PL211754B1 - Enzym tworzący peptyd, mikroorganizm i sposób wytwarzania dipeptydu - Google Patents

Enzym tworzący peptyd, mikroorganizm i sposób wytwarzania dipeptydu

Info

Publication number
PL211754B1
PL211754B1 PL374192A PL37419203A PL211754B1 PL 211754 B1 PL211754 B1 PL 211754B1 PL 374192 A PL374192 A PL 374192A PL 37419203 A PL37419203 A PL 37419203A PL 211754 B1 PL211754 B1 PL 211754B1
Authority
PL
Poland
Prior art keywords
enzyme
ala
ome
peptide
component
Prior art date
Application number
PL374192A
Other languages
English (en)
Other versions
PL374192A1 (pl
Inventor
Kenzo Yokozeki
Sonoko Suzuki
Seiichi Hara
Satoshi Katayama
Original Assignee
Ajinomoto Kk
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Ajinomoto Kk filed Critical Ajinomoto Kk
Publication of PL374192A1 publication Critical patent/PL374192A1/pl
Publication of PL211754B1 publication Critical patent/PL211754B1/pl

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/14—Hydrolases (3)
    • C12N9/48—Hydrolases (3) acting on peptide bonds (3.4)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K5/00—Peptides containing up to four amino acids in a fully defined sequence; Derivatives thereof
    • C07K5/04—Peptides containing up to four amino acids in a fully defined sequence; Derivatives thereof containing only normal peptide links
    • C07K5/06—Dipeptides
    • C07K5/06008—Dipeptides with the first amino acid being neutral
    • C07K5/06017—Dipeptides with the first amino acid being neutral and aliphatic
    • C07K5/06026—Dipeptides with the first amino acid being neutral and aliphatic the side chain containing 0 or 1 carbon atom, i.e. Gly or Ala
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K5/00—Peptides containing up to four amino acids in a fully defined sequence; Derivatives thereof
    • C07K5/04—Peptides containing up to four amino acids in a fully defined sequence; Derivatives thereof containing only normal peptide links
    • C07K5/06—Dipeptides
    • C07K5/06008—Dipeptides with the first amino acid being neutral
    • C07K5/06017—Dipeptides with the first amino acid being neutral and aliphatic
    • C07K5/06034—Dipeptides with the first amino acid being neutral and aliphatic the side chain containing 2 to 4 carbon atoms
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K5/00—Peptides containing up to four amino acids in a fully defined sequence; Derivatives thereof
    • C07K5/04—Peptides containing up to four amino acids in a fully defined sequence; Derivatives thereof containing only normal peptide links
    • C07K5/06—Dipeptides
    • C07K5/06008—Dipeptides with the first amino acid being neutral
    • C07K5/06017—Dipeptides with the first amino acid being neutral and aliphatic
    • C07K5/06034—Dipeptides with the first amino acid being neutral and aliphatic the side chain containing 2 to 4 carbon atoms
    • C07K5/06043—Leu-amino acid
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K5/00—Peptides containing up to four amino acids in a fully defined sequence; Derivatives thereof
    • C07K5/04—Peptides containing up to four amino acids in a fully defined sequence; Derivatives thereof containing only normal peptide links
    • C07K5/06—Dipeptides
    • C07K5/06008—Dipeptides with the first amino acid being neutral
    • C07K5/06017—Dipeptides with the first amino acid being neutral and aliphatic
    • C07K5/06034—Dipeptides with the first amino acid being neutral and aliphatic the side chain containing 2 to 4 carbon atoms
    • C07K5/06052—Val-amino acid
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K5/00—Peptides containing up to four amino acids in a fully defined sequence; Derivatives thereof
    • C07K5/04—Peptides containing up to four amino acids in a fully defined sequence; Derivatives thereof containing only normal peptide links
    • C07K5/06—Dipeptides
    • C07K5/06008—Dipeptides with the first amino acid being neutral
    • C07K5/06017—Dipeptides with the first amino acid being neutral and aliphatic
    • C07K5/0606—Dipeptides with the first amino acid being neutral and aliphatic the side chain containing heteroatoms not provided for by C07K5/06086 - C07K5/06139, e.g. Ser, Met, Cys, Thr
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K5/00—Peptides containing up to four amino acids in a fully defined sequence; Derivatives thereof
    • C07K5/04—Peptides containing up to four amino acids in a fully defined sequence; Derivatives thereof containing only normal peptide links
    • C07K5/06—Dipeptides
    • C07K5/06008—Dipeptides with the first amino acid being neutral
    • C07K5/06017—Dipeptides with the first amino acid being neutral and aliphatic
    • C07K5/0606—Dipeptides with the first amino acid being neutral and aliphatic the side chain containing heteroatoms not provided for by C07K5/06086 - C07K5/06139, e.g. Ser, Met, Cys, Thr
    • C07K5/06069—Ser-amino acid
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K5/00—Peptides containing up to four amino acids in a fully defined sequence; Derivatives thereof
    • C07K5/04—Peptides containing up to four amino acids in a fully defined sequence; Derivatives thereof containing only normal peptide links
    • C07K5/06—Dipeptides
    • C07K5/06008—Dipeptides with the first amino acid being neutral
    • C07K5/06078—Dipeptides with the first amino acid being neutral and aromatic or cycloaliphatic
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K5/00—Peptides containing up to four amino acids in a fully defined sequence; Derivatives thereof
    • C07K5/04—Peptides containing up to four amino acids in a fully defined sequence; Derivatives thereof containing only normal peptide links
    • C07K5/06—Dipeptides
    • C07K5/06086—Dipeptides with the first amino acid being basic
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K5/00—Peptides containing up to four amino acids in a fully defined sequence; Derivatives thereof
    • C07K5/04—Peptides containing up to four amino acids in a fully defined sequence; Derivatives thereof containing only normal peptide links
    • C07K5/06—Dipeptides
    • C07K5/06086—Dipeptides with the first amino acid being basic
    • C07K5/06095—Arg-amino acid
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K5/00—Peptides containing up to four amino acids in a fully defined sequence; Derivatives thereof
    • C07K5/04—Peptides containing up to four amino acids in a fully defined sequence; Derivatives thereof containing only normal peptide links
    • C07K5/06—Dipeptides
    • C07K5/06104—Dipeptides with the first amino acid being acidic
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K5/00—Peptides containing up to four amino acids in a fully defined sequence; Derivatives thereof
    • C07K5/04—Peptides containing up to four amino acids in a fully defined sequence; Derivatives thereof containing only normal peptide links
    • C07K5/06—Dipeptides
    • C07K5/06104—Dipeptides with the first amino acid being acidic
    • C07K5/06113—Asp- or Asn-amino acid
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K5/00—Peptides containing up to four amino acids in a fully defined sequence; Derivatives thereof
    • C07K5/04—Peptides containing up to four amino acids in a fully defined sequence; Derivatives thereof containing only normal peptide links
    • C07K5/06—Dipeptides
    • C07K5/06139—Dipeptides with the first amino acid being heterocyclic
    • C07K5/06147—Dipeptides with the first amino acid being heterocyclic and His-amino acid; Derivatives thereof
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K5/00—Peptides containing up to four amino acids in a fully defined sequence; Derivatives thereof
    • C07K5/04—Peptides containing up to four amino acids in a fully defined sequence; Derivatives thereof containing only normal peptide links
    • C07K5/06—Dipeptides
    • C07K5/06139—Dipeptides with the first amino acid being heterocyclic
    • C07K5/06156—Dipeptides with the first amino acid being heterocyclic and Trp-amino acid; Derivatives thereof
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K5/00—Peptides containing up to four amino acids in a fully defined sequence; Derivatives thereof
    • C07K5/04—Peptides containing up to four amino acids in a fully defined sequence; Derivatives thereof containing only normal peptide links
    • C07K5/06—Dipeptides
    • C07K5/06139—Dipeptides with the first amino acid being heterocyclic
    • C07K5/06165—Dipeptides with the first amino acid being heterocyclic and Pro-amino acid; Derivatives thereof
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K5/00—Peptides containing up to four amino acids in a fully defined sequence; Derivatives thereof
    • C07K5/04—Peptides containing up to four amino acids in a fully defined sequence; Derivatives thereof containing only normal peptide links
    • C07K5/06—Dipeptides
    • C07K5/06191—Dipeptides containing heteroatoms different from O, S, or N
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K5/00—Peptides containing up to four amino acids in a fully defined sequence; Derivatives thereof
    • C07K5/04—Peptides containing up to four amino acids in a fully defined sequence; Derivatives thereof containing only normal peptide links
    • C07K5/08—Tripeptides
    • C07K5/0802—Tripeptides with the first amino acid being neutral
    • C07K5/0804—Tripeptides with the first amino acid being neutral and aliphatic
    • C07K5/0806—Tripeptides with the first amino acid being neutral and aliphatic the side chain containing 0 or 1 carbon atoms, i.e. Gly, Ala
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K5/00—Peptides containing up to four amino acids in a fully defined sequence; Derivatives thereof
    • C07K5/04—Peptides containing up to four amino acids in a fully defined sequence; Derivatives thereof containing only normal peptide links
    • C07K5/08—Tripeptides
    • C07K5/0802—Tripeptides with the first amino acid being neutral
    • C07K5/0804—Tripeptides with the first amino acid being neutral and aliphatic
    • C07K5/081—Tripeptides with the first amino acid being neutral and aliphatic the side chain containing O or S as heteroatoms, e.g. Cys, Ser
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K5/00—Peptides containing up to four amino acids in a fully defined sequence; Derivatives thereof
    • C07K5/04—Peptides containing up to four amino acids in a fully defined sequence; Derivatives thereof containing only normal peptide links
    • C07K5/10—Tetrapeptides
    • C07K5/1002—Tetrapeptides with the first amino acid being neutral
    • C07K5/1005—Tetrapeptides with the first amino acid being neutral and aliphatic
    • C07K5/1008—Tetrapeptides with the first amino acid being neutral and aliphatic the side chain containing 0 or 1 carbon atoms, i.e. Gly, Ala
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K7/00—Peptides having 5 to 20 amino acids in a fully defined sequence; Derivatives thereof
    • C07K7/04—Linear peptides containing only normal peptide links
    • C07K7/06—Linear peptides containing only normal peptide links having 5 to 11 amino acids
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N1/00—Microorganisms, e.g. protozoa; Compositions thereof; Processes of propagating, maintaining or preserving microorganisms or compositions thereof; Processes of preparing or isolating a composition containing a microorganism; Culture media therefor
    • C12N1/20—Bacteria; Culture media therefor
    • C12N1/205—Bacterial isolates
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/14—Hydrolases (3)
    • C12N9/16—Hydrolases (3) acting on ester bonds (3.1)
    • C12N9/18—Carboxylic ester hydrolases (3.1.1)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/93—Ligases (6)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
    • C12P21/00—Preparation of peptides or proteins
    • C12P21/02—Preparation of peptides or proteins having a known sequence of two or more amino acids, e.g. glutathione
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12R—INDEXING SCHEME ASSOCIATED WITH SUBCLASSES C12C - C12Q, RELATING TO MICROORGANISMS
    • C12R2001/00—Microorganisms ; Processes using microorganisms
    • C12R2001/01—Bacteria or Actinomycetales ; using bacteria or Actinomycetales

Landscapes

  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Tropical Medicine & Parasitology (AREA)
  • Virology (AREA)
  • Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
  • Enzymes And Modification Thereof (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)

