CN114015689A - 一种特异性抑制GOS2基因表达的shRNA序列及其应用 - Google Patents

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Abstract

本发明提供了一种特异性抑制GOS2基因表达的shRNA序列及其应用，属于卵巢癌基因沉默治疗技术领域；在本发明中提供了特异性抑制GOS2基因表达的shRNA序列，并通过实验验证沉默GOS2基因的表达对卵巢癌细胞系OVCAR8的增殖并不产生显著影响，但显著抑制了卵巢癌细胞系OVCAR8的迁移及侵润行为，在制备抑制卵巢癌细胞迁移侵润的基因药物中有着很好的应用。

Description

一种特异性抑制GOS2基因表达的shRNA序列及其应用
技术领域
本发明属于卵巢癌基因沉默治疗技术领域，具体涉及一种特异性抑制GOS2基因表达的shRNA序列及其应用。
背景技术
RNA干扰技术(RNAinterference, RNAi) 是有效沉默或抑制目标基因表达的过程，它是物种在进化上的一种高度保守的基因防御机制，即一种依赖于双链RNA特异性短序列实现转录后的基因沉默的技术。目前实验室常用的RNAi技术主要有siRNA寡核苷酸载体与shRNA慢病毒质粒表达载体。siRNA是短的双链RNA，大小在19-29 nt左右，3´端有两个游离的碱基，可激活RNA的干扰，通过与目标mRNA互补序列结合，特异性地实现mRNA降解。但是siRNA在细胞中的表达是瞬时的，发挥作用的时间比较短。相对于siRNA，短发夹核糖核酸(Short Hairpin RNA, shRNA)可以通过病毒介导的转染保持稳定，能够减少脱靶效应。因此，在探讨和验证靶向沉默基因表达的RNA片段序列时，会优先选择shRNA沉默基因表达的技术。
借助于shRNA实现基因沉默的RNA干扰技术的原理目前已被大量报道。shRNA包括两个短的反向重复序列，中间由茎环结构进行分割，组成一个类似发夹的结构。shRNA首先被插入到慢病毒载体上形成重组慢病毒质粒，慢病毒质粒与其他辅助质粒借助于293FT细胞形成慢病毒，最终用慢病毒转染细胞发挥shRNA的沉默作用。在内切核酸酶Dicer作用下，shRNA被裂解成21-25nt的核苷酸链，由正义链和反义链组成。反义链与特定的酶结合形成由RNA诱导的沉默复合物RISC（RISC复合物中含siRNA、核酸外切酶、核酸内切酶以及解旋酶等元件），核苷酸双链会被活化后的RISC解聚成为两条单链，随后反义链识别并结合与其同源的靶mRNA，在反义链的引导下活化型RISC会切割靶mRNA的特定位置，同时切割的mRNA会被RISC复合物中的酶特异性降解，从而阻断了mRNA的遗传信息传递。基于以上原理，针对癌基因开发出具有高度特异性与靶向性的shRNA干扰片段从而沉默癌基因的表达，对于恶性肿瘤的治疗具有重要的意义。
GOS2（GOS2GO/G1 switch 2）基因，即GO/G1期开关基因2，被认为是在凝集素激活的人类淋巴细胞中被早期激活基因所表达的一种重要的基础蛋白质，并且被认为能调控细胞GO期至C1期的转换，从而调控细胞增殖。近年来有文献报道在膀胱癌﹑慢性髓细胞白血病、肺癌细胞中GOS2基因可抑制细胞增殖或增加细胞对化疗药物的敏感性。还有文献报道在人类侵润性乳腺癌细胞中G0/G1 Switch 2 通过整合素介导的信号转导可以诱导细胞存活和转移。但是目前尚未见有关于shRNA干扰卵巢癌组织中GOS2基因的表达情况及作用的相关报道。
发明内容
针对现有技术中存在不足，本发明提供了一种特异性抑制GOS2基因表达的shRNA序列及其应用。在本发明中提供了特异性抑制GOS2基因表达的shRNA序列，并通过实验验证特异性抑制GOS2基因表达的shRNA序列对卵巢癌细胞系OVCAR8的增殖并不产生显著影响，但显著抑制了卵巢癌细胞系OVCAR8的迁移及侵润行为，在制备抑制卵巢癌细胞迁移侵润的基因药物中有着很好的应用。
本发明中首先提供了特异性抑制GOS2基因表达的shRNA序列，所述shRNA为shGOS2-2 或shGOS2-4，所述shGOS2-2和shGOS2-4的序列为：
shGOS2-2：5´-GGCCCTGTCCAACCGGCAGCA-3´（SEQ ID NO:1）；
shGOS2-4：5´-GCGACAGGCTCTCCAGAAGCA-3（SEQ ID NO:2）。
本发明中还提供了用于制备上述shRNA的引物序列，其中shGOS2-2的引物序列为：
F ：CCGGGGCCCTGTCCAACCGGCAGCACTCGAGTGCTGCCGGT
TGGACAGGGCCTTTTTG（SEQ ID NO:5）；
R： AATTCAAAAAGGCCCTGTCCAACCGGCAGCACTCGAGTGCT
GCCGGTTGGACAGGGCC（SEQ ID NO:6）；
shGOS2-4的引物序列为：
F： CCGGGCGACAGGCTCTCCAGAAGCACTCGAGTGCTTCTGGA
GAGCCTGTCGCTTTTTG（SEQ ID NO:9）；
R：AATTCAAAAAGCGACAGGCTCTCCAGAAGCACTCGAGTGCT
TCTGGAGAGCCTGTCGC（SEQ ID NO:10）。
本发明中还提供了一种shRNA慢病毒表达载体Plko.1-TRC-shRNA-GOS2，所述Plko.1-TRC-shRNA-GOS2表达载体包含上述shRNA序列。
进一步的，所述Plko.1-T所述RC-shRNA-GOS2表达载体的制备方法为采用上述shRNA的引物退火合成特异性抑制GOS2基因表达的shRNA，将合成的shRNA克隆到慢病毒表达载体pLKO .1-TRC中，得到Plko.1-TRC-shRNA-GOS2。
进一步的，所述Plko.1-TRC-shRNA-GOS2包含质粒shGOS2-2和质粒shGOS2-4。其中，所述质粒shGOS2-2的核苷酸序列如SEQ ID NO:14所示，质粒shGOS2-4的核苷酸序列如SEQ ID NO:16所示。
本发明中还提供了一种含有上述慢病毒表达载体的转基因细胞或工程菌。
本发明中还提供了上述shRNA序列或Plko.1-TRC-shRNA-GOS2表达载体或转基因细胞或工程菌在制备GOS2基因功能研究的产品的应用。
进一步的，所述应用为特异性抑制卵巢癌细胞中的GOS2基因的表达，使GOS2基因的mRNA表达显著降低。
进一步的，所述应用为在不显著影响卵巢癌细胞增殖的情况下显著抑制卵巢癌细胞的迁移侵润能力。
本发明中还提供了上述shRNA序列或Plko.1-TRC-shRNA-GOS2表达载体或转基因细胞或工程菌在制备GOS2基因有关疾病的靶向治疗药物中的应用。
进一步的，所述药物为抑制卵巢癌细胞转移的药物。
与现有技术相比，本发明的有益效果在于：
本发明中，首次发现shGOS2在卵巢癌细胞系OVCAR8中可以显著抑制其迁移侵润行为。本发明基于GOS2基因的mRNA序列，设计了4条shRNA（shGOS2-1、shGOS2-、shGOS2-3以及shGOS2-4），通过前期相关研究筛选出2条shRNA（即shGOS2-2和shGOS2-4）可以显著降低GOS2基因在卵巢癌细胞中的表达以及可以显著抑制卵巢癌细胞的迁移、侵润能力。通过构建慢病毒载体pLKO.1-TRC-shGOS2，用EZ-Trans转染试剂将目的质粒与辅助质粒pLP1、pLP2和pLPSVG转入293FT细胞中，制备并收集病毒，之后用含目标shGOS2序列的慢病毒感染卵巢癌细胞株OVCAR8，用Puromycin筛选出具有抗性的细胞用于实验，并设立对照组（不含目标shGOS2序列的慢病毒）。用qRT-PCR技术检测目的基因GOS2的表达验证shRNA对卵巢癌细胞中GOS2基因表达的沉默作用；通过Transwell小室实验检测shRNA对OVCAR8细胞迁移和侵润能力的影响。
本发明中所涉及的shGOS2-2和shGOS2-4经前期验证，这两条shRNA序列通过慢病毒载体包装成慢病毒后感染人卵巢癌细胞，能够高效地干扰其转录，降低GOS2基因在卵巢癌细胞中的表达，对OVCAR8细胞中GOS2基因的表达具有显著的沉默作用；同时，MTT实验证实shGOS2-2和shGOS2-4对卵巢癌OVCAR8细胞系的增殖不产生显著影响；Transwell小室实验证实shGOS2-2和shGOS2-4都能显著抑制OVCAR8细胞的迁移和侵润，对制备卵巢癌细胞的靶向药物具有十分重要的意义。
本发明提供的shRNA分子为以GOS2抑制剂为核心的卵巢癌治疗新策略提供理论基础，有望应用于制备高效、特异性强、副作用小的抗癌基因药物，尤其在未来针对卵巢癌的靶向基因药物研发中具有巨大的潜在价值。
附图说明
图1为重组质粒的琼脂糖凝胶电泳图；图中，M：DNA marker；1为酶切的空载质粒Plko.1-TRC，记为pLKO.1-control；2-5为酶切成功构建的慢病毒载体pLKO.1-TRC-shGOS2制备的质粒，分别记为pLKO.1-shGOS2-1，pLKO.1-shGOS2-2，pLKO.1-shGOS2-3以及pLKO.1-shGOS2-4。
