간(120%)에서 증가된 것을 확인할 수 있다. 특히, 1개의 RBS를 통해 KGSADH를 발현시킬 경우, 즉 모든 단량체에 태그가 포함되어 발현되는 경우, 오히려 3-HP 생산이 대조군(G/K) 대비 감소하는 것을 확인할 수 있다(도 16).

Claims

하기 단계를 포함하는 다량체 단백질 어셈블리 구조체의 제조방법:
(a) 제1 목적 단백질을 암호화하는 유전자 및 제1 태그 단백질을 암호화하는 유전자를 포함하는 제1 유전자 구조체, 및
제2 목적 단백질을 암호화하는 유전자, 제2 태그 단백질을 암호화하는 유전자, 제1 리보솜 결합부위, 및 제2 리보솜 결합부위를 포함하는 제2 유전자 구조체가 도입된 재조합 미생물을 배양하여,
제1 목적 단백질 다량체 및 제2 목적 단백질 다량체가 공유결합에 의해 연결된 다량체 단백질 어셈블리 구조체를 생성하는 단계; 및
(b) 상기 생성된 다량체 단백질 어셈블리 구조체를 회수하는 단계.
제1항에 있어서,
상기 제2 목적 단백질 다량체 1개당 연결되는 제1 목적 단백질 다량체는 1개 내지 4개인 것을 특징으로 하는 다량체 단백질 어셈블리 구조체의 제조방법.
제1항에 있어서,
상기 제2 유전자 구조체는 제1 리보솜 결합부위, 제2 태그 단백질을 암호화하는 유전자, 제2 리보솜 결합부위 및 제2 목적 단백질을 암호화하는 유전자를 순차적으로 포함하는 것을 특징으로 하는 다량체 단백질 어셈블리 구조체의 제조방법.
제1항에 있어서,
상기 제2 유전자 구조체는 제3 태그 단백질을 암호화하는 유전자를 추가적으로 포함하는 것을 특징으로 하는 다량체 단백질 어셈블리 구조체의 제조방법.
제4항에 있어서,
상기 제2 유전자 구조체는 제1 리보솜 결합부위, 제3 태그 단백질을 암호화하는 유전자, 제2 태그 단백질을 암호화하는 유전자, 제2 리보솜 결합부위 및 제2 목적 단백질을 암호화하는 유전자를 순차적으로 포함하고,
상기 제3 태그는 Z-domain인 것을 특징으로 하는 다량체 단백질 어셈블리 구조체의 제조방법.
제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 있어서,
상기 목적 단백질은 효소인 것을 특징으로 하는 다량체 단백질 어셈블리 구조체의 제조방법.
제6항에 있어서,
상기 제1 목적 단백질은 글리세롤 탈수소효소(glycerol dehydratase, GDHt)이고,
상기 제2 목적 단백질은 알파-케토글루타릭 세미알데히드 탈수소효소(α-ketoglutaric semialdehyde dehydrogenase, KGSADH)인 것을 특징으로 하는 다량체 단백질 어셈블리 구조체의 제조방법.
제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 있어서,
상기 제1 태그 및 상기 제2 태그는 각각 Spytag(ST) 및 Spycathcer003(SC3), 또는 각각 Spycathcer003(SC3) 및 Spytag(ST)인 것을 특징으로 하는 다량체 단백질 어셈블리 구조체의 제조방법.
제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 있어서,
상기 공유결합은 이소펩티드결합(isopeptide bond)인 것을 특징으로 하는 다량체 단백질 어셈블리 구조체의 제조방법.
제1항 내지 제5항 중 어느 한 항의 방법에 의해 제조되고, 상기 제2 목적 단백질 다량체 1개당 연결되는 제1 목적 단백질 다량체는 1개 내지 4개인 다량체 단백질 어셈블리 구조체.