Description

Opis wynalazku
Wynalazek dotyczy enzymu, który łatwo, niedrogo i z wysoką wydajnością wytwarza peptyd bez przechodzenia przez złożoną syntezę. Dokładniej, wynalazek dotyczy nowego enzymu, który katalizuje reakcję wytwarzania peptydu z karboksylowego komponentu i aminowego komponentu, mikroorganizmu, który wytwarza enzym i sposobu wytwarzania dipeptydu z zastosowaniem enzymu lub mikroorganizmu.
Peptydy stosuje się w dziedzinach produktów farmaceutycznych, żywności i w różnych innych dziedzinach. Na przykład, ponieważ L-alanylo-L-glutamina ma większą trwałość i rozpuszczalność w wodzie niż L-glutamina, jest szeroko stosowana jako sk ł adnik pł ynu infuzyjnego i poż ywek bezsurowiczych.
Metody syntezy chemicznej, znane jako metody wytwarzania peptydów, nie zawsze są proste. Do znanych przykładów takich metod należy sposób, w którym stosuje się N-benzyloksykarbonyloalaninę (Z-alanina) i zabezpieczoną L-glutaminę (zobacz Bull. Chem. Soc. Jpn., 34, 739 (1961), Bull.
Chem. Soc. Jpn., 35, 1966 (1962)), sposób, w którym stosuje się Z-alaninę i zabezpieczony ester γ-metylowy kwasu L-glutaminowego (zobacz Bull. Chem. Soc. Jpn., 37, 200 (1964)), sposób, w którym stosuje się ester Z-alaniny i niezabezpieczony kwas glutaminowy (Japońskie Zgłoszenie Nr H1-96194), sposób obejmujący syntezę pochodnej N-(2-podstawionej)-propionyloglutaminowej jako produktu pośredniego z halogenku 2-podstawionego propionylu jako surowca (Japońskie Zgłoszenie Patentowe Nr H6-234715).
Ponieważ jednak wszystkie te sposoby wymagają wprowadzenia i usunięcia grup zabezpieczających lub stosowania optycznie czynnych produktów pośrednich, nie uważa się ich za zadowalające w wystarczającym stopniu pod względem przydatności w przemyśle.
Z drugiej strony, powszechnie znane przykłady typowych sposobów wytwarzania peptydów z zastosowaniem enzymów obejmują reakcję kondensacji z zastosowaniem komponentu karboksylowego zabezpieczonego na atomie azotu i niezabezpieczonego na atomie węgla i niezabezpieczonego na atomie azotu, zabezpieczonego na atomie węgla komponentu aminowego (w dalszej części opisu Reakcja 1) oraz reakcję podstawienia z zastosowaniem zabezpieczonego na atomie azotu i zabezpieczonego na atomie węgla komponentu karboksylowego i niezabezpieczonego na atomie azotu, zabezpieczonego na atomie węgla komponentu aminowego (Reakcja 2). Przykładem Reakcji 1 jest sposób wytwarzania estru metylowego Z-asparaginofenyloalaniny z kwasu Z-asparaginowego i estru metylowego fenyloalaniny (Japońskie Zgłoszenie Nr S53-92729), natomiast przykładem Reakcji 2 jest sposób wytwarzania acetylofenyloalanyloleucynoamidu z estru etylowego acetylofenyloalaniny i leucynoamidu (Biochemical J., 163, 531 (1977)). Bardzo mało jest opisanych przykładów badań nad sposobami z zastosowaniem niezabezpieczonego na atomie azotu, zabezpieczonego na atomie węgla komponentu karboksylowego. Przykład reakcji podstawienia z zastosowaniem niezabezpieczonego na atomie azotu, zabezpieczonego na atomie węgla komponentu karboksylowego i niezabezpieczonego na atomie azotu, zabezpieczonego na atomie węgla komponentu aminowego (Reakcja 3) jest opisany w publikacji WO 90/01555. Jako przykład można wskazać sposób otrzymywania arginyloleucynoamidu z estru etylowego argininy i leucynoamidu. Przykłady reakcji podstawienia z użyciem niezabezpieczonego na atomie azotu, zabezpieczonego na atomie węgla komponentu karboksylowego i niezabezpieczonego na atomie azotu, niezabezpieczonego na atomie węgla komponentu aminowego (Reakcja 4) opisano w EP 278787A1 i EP 359399B1. Jako przykład można wskazać sposób otrzymywania tyrozyloalaniny z estru etylowego tyrozyny i alaniny.
Najmniej kosztowny spośród wymienionych wyżej Reakcji 1 do 4 sposób wytwarzania należy oczywiście do klasy Reakcji 4, która wymaga najmniej grup zabezpieczających.
Przykład Reakcji 4 według dotychczasowego stanu techniki (EP 278787A1) stwarza jednak następujące istotne problemy:
(1) wyjątkowo mała szybkość wytwarzania peptydu, (2) niska wydajność wytwarzania peptydu, (3) peptydy, które można wytwarzać są ograniczone do tych, które zawierają aminokwasy o stosunkowo wysokiej hydrofobowości, (4) ilość dodanego enzymu jest wyjątkowo duża oraz (5) potrzebne są stosunkowo drogie preparaty karboksypeptydazy pochodzące z pleśni, drożdży lub roślin.
PL 211 754 B1
W Reakcji 4 nie jest znany żaden sposób z zastosowaniem enzymu pochodzącego od bakterii lub drożdży innych niż rodzaj Saccharomyces i nie jest znany sposób otrzymywania alanyloglutaminy i innych wysoce hydrofilowych peptydów.
W tej sytuacji potrzebne jest opracowanie niedrogiego w warunkach przemysł owych sposobu wytwarzania tych peptydów.
Celem wynalazku jest dostarczenie nowego enzymu, który łatwo, niedrogo i z wysoką wydajnością wytwarza peptyd, bez przechodzenia przez złożone syntezy.
W szczególności, celem wynalazku jest dostarczenie nowego enzymu katalizującego reakcję wytwarzającą peptyd z komponentu karboksylowego i komponentu aminowego, mikroorganizmu wytwarzającego enzym i sposobu niedrogiego wytwarzania peptydu z użyciem enzymu lub mikroorganizmu.
Twórcy wynalazku uzyskali nowy enzym, który wydajnie wytwarza peptyd z nowej bakterii należącej do rodzaju Empedobacter i dokonali tego wynalazku.
Przedmiotem wynalazku jest enzym pochodzący z bakterii należącej do rodzaju Empedobacter, który z komponentu karboksylowego o niezabezpieczonym atomie azotu N i komponentu aminowego tworzy peptyd oraz tworzy L-alanylo-L-glutaminę z szybkością 0,03 mM/min lub większą, w reakcji powstawania dipeptydu w warunkach (i) do (iv):
(i) komponent karboksylowy stanowi chlorowodorek estru metylowego L-alaniny w ilości 100 mM, (ii) komponent aminowy stanowi L-glutamina w ilości 200 mM, (iii) pH wynosi 9,0 oraz (iv) ilość dodanego enzymu oczyszczonego do homogeniczności, jest mniejsza niż 0,61 mg/ml, jako ilość białka.
Enzym ma przy tym masę cząsteczkową 75 000 oznaczoną elektroforetycznie w żelu SDS a według oznaczenia chromatografią filtracyjną na ż elu masa czą steczkowa wynosi 150 000 a szczep stanowi Empedobacter brevis FERM BP-8113. Korzystnie komponent karboksylowy jako substrat obejmuje zarówno ester aminokwasu i amid aminokwasu.
Korzystnie komponent aminowy jako substrat stanowi dowolny aminokwas, aminokwas o zabezpieczonym atomie węgla i amina. Enzym według wynalazku tworzy peptyd w zakresie pH 6,5-10,5, w zakresie temperatury od 0-60°C. Korzystnie enzym jest niewraż liwy na hamowanie przez inhibitor enzymu serynowego, fluorek fenylometylosulfonylu lecz jest inhibowalny przez p'-guanidynobenzoesan p-nitrofenylu.
Przedmiotem wynalazku jest mikroorganizm Empedobacter brevis FERM BP-8113.
Przedmiotem wynalazku jest także sposób wytwarzania dipeptydu, który obejmuje otrzymywanie dipeptydu z komponentu karboksylowego o niezabezpieczonym atomie azotu N i komponentu aminowego, w którym stosuje się enzym określony w dowolnym z zastrz. 1-6 lub substancję zawierającą ten enzym.
Krótki opis rysunków
Fig. 1 jest wykresem przedstawiającym optymalne pH dla enzymu według wynalazku;
Fig. 2 jest wykresem przedstawiającym optymalną temperaturę dla enzymu według wynalazku, a
Fig. 3 jest wykresem przedstawiającym przebieg w czasie wytwarzania L-alanylo-L-glutaminy z estru metylowego L-alaniny i L-glutaminy.
Sposoby wykonania wynalazku są wyjaśnione szczegółowo w kolejności:
(1) Mikroorganizm wytwarzający enzym według wynalazku, (2) Hodowla mikroorganizmu, (3) Oczyszczanie enzymu, (4) Właściwości enzymu, i (5) Metoda syntezy dipeptydu.
(1) Mikroorganizm wytwarzający enzym według wynalazku
Enzymem według wynalazku może być dowolny enzym, który wytwarza peptyd z komponentu karboksylowego i komponentu aminowego i nie ima szczególnych ograniczeń co do organizmów, które wytwarzają taki enzym. W opisie komponent karboksylowy odnosi się do komponentu, który dostarcza grupę karbonylową (CO) w wiązaniu peptydowym (-CONH-), natomiast komponent aminowy odnosi się do komponentu, który dostarczy grupę aminową (NH) w wiązaniu peptydowym. Określenie peptyd użyte samodzielnie odnosi się do polimeru mającego co najmniej jedno lub więcej wiązań peptydowych, jeśli specjalnie nie zaznaczono inaczej. Dodatkowo, określenie dipeptyd odnosi się do peptydu mającego jedno wiązanie peptydowe.
PL 211 754 B1
Mikroorganizmem, który wytwarza enzym według wynalazku są bakterie należące do rodzaju Empedobacter, którego szczególne przykłady obejmują Empedobacter brevis szczep ATCC 14234 (szczep FERM P-18545). Ujawniono też Sphingobacterium sp. szczep FERM BP-8124. Empedobacter brevis szczep ATCC 14234 (szczep FERM P-18545, szczep FERM BP-8113) i Sphingobacterium sp. szczep FERM BP-8124 są mikroorganizmami, które zostały wyselekcjonowane przez twórców wynalazku w wyniku poszukiwania mikroorganizmów, które wytwarzają z wysoką wydajnością peptyd z komponentu karboksylowego i komponentu aminowego. Mikroorganizmy o właściwościach bakteriologicznych podobnych do właściwości Empedobacter brevis szczep ATCC 14234 (szczep FERM P-18545) lub Sphingobacterium sp. szczep FERM BP-8124 są również mikroorganizmami wytwarzającymi enzym według wynalazku.
Empedobacter brevis szczep ATCC 14234 (szczep FERM P-18545) został zdeponowany w International Patent Organism Depositary w National Institute for Advanced Industrial Science and Technology (Central 6, 1-1 Higashi, miasto Tsukuba, prefektura Ibaraki, Japonia) 1 października 2001 r. i jest oznaczony numerem depozytu FERM P-18545. Zgodnie z postanowieniem Porozumienia Budapeszteńskiego, próbkę kontrolną tego organizmu przekazano następnie 8 lipca 2002 r. do depozytu do International Patent Organism Depositary of National Institute for Advanced Industrial Science and Technology i oznaczono numerem depozytu FERM BP-8113 (oznaczenie mikroorganizmu: Empedobacter brevis szczep AJ 13933).
Sphingobacterium szczep AJ 110003 zdeponowano 22 lipca 2002 r. w International Patent Organism Depositary of National Institute for Advanced Industrial Science and Technology i oznaczono numerem depozytu FERM BP-8124. Należy zauważyć, że szczep AJ 110003 został zidentyfikowany jako wspomniany Sphingobacterium sp. Szczep FERM BP-8124 (Instytucja depozytariusza: National Institute for Advanced Industrial Science and Technology, International Patent Organism Depositary, Adres depozytariusza: Chuo Dai-6, 1-1 Higashi 1-Chome, Tsukuba-shi, Ibaraki-ken, Japonia, Data przekazania międzynarodowego depozytu: 22 lipca 2002) jest Gram-ujemną pałeczką (0,7 do 0,8 x 1,5 do 2,0 mikrometrów (Vm)), która nie tworzy przetrwalników i nie jest ruchliwa. Jej kolonie są okrągłe i mają całkowicie gładkie brzegi, zawierają niewielkie wypukłości i mają lśniący, jasnożółty kolor. Organizm wzrasta w 30°C i jest katalazododatni, oksydazododatni i ujemny wobec testu OF (glukoza), i na podstawie tych właściwości został zidentyfikowany jako bakteria należąca do rodzaju Sphingobacterium. Ponadto, na podstawie tego, że jest ujemny w teście redukcji azotanów, ujemny w teście wytwarzania indolu, ujemny w teście otrzymywania z glukozy, ujemny w teście z dihydrolazą argininy, dodatni wobec ureazy, dodatni w teście hydrolizy eskuliny, ujemny w teście hydrolizy żelatyny, dodatni w teście z β-galaktozydazą, dodatni w teście asymilacji glukozy, ujemny w teście asymilacji L-arabinozy, dodatni w teście asymilacji D-mannozy, ujemny w teście asymilacji D-mannitu, dodatni w teście asymilacji N-acetylo-D-glukozoaminy, dodatni w teście asymilacji maltozy, ujemny w teście asymilacji glukonianu potasu, ujemny w teście z kwasem n-kapronowym, ujemny w teście asymilacji kwasu adypinowego, ujemny w teście asymilacji kwasu dl-jabłkowego, ujemny w teście asymilacji cytrynianu sodu, ujemny w teście asymilacji octanu fenylu i dodatni w teście z cytochromooksydazą stwierdzono, że mikroorganizm ma właściwości podobne do właściwości Sphingobacterium multivorum lub Sphingobacterium spiritivorum. Ponadto, mimo że w wyniku przeanalizowania homologii sekwencji bazowej genu 16S rRNA wykazano najwyższy stopień homologii (98,8%) ze Sphingobacterium multivorum, nie było szczepu, z którym dopasowanie byłoby całkowite. Omawiany szczep bakteryjny zidentyfikowano jako Sphingobacterium sp.
Enzym według wynalazku można otrzymać przez wyizolowanie i oczyszczenie z komórek Empedobacter brevis lub Sphingobacterium sp. Ponadto, enzym według wynalazku a także mikroorganizmy, które wytwarzają enzym można również otrzymywać w oparciu o wyizolowany enzym metodami inżynierii genetycznej. Enzym i mikroorganizm według wynalazku można otrzymywać przez wyizolowanie kodującego enzym według wynalazku w oparciu o wyizolowany i oczyszczony enzym, a następnie ekspresję DNA przez wprowadzenie DNA do odpowiedniego gospodarza. Dodatkowo, enzym mogący wytwarzać peptyd z komponentu karboksylowego i komponentu aminowego można otrzymać również z innych mikroorganizmów przez wytworzenie sondy opartej na polinukleotydzie, która koduje enzym według wynalazku otrzymany z Empedobacter brevis. Różne metody rekombinacji genów są opisane w Molecular Cloning, wyd. drugie, Cold Spring Harbor Press (1989) i w innych publikacjach.
(2) Hodowla mikroorganizmów
Dla otrzymania hodowanych komórek mikroorganizmów zawierających enzym stosowany w wynalazku wystarcza, żeby mikroorganizmy były hodowane i wzrastały we właściwej pożywce.
PL 211 754 B1
Niema szczególnych ograniczeń dotyczących stosowanej pożywki, pod warunkiem, że pozwala ona na wzrost mikroorganizmów. Pożywką tą może być zwykła pożywka zawierająca zwykłe źródła węgla, źródła azotu, źródła fosforu, źródła siarki, jony nieorganiczne oraz potrzebne źródła organicznych czynników odżywczych.
Można na przykład zastosować dowolne źródło węgla, pod warunkiem, że mikroorganizmy mogą je wykorzystać.
Do konkretnych przykładów źródła węgla, które można użyć, należą cukry takie jak glukoza, fruktoza, maltoza i amyloza, alkohole takie jak sorbit, etanol i gliceryna, kwasy organiczne takie jak kwas fumarowy, kwas cytrynowy, kwas octowy i kwas propionowy i ich sole, węglowodory takie jak parafina, a także ich mieszaniny.