图2为shRNA对卵巢癌细胞系OVCAR8中GOS2基因mRNA表达的抑制情况图；图中，Vector为对照组，用pLKO.1-TRC空载质粒感染；其他为实验组，OVCAR8细胞分别感染慢病毒质粒，分别记为shGOS2-1，shGOS2-2，shGOS2-3和shGOS2-4；其中*表示P＜0.05，**表示P＜0.01，***表示P＜0.001，****表示P＜0.0001，n=3。
图3为质粒shGOS2-1，shGOS2-2，shGOS2-3以及shGOS2-4对OVCAR8细胞增殖影响结果图；图中，Vector为对照组，shGOS2-1，shGOS2-2，shGOS2-3以及shGOS2-4为实验组。
图4为质粒shGOS2-1，shGOS2-2，shGOS2-3以及shGOS2-4对卵巢癌细胞系OVCAR8迁移的影响结果图；图中Vector为对照组，shGOS2-1，shGOS2-2，shGOS2-3以及shGOS2-4为实验组；*表示P＜0.05，**表示P＜0.01，**表示P＜0.001，n=3。
图5为质粒shGOS2-1，shGOS2-2，shGOS2-3以及shGOS2-4对卵巢癌细胞系OVCAR8侵润的影响结果图；图中Vector为对照组，shGOS2-1，shGOS2-2，shGOS2-3以及shGOS2-4为实验组；*表示P＜0.05，**表示P＜0.01，**表示P＜0.001，n=3。
具体实施方式
下面结合附图以及具体实施例对本发明作进一步的说明，但本发明的保护范围并不限于此。
实施例1：
首先基于GOS2基因（在GENABANK中的登录号为NM_015714.4）设计了4条shRNA对应的引物对，记为shRNA引物，4对shRNA引物的具体序列如表1所示。将这4对shRNA引物退火形成4条双链寡核苷酸短片段，得到shRNA，分别命名为shGOS2-1、shGOS2-2、shGOS2-3、shGOS2-4。。
shGOS2-1：5´-GGAGCGACAGGCTCTCCAGAA-3´（SEQ ID NO:1）；
shGOS2-2：5´-GGCCCTGTCCAACCGGCAGCA-3´（SEQ ID NO:2）；
shGOS2-3：5´-GCCGCCAGACGTCTGCGGGAC-3´（SEQ ID NO:3）；
shGOS2-4：5´-GCGACAGGCTCTCCAGAAGCA-3（SEQ ID NO:4）。
表1.shRNA序列对应的引物对
Figure RE-GDA0003415763070000051
将上述得到的shGOS2-1、shGOS2-2、shGOS2-3、shGOS2-4分别连接到双酶切的慢病毒 载体Plko.1-TRC(Open Biosystem公司)上，酶切位点为EcoRⅠ和AgeⅠ(生工生物工程(上海)股份有限公司)。
将4条连接产物通过热激法分别转化到DH5α大肠杆菌感受态细胞（诺唯赞生物科技有限公司）中，然后置于含100μg/mL氨苄抗性的LB固体培养基（蛋白胨：10g、酵母粉：5g、NaCl：10g、琼脂粉：15g，蒸馏水定容至1L）上37 ℃培养16 h，挑取单个菌落于含100μg/mL氨苄抗性LB液体培养基（蛋白胨：10g/L、酵母粉：5g/L、NaCl：10g/L，蒸馏水定容至1L）中摇菌，37 ℃、220 rpm、16 h，收集菌体提质粒。对提取得到的质粒进行酶切验证，验证结果显示质粒构建成功，得到质粒Plko.1-TRC-shRNA-GOS2，根据shRNA的不同记为质粒shGOS2-1，质粒shGOS2-2，质粒shGOS2-3和质粒shGOS2-4。具体的，质粒shGOS2-1的核苷酸序列如SEQ IDNO:13所示，质粒shGOS2-2的核苷酸序列如SEQ ID NO:14所示，质粒shGOS2-3的核苷酸序列如SEQ ID NO:15所示，质粒shGOS2-4的核苷酸序列如SEQ ID NO:16所示。
实施例2：细胞慢病毒的制备及慢病毒转染细胞
混合液A的制备：
实验组的A液：0.75µg 辅助质粒pLP1 +0.35 µg 辅助质粒pLP2 +0.49 µg 辅助质粒pL PSVG +0.61 µg 实施例1中得到的目的质粒Plko.1-TRC-shRNA-shGOS2OpenBiosystem公司，生工生物工程（上海）股份有限公司）。
对照组的A液：0.75µg 辅助质粒pLP1 +0.35 µg 辅助质粒pLP2 +0.49 µg 辅助质粒pL PSVG +0.61 µg载体质粒Plko.1-TRC（Open Biosystem公司）。
将A液分别加到0.125μL的无血清的低糖DMEM培养基（购自于赛默飞）中，轻轻混匀，室温孵育5 min。
混合液B的制备：取2个1.5mL EP管分别加入125μL的无血清的低糖DMEM培养基，然后再分别加入9 μL EZ-Trans细胞转染试剂（购于上海李记生物科技有限公司）轻轻混匀，室温放置 5min。
将B液分别加入到实验组和对照组的A液中混匀（注意，此顺序不能反），室温孵育20min，得到AB混合液。期间消化293FT细胞（美国模式培养物保藏所）200xg离心5min，用293FT专用培养基（购自于赛默飞）重悬细胞并在显微镜下计数，调整细胞密度为100万/mL。取1ml 293FT细胞混悬液，然后逐滴缓慢滴入AB混合液，与AB混合液轻轻充分混匀。将培养皿放置在培养箱中孵育12 h后，给细胞更换2mL新鲜的293FT专用培养基，继续培养。培养两天后，用5 mL的灭菌注射器吸取细胞上清液，再经0.45 μm微孔滤膜过滤掉细胞上清杂质即可收集实验组与对照组病毒液。。
接下来用收集到的实验组与对照组病毒液转染OVCAR8细胞（购于ATCC细胞资源中心，美国），具体操作步骤如下：
第一天，种板：数细胞，调整细胞密度为6 cm培养皿底面积的三分之一。
第二天，病毒感染：取5个2mL EP管，然后分别将将实验组与对照组病毒液与含10%（体积比）小牛血清（Gibco）的1640完全培养基（购自于赛默飞）按体积比为1：1混合加入，并加入8 mg/mL 聚凝胺（polybrene，购自 Sigma生物公司，美国）使其终浓度为8µg/mL。然后取出前一天种好细胞的6cm培养皿，弃上清，分别加入2mL上述配好的实验组与对照组病毒液。接着将培养皿放入培养箱中孵育8 h，孵育结束后，弃上清并更换为新鲜的4mL含10%小牛血清的1640完全培养基，继续放入培养箱培养两天。培养结束后，弃上清，用1000 mg/mL嘌呤霉素(puromycin;PM ，Biosharp生物科技公司，中国）与新鲜的含10%小牛血清的1640完全培养基按1：1000稀释，筛选2-3天。
筛选结束后，重新种板：将筛选后的细胞消化下来重新种回培养皿中，此时，得到的活细胞为慢病毒转染细胞，是具有抗性的细胞，可用于实验。
实施例3： GOS2基因在OVCAR8细胞中的表达水平的检测
收集实施例2中嘌呤霉素(puromycin;PM )筛选后实验组和对照组存活的OVCAR8细胞，利用TRIzol法提取RNA，然后根据实时荧光定量试剂盒（购自于诺唯赞）说明书操作，检测不同组细胞中目的GOS2的mRNA表达情况。
根据实验结果所得到的实验组与对照组的Ct值（每个反应管内的荧光信号达到设定的阈值时所经历的循环数）利用2-△△Ct值计算shGOS2的沉默效率。其中，△△Ct=实验组的△Ct-对照组的△Ct，△Ct=（实验组的Ct-实验组内参的Ct值）/（对照组的Ct-实验组内参的Ct）。
图2为shRAN对GOS2基因在OVCAR8细胞中的mRNA表达水平的抑制情况图；图中，Vector为对照组，用pLKO.1-TRC空载质粒感染；其他为实验组，OVCAR8细胞分别感染慢病毒质粒，分别记为shGOS2-1，shGOS2-2，shGOS2-3和shGOS2-4；其中*表示P＜0.05，**表示P＜0.01，***表示P＜0.001，****表示P＜0.0001，n=3。从图中可以看出，与对照组Vector相比，实验组shGOS2-1，shGOS2-2，shGOS2-3和shGOS2-4均能显著沉默卵巢癌细胞系OVCAR8中GOS2的表达，对卵巢癌细胞系OVCAR8中GOS2的表达有显著的沉默作用。实施例4：MTT实验检测shGOS2对OVCAR8细胞细胞增殖的影响。
用含10%血清的1640完全培养基（购自于赛默飞）分别将实施例2中嘌呤霉素(puromycin;PM )筛选后实验组和对照组存活的OVCAR8细胞调成细胞密度为3×104 个/100μL的细胞悬液；将上述细胞悬液按每孔100μL的量接种到96孔板中，在37℃、5%CO2培养箱中分别继续培养24h、48h、72h以及96h后，于相应的时间点内每孔加入10μL MTT（5mg/mL），然后放回培养箱内继续培养2h。培养结束后于显微镜下观察有蓝紫色甲瓒结晶，移除卵巢癌细胞系OVCAR8上清液，每孔加 100 μL DMSO 溶解结晶，轻轻拍匀，使用酶标仪在 550 nm波长处测定每孔吸光值，计算细胞的相对存活率（以24h所测得的吸光度值为参照标准，48h，72h，96h所测得的吸光度分别与24h所测得的吸光度值的比值即为该细胞的相对存活率）。
图3为shGOS2-1，shGOS2-2，shGOS2-3以及shGOS2-4对OVCAR8细胞增殖的影响结果；图中，Vector为对照组，shGOS2-1，shGOS2-2，shGOS2-3以及shGOS2-4为实验组。如图3所示，可知实验组与对照组细胞的相对存活率的P值大于0.05，即对照组（Vector）与实验组（shGOS2-1，shGOS2-2，shGOS2-3以及shGOS2-4）OVCAR8细胞的相对存活率并不存在显著差异，不具备统计学意义。结果表明：利用shGOS2-1，shGOS2-2，shGOS2-3以及shGOS2-4沉默GOS2基因表达对卵巢癌细胞OVCAR8的增殖并不产生显著影响。
实施例5： shGOS2对OVCAR8细胞细胞迁移侵润的影响
Transwell迁移：
将实施例2中嘌呤霉素(puromycin;PM )筛选后实验组和对照组存活的OVCAR8细胞消化下来，用无血清培养基调成细胞密度为20×104 个/mL的细胞悬液。将24孔板中的Transwell小室用无菌镊子移开，在24孔板底部加入500 μL含10%血清的1640完全培养基后，再将Transwell小室轻轻放回，并且保证与培养基接触的Transwell小室底部无气泡。
取300 μL细胞悬液加入每个Transwell小室内，放回培养箱孵育16 h；孵育结束后，停止Transwell小室实验。取一干净的24孔板，每孔加入1 mL PBS和500 μL的0.1%的结晶紫溶液；从培养箱中取出Transwell 24孔板，用镊子移出小室，用脱脂棉签轻轻擦去上小室内的细胞，将小室底部膜于风口风干，便于染色，将小室放入孔中染色15-20 min。若染色过深，可用PBS清洗；在洁净的载玻片上，滴加一滴清水或PBS溶液，将Transwell小室底部膜正置放在液滴上，用显微镜观察就可清楚看到小室底膜上附着的细胞，随机选5到10个视野进行拍照，进行统计。
Transwell侵润：
第一天，将Extracellular Matrix（ECM）基质胶（Sigma，美国）从-20℃转移到4℃过夜融化。
第二天，将待用的Transwell（8 μm）小孔、24孔板、EP管、枪头等置于4℃冰箱预冷，用1640无血清培养基（购自于赛默飞）+青霉素（100ug/mL，购买自Biosharp） +链霉素（50ug/mL ，购买自Biosharp））按1:10（体积比）稀释基质胶，每个小室加45 μL细胞外基质（ECM）水凝胶稀释液迅速铺匀，要无气泡，放入5 % CO2、37℃细胞培养箱中培养；后面的步骤跟Transwell迁移的步骤相同，只是培养箱孵育时间为24 h。
图4及图5为shGOS2-1，shGOS2-2，shGOS2-3以及shGOS2-4对OVCAR8细胞迁移和侵润的影响结果图。图4A和4B为利用Transwell检测shGOS2对细胞迁移的影响及统计结果，图5A和5B 为shGOS2对OVCAR8细胞侵润的影响及统计结果；*表示P＜0.05，**表示P＜0.01，***表示P＜0.001，n=3。Vector为对照组，shGOS2-1，shGOS2-2，shGOS2-3以及shGOS2-4为实验组。实验结果显示，shGOS2确实可以抑制OVCAR8细胞株的迁移和侵润能力（图4A和图5A ），其中shGOS2-1，shGOS2-2，shGOS2-3以及shGOS2-4的迁移能力分别为对照组的89±2.5%，38±4.1%，22±2.4%以及24±3.2%（图4B）；shGOS2-1，shGOS2-2，shGOS2-3以及shGOS2-4对OVCAR8细胞侵润能力分别为对照组的109±2.9%，37±3.1%，110±4.5%和44±3.5%（图5B）。结果表明：利用shGOS2-2，shGOS2-4沉默GOS2基因表达对卵巢癌细胞OVCAR8的迁移和侵润都具有明显的抑制作用。
综上所述，在卵巢癌细胞系OVCAR8中shGOS2特异性沉默GOS2基因的表达对细胞的增殖能力并不产生显著影响，但可以显著抑制卵巢癌细胞系OVCAR8的迁移与侵润能力，其中以shGOS2-2，shGOS2-4效果最为显著，可见，本发明设计的shRNA可以用于制备治疗卵巢癌的药物。
所述实施例为本发明的优选的实施方式，但本发明并不限于上述实施方式，在不背离本发明的实质内容的情况下，本领域技术人员能够做出的任何显而易见的改进、替换或变型均属于本发明的保护范围。
序列表
<110> 江苏大学
<120> 一种特异性抑制GOS2基因表达的shRNA序列及其应用
<160> 16
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
ggagcgacag gctctccaga a 21
<210> 2
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
ggccctgtcc aaccggcagc a 21
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<211> 21
<212> DNA
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<211> 21
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<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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gcgacaggct ctccagaagc a 21
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<211> 58
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 5
ccggggagcg acaggctctc cagaactcga gttctggaga gcctgtcgct cctttttg 58
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<211> 58
<212> DNA
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aattcaaaaa ggagcgacag gctctccaga actcgagttc tggagagcct gtcgctcc 58
<210> 7
<211> 58
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 7
ccggggccct gtccaaccgg cagcactcga gtgctgccgg ttggacaggg cctttttg 58
<210> 8
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<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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aattcaaaaa ggccctgtcc aaccggcagc actcgagtgc tgccggttgg acagggcc 58
<210> 9
<211> 58
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 9
ccgggccgcc agacgtctgc gggacctcga ggtcccgcag acgtctggcg gctttttg 58
<210> 10
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<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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aattcaaaaa gccgccagac gtctgcggga cctcgaggtc ccgcagacgt ctggcggc 58
<210> 11
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<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 11
ccgggcgaca ggctctccag aagcactcga gtgcttctgg agagcctgtc gctttttg 58