Przykładowe źródła azotu, które można użyć obejmują sole amonowe soli nieorganicznych takie jak siarczan amonu i chlorek amonu, sole amonowe kwasów organicznych takie jak fumaran amonu i cytrynian amonu, azotany takie jak azotan sodu i azotan potasu, organiczne związki azotu takie jak peptony, ekstrakt drożdżowy, ekstrakt mięsny i wyciąg namokowy kukurydzy, a także ich mieszaniny.
Jako dodatki można odpowiednio domieszać i użyć również zwykłe dodatki odżywcze stosowane w pożywkach, takie jak sole nieorganiczne, sole metali śladowych i witaminy.
Nie ma szczególnych ograniczeń co do warunków hodowli i można ją prowadzić na przykład przez około 12 do około 48 godzin przy odpowiedniej kontroli pH i temperatury, odpowiednio w zakresie pH 5 do 8 i zakresie temperatury 15 do 40°C, w warunkach tlenowych.
(3) Oczyszczanie enzymu
Jako przykład oczyszczania enzymu według wynalazku objaśniono sposób wyodrębniania i oczyszczania wytwarzającego peptyd enzymu z Empedobacter brevis. Po pierwsze, z komórek na przykład Empedobacter brevis szczepu FERM BP-8113 (Instytucja depozytariusza: National Institute for Advanced Industrial Science and Technology, International Patent Organism Depositary, Adres depozytariusza: Central 6, 1-1-1 Higashi, Miasto Tsukuba, Prefektura Ibaraki, Japonia, Data przekazania międzynarodowego depozytu: 8 lipca 2002) sporządza się mikroorganizmowy ekstrakt komórkowy przez destrukcję komórek metodą fizyczną taką jak miażdżenie ultradźwiękami lub metodą enzymatyczną z użyciem enzymu rozpuszczającego ścianki oraz oddzielenie frakcji nierozpuszczalnej przez wirowanie.
Wytwarzający peptyd enzym można następnie wyizolować z ekstraktu komórkowego tak otrzymanego przez kombinację zwykłych sposobów oczyszczania białek takich jak chromatografia anionowymienna, chromatografia kationowymienna lub filtracyjna chromatografia żelowa.
Przykładem nośnika, który można zastosować w chromatografii anionowymiennej jest Q-Sepharose HP (wytwarzany przez Amersham). Enzym odzyskuje się we frakcji niezaadsorbowanej w warunkach pH 8,5, gdy umożliwi się przejście ekstraktu komórkowego zawierającego enzym przez kolumnę wypełnioną nośnikiem.
Przykładem nośnika, który można zastosować w chromatografii kationowymiennej jest MonoS HR (wytwarzany przez Amersham). Po zaadsorbowaniu enzymu na nośniku (w kolumnie) przez umożliwienie przejścia ekstraktu komórkowego zawierającego enzym przez kolumnę wypełnioną nośnikiem a następnie przemyciu kolumny, enzym eluuje się roztworem buforowym o wysokim stężeniu soli. W tym czasie stężenie soli można zwiększać sekwencyjnie lub zwiększać gradientowo. Na przykład, w przypadku użycia MonoS HR, enzym zaadsorbowany na nośniku eluuje się przy stężeniu NaCl około 0,2 do około 0,5 M.
Enzym oczyszczony opisanym sposobem można następnie dalej homogenicznie oczyszczać przez filtracyjną chromatografię żelową. Przykładem nośnika do zastosowania w filtracyjnej chromatografii żelowej jest Sephadex 200 pg (wytwarzany przez Amersham).
Frakcję z oczyszczania, w której jest obecny enzym można potwierdzić przez zbadanie aktywności każdej frakcji przy wytwarzaniu peptydu opisanym sposobem.
(4) Właściwości enzymu według wynalazku
Ponieważ enzym według wynalazku jest enzymem, który wytwarza peptyd z komponentu karboksylowego i komponentu aminowego, zostanie omówiona korzystna odmiana enzymu według wynalazku z punktu widzenia jego właściwości.
Enzym o opisanych właściwościach, dla których szybkość wytwarzania dipeptydu jest wykorzystywana jako wskaźnik, jest jedyną korzystną odmianą enzymu według wynalazku. Korzystną odmianą enzymu według wynalazku jest mianowicie enzym, który może wytwarzać peptyd z komponentu karboksylowego i komponentu aminowego i może wykazywać szybkość tworzenia L-alanylo-L-glutaminy
PL 211 754 B1 w reakcji wytwarzania dipeptydu w warunkach (i) do (iv) korzystnie 0,03 mM/min lub wię kszą , korzystniej 0,3 mM/min lub większą, a szczególnie korzystnie 1,0 mM/min lub większą.
Warunki reakcji wytwarzającej dipeptyd są następujące:
(i) Komponentem karboksylowym jest chlorowodorek estru metylowego L-alaniny (100 milimolowy (mM));
(ii) Komponentem aminowym jest L-glutamina (200 mM);
(iii) pH wynosi 9,0; i (iv) Ilość dodanego enzymu w przeliczeniu na ilość białka jest mniejsza niż 0,61 mg/ml.
Podana ilość dodanego enzymu wskazuje końcową ilość dodanego enzymu, to znaczy dodaną do układu reakcyjnego, a pożądane jest dodanie 0,01 mg/ml lub więcej, a korzystnie 0,02 mg/ml lub więcej w przeliczeniu na ilość białka. Określenie ilość białka odnosi się do wartości oznaczonej metodą kolorymetryczną z błękitem brylantowym Coomassiego przy użyciu roztworu CBB do oznaczania białka (dostarczanego przez Nakarai) i albuminy z surowicy bydlęcej jako wzorca.
Podana szybkość wytwarzania dalece przewyższa tradycyjną szybkość wytwarzania dla wytwarzania peptydu przy użyciu enzymu a enzym według wynalazku może katalizować wytwarzanie peptydu z wyjątkowo dużą szybkością.
Jako szczegółowy przykład sposobu postępowania przy badaniu aktywności enzymu, aktywność enzymu można badać przez doprowadzenie do reakcji enzymu w roztworze buforu boranowego zawierającym ester aminokwasu i aminę jako substraty, z następnym oznaczaniem ilościowym powstającego peptydu.
W bardziej szczegółowym przykładzie, doprowadza się do reakcji enzymu przez kilka minut w 25°C, stosując 100 mM roztwór buforu boranowego (pH 9,0) zawierający 100 mM ester metylowy L-alaniny i 200 mM L-glutaminę.
Jednostka aktywności enzymu stosowana w wynalazku jest zdefiniowana tak, że 1 jednostka (J) jest ilością enzymu, która wytwarza 1 mikromol peptydu w ciągu jednej minuty w warunkach reakcji w 25°C przy uż yciu 100 mM roztworu buforu boranowego (pH 9,0) zawierają cego 100 mM ester metylowy L-alaniny i 200 mM L-glutaminę.
Ponadto, przykładem korzystnej modyfikacji enzymu według wynalazku jest enzym mający właściwości dzięki którym jako substrat dla komponentu karboksylowego może zostać użyty dowolny ester aminokwasu i amid aminokwasu. Sformułowanie jako substrat może zostać użyty zarówno ester aminokwasu jak i amid aminokwasu oznacza, że jako substrat może zostać użyty co najmniej jeden rodzaj estru aminokwasu i co najmniej jeden rodzaj amidu aminokwasu. Ponadto, korzystnym rozwiązaniem enzymu według wynalazku jest enzym, który ma właściwość dzięki której jako substrat dla komponentu aminowego mogą zostać użyte dowolny aminokwas, aminokwas zabezpieczony na atomie węgla i amina. Sformułowanie jako substrat mogą zostać użyte dowolny aminokwas, aminokwas zabezpieczony na atomie węgla i amina oznacza, że jako substrat mogą zostać użyte co najmniej jeden rodzaj aminokwasu, co najmniej jeden rodzaj aminokwasu zabezpieczonego na atomie węgla i co najmniej jeden rodzaj aminy. W wyniku szerokiego zakresu specyficzności substratu względem komponentu karboksylowego lub komponentu aminowego, enzym według wynalazku jest korzystny w tym znaczeniu, że może zostać dobrany szeroki zakres materiałów wyjściowych, który z kolei jest korzystny pod względem kosztu i aparatury produkcyjnej w przypadku produkcji przemysłowej. Konkretne przykłady komponentów karboksylowych obejmują estry L-aminokwasów, estry D-aminokwasów, amidy L-aminokwasów i amidy D-aminokwasów. W dodatku estry aminokwasów obejmują nie tylko estry aminokwasów odpowiadające aminokwasom występującym w przyrodzie, ale także estry aminokwasów odpowiadające aminokwasom niewystępującym w przyrodzie lub ich pochodne. Ponadto przykłady estrów aminokwasów obejmują zarówno estry a-aminokwasów jak i estry β-, γ- i ω-aminokwasów i tym podobne, z różnymi miejscami wiązania grupy aminowej. Do typowych przykładów estrów aminokwasów należą estry metylowe, estry etylowe, estry n-propylowe, estry izopropylowe, estry n-butylowe, estry izobutylowe i estry tert-butylowe aminokwasów itp.
Konkretne przykłady komponentów aminowych obejmują L-aminokwasy, zabezpieczone na atomie węgla L-aminokwasy, D-aminokwasy, zabezpieczone na atomie węgla D-aminokwasy i aminy. W dodatku przykłady amin obejmują nie tylko aminy występujące w przyrodzie, ale także aminy niewystępujące w przyrodzie lub ich pochodne. Ponadto przykłady aminokwasów obejmują nie tylko aminokwasy występujące w przyrodzie, lecz także aminokwasy niewystępujące w przyrodzie lub ich pochodne. Należą do nich zarówno α-aminokwasy jak i β-, γ- lub ω-aminokwasy, z różnymi miejscami wiązania grupy aminowej.
PL 211 754 B1
Dodatkowo, pod różnymi względami, korzystną modyfikacją enzymu według wynalazku jest enzym, dla którego zakres pH w którym może być katalizowana reakcja wytwarzania peptydu jest 6,5 do 10,5. Zdolność enzymu według wynalazku do katalizowania tej reakcji w szerokim zakresie pH jest korzystna z tego względu, że umożliwia elastyczne dostosowanie do produkcji przemysłowej, w której mogą występować różne ograniczenia. Przy aktualnej produkcji peptydu korzystnie jest jednak użyć enzym przy dostosowaniu do optymalnego pH odpowiadającego pozyskanemu enzymowi tak, aby maksymalizować efektywność katalityczną enzymu.
Ponadto, przykładem innego aspektu korzystnej modyfikacji enzymu według wynalazku jest enzym, dla którego zakres temperatury w jakim enzym może katalizować reakcje wytwarzania peptydu jest w granicach 0 do 60°C. Ponieważ enzym według wynalazku może katalizować reakcję w szerokim zakresie temperatury, jest korzystny ze względu na to, że umożliwia elastyczne dostosowanie do produkcji przemysłowej, w której mogą występować różne ograniczenia. Przy aktualnej produkcji peptydu korzystnie jest jednak użyć enzym przy dostosowaniu do optymalnej temperatury odpowiadającej pozyskanemu enzymowi tak, aby maksymalizować efektywność katalityczną enzymu.
(5) Sposób syntezy dipeptydu
Sposób wytwarzania dipeptydu według wynalazku obejmuje syntetyzowanie dipeptydu przez umożliwienie enzymowi mogącemu wytwarzać peptyd z komponentu karboksylowego i komponentu aminowego lub substancji, która zawiera ten enzym działania na komponent karboksylowy i komponent aminowy.
Dla sposobu umożliwienia enzymowi użytemu w wynalazku lub substancji zawierającej enzym działania na komponent karboksylowy i komponent aminowy wystarcza, żeby enzym lub substancja zawierająca enzym, komponent karboksylowy i komponent aminowy zostały zmieszane. Dokładniej, można zastosować metodę, w której enzym lub substancję zawierającą enzym dodaje się do roztworu zawierającego komponent karboksylowy i komponent aminowy i umożliwia się reakcję lub, w przypadku użycia mikroorganizmu wytwarzającego enzym, można zastosować sposób, w którym hoduje się mikroorganizm wytwarzający enzym, enzym znajdujący się w mikroorganizmie lub bulion z hodowli mikroorganizmu oczyszcza się i zatęża, a następnie do bulionu dodaje się komponent karboksylowy i komponent aminowy. Zsyntetyzowany dipeptyd moż na następnie zebrać standardowymi metodami i w razie potrzeby oczyś cić .
Określenie substancja zawierająca enzym odnosi się do tego, co zawiera enzym, a przykłady konkretnych tego postaci obejmują hodowlę mikroorganizmów wytwarzających enzym, komórki mikroorganizmów wyizolowane z hodowli i produkt obróbki komórek mikroorganizmów. Hodowla mikroorganizmów odnosi się do tego, co uzyskuje się w wyniku hodowania mikroorganizmów, a ściślej do mieszaniny komórek mikroorganizmów, pożywki użytej do hodowli mikroorganizmów oraz substancji wytworzonych przez hodowane mikroorganizmy i tym podobnych. Dodatkowo, komórki mikroorganizmów mogą zostać przemyte i stosowane w postaci przemytych komórek mikroorganizmów. Produkt obróbki komórek mikroorganizmów obejmuje dodatkowo zmiażdżone, lizowane lub liofilizowane komórki mikroorganizmów i obejmuje również surowy enzym odzyskany w wyniku przetworzenia komórek mikroorganizmów a także oczyszczony enzym otrzymany przez oczyszczenie surowego enzymu. Do otrzymania oczyszczonego enzymu można użyć enzym częściowo oczyszczony otrzymany różnymi metodami oczyszczania lub enzym immobilizowany, który immobilizowano przez wiązanie kowalentne, adsorpcję lub pułapkowanie. Dodatkowo, ponieważ niektóre mikroorganizmy zależnie od ich rodzaju są częściowo lizowane podczas hodowli, w takich przypadkach jako substancja zawierająca enzym może również zostać użyty nadsącz z hodowli.
Ponadto, stosować można nie tylko dzikie szczepy mikroorganizmów zawierających enzym, ale również szczepy rekombinowane genetycznie. Mikroorganizmy nie są ograniczone do nienaruszonych komórek, lecz można stosować komórki mikroorganizmów po obróbce acetonem, liofilizowane komórki mikroorganizmów lub komórki inaczej obrabiane. Można też stosować immobilizowane komórki mikroorganizmów, które immobilizowano przez wiązanie kowalencyjne, adsorpcję, pułapkowanie lub innymi metodami, a także obrobione immobilizowane komórki mikroorganizmów.
Należy zauważyć, że w przypadku użycia hodowli, hodowanych komórek mikroorganizmów lub produktu pochodzącego z poddanych obróbce komórek mikroorganizmów, występują liczne przypadki, w których istnieje enzym, który nie uczestniczy w wytwarzaniu peptydów, lecz rozkłada otrzymane peptydy i w takich przypadkach jest korzystne dodanie inhibitora metaloproteazy takiego jak kwas etylenodiaminotetraoctowy (EDTA), zależnie od przypadku. Dodana ilość jest w zakresie 0,1 mM do 300 mM, a korzystnie 1 mM do 100 mM.
PL 211 754 B1
Użyta ilość enzymu lub substancji zawierającej enzym powinna być ilością, przy której wykazany zostaje zamierzony skutek (skuteczna ilość). Chociaż ta skuteczna ilość może zostać z łatwością wyznaczona w prostym, wstępnym doświadczeniu przez osobę przeciętnie biegłą w omawianej dziedzinie, w przypadku użycia na przykład enzymu jego użyta ilość wynosi około 0,01 do 100 jednostek (J), podczas gdy w przypadku użycia przemytych komórek mikroorganizmów ich użyta ilość wynosi około 1 do 500 g/l.
Użyty może być dowolny komponent karboksylowy, pod warunkiem, że może on wytwarzać peptyd przez kondensację z innym substratem w postaci komponentu aminowego. Przykłady komponentów karboksylowych obejmują estry L-aminokwasów, estry D-aminokwasów, amidy L-aminokwasów i amidy D-aminokwasów. Przykłady estrów aminokwasów obejmują nie tylko estry aminokwasów odpowiadające aminokwasom występującym w przyrodzie, ale także estry aminokwasów odpowiadające aminokwasom niewystępującym w przyrodzie lub ich pochodnych.
Ponadto przykłady estrów aminokwasów obejmują zarówno estry α-aminokwasów jak i estry β-, γ- i ω-aminokwasów i tym podobne, z różnymi miejscami związania grupy aminowej.
Do typowych przykładów estrów aminokwasów należą estry metylowe, estry etylowe, estry n-propylowe, estry izopropylowe, estry n-butylowe, estry izobutylowe i estry tert-butylowe aminokwasów.
Można zastosować dowolny komponent aminowy, pod warunkiem, że może on wytwarzać peptyd przez kondensację z innym substratem w postaci komponentu karboksylowego. Przykłady komponentów aminowych obejmują L-aminokwasy, zabezpieczone na atomie węgla L-aminokwasy, D-aminokwasy, zabezpieczone na atomie węgla D-aminokwasy i aminy. W dodatku przykłady amin obejmują nie tylko aminy występujące w przyrodzie, ale także aminy niewystępujące w przyrodzie lub ich pochodne. Przykłady aminokwasów obejmują nie tylko aminokwasy występujące w przyrodzie, lecz także aminokwasy niewystępujące w przyrodzie lub ich pochodne. Należą do nich zarówno α-aminokwasy jak i β-, γ- i ω-aminokwasy, z różnymi miejscami związania grupy aminowej.
Chociaż stężenia komponentu karboksylowego i komponentu aminowego służących jako materiały wyjściowe są odpowiednio 1 mM do 10 M, a korzystnie 0,05 molowe (M) do 2 M, są przypadki, w których korzystne jest dodanie komponentu aminowego w ilości równej lub większej niż ilość komponentu karboksylowego. Ponadto w przypadku substratów które w wysokich stężeniach hamują reakcję, mogą one być korygowane do stężenia które nie powoduje hamowania i stopniowo dodawane w trakcie reakcji.
Temperatura reakcji która umożliwia wytwarzanie peptydu wynosi 0 do 60°C, a korzystnie 5 do 40°C. pH reakcji które umożliwia wytwarzanie peptydu wynosi 6,5 do 10,5, a korzystnie 7,0 do 10,0.
Przykłady
Przedstawiono bardziej szczegółowe wyjaśnienie wynalazku poprzez jego przykłady. W uzupełnieniu, do potwierdzenia przez barwienie ninhydryną chromatogramów cienkowarstwowych (jakościowo), w celu zbadania produktów wykonywano oznaczenia ilościowe wysokosprawną chromatografią cieczową. Kolumna: InertsiL ODS-2 (produkowana przez GL Science, Inc.), eluat: wodny roztwór fosforanu zawierający 5,0 mM 1-oktanosulfonian sodu (pH 2,1): metanol = 100: 15 do 50, szybkość przepływu: 1,0 ml/min, detekcja: 210 nanometrów (nm).
P r z y k ł a d 1.
Hodowla mikroorganizmu (Empedobacter brevis szczep FERM BP-8113) ml pożywki (pH 6,2) zawierającej 5 gramów (g) glukozy, 5 g siarczanu amonu, 1 g fosforanu monopotasowego, 3 g fosforanu dipotasowego, 0,5 g siarczanu magnezu, 10 g ekstraktu z drożdży i 10 g peptonu w 1 litrze (l) przeniesiono do 500 ml kolby Sakaguchi i przez 15 minut sterylizowano w 115°C. Pożywkę tę zaszczepiono następnie jedną ezą bulionu hodowlanego Empedobacter brevis, szczep FERM BP-8113 (Instytucja depozytariusza: National Institute for Advanced Industrial Science and Technology, International Patent Organism Depositary, Adres depozytariusza: Chuo Dai-6, 1-1 Higashi 1-Chome, Tsukuba-shi, Ibaraki-ken, Japonia, Data przekazania międzynarodowego depozytu: 8 lipca 2002), który hodowano przez 16 godzin w 30°C w tej samej pożywce, a następnie przez 16 godzin w 30°C w wytrząsarce przy 120 suwach/min.
P r z y k ł a d 2.
Otrzymywanie peptydu przy użyciu komórek mikroorganizmów Komórki mikroorganizmów zebrano przez odwirowanie (10000 obrotów na minutę (obr/min), 15 minut) bulionu hodowlanego otrzymanego w Przykładzie 1, a następnie zawieszenie do stężenia 100 g/l w 100 mM buforze boranowym (pH 9,0) zawierającym 10 mM EDTA. Po dodaniu odpowiednio 1 ml tej zawiesiny do 1 ml 100 buforu
PL 211 754 B1 boranowego (pH 9,0) zawierającego 10 mM EDTA, 200 komponentu karboksylowego i 400 mM aminokwasu dla doprowadzenia do objętości końcowej 2 ml, prowadzono reakcję w 18°C przez 2 godziny. Peptydy otrzymane w wyniku tej reakcji przedstawiono w Tabeli 1.
T a b e l a 1
Komponent karboksylowy Komponent aminowy Otrzymany peptyd (mM) Komponent karboksylowy Komponent aminowy Otrzymany peptyd (mM)
L-Ala-OMe L-Leu L-Ala-L-Leu 38,2 Gly-OMe L-His L-Gly-L-His 22,1
L-Met L-Ala-L-Met 68,3 L-Ser-OMe L-Ser L-Ser-L-Ser 29,0
L-Phe L-Ala-L-Phe 62,4 L-Val-OMe L-Met L-Val-L-Met 10,5
L-Ser L-Ala-L-Ser 51,3 L-Met-OMe L-Phe L-Met-L-Phe 28,5
L-His L-Ala-L-His 52,1 L-Thr-OMe L-Leu L-Thr-L-Leu 23,0
L-Arg L-Ala-L-Arg 72,1 L-Ile-OMe L-Met L-Ile-L-Met 8,3
L-Gln L-Ala-L-Gln 68,0
Wszystkie użyte komponenty karboksylowe były chlorowodorkami.
P r z y k ł a d 3.
Oczyszczanie enzymu
Czynności po odzieleniu przez wirowanie przeprowadzono bądź w lodzie, bądź w 4°C. Empedobacter brevis, szczep FERM BP-8113 (Instytucja depozytariusza: National Institute for Advanced Industrial Science and Technology, International Patent Organism Depositary, Adres depozytariusza: Chuo Dai-6, 1-1 Higashi 1-Chome, Tsukuba-shi, Ibaraki-ken, Japonia, Data przekazania międzynarodowego depozytu: 8 lipca 2002) hodowano tak jak w Przykładzie 1, a komórki mikroorganizmów zebrano przez rozdział wirówkowy (10000 obr/min, 15 minut).
Po przemyciu 16 g komórek mikroorganizmów 50 mM buforem Tris-HCl (pH 8,0) zawieszono je w 40 ml (ml lub mL) tego samego buforu i poddawano przez 45 minut operacji miaż d ż enia za pomocą ultradźwięków przy 195 watach. Ciecz po miażdżeniu ultradźwiękami poddano wirowaniu (10000 obr/min, 30 minut) w celu usunięcia fragmentów zmiażdżonych komórek i otrzymania nadsączu cieczy po miażdżeniu ultradźwiękami. Ten nadsącz cieczy po miażdżeniu ultradźwiękami dializowano w ciągu nocy wobec 50 mM buforu Tris-HCl (pH 8,0), a następnie usunięto frakcję nierozpuszczalną przez ultrawirowanie (50000 obr/min, 30 minut) w celu otrzymania frakcji rozpuszczalnej w postaci nadsączu. Otrzymaną frakcję rozpuszczalną naniesiono na kolumnę z Q-Sepharose HP (produkcji Amersham) wstępnie równowagowaną buforem Tris-HCl (pH 8,0) i z niezaadsorbowanej frakcji zebrano frakcję aktywną. Tę frakcję aktywną dializowano w ciągu nocy wobec 50 mM buforu octanowego (pH 4,5), a następnie poddano rozdziałowi przez wirowanie (10000 obr/min, 30 minut) w celu otrzymania frakcji dializowanej w postaci nadsączu. Następnie tę frakcję dializowaną naniesiono na kolumnę z Mono S (produkcji Amersham) wstępnie równowagowaną 50 mM buforem octanowym (pH 4,5) w celu wyeluowania enzymu przy liniowym gradiencie stężenia tego samego buforu zawierającego 0 do 1 M NaCl. Frakcję o najniższym spośród frakcji aktywnych poziomie zanieczyszczających białek naniesiono na kolumnę Superdex 20 pg (produkcji Amersham) wstępnie równowagowaną 50 mM buforem octanowym (pH 4,5) zawierającym 1M NaCl i przeprowadzono filtrację żelową przez zapewnienie przepływu tego samego buforu (pH 4,5) zawierającego 1M NaCl przez kolumnę w celu otrzymania roztworu frakcji aktywnej. W wyniku przeprowadzenia tych procedur, na podstawie wyników eksperymentalnych elektroforezy potwierdzono oczyszczenie w sposób powtarzalny wytwarzającego peptyd enzymu stosowanego w wynalazku. Stopień odzyskania enzymu w opisanym procesie oczyszczania wyniósł 12,2%, a stopień oczyszczenia był 707-krotny.
P r z y k ł a d 4.
Pomiar ciężaru cząsteczkowego enzymu
Elektroforeza na żelu SDS
0,3 mikrograma ^g) frakcji oczyszczonego enzymu otrzymanej metodą według Przykładu 3 poddano elekroforezie w żelu poliakryloamidowym. Jako roztwór buforowy do elektroforezy zastosowano 0,3% (w/v) Tris, 1,44% (w/v) glicynę i 0,1% (w/v) laurylosulfonian sodu, jako żel poliakryloamidowy zastosowano żel o gradiencie stężenia żelu 10 do 20% (Multigel 10 do 20, produkcji Daiichi
PL 211 754 B1
Pure Chemicals), a jako markery ciężaru cząsteczkowego zastosowano markery ciężaru cząsteczkowego Pharmacia. Po zakończeniu elektroforezy żel wybarwiono błękitem brylantowym Coomassiego R-250 i wykryto jednorodne pasmo w miejscu ciężaru częsteczkowego 75 kilodaltonów (kDa).
Filtracja żelowa
Frakcję oczyszczonego enzymu otrzymaną metodą według Przykładu 3 naniesiono na kolumnę z Superdex 200 pg (produkcji Amersham) wstępnie równowagowaną 50 mM buforem octanowym (pH 4,5) zawierającym 1M NaCl i w celu zmierzenia ciężaru cząsteczkowego prowadzono filtrację żelową, doprowadzając do przepływu przez kolumnę tego samego buforu (pH 4,5) zawierającego 1M NaCl. W celu sporządzenia krzywej kalibracyjnej, jako białka wzorcowe o znanych ciężarach cząsteczkowych użyto markery ciężaru cząsteczkowego Pharmacia. Otrzymany w wyniku ciężar cząsteczkowy enzymu wynosił 150 kDa.
Na podstawie wyników elektroforezy w żelu SDS i filtracji żelowej zasugerowano, że enzym jest homodimerem o ciężarze cząsteczkowym 75 kDa.
P r z y k ł a d 5.
Optimum pH enzymu
Wpływ pH sprawdzono w reakcji, w której z chlorowodorku estru metylowego L-alaniny i L-glutaminy wytwarza się L-alanylo-L-glutaminę. Jako bufory stosowano bufor octanowy (pH 3,9 do 5,4), bufor MES (pH 5,4 do 6,4), bufor fosforanowy (pH 6,0 do 7,9), bufor boranowy (pH 7,8 do 9,3), bufor
CAPS (pH 9,3 do 10,7) i bufor K2HPO4-NaOH (pH 10,8 do 11,6).
mikrolitr (ul) frakcji MonoS enzymu otrzymanej w Przykładzie 3 (180 J/ml) dodano do 100 μΐ każdego buforu (100 mM) zawierającego 100 mM ester metylowy L-alaniny, 200 mM L-glutaminę i 10 mM EDTA i pozostawiono na 5 minut do reakcji w 18°C w celu określenia wpływu pH na reakcję. Wyniki oparte na przypisaniu wartości 100% przypadkowi użycia buforu boranowego (pH 9,3) przedstawiono na Fig. 1. W rezultacie optymalnym pH enzymu było 8 do 9,5.
P r z y k ł a d 6.
Optymalna temperatura enzymu
Wpływ temperatury sprawdzono w reakcji, w której z chlorowodorku estru metylowego L-alaniny i L-glutaminy wytwarza się L-alanylo-L-glutaminę. 1 μl porcję tej samej frakcji enzymu co użyta w Przykładzie 5 dodano do 100 μl 100 mM buforu boranowego (pH 9,0) zawierającego 100 mM ester metylowy L-alaniny, 200 mM L-glutaminę i 10 mM EDTA i pozostawiono na 5 minut do reakcji w każdej temperaturze w celu określenia wpływu temperatury na reakcję. Wyniki oparte na przypisaniu wartości 100% aktywności w 34°C przedstawiono na Fig. 2. W rezultacie optymalną temperaturą enzymu było 30 do 40°C.
P r z y k ł a d 7.
Inhibitory enzymu
Wpływ inhibitorów na wytwarzanie L-alanylo-L-glutaminy badano stosując jako substraty chlorowodorek estru metylowego L-alaniny i L-glutaminę. 2 μl porcję tej samej frakcji enzymu co użyta w Przykładzie 5 dodano do 50 μl 100 mM buforu boranowego (pH 9,0) zawierającej każdy z inhibitorów enzymu przedstawionych w Tabeli 2 w stężeniu 10 mM i pozostawiono na 5 minut do reakcji w 25°C. Należy zauważyć, że o-fenantrolina, fluorek fenylometylosulfonylu i p'-guanidynobenzoesan p-nitrofenylu były przed użyciem rozpuszczone w metanolu do stężenia 50 mM. Aktywność enzymu w każdych warunkach była przedstawiona jako aktywność względna w przypadku przypisania wartości 100 wytwarzaniu L-alanylo-L-glutaminy przy nieobecności inhibitora enzymu. Wyniki te przedstawiono w Tabeli 2. W rezultacie spośród badanych inhibitorów enzymu serynowego enzym nie był hamowany przez fluorek fenylometylosulfonylu, lecz był hamowany przez p'-guanidynobenzoesan p-nitrofenylu.
T a b e l a 2
Inhibitor enzymu Względna aktywność wytwarzania L-Ala-L-Gln (%)
1 2 3
Brak 100
Inhibitor metaloenzymu EDTA 96
o-Fenantrolina 96
PL 211 754 B1 cd. tabeli 2
1 2 3
Inhibitor enzymu SH N-Etylomaleimid 110
Monojodooctan 101
Inhibitor enzymu serynowego Fluorek fenylometylosulfonylu 115
Fluorek 4-(2-aminoetylo)benzenosulfonylu 75
p'-Guanidynobenzoesan p-nitrofenylu 0,1
P r z y k ł a d 8.
Wytwarzanie L-alanylo-L-glutaminy z estru metylowego L-alaniny i L-glutaminy μΐ porcję tej samej frakcji enzymu co użyta w Przykładzie 5 dodano do 100 μΐ 100 mM buforu boranowego (pH 9,0) zawierającego 100 mM chlorowodorku estru metylowego L-alaniny, 200 mM L-glutaminę i 10 mM EDTA i pozostawiono do reakcji w 18°C. W rezultacie, co przedstawiono na Fig. 3, w przypadku szarży z dodanym enzymem otrzymano 83 mM L-alanylo-L-glutaminę (L-Ala-L-Gln), a stężenie produktu ubocznego L-Ala-L-Ala-L-Gln wynosiło 1,3 mM. Z drugiej strony, w szarży bez dodanego enzymu niemal nie obserwowano wytwarzania L-Ala-L-Gln, a stężenie enzymu po reakcji trwającej 120 minut wynosiło 0,07 mM.
P r z y k ł a d 9.
Wpływ stężenia L-glutaminy na wytwarzanie L-alanylo-L-glutaminy μl porcję tej samej frakcji enzymu co użyta w Przykładzie 5 dodano do 100 μl 100 mM buforu boranowego (pH 9,0) zawierającego 100 mM chlorowodorku estru metylowego L-alaniny, L-glutaminę w stężeniach przedstawionych w Tabeli 3 i 10 mM EDTA i pozostawiono na 2 godziny do reakcji w 18°C. Wyniki przedstawiono w Tabeli 3.
T a b e l a 3
Chlorowodorek estru metylowego L-alaniny (mM) L-Glutamina (mM) L-Ala-L-Gln (mM)
100 100 68,2
110 72,1
120 73,3
130 75,1
150 75,5
200 82,0
P r z y k ł a d 10.
Specyficzność substratu enzymu (1)
Zbadano specyficzność estru w przypadku użycia estru L-aminokwasu jako komponentu karboksylowego. 2 μl porcję tej samej frakcji enzymu co użyta w Przykładzie 5 dodano do 100 μl 100 mM buforu boranowego (pH 9,0) zawierającego 100 mM komponenty przedstawione w Tabeli 4, 200 mM L-glutaminę i 10 mM EDTA i pozostawiono na 2 godziny do reakcji w 25°C. Ilości L-Ala-L-Gln otrzymane w tej reakcji przedstawiono w Tabeli 4 (w Tabeli 4 HCl oznacza chlorowodorek).
T a b e l a 4
Komponent karboksylowy Otrzymany L-Ala-L-Gln (mM)
Ester metylowy L-alaniny-HCl 84,3
Ester etylowy L-alaniny-HCl 91,5
Ester izopropylowy L-alaniny-HCl 78,9
Ester t-butylowy L-alaniny-HCl 7,5
PL 211 754 B1
P r z y k ł a d 11.
Specyficzność substratu enzymu (2)
Zbadano wytwarzanie peptydu w przypadku użycia estru metylowego L-alaniny jako komponentu karboksylowego i różnych L-aminokwasów jako komponentu aminowego. 2 μl porcję tej samej frakcji enzymu co użyta w Przykładzie 5 dodano do 100 μl 100 mM buforu boranowego (pH 9,0) zawierającego 100 mM chlorowodorku estru metylowego L-alaniny, 150 mM L-aminokwasy przedstawione w Tabeli 5 i 10 mM EDTA i pozostawiono na 3 godziny do reakcji w 25°C. Ilości każdego z peptydów otrzymane w tej reakcji przedstawiono w Tabeli 5. (Znak „+” oznacza te peptydy których otrzymanie potwierdzono, lecz których nie można było oznaczyć ilościowo z powodu braku wzorca, podczas gdy „śl” oznacza ilość śladową.)
T a b e l a 5
Komponent aminowy Otrzy™ny (mM) peptyd Komponent aminowy Otrzymany (mM) peptyd
Gly L-Ala-Gly 13,7 L-Asn L-Ala-L-Asn 65,5
L-Ala L-Ala-L-Ala 25,4 L-Gln L-Ala-L-Gln 79,3
L-Val L-Ala-L-Val 20,8 L-Tyr L-Ala-L-Tyr 17,6