<210> 12
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<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 12
aattcaaaaa gcgacaggct ctccagaagc actcgagtgc ttctggagag cctgtcgc 58
<210> 13
<211> 7084
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 13
ttcggcctat tggttaaaaa atgagctgat ttaacaaaaa tttaacgcga attttaacaa 60
aatattaacg cttacaattt aggtggcact tttcggggaa atgtgcgcgg aacccctatt 120
tgtttatttt tctaaataca ttcaaatatg tatccgctca tgagacaata accctgataa 180
atgcttcaat aatattgaaa aaggaagagt atgagtattc aacatttccg tgtcgccctt 240
attccctttt ttgcggcatt ttgccttcct gtttttgctc acccagaaac gctggtgaaa 300
gtaaaagatg ctgaagatca gttgggtgca cgagtgggtt acatcgaact ggatctcaac 360
agcggtaaga tccttgagag ttttcgcccc gaagaacgtt ttccaatgat gagcactttt 420
aaagttctgc tatgtggcgc ggtattatcc cgtattgacg ccgggcaaga gcaactcggt 480
cgccgcatac actattctca gaatgacttg gttgagtact caccagtcac agaaaagcat 540
cttacggatg gcatgacagt aagagaatta tgcagtgctg ccataaccat gagtgataac 600
actgcggcca acttacttct gacaacgatc ggaggaccga aggagctaac cgcttttttg 660
cacaacatgg gggatcatgt aactcgcctt gatcgttggg aaccggagct gaatgaagcc 720
ataccaaacg acgagcgtga caccacgatg cctgtagcaa tggcaacaac gttgcgcaaa 780
ctattaactg gcgaactact tactctagct tcccggcaac aattaataga ctggatggag 840
gcggataaag ttgcaggacc acttctgcgc tcggcccttc cggctggctg gtttattgct 900
gataaatctg gagccggtga gcgtgggtct cgcggtatca ttgcagcact ggggccagat 960
ggtaagccct cccgtatcgt agttatctac acgacgggga gtcaggcaac tatggatgaa 1020
cgaaatagac agatcgctga gataggtgcc tcactgatta agcattggta actgtcagac 1080
caagtttact catatatact ttagattgat ttaaaacttc atttttaatt taaaaggatc 1140
taggtgaaga tcctttttga taatctcatg accaaaatcc cttaacgtga gttttcgttc 1200
cactgagcgt cagaccccgt agaaaagatc aaaggatctt cttgagatcc tttttttctg 1260
cgcgtaatct gctgcttgca aacaaaaaaa ccaccgctac cagcggtggt ttgtttgccg 1320
gatcaagagc taccaactct ttttccgaag gtaactggct tcagcagagc gcagatacca 1380
aatactgttc ttctagtgta gccgtagtta ggccaccact tcaagaactc tgtagcaccg 1440
cctacatacc tcgctctgct aatcctgtta ccagtggctg ctgccagtgg cgataagtcg 1500
tgtcttaccg ggttggactc aagacgatag ttaccggata aggcgcagcg gtcgggctga 1560
acggggggtt cgtgcacaca gcccagcttg gagcgaacga cctacaccga actgagatac 1620
ctacagcgtg agctatgaga aagcgccacg cttcccgaag ggagaaaggc ggacaggtat 1680
ccggtaagcg gcagggtcgg aacaggagag cgcacgaggg agcttccagg gggaaacgcc 1740
tggtatcttt atagtcctgt cgggtttcgc cacctctgac ttgagcgtcg atttttgtga 1800
tgctcgtcag gggggcggag cctatggaaa aacgccagca acgcggcctt tttacggttc 1860
ctggcctttt gctggccttt tgctcacatg ttctttcctg cgttatcccc tgattctgtg 1920
gataaccgta ttaccgcctt tgagtgagct gataccgctc gccgcagccg aacgaccgag 1980
cgcagcgagt cagtgagcga ggaagcggaa gagcgcccaa tacgcaaacc gcctctcccc 2040
gcgcgttggc cgattcatta atgcagctgg cacgacaggt ttcccgactg gaaagcgggc 2100
agtgagcgca acgcaattaa tgtgagttag ctcactcatt aggcacccca ggctttacac 2160
tttatgcttc cggctcgtat gttgtgtgga attgtgagcg gataacaatt tcacacagga 2220
aacagctatg accatgatta cgccaagcgc gcaattaacc ctcactaaag ggaacaaaag 2280
ctggagctgc aagcttaatg tagtcttatg caatactctt gtagtcttgc aacatggtaa 2340
cgatgagtta gcaacatgcc ttacaaggag agaaaaagca ccgtgcatgc cgattggtgg 2400
aagtaaggtg gtacgatcgt gccttattag gaaggcaaca gacgggtctg acatggattg 2460
gacgaaccac tgaattgccg cattgcagag atattgtatt taagtgccta gctcgataca 2520
taaacgggtc tctctggtta gaccagatct gagcctggga gctctctggc taactaggga 2580
acccactgct taagcctcaa taaagcttgc cttgagtgct tcaagtagtg tgtgcccgtc 2640
tgttgtgtga ctctggtaac tagagatccc tcagaccctt ttagtcagtg tggaaaatct 2700
ctagcagtgg cgcccgaaca gggacttgaa agcgaaaggg aaaccagagg agctctctcg 2760
acgcaggact cggcttgctg aagcgcgcac ggcaagaggc gaggggcggc gactggtgag 2820
tacgccaaaa attttgacta gcggaggcta gaaggagaga gatgggtgcg agagcgtcag 2880
tattaagcgg gggagaatta gatcgcgatg ggaaaaaatt cggttaaggc cagggggaaa 2940
gaaaaaatat aaattaaaac atatagtatg ggcaagcagg gagctagaac gattcgcagt 3000
taatcctggc ctgttagaaa catcagaagg ctgtagacaa atactgggac agctacaacc 3060