L-Leu L-Ala-L-Leu 45,3 L-CySH L-Ala-L-CySH +
L-Ile L-Ala-L-Ile 33,9 L-Lys L-Ala-L-Lys 71,8
L-Met L-Ala-L-Met 83,3 L-Arg L-Ala-L-Arg 88,0
L-Phe L-Ala-L-Phe 74,4 L-His L-Ala-L-His 66,9
L-Trp L-Ala-L-Trp 53,9 L-Asp L-Ala-L-Asp 2,1
L-Ser L-Ala-L-Ser 62,5 L-Glu L-Ala-L-Glu 42,9
L-Thr L-Ala-L-Thr 53,9 L-Pro L-Ala-L-Pro śl
P r z y k ł a d 12.
Specyficzność substratu enzymu (3)
Zbadano wytwarzanie enzymu w przypadku użycia estrów metylowych różnych rodzajów L-aminokwasu jako komponentu karboksylowego i użycia L-glutaminy jako komponentu aminowego. 2 μl porcje tej samej frakcji enzymu co użyta w Przykładzie 5 dodano do 100 μl 100 mM buforu boranowego (pH 9,0) zawierającego 100 mM chlorowodorku estru metylowego L-aminokwasu (AA-OMe-HCl) przedstawione w Tabeli 6, 150 mM L-glutaminę i 10 mM EDTA i pozostawiono na 3 godziny do reakcji w 25°C. Ilości każdego z peptydów otrzymane w tej reakcji przedstawiono w Tabeli 6. (Znak „+” oznacza te peptydy dla których wytwarzanie potwierdzono, lecz których nie można było oznaczyć ilościowo z powodu braku wzorca, podczas gdy „śl” oznacza ilość śladową.) W przypadku użycia L-Trp-OMe i L-Tyr-Ome do układu reakcyjnego dodano ponadto Tween-80 do stężenia końcowego 0,1%.
T a b e l a 6
Komponent karboksylowy Otrzymany (mM) peptyd Komponent karboksylowy Otrzymany (mM) peptyd
1 2 3 4 5 6
Gly-OMe Gly-L-Gln 54,7 L-Tyr-OMe L-Tyr-L-Gln 3,4
L-Ala-OMe L-Ala-L-Gln 74,6 CySH-OMe L-CySH-L-Gln +
L-Val-OMe L-Val-L-Gln 15,4 L-Lys-OMe L-Lys-L-Gln +
L-Leu-OMe L-Leu-L-Gln + L-Arg-OMe L-Arg-L-Gln 7,1
L-Ile-OMe L-Ile-L-Gln 8,4 L-His-OMe L-His-L-Gln +
L-Met-OMe L-Met-L-Gln 12,0 L-Asp-a-OMe a-L-Asp-L-Gln śl
L-Phe-OMe L-Phe-L-Gln 0,9 L-Asp-p-OMe P-L-Asp-L-Gln śl
PL 211 754 B1 cd. tabeli 6
1 2 3 4 5 6
L-T rp-OMe L-Trp-L-Gln + L-Glu-a-OMe a-L-Glu-L-Gln +
L-Ser-OMe L-Ser-L-Gln 24,0 L-Glu-Y-OMe γ-L-Glu-L-Gln +
L-Thr-OMe L-Thr-L-Gln 81,9 L-Pro-OMe L-Pro-L-Gln 2,2
L-Asn-OMe L-Asn-L-Gln +
L-Gln-OMe L-Gln-L-Gln 0,3
Wszystkie komponenty karboksylowego użyto w postaci chlorowodorków
P r z y k ł a d 13.
Specyficzność substratu enzymu (4)
Zbadano wytwarzanie peptydu w przypadku użycia estrów metylowych różnych L-aminokwasów jako komponentów karboksylowego i różnych L-aminokwasów jako komponentów aminowych. 2 μl porcje tej samej frakcji enzymu co użyta w Przykładzie 5 dodano do 100 μl 100 nM buforu boranowego (pH 9,0) zawierającego 100 mM chlorowodorku estru metylowego L-aminokwasu (AA-OMe-HCl) przedstawione w Tabeli 7, 150 mM L-aminokwasy przedstawione w Tabeli 7 i 10 mM i pozostawiono na 3 godziny do reakcji w 25°C. Ilości każdego z peptydów otrzymane w tej reakcji przedstawiono w Tabeli 7. („śl” oznacza ilość śladową). W przypadku użycia L-Trp-OMe do układu reakcyjnego dodano ponadto Tween 80 do stężenia końcowego 0,1%. (Znak „+” oznacza te peptydy dla których wytwarzanie potwierdzono, lecz których nie można było oznaczyć ilościowo z powodu braku wzorca.)
T a b e l a 7
Komponent karboksy- lowy Kompo- nent amino- wy Otrzymany (mM) peptyd Komponent karboksylowy Kompo- nent aminowy Otrzymany (mM) peptyd
Gly-OMe L-CySH Gly-L-CySH 45,6 L-Met-OMe L-Ser L-Met-L-Ser 12,8
L-Arg Gly-L-Arg 25,5 L-Met L-Met-L-Met 25,0
L-Phe Gly-L-Phe 44,0 L-Phe L-Met-L-Phe 34,0
L-His Gly-L-His 31,6 L-Ile-OMe L-Ser L-Ile-L-Ser 17,2
L-Lys Gly-L-Lys 9,8 L-Met L-Ile-L-Met 10,0
L-Ser Gly-L-Ser 44,2 L-Phe L-Ile-L-Phe 5,2
L-Thr-OMe Gly L-Thr-Gly 9,4 L-Arg-OMe L-Ser L-Arg-L-Ser 3,6
L-Ala L-Thr-L-Ala 9,4 L-Met L-Arg-L-Met 0,7
L-Val L-Thr-L-Val 0,7 L-Phe L-Arg-L-Phe 1,9
L-Leu L-Thr-L-Leu 28,4 L-Leu-OMe L-Met L-Leu-L-Met 12,2
L-Met L-Thr-L-Met 38,6 L-Trp-OMe L-Met L-Trp-L-Met 4,1
L-Ser L-Thr-L-Ser 58,2 L-Lys-OMe L-Met L-Lys-L-Met 6,8
L-Ser-OMe L-Ser L-Ser-L-Ser 38,0 L-His-OMe L-Met L-His-L-Met 6,5
L-Met L-Ser-L-Met 12,5 L-Asn-OMe L-Glu LAsn-L-Glu 10,2
L-Phe L-Ser-L-Phe 20,3
L-Val-OMe L-Ser L-Val-L-Ser 30,8
L-Met L-Val-L-Met 10,3
L-Phe L-Val-L-Phe 6,1
Wszystkie komponenty karboksy użyto w postaci chlorowodorków
PL 211 754 B1
P r z y k ł a d 14.
Specyficzność substratu enzymu (5)
Zbadano wytwarzanie peptydu w przypadku użycia estrów metylowych form L lub D różnych aminokwasów jako komponentu karboksylowego i form L lub D różnych aminokwasów jako komponentu aminowego. 2 μl samej frakcji enzymu co użyta w Przykładzie 5 dodano do 100 μl 100 mM buforu boranowego (pH 9,0) zawierającego 100 mM chlorowodorki estru metylowego różnych aminokwasów (AA-OMe-HCl) przedstawionych w Tabeli 8, 150 mM różne aminokwasy przedstawione w Tabeli 8 i 10 mM EDTA i pozostawiono na 3 godziny do reakcji w 25°C. Ilości każdego z peptydów otrzymane w tej reakcji przedstawiono w Tabeli 8. („śl” oznacza ilość śladową.)
T a b e l a 8
Komponent karboksylowy Komponent aminowy Otrzymany peptyd (mM)
D-Ala-OMe L-Gln D-Ala-L-Gln 69,3
D-Ala-OMe L-Ser D-Ala-L-Ser 20,3
D-Thr-OMe D-Thr-L-Ser 1,0
D-Ser-OMe D-Ser-L-Ser 3,3
D-Val-OMe D-Val-L-Ser 0,6
D-Met-OMe D-Met-L-Ser 5,1
L-Ala-OMe D-Gln L-Ala-D-Gln 0,3
L-Ala-OMe D-Ser L-Ala-D-Ser 5,4
L-Thr-OMe L-Thr-D-Ser 6,9
L-Ser-OMe L-Ser-D-Ser 16,2
L-Val-OMe L-Val-D-Ser 1,4
L-Met-OMe L-Met-D-Ser 1,9
D-Ala-OMe D-Gln D-Ala-D-Gln śl
D-Ala-OMe D-Ser D-Ala-D-Ser 0,2
D-Thr-OMe D-Thr-D-Ser 1,1
D-Ser-OMe D-Ser-D-Ser 2,5
D-Val-OMe D-Val-D-Ser 0,5
D-Met-OMe D-Met-D-Ser 2,7
Wszystkie komponenty karboksylowego użyto w postaci chlorowodorków
P r z y k ł a d 15.
Specyficzność substratu enzymu (6)
Zbadano wytwarzanie peptydu w przypadku użycia amidów różnych L-aminokwasów jako komponentów karboksylowego i różnych L-aminokwasów jako komponentów aminowych. 2 μl porcje tej samej frakcji enzymu co użyta w Przykładzie 5 dodano do 100 μl 100 mM buforu boranowego (pH 9,0) zawierającego 100 mM chlorowodorki amidów L-aminokwasów (AA-NH2-HCl) przedstawionych w Tabeli 9, 150 mM L-aminokwasy przedstawione w Tabeli 9 i 10 mM EDTA i pozostawiono na 3 godziny do reakcji w 25°C. Ilości każdego z peptydów otrzymane w tej reakcji przedstawiono w Tabeli 9.
T a b e l a 9
Komponent karboksylowy Komponent aminowy Otrzymany (mM) peptyd
1 2 3 4
L-Phe-NH2 L-Gln L-Phe-L-Gln 0,2
L-Phe-NH2 L-Ser L-Phe-L-Ser 0,6
PL 211 754 B1 cd. tabeli 9
1 2 3 4
L-Ala- NH2 L-Gln L-Ala-L-Gln 7,6
L-Ala-NH2 L-Met L-Ala-L-Met 3,4
L-Ala-NH2 L-His L-Ala-L-His 3,9
L-Thr-NH2 L-Gln L-Thr-L-Gln 0,3
P r z y k ł a d 16.
Specyficzność substratu enzymu (7)
Zbadano wytwarzanie peptydu w przypadku użycia różnych estrów metylowych L-alaniny jako komponentów karboksylowych i zabezpieczonych na atomie węgla L-aminokwasów jako komponentów aminowych. 2 μΐ porcje tej samej frakcji enzymu co użyta w Przykładzie 5 dodano do 100 μΐ 100 mM buforu boranowego (pH 9,0) zawierającego 100 mM ester metylowy L-aminokwasu (AA-OMe-HCl) przedstawiony w Tabeli 10, 150 mM amidy L-aminokwasów przedstawione w Tabeli 10 i 10 mM EDTA i pozostawiono na 3 godziny do reakcji w 25°C. Ilości każdego z peptydów otrzymane w tej reakcji przedstawiono w Tabeli 10.
T a b e l a 10
Komponent karboksylowy Komponent aminowy Otrzy™ny (mM) peptyd
L-Ala-OMe Gly-NH2 L-Ala-Gly-NH2 7,4
L-Ala-NH2 L-Ala-L-Ala-NH2 8,3
L-Phe-NH2 L-Ala-L-Phe-NH2 12,2
P r z y k ł a d 17.
Specyficzność substratu enzymu (8)
Zbadano wytwarzanie peptydu w przypadku użycia estrów metylowych różnych aminokwasów jako komponentów karboksylowego i metyloaminy jako komponentu aminowego. 2 μl porcje tej samej frakcji enzymu co użyta w Przykładzie 5 dodano do 100 μl 100 mM buforu boranowego (pH 9,0) zawierającego 100 mM ester metylowy aminokwasu (AA-OMe-HCl) przedstawiony w Tabeli 11, 150 mM metyloaminę przedstawioną w Tabeli 11 i 10 mM EDTA i pozostawiono na 3 godziny do reakcji w 25°C. Ilości każdego z peptydów otrzymane w tej reakcji przedstawiono w Tabeli 11.
T a b e l a 11
Komponent karboksylowy Komponent aminowy Otrzymany peptyd (mM)
Gly-OMe Metyloamina Gly-metyloamina 1,1
L-Thr-OMe L-Thr-metyloamina 0,2
L-Ala-OMe L-Ala-metyloamina 0,3
P r z y k ł a d 18.
Specyficzność substratu enzymu (9)
Zbadano wytwarzanie peptydu w przypadku użycia estru β-aminokwasu jako komponentu karboksylowego lub β-aminokwasu jako komponentu aminowego. 2 μl porcje tej samej frakcji enzymu co użyta w Przykładzie 5 dodano do 100 μl 100 mM buforu boranowego (pH 9,0) zawierającego 100 mM komponenty karboksylowego przedstawione w Tabeli 12, 150 mM komponenty aminowe przedstawione w Tabeli 12 i 10 mM EDTA i pozostawiono na 3 godziny do reakcji w 25°C. Ilości każdego z peptydów otrzymane w tej reakcji przedstawiono w Tabeli 12. („śl” oznacza ilość śladową.)
PL 211 754 B1
T a b e l a 12
Komponent karboksylowy Komponent aminowy Otrzymany peptyd (mM)
Gly-OMe β-Ala Gly-p-Ala 2,2
Gly-OMe β-Phe Gly^-Phe 0,4
L-Ala-OMe β-Ala Ala-p-Ala 7,7
L-Ala-OMe β-Phe Ala^-Plie 1,4
L-Thr-OMe β-Ala Thr^-Ala 3,2
L-Thr-OMe β-Phe Thr^-Rhe 1,4
β-Ala-OMe L-a-Ala β-Ala-L-a-Ala śl
β-Ala-OMe β-Ala 0,2
B-Ala-OMe L-Gln β-Ala-L-Gln 0,6
B-Ala-OMe L-Ser β-Ala-L-Ser 3,2
P r z y k ł a d 19.
Specyficzność substratu enzymu (10)
Zbadano wytwarzanie oligopeptydu w przypadku użycia estru L-aminokwasu jako komponentu karboksylowego i peptydu jako komponentu aminowego. 2 μl porcje tej samej frakcji enzymu co użyta w Przykładzie 5 dodano do 100 μl 100 mM buforu boranowego (pH 9,0) zawierającego 100 mM komponenty karboksylowe przedstawione w Tabeli 13, 150 mM komponenty aminowe przedstawione w Tabeli 13 i 10 mM EDTA i pozostawiono na 3 godziny do reakcji w 25°C. Ilości każdego z peptydów otrzymane w tej reakcji przedstawiono w Tabeli 13. W wyniku wykazano w sposób oczywisty, że przedstawiony enzym może wytwarzać nie tylko dipeptyd, lecz także peptydy o długim łańcuchu przy użyciu peptydu jako komponentu aminowego.
Jak pokazano w przedstawionych wcześniej Przykładach 9 do 19, przedstawiony enzym otrzymany z Empedobacter brevis szczep FERM BP-8113 (Instytucja depozytariusza: National Institute for Advanced Industrial Science and Technology, International Patent Organism Depositary, Adres depozytariusza: Chuo Dai-6, 1-1 Higashi 1-Chome, Tsukuba-shi, Ibaraki-ken, Japonia, Data przekazania międzynarodowego depozytu: 8 lipca 2002) wykazał wyjątkowo szeroki zakres specyficzności substratu.
T a b e l a 13
Komponent karboksylowy Komponent aminowy Otrzymany peptyd (Mm)
1 2 3 4
L-Ala-OMe L-Ala L-Ala-L-Ala 28,7
L-Ala-L-Ala L-Ala-L-Ala-L-Ala 57,5
L-Ala-L-Ala-L-Ala L-Ala-L-Ala-L-Ala-L-Ala 44,5
L-Ala-L-Ala-L-Ala-L-Ala L-Ala-L-Ala-L-Ala-L-Ala-L-Ala 34,8
L-Ala-L-Ala-L-Ala-L-Ala-L-Ala L-Ala-L-Ala-L-Ala-L-Ala-L-Ala-L-Ala 1,4*
L-Ala-L-Gln L-Ala-L-Ala-L-Gln 15,2
Gly-L-Ala L-Ala-Gly-L-Ala 25,9
Gly-Gly L-Ala-Gly-Gly 41,7
L-His-L-Ala L-Ala-L-His-L-Ala 55,9
L-Leu-L-Ala L-Ala-L-Leu-L-Ala 48,3
L-Phe-L-Ala L-Ala-L-Phe-L-Ala 49,7
L-Phe-Gly L-Ala-L-Phe-Gly 43,7
PL 211 754 B1 cd. tabeli 13
1 2 3 4
Gly-OMe L-Ala-L-Tyr Gly-L-Ala-L-Tyr 1,7
Gly-L-Gln Gly-Gly-L-Gln 7,2
Gly-L-Tyr-L-Ala Gly-Gly-L-Tyr-L-Ala 44,2
L-Thr-OMe Gly-Gly L-Thr-Gly-Gly 83,0
* Ponieważ rozpuszczalność L-Ala-L-Ala-L-Ala-L-Ala-L-Ala była niska, komponent karboksylowego użyto w tym ukł adzie reakcyjnym przy stężeniu 10 mM a komponent aminowy przy stężeniu 15 mM. Inne warunki były takie same jak podano w przykładzie.
P r z y k ł a d 20.
Porównanie zdolności do katalizowania wytwarzania peptydów ze znanymi enzymami
Porównano zdolność enzymu do tworzenia peptydów ze zdolnością znanych enzymów.
Jako znane enzymy zastosowano karboksypeptydazę Y opisaną w EP 278787A1 i tioloendopeptydazy (ficynę, papainę, bromelainę i chymopapainę) opisane w EP 359399B1, które użyto w postaci oczyszczonych enzymów produkowanych przez Sigma. Jako źródło enzymu według wynalazku użyto enzym oczyszczony w Przykładzie 3. Enzymy te dodano do układu reakcyjnego w ilościach przedstawionych w Tabeli 14 w przeliczeniu na białko. Reakcję prowadzono przez dodanie enzymu do 100 μl buforu koranowego (pH 9,0) zawierającego 100 mM ester metylowy L-alaniny i 200 mM glutaminę i pozostawiono do reakcji w 25°C. Ponadto, jako karboksypeptydaza był użyty enzym rozpuszczony w 10 mM buforze octanowym (pH 5,0) zawierającym 1 mM EDTA, natomiast jako tioloendopeptydaza był użyty enzym rozpuszczony w 10 mM buforze octanowym (pH 5,0) zawierającym 2 mM EDTA, 0,1 M KCl i 5 ditiotreitol. Stosunki szybkości tworzenia przez te enzymy L-alanino-L-glutaminy przedstawiono w Tabeli 14.
W rezultacie, nawet przy nieobecności enzymu zaobserwowano utworzenie śladowej ilości L-alanino-L-glutaminy, podczas gdy niewielki w porównaniu z szarżą bez dodanego enzymu wzrost szybkości tworzenia zauważono w szarży w której dodano karboksypeptydazę lub tioloendopeptydazę. W przeciwieństwie do tego, zaobserwowano przytłaczające zwiększenie szybkości otrzymywania L-alanino-L-glutaminy w szarży, w której dodano enzym i ta szybkość otrzymywania była 5000 do 100000 razy większa niż dla karboksypeptydazy Y i tioloendopeptydazy. Jak opisano wyżej, została potwierdzona niezwykle duża szybkość tworzenia peptydu, nie porównywalna z jakimkolwiek enzymem według znanego stanu wiedzy. Co więcej, w przeciwieństwie do enzymu według wynalazku, który jest dimerem o ciężarze cząsteczkowym 75000, ponieważ ciężar cząsteczkowy karboksypeptydazy Y wynosi według doniesień 61000, podczas gdy ciężar cząsteczkowy tioloendopeptydazy wynosi według doniesień 23000 do 36000, wykazana w przykładach szybkość tworzenia L-alanylo-L-glutaminy w stosunku do ciężaru cząsteczkowego jest dla enzymu według wynalazku jeszcze większa niż w stosunku do jednostki wagi.
T a b e l a 14
Enzym Ilość dodanego enzymu (białko mg/ml) Szybkość tworzenia L-Ala-L-Gln (mM/min) Stosunek szybkości tworzenia L-Ala-L-Gln na jednostkę wagi enzymu
Brak enzymu 0 0,0006
Karboksypeptydaza Y 0,61 0,0257 0,0191
Ficyna 2,60 0,0096 0,0017
Papaina 2,30 0,0106 0,0021
Bromelaina 2,80 0,0062 0,0010
Chymopapaina 3,60 0,0100 0,0013
Enzym według wynalazku 0,02 4,4000 100,0
PL 211 754 B1
P r z y k ł a d 21.
Otrzymywanie L-alanylo-L-glutaminy z użyciem komórek drobnoustrojowych Sphingobacterium sp.