atcccttcag acaggatcag aagaacttag atcattatat aatacagtag caaccctcta 3120
ttgtgtgcat caaaggatag agataaaaga caccaaggaa gctttagaca agatagagga 3180
agagcaaaac aaaagtaaga ccaccgcaca gcaagcggcc gctgatcttc agacctggag 3240
gaggagatat gagggacaat tggagaagtg aattatataa atataaagta gtaaaaattg 3300
aaccattagg agtagcaccc accaaggcaa agagaagagt ggtgcagaga gaaaaaagag 3360
cagtgggaat aggagctttg ttccttgggt tcttgggagc agcaggaagc actatgggcg 3420
cagcgtcaat gacgctgacg gtacaggcca gacaattatt gtctggtata gtgcagcagc 3480
agaacaattt gctgagggct attgaggcgc aacagcatct gttgcaactc acagtctggg 3540
gcatcaagca gctccaggca agaatcctgg ctgtggaaag atacctaaag gatcaacagc 3600
tcctggggat ttggggttgc tctggaaaac tcatttgcac cactgctgtg ccttggaatg 3660
ctagttggag taataaatct ctggaacaga tttggaatca cacgacctgg atggagtggg 3720
acagagaaat taacaattac acaagcttaa tacactcctt aattgaagaa tcgcaaaacc 3780
agcaagaaaa gaatgaacaa gaattattgg aattagataa atgggcaagt ttgtggaatt 3840
ggtttaacat aacaaattgg ctgtggtata taaaattatt cataatgata gtaggaggct 3900
tggtaggttt aagaatagtt tttgctgtac tttctatagt gaatagagtt aggcagggat 3960
attcaccatt atcgtttcag acccacctcc caaccccgag gggacccgac aggcccgaag 4020
gaatagaaga agaaggtgga gagagagaca gagacagatc cattcgatta gtgaacggat 4080
ctcgacggta tcgatcacga gactagcctc gagcggccgc ccccttcacc gagggcctat 4140
ttcccatgat tccttcatat ttgcatatac gatacaaggc tgttagagag ataattggaa 4200
ttaatttgac tgtaaacaca aagatattag tacaaaatac gtgacgtaga aagtaataat 4260
ttcttgggta gtttgcagtt ttaaaattat gttttaaaat ggactatcat atgcttaccg 4320
taacttgaaa gtatttcgat ttcttggctt tatatatctt gtggaaagga cgaaacaccg 4380
ggcgacaggc tctccagaag cactcgagtg cttctggaga gcctgtcgct ttttgaattc 4440
tcgacctcga gacaaatggc agtattcatc cacaatttta aaagaaaagg ggggattggg 4500
gggtacagtg caggggaaag aatagtagac ataatagcaa cagacataca aactaaagaa 4560
ttacaaaaac aaattacaaa aattcaaaat tttcgggttt attacaggga cagcagagat 4620
ccactttggc cgcggctcga gggggttggg gttgcgcctt ttccaaggca gccctgggtt 4680
tgcgcaggga cgcggctgct ctgggcgtgg ttccgggaaa cgcagcggcg ccgaccctgg 4740
gtctcgcaca ttcttcacgt ccgttcgcag cgtcacccgg atcttcgccg ctacccttgt 4800
gggccccccg gcgacgcttc ctgctccgcc cctaagtcgg gaaggttcct tgcggttcgc 4860
ggcgtgccgg acgtgacaaa cggaagccgc acgtctcact agtaccctcg cagacggaca 4920
gcgccaggga gcaatggcag cgcgccgacc gcgatgggct gtggccaata gcggctgctc 4980
agcagggcgc gccgagagca gcggccggga aggggcggtg cgggaggcgg ggtgtggggc 5040
ggtagtgtgg gccctgttcc tgcccgcgcg gtgttccgca ttctgcaagc ctccggagcg 5100
cacgtcggca gtcggctccc tcgttgaccg aatcaccgac ctctctcccc agggggatcc 5160
accggagctt accatgaccg agtacaagcc cacggtgcgc ctcgccaccc gcgacgacgt 5220
ccccagggcc gtacgcaccc tcgccgccgc gttcgccgac taccccgcca cgcgccacac 5280
cgtcgatccg gaccgccaca tcgagcgggt caccgagctg caagaactct tcctcacgcg 5340
cgtcgggctc gacatcggca aggtgtgggt cgcggacgac ggcgccgcgg tggcggtctg 5400
gaccacgccg gagagcgtcg aagcgggggc ggtgttcgcc gagatcggcc cgcgcatggc 5460
cgagttgagc ggttcccggc tggccgcgca gcaacagatg gaaggcctcc tggcgccgca 5520
ccggcccaag gagcccgcgt ggttcctggc caccgtcggc gtctcgcccg accaccaggg 5580
caagggtctg ggcagcgccg tcgtgctccc cggagtggag gcggccgagc gcgccggggt 5640
gcccgccttc ctggagacct ccgcgccccg caacctcccc ttctacgagc ggctcggctt 5700
caccgtcacc gccgacgtcg aggtgcccga aggaccgcgc acctggtgca tgacccgcaa 5760
gcccggtgcc tgacgcccgc cccacgaccc gcagcgcccg accgaaagga gcgcacgacc 5820
ccatgcatcg gtacctttaa gaccaatgac ttacaaggca gctgtagatc ttagccactt 5880
tttaaaagaa aaggggggac tggaagggct aattcactcc caacgaagac aagatctgct 5940
ttttgcttgt actgggtctc tctggttaga ccagatctga gcctgggagc tctctggcta 6000
actagggaac ccactgctta agcctcaata aagcttgcct tgagtgcttc aagtagtgtg 6060
tgcccgtctg ttgtgtgact ctggtaacta gagatccctc agaccctttt agtcagtgtg 6120
gaaaatctct agcagtagta gttcatgtca tcttattatt cagtatttat aacttgcaaa 6180
gaaatgaata tcagagagtg agaggaactt gtttattgca gcttataatg gttacaaata 6240
aagcaatagc atcacaaatt tcacaaataa agcatttttt tcactgcatt ctagttgtgg 6300
tttgtccaaa ctcatcaatg tatcttatca tgtctggctc tagctatccc gcccctaact 6360
ccgcccatcc cgcccctaac tccgcccagt tccgcccatt ctccgcccca tggctgacta 6420
atttttttta tttatgcaga ggccgaggcc gcctcggcct ctgagctatt ccagaagtag 6480
tgaggaggct tttttggagg cctagggacg tacccaattc gccctatagt gagtcgtatt 6540
acgcgcgctc actggccgtc gttttacaac gtcgtgactg ggaaaaccct ggcgttaccc 6600
aacttaatcg ccttgcagca catccccctt tcgccagctg gcgtaatagc gaagaggccc 6660
gcaccgatcg cccttcccaa cagttgcgca gcctgaatgg cgaatgggac gcgccctgta 6720
gcggcgcatt aagcgcggcg ggtgtggtgg ttacgcgcag cgtgaccgct acacttgcca 6780
gcgccctagc gcccgctcct ttcgctttct tcccttcctt tctcgccacg ttcgccggct 6840
ttccccgtca agctctaaat cgggggctcc ctttagggtt ccgatttagt gctttacggc 6900
acctcgaccc caaaaaactt gattagggtg atggttcacg tagtgggcca tcgccctgat 6960
agacggtttt tcgccctttg acgttggagt ccacgttctt taatagtgga ctcttgttcc 7020
aaactggaac aacactcaac cctatctcgg tctattcttt tgatttataa gggattttgc 7080
cgat 7084
<210> 14
<211> 7084
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 14
ttcggcctat tggttaaaaa atgagctgat ttaacaaaaa tttaacgcga attttaacaa 60
aatattaacg cttacaattt aggtggcact tttcggggaa atgtgcgcgg aacccctatt 120
tgtttatttt tctaaataca ttcaaatatg tatccgctca tgagacaata accctgataa 180
atgcttcaat aatattgaaa aaggaagagt atgagtattc aacatttccg tgtcgccctt 240
attccctttt ttgcggcatt ttgccttcct gtttttgctc acccagaaac gctggtgaaa 300
gtaaaagatg ctgaagatca gttgggtgca cgagtgggtt acatcgaact ggatctcaac 360
agcggtaaga tccttgagag ttttcgcccc gaagaacgtt ttccaatgat gagcactttt 420
aaagttctgc tatgtggcgc ggtattatcc cgtattgacg ccgggcaaga gcaactcggt 480
cgccgcatac actattctca gaatgacttg gttgagtact caccagtcac agaaaagcat 540
cttacggatg gcatgacagt aagagaatta tgcagtgctg ccataaccat gagtgataac 600
actgcggcca acttacttct gacaacgatc ggaggaccga aggagctaac cgcttttttg 660
cacaacatgg gggatcatgt aactcgcctt gatcgttggg aaccggagct gaatgaagcc 720
ataccaaacg acgagcgtga caccacgatg cctgtagcaa tggcaacaac gttgcgcaaa 780
ctattaactg gcgaactact tactctagct tcccggcaac aattaataga ctggatggag 840
gcggataaag ttgcaggacc acttctgcgc tcggcccttc cggctggctg gtttattgct 900
gataaatctg gagccggtga gcgtgggtct cgcggtatca ttgcagcact ggggccagat 960
ggtaagccct cccgtatcgt agttatctac acgacgggga gtcaggcaac tatggatgaa 1020
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ctacagcgtg agctatgaga aagcgccacg cttcccgaag ggagaaaggc ggacaggtat 1680
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tggtatcttt atagtcctgt cgggtttcgc cacctctgac ttgagcgtcg atttttgtga 1800
tgctcgtcag gggggcggag cctatggaaa aacgccagca acgcggcctt tttacggttc 1860
ctggcctttt gctggccttt tgctcacatg ttctttcctg cgttatcccc tgattctgtg 1920
gataaccgta ttaccgcctt tgagtgagct gataccgctc gccgcagccg aacgaccgag 1980
cgcagcgagt cagtgagcga ggaagcggaa gagcgcccaa tacgcaaacc gcctctcccc 2040
gcgcgttggc cgattcatta atgcagctgg cacgacaggt ttcccgactg gaaagcgggc 2100
agtgagcgca acgcaattaa tgtgagttag ctcactcatt aggcacccca ggctttacac 2160
tttatgcttc cggctcgtat gttgtgtgga attgtgagcg gataacaatt tcacacagga 2220
aacagctatg accatgatta cgccaagcgc gcaattaacc ctcactaaag ggaacaaaag 2280
ctggagctgc aagcttaatg tagtcttatg caatactctt gtagtcttgc aacatggtaa 2340
cgatgagtta gcaacatgcc ttacaaggag agaaaaagca ccgtgcatgc cgattggtgg 2400
aagtaaggtg gtacgatcgt gccttattag gaaggcaaca gacgggtctg acatggattg 2460
gacgaaccac tgaattgccg cattgcagag atattgtatt taagtgccta gctcgataca 2520
taaacgggtc tctctggtta gaccagatct gagcctggga gctctctggc taactaggga 2580
acccactgct taagcctcaa taaagcttgc cttgagtgct tcaagtagtg tgtgcccgtc 2640
tgttgtgtga ctctggtaac tagagatccc tcagaccctt ttagtcagtg tggaaaatct 2700
ctagcagtgg cgcccgaaca gggacttgaa agcgaaaggg aaaccagagg agctctctcg 2760
acgcaggact cggcttgctg aagcgcgcac ggcaagaggc gaggggcggc gactggtgag 2820
tacgccaaaa attttgacta gcggaggcta gaaggagaga gatgggtgcg agagcgtcag 2880
tattaagcgg gggagaatta gatcgcgatg ggaaaaaatt cggttaaggc cagggggaaa 2940