ml pożywki (pH 7,0) zawierającej 5 g glukozy, 5 g siarczanu amonu, 1 g fosforanu monopotasowego, 3 g fosforanu dipotasowego, 0,5 g siarczanu magnezu, 10 g ekstraktu z drożdży i 10 g peptonu w 1 l, przeniesiono do 500 ml kolby Sakaguchi i sterylizowano przez 15 minut w 115°C w celu hodowania Sphingobacterium sp. szczep FERM BP-8124 (Instytucja depozytariusza: National Institute for Advanced Industrial Science and Technology, International Patent Organism Depositary, Adres depozytariusza: Chuo Dai-6, 1-1 Higashi 1-Chome, Tsukuba-shi, Ibaraki-ken, Japonia, Data przekazania międzynarodowego depozytu: 22 lipca 2002). Pożywkę tę zaszczepiono następnie jedną ezą Sphingobacterium sp. szczep FEPM BP-8124 (Instytucja depozytariusza: National Institute for Advanced Industrial Science and Technology, International Patent Organism Depositary, Adres depozytariusza: Chuo Dai-6, 1-1 Higashi 1-Chome, Tsukuba-shi, Ibaraki-ken, Japonia, Data przekazania międzynarodowego depozytu: 22 lipca 2002) hodowanego przez 24 godziny w 30°C w skośnej pożywce agarowej (agar: 20 g/l, pH 7,0) zawierającej 5 g glukozy, 10 g ekstraktu z drożdży, 10 g peptonu i 5 g NaCl w 1 l, a następnie przez 20 godzin hodowano przy wytrząsaniu w 30°C przy 120 suwach/minutę. 1 ml porcję tego bulionu hodowlanego dodano następnie do opisanej wyżej pożywki (50 ml/500 ml kolba Sakaguchi) i hodowano przez 18 godzin w 30°C. Po doprowadzeniu hodowli do końca, komórki drobnoustrojowe oddzielono od bulionu z hodowli przez odwirowanie i zawieszono w 0,1 M buforze boranowym (pH 9,0) zawierającym 10 mM RDTA do 100 g/l jako mokre komórki drobnoustrojowe. Do 0,1 ml tej zawiesiny dodano następnie 0,1 ml porcję 100 mM buforu boranowego (pH 9,0) zawierającego 10 mM EDTA, 200 mM chlorowodorek estru metylowego L-alanylu i 400 mM L-glutaminę i po doprowadzeniu końcowej objętości do 0,2 ml pozostawiono na 120 minut do reakcji w 25°C. Ilość L-alanylo-L-glutaminy otrzymanej w tym czasie wyniosła 62 mM.
P r z y k ł a d 22.
Oczyszczanie enzymu ze Sphingobacterium sp.
Procedurę po oddzieleniu przez wirowanie przeprowadzono bądź w lodzie, bądź w 4°C. Sphingobacterium sp. szczep FEPM BP-8124 (Instytucja depozytariusza: National Institute for Advanced Industrial Science and Technology, International Patent Organism Depositary, Adres depozytariusza: Chuo Dai-6, 1-1 Higashi 1-Chome, Tsukuba-shi, Ibaraki-ken, Japonia, Data przekazania międzynarodowego depozytu: 22 lipca 2002) hodowano tak jak w Przykładzie 21 i komórki drobnoustrojowe zebrano przez rozdział wirówkowy (10000 obr/min, 15 minut). Po przemyciu 2 g komórek mikroorganizmów 20 mM buforem Tris-HCl (pH 7,6) zawieszono je w 8 ml tego samego buforu i poddawano przez 45 minut operacji miażdżenia za pomocą ultradźwięków przy 195 watach. Ciecz po miażdżeniu ultradźwiękami poddano wirowaniu (10000 obr/min, 30 minut) w celu usunięcia fragmentów zmiażdżonych komórek i otrzymania nadsączu cieczy po miażdżeniu ultradźwiękami. Ten nadsącz cieczy po miażdżeniu ultradźwiękami dializowano w ciągu nocy wobec 20 mM buforu Tris-HCl (pH 7,6), a następnie usunięto frakcję nierozpuszczalną przez ultrawirowanie (50000 obr/min, 30 minut) w celu otrzymania frakcji rozpuszczalnej w postaci nadsączu. Otrzymaną frakcję rozpuszczalną naniesiono na kolumnę z Q-Sepharose HP (produkcji Amersham) wstępnie równowagowaną buforem Tris-HCl (pH 7,6) i z niezaadsorbowanej frakcji zebrano frakcję aktywną. Tę frakcję aktywną dializowano w ciągu nocy wobec 20 mM buforu octanowego (pH 5,0), a następnie poddano usunięciu frakcji nierozpuszczalnej przez rozdział w wirówce (10000 obr/min, 30 minut) w celu otrzymania frakcji dializowanej w postaci nadsączu. Następnie tę frakcję dializowaną naniesiono na kolumnę z SP-Sepharose HP (produkcji Amersham) wstępnie równowagowaną 20 mM buforem octanowym (pH 5,0) w celu otrzymania frakcji aktywnej, w której eluowano enzym przy liniowym gradiencie stężenia tego samego buforu zawierającego 0 do 1 M NaCl.
P r z y k ł a d 23.
Otrzymywanie L-alanylo-L-glutaminy z użyciem frakcji enzymu 10 μl porcję frakcji z SP-Sepharose HP (27 J/ml) oczyszczonej w Przykładzie 22 dodano do 90 μl 111 mM buforu boranowego (pH 9,0) zawierającego 111 mM chlorowodorek estru metylowego L-alaniny, 222 mM L-glutaminę i 11 EDTA i pozostawiono do reakcji na 120 minut w 25°C. W rezultacie, w szarży z dodanym enzymem otrzymano 73 mM L-alanylo-L-glutaminę. Z drugiej strony, w szarży bez dodanego enzymu niemal nie obserwowano wytwarzania L-Ala-L-Glu, a ilość enzymu po reakcji trwającej 120 minut wynosiła 0,07 mM.
PL 211 754 B1
P r z y k ł a d 24.
Specyficzność substratu enzymu (11)
Specyficzność substratu badano dla enzymu pochodzącego ze Sphingobacterium sp. szczep FEFM BP-8124 (Instytucja będąca depozytariuszem: National Institute for Advanced Industrial Science and Technology, International Patent Organism Depositary, Adres instytucji będącej depozytariuszem: Chuo Dai-6, 1-1 Higashi 1-Chome, Tsukuba-shi, Ibaraki-ken, Japonia, Data przekazania międzynarodowego depozytu: 22 lipca 2002). 100 μl 100 mM buforu boranowego (pH 9,0) zawierającego różne komponenty karboksylowego o końcowym stężeniu 100 mM i różne komponenty aminowe o stężeniu końcowym 150 mM przedstawione w Tabelach 15-1 do 15-4, frakcję enzymu z SP-Sepharose HP oczyszczoną w Przykładzie 22 (dodanie 0,33 jednostek w cieczy reakcyjnej) i 10 mM EDTA pozostawiono na 1,5 godziny do reakcji w 25°C. Ilości każdego z otrzymanych w tej reakcji peptydów przedstawiono w Tabeli 15. (Znak „+” oznacza te peptydy dla których wytwarzanie potwierdzono, lecz których nie można było oznaczyć ilościowo z powodu braku wzorca, podczas gdy „śl” oznacza ilość śladową.) W przypadku użycia L-Tyr-OMe do układu reakcyjnego dodano ponadto Tween-80 do stężenia końcowego 0,1%. Ponadto wszystkie komponenty karboksylowego były użyte jako chlorowodorki.
T a b e l a 15-1
Komponent karboksylowy Komponent aminowy Otrzymany peptyd (mM)
Gly L-Ala-Gly 11,1
L-Ala L-Ala-L-Ala 13,1
L-Val L-Ala-L-Val 10,9
L-Leu L-Ala-L-Leu 33,0
L-Ile L-Ala-L-Ile 24,7
L-Met L-Ala-L-Met 86,9
L-Pro L-Ala-L-Pro 1,5
L-Phe L-Ala-L-Phe 69,5
L-Trp L-Ala-L-Trp 46,0
L-Thr L-Ala-L-Thr 47,3
L-Asn L-Ala-L-Asn 52,3
L-Tyr L-Ala-L-Tyr 11,1
L-CySH L-Ala-L-CySH +
L-Lys L-Ala-L-Lys 71,2
L-Arq L-Ala-L-Arq 72,2
L-His L-Ala-L-His 73,6
L-Asp L-Ala-L-Asp 2,3
L-Glu L-Ala-L-Glu 39,1
L-Ser L-Ala-L-Ser 43,8
D-Ser L-Ala-D-Ser 3,3
D-Ala-OMe L-Ser D-Ala-L-Ser 24,1
D-Ser D-Ala-D-Ser 5,5
PL 211 754 B1
T a b e l a 15-2
Komponent karboksylowy Komponent aminowy Otrzymany peptyd (mM)
L-Thr-OMe L-Gln L-Thr-L-Gln 36,1
Gly-OMe Gly-L-Gln 61,1
L-Ser-OMe L-Ser-L-Gln 12,9
L-Val-OMe L-Val-L-Gln 8,2
L-Met-OMe L-Met-L-Gln 32,6
L-Ile-OMe L-Ile-L-Gln 6,4
L-Arq-OMe L-Arq-L-Gln 17,2
L-Tyr-OMe L-Tyr-L-Gln 0,6
L-Pro-OMe L-Pro-L-Gln 1,8
L-Phe-OMe L-Phe-L-Gln 0,8
L-Gln-OMe L-Gln-L-Gln 0,1
Asp-a-OMe a-L-Asp-L-Gln 0,05
T a b e l a 15-3
Komponent karboksylowy Komponent aminowy Otrzymany peptyd (mM)
1 2 3 4
L-Thr-OMe Gly L-Thr-Gly 0,4
L-Ala L-Thr-L-Ala 5,8
L-Val L-Thr-L-Val 1,3
L-Leu L-Thr-L-Leu 15,3
L-Met L-Thr-L-Met 28,9
Gly-OMe L-Arg Gly-L-Arg 17,9
L-Phe Gly-L-Phe 20,0
L-His Gly-L-His 36,2
L-Lys Gly-L-Lys 48,2
L-Ser Gly-L-Ser 53,8
L-Ser-OMe L-Ser L-Ser-L-Ser 9,9
L-Met L-Ser-L-Met 7,6
L-Phe L-Ser-L-Phe 4,3
L-Val-OMe L-Ser L-Val-L-Ser 31,9
L-Met L-Val-L-Met 6,8
L-Phe L-Val-L-Phe 1,0
L-Met-OMe L-Ser L-Met-L-Ser 25,3
L-Met L-Met-L-Met 28,4
L-Phe L-Met-L-Phe 8,9
PL 211 754 B1 cd. tabeli 15-3
1 2 3 4
L-Ile-OMe L-Ser L-Ile-L-Ser 17,3
L-Met L-Ile-L-Met 5,1
L-Phe L-Ile-L-Phe 1,5
L-Arg-OMe L-Ser L-Arg-L-Ser 2,2
L-Met L-Arg-L-Met śl
L-Phe L-Arg-L-Phe śl
T a b e l a 15-4
Komponent karboksylowy Komponent aminowy Otrzymany peptyd (mM)
L-Ala-OMe Gly amid L-Ala-Gly amid 15,1
L-Ala amid L-Ala-L-Ala amid 9,2
L-Phe amid L-Ala-Phe amid 27,1
L-Ala-OMe Metyloamina L-Ala-metyloamina 0,6
L-Thr-OMe L-Thr-metyloamina 0,3
Gly-OMe Gly-metyloamina 1,0
L-Ala amid L-Gln L-Ala-L-Gln 0,3
L-Met L-Ala-L-Met śl
L-His L-Ala-L-His śl
P r z y k ł a d 25.
Specyficzność substratu enzymu (12)
Specyficzność substratu w odniesieniu do wytwarzania oligopeptydów badano dla enzymu pochodzącego ze Sphingobacterium sp. szczep FERM BP-8124 (Instytucja będąca depozytariuszem: National Institute for Advanced Industrial Science and Technology, International Patent Organism Depositary, Adres instytucji będącej depozytariuszem: Chuo Dai-6, 1-1 Higashi 1-Chome, Tsukuba-shi, Ibaraki-ken, Japonia, Data przekazania międzynarodowego depozytu: 22 lipca 2002). 100 μl porcję buforu boranowego (pH 9,0) zawierającego różne komponenty karboksylowego o końcowym stężeniu 100 mM i różne komponenty aminowe o stężeniu końcowym 150 mM przedstawione w Tabeli 16, frakcję enzymu z SP-Sepharose HP oczyszczoną w Przykładzie 22 (dodanie 0,33 jednostek w cieczy reakcyjnej) i 10 mM EDTA pozostawiono na 1,5 godziny do reakcji w 25°C. Ilości każdego z otrzymanych w tej reakcji peptydów przedstawiono w Tabeli 18. Wszystkie komponenty karboksylowego były ponadto użyte jako chlorowodorki.
T a b e l a 16
Komponent karboksylowy Komponent aminowy Otrzymany (mM) peptyd
1 2 3 4
L-Ala-OMe L-Ala L-Ala-L-Ala 25,6
L-Ala-L-Ala L-Ala-L-Ala-L-Ala 41,1
L-Ala-L-Ala-L-Ala L-Ala-L-Ala-L-Ala-L-Ala 30,1
L-Ala-L-Ala-L-Ala-L-Ala L-Ala-L-Ala-L-Ala-L-Ala-L-Ala 22,8
Gly-Gly L-Ala-Gly-Gly 33,7
Gly-Ala L-Ala-Gly-L-Ala 35,1
PL 211 754 B1 cd. tabeli 16
1 2 3 4
L-His-L-Ala L-Ala-L-His-L-Ala 58,0
L-Phe-Gly L-Ala-L-Phe-Gly 34,0
L-Leu-L-Ala L-Ala-L-Leu-L-Ala 40,7
L-Phe-L-Ala L-Ala-L-Phe-L-Ala 24,8
L-Thr-OMe Gly-Gly L-Thr-Gly-Gly 8,4
Gly-OMe L-Ala-L-Tyr Gly-L-Ala-L-Tyr 0,6
P r z y k ł a d 26.
Specyficzność substratu enzymu (13)
Specyficzność substratu oceniono dodatkowo stosując tę samą frakcję enzymu jak użyta w Przykładzie 5.
T a b e l a 17
Komponent karboksy (mM) Komponent aminowy (mM) Otrzymany peptyd (mM) Czas reakcji (h)
1 2 3 4
H-Ala-OMe H-p-F-Phe-OH H-Ala-p-F-Phe-OH 3
50 mM 50 mM 21,9 mM 3
H-Ala-OMe H-Cl-F-Phe-OH H-Ala-Cl-F-Phe-OH 3
40 mM 40 mM 20,8 mM 3
H-Ala-OMe 40 mM H-Ala-OMe 100 mM H-Ala-OMe 20 mM H-p-NO2-Phe-0H 40 mM H-t-Leu-OH 150 mM H-2-Nal-OH 20 mM H-Ala-p-NO2-Phe-OH 27,5 mM H-Ala-t-Leu-OH 0,4 mM H-Ala-2-Nal-OH + 3
H-p-F-Phe-OMe H-Gln-OH H-p-F-Phe-H-Gln-OH 3
100 mM 150 mM śl 3
H-Cl-F-Phe-OMe H-Gln-OH H-Cl-F-Phe-H-Gln-OH 3
25 mM 50 mM śl 3
H-p-NO2-Phe-OMe H-Gln-OH H-p-NO2-Phe-H-Gln-OH 3
40 mM 40 mM 1,1 mM 3
H-t-Leu-OMe 100 mM H-2-Nal-OMe 40 mM H-Aib-OMe 100 mM H-N-Me-Ala-OMe 100 mM H-Gln-OH 150 mM H-Gln-OH 40 mM H-Gln-OH 150 mM H-Gln-OH 150 mM H-t-Leu-H-Gln-OH śl H-2-Nal-H-Gln-OH śl H-Aib-H-Gln-OH 18,8 mM H-N-Me-Ala-H-Gln-OH 0,5 mM 3
H-Aib-OMe H-Phe-OH H-Aib-Phe-OH 3
100 mM 150 mM 17,2 mM 3
H-CHA-OMe 40 mM H-N-Me-Ala-OMe 100 mM H-Phe-OH 40 mM H-Phe-OH 150 mM H-CHA-Phe-OH + H-N-Me-Ala-Phe-OH śl 3
H-Ala-OMe H-Ser(tBu)OH H-Ala-Ser(tBu)-OH 2
100 mM 150 mM 48,8 mM 2
H-Ser(tBu)-OMe H-Gln-OH H-Ser(tBu)-Gln-OH 2
100 mM 150 mM śl 2
PL 211 754 B1 cd. tabeli 17
1 2 3 4
H-Ala-OMe H-Asp(OtBu)OH H-Ala-Asp(OtBu)-OH 2
100 mM 150 mM 62,6 mM 2
H-Asp(OtBu)OMe H-Gln-OH H-Asp(OtBu)-Gln-OH
100 mM 150 mM 0,9 mM
H-Ala-OMe H-Lys(Boc)OH H-Ala-Lys(Boc)-OH
100 mM 150 mM 51,0 mM
H-Lys(Boc)OMe H-Gln-OH H-Lys(Boc)-Gln-OH
100 mM 150 mM +
100 μl roztworu reakcyjnego składającego się ze 100 mM buforu boranowego (pH 9,0) zawierającego każdy z komponentów karboksylowych i komponentów aminowych przedstawionych w Tabeli 17, enzymu (dodanie 0,1 jednostki w roztworze reakcyjnym) i 10 mM EDTA pozostawiono na czas podany w tabeli 17 do reakcji w 25°C. Ilości każdego z otrzymanych w tej reakcji peptydów przedstawiono w Tabeli 17. (Znak „+” oznacza te peptydy, dla których wytwarzanie potwierdzono, lecz których nie można było oznaczyć ilościowo z powodu braku wzorca, podczas gdy „śl” oznacza ilość śladową.)
Skróty
H-Ala-OMe: chlorowodorek estru metylowego L-alaniny
H-p-F-Phe-OMe: chlorowodorek estru metylowego p-fluoro-L-fenyloalaniny
H-Cl-F-Phe-OMe: chlorowodorek estru metylowego p-chloro-L-fenyloalaniny
H-p-NO2-Phe-OMe: chlorowodorek estru metylowego p-nitro-L-fenyloalaniny
H-t-Leu-OMe: chlorowodorek estru metylowego tert-L-leucyny
H-2-Nal-OMe: chlorowodorek estru metylowego 3-(2-naftylo)-L-alaniny
H-Aib-OMe: chlorowodorek estru metylowego kwasu α-aminoizomasłowego
H-N-Me-Ala-OMe: chlorowodorek estru metylowego N-metylo-L-alaniny
H-CHA-OMe: chlorowodorek estru metylowego β-cykloheksylo-L-alaniny
H-Ser(tBu)-OMe: chlorowodorek estru metylowego O-tert-butylo-L-seryny
H-Asp(OtBu)-OMe: chlorowodorek estru α-metylowego estru β-tert-butylowego kwasu L-asparaginowego
H-Lys(Boc)-OMe: chlorowodorek estru metylowego N-i-tert-butoksykarbonylo-L-lizyny
H-p-F-Phe-OH: p-fluoro-L-fenyloalanina
H-Cl-F-Phe-OH: p-chloro-L-fenyloalanina
H-p-NO2-Phe-OH: p-nitro-L-fenyolalanina
H-t-Leu-OH: tert-L-leucyna
H-2-Nal-OH: 3-(2-naftylo)-L-alanina
H-Gln-OH: L-glutamina
H-Phe-OH: L-fenyloalanina
H-Ser(tBu)-OH: O-tert-butylo-L-seryna
H-Asp(OtBu)-OH: ester β-tert-butylowy kwasu L-asparaginowego
H-Lys(Boc)-OH: N-i-tert-butoksykarbonylo-L-lizyna
P r z y k ł a d 27.
Specyficzność substratu enzymu (14)
Specyficzność substratu w odniesieniu do wytwarzania oligopeptydu oceniono stosując tę samą frakcję enzymu co w Przykładzie 26. 100 μl porcję roztworu reakcyjnego składającego się ze 100 mM buforu boranowego (pH 9,0) zawierającego każdy z komponentów karboksylowego i komponentów aminowych w stężeniach końcowych przedstawionych w Tabeli 18, enzymu (liczby jednostek dodanych do roztworu reakcyjnego przedstawiono w Tabeli 18) i 10 mM EDTA pozostawiono na 3 godziny do reakcji w 25°C. Ilości każdego z otrzymanych w tej reakcji oligopeptydów przedstawiono w Tabeli 18. (Znak „+” oznacza te peptydy, dla których wytwarzanie potwierdzono, lecz których nie można było oznaczyć ilościowo z powodu braku wzorca, podczas gdy „śl” oznacza ilość śladową.) Należy zauważyć, że wszystkie komponenty karboksylowego były użyte jako chlorowodorki.
PL 211 754 B1
T a b e l a 18
Komponent karboksy Komponent aminowy Ilość enzymu (jednostki) Otrzym ny (mM) peptyd
Gly-OMe L-Phe-L-Met 1,0 Gly-Phe-Met 13,3
L-Ala-OMe L-Phe-L-Met 0,2 L-Ala-L-Phe-L-Met +
L-Tyr-OMe Gly-Gly-L-Phe-L-Met 1,0 L-Tyr-Gly-Gly-L-Phe-L-Met 2,7
L-Ala-OMe Gly-Gly-L-Phe-L-Met 0,2 L-Ala-Gly-Gly-L-Phe-L-Met +
Gly-OMe Gly-L-Phe 0,1 Gly-L-Phe 17,3
L-Ala-OMe Gly-L-Phe 0,1 L-Ala-Gly-L-Phe +
D-Ala-OMe Gly-L-Phe 0,1 D-Ala-Gly-L-Phe śl
Możliwość zastosowania w przemyśle
Wynalazek dotyczy nowego enzymu wobec którego można łatwo, niedrogo i z wysoką wydajnością wytwarzać peptyd przez ograniczenie stosowania złożonych metod syntezy takich jak wprowadzanie i usuwanie grup zabezpieczających. Użycie enzymu według wynalazku umożliwia wydajne przemysłowe wytwarzanie peptydów.