gaaaaaatat aaattaaaac atatagtatg ggcaagcagg gagctagaac gattcgcagt 3000
taatcctggc ctgttagaaa catcagaagg ctgtagacaa atactgggac agctacaacc 3060
atcccttcag acaggatcag aagaacttag atcattatat aatacagtag caaccctcta 3120
ttgtgtgcat caaaggatag agataaaaga caccaaggaa gctttagaca agatagagga 3180
agagcaaaac aaaagtaaga ccaccgcaca gcaagcggcc gctgatcttc agacctggag 3240
gaggagatat gagggacaat tggagaagtg aattatataa atataaagta gtaaaaattg 3300
aaccattagg agtagcaccc accaaggcaa agagaagagt ggtgcagaga gaaaaaagag 3360
cagtgggaat aggagctttg ttccttgggt tcttgggagc agcaggaagc actatgggcg 3420
cagcgtcaat gacgctgacg gtacaggcca gacaattatt gtctggtata gtgcagcagc 3480
agaacaattt gctgagggct attgaggcgc aacagcatct gttgcaactc acagtctggg 3540
gcatcaagca gctccaggca agaatcctgg ctgtggaaag atacctaaag gatcaacagc 3600
tcctggggat ttggggttgc tctggaaaac tcatttgcac cactgctgtg ccttggaatg 3660
ctagttggag taataaatct ctggaacaga tttggaatca cacgacctgg atggagtggg 3720
acagagaaat taacaattac acaagcttaa tacactcctt aattgaagaa tcgcaaaacc 3780
agcaagaaaa gaatgaacaa gaattattgg aattagataa atgggcaagt ttgtggaatt 3840
ggtttaacat aacaaattgg ctgtggtata taaaattatt cataatgata gtaggaggct 3900
tggtaggttt aagaatagtt tttgctgtac tttctatagt gaatagagtt aggcagggat 3960
attcaccatt atcgtttcag acccacctcc caaccccgag gggacccgac aggcccgaag 4020
gaatagaaga agaaggtgga gagagagaca gagacagatc cattcgatta gtgaacggat 4080
ctcgacggta tcgatcacga gactagcctc gagcggccgc ccccttcacc gagggcctat 4140
ttcccatgat tccttcatat ttgcatatac gatacaaggc tgttagagag ataattggaa 4200
ttaatttgac tgtaaacaca aagatattag tacaaaatac gtgacgtaga aagtaataat 4260
ttcttgggta gtttgcagtt ttaaaattat gttttaaaat ggactatcat atgcttaccg 4320
taacttgaaa gtatttcgat ttcttggctt tatatatctt gtggaaagga cgaaacaccg 4380
gggagcgaca ggctctccag aactcgagtt ctggagagcc tgtcgctcct ttttgaattc 4440
tcgacctcga gacaaatggc agtattcatc cacaatttta aaagaaaagg ggggattggg 4500
gggtacagtg caggggaaag aatagtagac ataatagcaa cagacataca aactaaagaa 4560
ttacaaaaac aaattacaaa aattcaaaat tttcgggttt attacaggga cagcagagat 4620
ccactttggc cgcggctcga gggggttggg gttgcgcctt ttccaaggca gccctgggtt 4680
tgcgcaggga cgcggctgct ctgggcgtgg ttccgggaaa cgcagcggcg ccgaccctgg 4740
gtctcgcaca ttcttcacgt ccgttcgcag cgtcacccgg atcttcgccg ctacccttgt 4800
gggccccccg gcgacgcttc ctgctccgcc cctaagtcgg gaaggttcct tgcggttcgc 4860
ggcgtgccgg acgtgacaaa cggaagccgc acgtctcact agtaccctcg cagacggaca 4920
gcgccaggga gcaatggcag cgcgccgacc gcgatgggct gtggccaata gcggctgctc 4980
agcagggcgc gccgagagca gcggccggga aggggcggtg cgggaggcgg ggtgtggggc 5040
ggtagtgtgg gccctgttcc tgcccgcgcg gtgttccgca ttctgcaagc ctccggagcg 5100
cacgtcggca gtcggctccc tcgttgaccg aatcaccgac ctctctcccc agggggatcc 5160
accggagctt accatgaccg agtacaagcc cacggtgcgc ctcgccaccc gcgacgacgt 5220
ccccagggcc gtacgcaccc tcgccgccgc gttcgccgac taccccgcca cgcgccacac 5280
cgtcgatccg gaccgccaca tcgagcgggt caccgagctg caagaactct tcctcacgcg 5340
cgtcgggctc gacatcggca aggtgtgggt cgcggacgac ggcgccgcgg tggcggtctg 5400
gaccacgccg gagagcgtcg aagcgggggc ggtgttcgcc gagatcggcc cgcgcatggc 5460
cgagttgagc ggttcccggc tggccgcgca gcaacagatg gaaggcctcc tggcgccgca 5520
ccggcccaag gagcccgcgt ggttcctggc caccgtcggc gtctcgcccg accaccaggg 5580
caagggtctg ggcagcgccg tcgtgctccc cggagtggag gcggccgagc gcgccggggt 5640
gcccgccttc ctggagacct ccgcgccccg caacctcccc ttctacgagc ggctcggctt 5700
caccgtcacc gccgacgtcg aggtgcccga aggaccgcgc acctggtgca tgacccgcaa 5760
gcccggtgcc tgacgcccgc cccacgaccc gcagcgcccg accgaaagga gcgcacgacc 5820
ccatgcatcg gtacctttaa gaccaatgac ttacaaggca gctgtagatc ttagccactt 5880
tttaaaagaa aaggggggac tggaagggct aattcactcc caacgaagac aagatctgct 5940
ttttgcttgt actgggtctc tctggttaga ccagatctga gcctgggagc tctctggcta 6000
actagggaac ccactgctta agcctcaata aagcttgcct tgagtgcttc aagtagtgtg 6060
tgcccgtctg ttgtgtgact ctggtaacta gagatccctc agaccctttt agtcagtgtg 6120
gaaaatctct agcagtagta gttcatgtca tcttattatt cagtatttat aacttgcaaa 6180
gaaatgaata tcagagagtg agaggaactt gtttattgca gcttataatg gttacaaata 6240
aagcaatagc atcacaaatt tcacaaataa agcatttttt tcactgcatt ctagttgtgg 6300
tttgtccaaa ctcatcaatg tatcttatca tgtctggctc tagctatccc gcccctaact 6360
ccgcccatcc cgcccctaac tccgcccagt tccgcccatt ctccgcccca tggctgacta 6420
atttttttta tttatgcaga ggccgaggcc gcctcggcct ctgagctatt ccagaagtag 6480
tgaggaggct tttttggagg cctagggacg tacccaattc gccctatagt gagtcgtatt 6540
acgcgcgctc actggccgtc gttttacaac gtcgtgactg ggaaaaccct ggcgttaccc 6600
aacttaatcg ccttgcagca catccccctt tcgccagctg gcgtaatagc gaagaggccc 6660
gcaccgatcg cccttcccaa cagttgcgca gcctgaatgg cgaatgggac gcgccctgta 6720
gcggcgcatt aagcgcggcg ggtgtggtgg ttacgcgcag cgtgaccgct acacttgcca 6780
gcgccctagc gcccgctcct ttcgctttct tcccttcctt tctcgccacg ttcgccggct 6840
ttccccgtca agctctaaat cgggggctcc ctttagggtt ccgatttagt gctttacggc 6900
acctcgaccc caaaaaactt gattagggtg atggttcacg tagtgggcca tcgccctgat 6960
agacggtttt tcgccctttg acgttggagt ccacgttctt taatagtgga ctcttgttcc 7020
aaactggaac aacactcaac cctatctcgg tctattcttt tgatttataa gggattttgc 7080
cgat 7084

Claims (10)

1.特异性抑制GOS2基因表达的shRNA序列，其特征在于，所述shRNA为shGOS2-2 或shGOS2-4，所述shGOS2-2和shGOS2-4的序列为：
GOS2-shRNA 2：5´-GGCCCTGTCCAACCGGCAGCA-3´；
GOS2-shRNA 4：5´-GCGACAGGCTCTCCAGAAGCA-3。
2.用于制备权利要求1所述的shRNA的引物序列，其特征在于，shGOS2-2的引物序列为：
上游引物shGOS2-2F:：CCGGGGCCCTGTCCAACCGGCAGCACTCGAGTGCTGCCGGT
TGGACAGGGCCTTTTTG（SEQ ID NO:5）；
下游引物shGOS2-2： AATTCAAAAAGGCCCTGTCCAACCGGCAGCACTCGAGTGCT
GCCGGTTGGACAGGGCC（SEQ ID NO:6）；
shGOS2-4的引物序列为：
上游引物shGOS2-4F： CCGGGCGACAGGCTCTCCAGAAGCACTCGAGTGCTTCTGGA
GAGCCTGTCGCTTTTTG（SEQ ID NO:9）；
下游引物shGOS2-4：AATTCAAAAAGCGACAGGCTCTCCAGAAGCACTCGAGTGCT
TCTGGAGAGCCTGTCGC（SEQ ID NO:10）。
3.一种shRNA慢病毒表达载体Plko.1-TRC-shRNA-GOS2，其特征在于，所述Plko.1-TRC-shRNA-GOS2表达载体包含权利要求1所述shRNA序列。
4.根据权利要求3所述的所述shRNA慢病毒表达载体Plko.1-TRC-shRNA-GOS2，其特征在于，所述Plko.1-TRC-shRNA-GOS2包含质粒shGOS2-2和质粒shGOS2-4；所述质粒shGOS2-2的核苷酸序列如SEQ ID NO:14所示，质粒shGOS2-4的核苷酸序列如SEQ ID NO:16所示。
5.一种含有权利要求2或3任一项所述慢病毒表达载体的转基因细胞或工程菌。
6.权利要求1所述shRNA序列或权利要求3所述Plko.1-TRC-shRNA-GOS2表达载体或权利要求5所述的转基因细胞或工程菌在制备GOS2基因功能研究的产品的应用。
7.根据权利要求6所述的应用，其特征在于，所示应用为特异性抑制卵巢癌细胞中的GOS2基因的表达，使GOS2基因的mRNA表达显著降低。
8.根据权利要求6所述的应用，其特征在于，所示应用为在不显著影响卵巢癌细胞增殖的情况下显著抑制卵巢癌细胞的迁移侵润能力。
9.权利要求1所述shRNA序列或权利要求3所述Plko.1-TRC-shRNA-GOS2表达载体或权利要求5所述的转基因细胞或工程菌在制备GOS2基因有关疾病的靶向治疗药物中的应用。
10.根据权利要求9所述的应用，其特征在于，所述药物为抑制卵巢癌细胞转移和肿瘤转移的药物。
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Citations (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN101998964A (zh) * 2008-02-15 2011-03-30 太平洋艾瑞有限公司 阻止癌细胞的转移的新化合物及其应用
CN102165315A (zh) * 2008-08-29 2011-08-24 森托科尔奥索生物科技公司 用于使用20基因群组评估及治疗溃疡性结肠炎和相关疾病的标记物和方法
CN103201385A (zh) * 2010-10-27 2013-07-10 德福根有限公司 下调昆虫害虫中的基因表达
GB201607393D0 (en) * 2016-04-28 2016-06-15 Isis Innovation Biomarkers for early diagnosis of ovarian cancer
US20180127358A1 (en) * 2015-01-28 2018-05-10 Kyushu University, National University Corporation Anti-inflammatory drug and uses thereof

Patent Citations (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN101998964A (zh) * 2008-02-15 2011-03-30 太平洋艾瑞有限公司 阻止癌细胞的转移的新化合物及其应用
CN102165315A (zh) * 2008-08-29 2011-08-24 森托科尔奥索生物科技公司 用于使用20基因群组评估及治疗溃疡性结肠炎和相关疾病的标记物和方法
CN103201385A (zh) * 2010-10-27 2013-07-10 德福根有限公司 下调昆虫害虫中的基因表达
US20180127358A1 (en) * 2015-01-28 2018-05-10 Kyushu University, National University Corporation Anti-inflammatory drug and uses thereof
GB201607393D0 (en) * 2016-04-28 2016-06-15 Isis Innovation Biomarkers for early diagnosis of ovarian cancer

Non-Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
CHRISTOPHER HALBUR 等: "siRNA-Conjugated Nanoparticles to Treat Ovarian Cancer", SLAS TECHNOLOGY, vol. 24, no. 2, 31 December 2019 (2019-12-31), pages 137 *
JUN XING 等: "Effect of shRNA targeting survivin on ovarian cancer", J CANCER RES CLIN ONCOL, 18 March 2012 (2012-03-18), pages 1221, XP035071027, DOI: 10.1007/s00432-012-1196-0 *

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