Claims (8)

1. Enzym pochodzący z bakterii należącej do rodzaju Empedobacter, znamienny tym, że z komponentu karboksylowego o niezabezpieczonym atomie azotu N i komponentu aminowego tworzy peptyd oraz tworzy L-alanylo-L-glutaminę z szybkością 0,03 mM/min lub większą, w reakcji powstawania dipeptydu w warunkach (i) do (iv):
(i) komponent karboksylowy stanowi chlorowodorek estru metylowego L-alaniny w ilości 100 mM, (ii) komponent aminowy stanowi L-glutamina w ilości 200 mM, (iii) pH wynosi 9,0 oraz (iv) ilość dodanego enzymu oczyszczonego do homogeniczności, jest mniejsza niż 0,61 mg/ml, jako ilość białka.
przy czym enzym ma masę cząsteczkową 75 000 oznaczoną elektroforetycznie w żelu SDS a według oznaczenia chromatografią filtracyjną na żelu masa cząsteczkowa wynosi 150 000 a szczep stanowi Empedobacter brevis FERM BP-8113.
2. Enzym według zastrz. 1, znamienny tym, że komponent karboksylowy jako substrat obejmuje zarówno ester aminokwasu i amid aminokwasu.
3. Enzym według zastrz. 1, znamienny tym, że komponent aminowy jako substrat stanowi dowolny aminokwas, aminokwas o zabezpieczonym atomie węgla i amina.
4. Enzym według zastrz. 1-3, znamienny tym, że enzym tworzy peptyd w zakresie pH 6,5-10,5.
5. Enzym według zastrz. 1-4, znamienny tym, że enzym tworzy peptyd w zakresie temperatury od 0-60°C.
6. Enzym według zastrz. 1-5, znamienny tym, że enzym jest niewrażliwy na hamowanie przez inhibitor enzymu serynowego, fluorek fenylometylosulfonylu lecz jest inhibowalny przez p'-guanidynobenzoesan p-nitrofenylu.
7. Mikroorganizm Empedobacter brevis FERM BP-8113.
8. Sposób wytwarzania dipeptydu, znamienny tym, że obejmuje otrzymywanie dipeptydu z komponentu karboksylowego o niezabezpieczonym atomie azotu N i komponentu aminowego, w którym stosuje się enzym określony w dowolnym z zastrz. 1-6 lub substancję zawierającą ten enzym.
PL374192A 2002-07-26 2003-07-25 Enzym tworzący peptyd, mikroorganizm i sposób wytwarzania dipeptydu PL211754B1 (pl)

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
JP2002218956 2002-07-26

Publications (2)

Publication Number Publication Date
PL374192A1 PL374192A1 (pl) 2005-10-03
PL211754B1 true PL211754B1 (pl) 2012-06-29

Family

ID=31972369

Family Applications (2)

Application Number Title Priority Date Filing Date
PL391108A PL211730B1 (pl) 2002-07-26 2003-07-25 Enzym pochodzący z bakterii należącej do rodzaju Sphingobacterium, mikroorganizm i sposób otrzymywania dipeptydu
PL374192A PL211754B1 (pl) 2002-07-26 2003-07-25 Enzym tworzący peptyd, mikroorganizm i sposób wytwarzania dipeptydu

Family Applications Before (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
PL391108A PL211730B1 (pl) 2002-07-26 2003-07-25 Enzym pochodzący z bakterii należącej do rodzaju Sphingobacterium, mikroorganizm i sposób otrzymywania dipeptydu

Country Status (11)

Country Link
US (1) US20040253665A1 (pl)
EP (1) EP1553171A4 (pl)
JP (1) JP4501689B2 (pl)
KR (1) KR20050025677A (pl)
CN (1) CN1316016C (pl)
AU (1) AU2003248117A1 (pl)
BR (1) BR0305638A (pl)
CA (1) CA2509765C (pl)
PL (2) PL211730B1 (pl)
RU (1) RU2300565C2 (pl)
WO (1) WO2004022733A1 (pl)

Families Citing this family (12)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP2005168405A (ja) 2003-12-11 2005-06-30 Ajinomoto Co Inc ジペプチドの製造方法
CN101087878A (zh) * 2004-12-20 2007-12-12 味之素株式会社 具有肽合成活性的突变型蛋白质
WO2006104186A1 (ja) * 2005-03-29 2006-10-05 Kyowa Hakko Kogyo Co., Ltd. ジペプチドの結晶およびその製造法
EP2036919A4 (en) * 2006-06-28 2012-01-11 Kyowa Hakko Bio Co Ltd PROCESS FOR PURIFYING AN OLIGOPEPTIDE
JPWO2009139392A1 (ja) * 2008-05-12 2011-09-22 味の素株式会社 β−アラニルアミノ酸またはその誘導体の製造方法
DE102009002044A1 (de) * 2009-03-31 2010-10-07 Evonik Degussa Gmbh Dipeptide als Futtermitteladditive
CN104561202B (zh) * 2015-02-06 2018-02-09 江苏诚信药业有限公司 一种酶催化合成丙谷二肽的制备方法及工艺系统
CA3049488C (en) 2016-12-30 2020-07-28 Innobio Corporation Limited Gene encoding alanyl-glutamine dipeptide biosynthetic enzyme and application thereof
CN106754447B (zh) * 2016-12-30 2020-08-25 大连医诺生物股份有限公司 重组酿酒酵母及其在合成丙谷二肽中的应用
CN106754985B (zh) * 2016-12-30 2019-08-13 大连医诺生物股份有限公司 编码丙谷二肽生物合成酶的基因及其应用
US10793594B2 (en) 2017-04-19 2020-10-06 Indiana University Research And Technology Corporation Antimicrobial compounds and/or modulators of microbial infections and methods of using the same
KR102650468B1 (ko) * 2024-01-19 2024-03-25 큐티스바이오 주식회사 생물전환공정을 이용한 디펩타이드의 제조방법

Family Cites Families (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US2953499A (en) * 1956-04-19 1960-09-20 Ajimomoto Co Inc Process for producing l-glutamic acid from hardly soluble amino-acid
US3847744A (en) * 1971-12-14 1974-11-12 Ajinomoto Kk Method of producing elastases by bacteria
DK72587D0 (da) * 1987-02-13 1987-02-13 Carlsberg Biotechnology Ltd Fremgangsmaade til enzymatisk fremstilling af dipeptider
CA1337936C (en) * 1987-08-07 1996-01-16 Akiva Tuvia Gross Vibriolysin coupling process
DK163435C (da) * 1988-08-12 1992-07-20 Carlsberg Biotechnology Ltd Fremgangsmaade til enzymatisk fremstilling af dipeptider og derivater deraf
JP4613282B2 (ja) * 1999-04-12 2011-01-12 アークレイ株式会社 α−糖化アミノ酸遊離酵素

Also Published As

Publication number Publication date
BR0305638A (pt) 2004-09-08
EP1553171A1 (en) 2005-07-13
CA2509765A1 (en) 2004-03-18
PL374192A1 (pl) 2005-10-03
AU2003248117A1 (en) 2004-03-29
WO2004022733A1 (ja) 2004-03-18
JPWO2004022733A1 (ja) 2005-12-22
US20040253665A1 (en) 2004-12-16
CN1671840A (zh) 2005-09-21
CN1316016C (zh) 2007-05-16
RU2005105321A (ru) 2005-08-10
CA2509765C (en) 2011-04-26
RU2300565C2 (ru) 2007-06-10
EP1553171A4 (en) 2005-09-21
KR20050025677A (ko) 2005-03-14
PL211730B1 (pl) 2012-06-29
JP4501689B2 (ja) 2010-07-14

Similar Documents

Publication Publication Date Title
US7736871B2 (en) Peptide-forming enzyme gene
US7749742B2 (en) Method for producing tripeptides and/or peptides longer than tripeptides
RU2300565C2 (ru) Новый фермент, образующий пептид, микроорганизм, продуцирующий данный фермент, и способ синтеза дипептида с их применением
US20050032187A1 (en) Novel peptide-forming enzyme, microbe producing the enzyme and method for producing peptide using them
US20040204577A1 (en) Novel peptide-forming enzyme gene
US20050032154A1 (en) Method for producing tripeptides and/or peptides longer than tripeptides